JP6096509B2 - インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119(e)条のもとで、以下の仮特許出願:2009年7月16日に出願された「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第61/226,237号、2009年9月18日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/243,939号、2010年5月27日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/349,088号、及び2010年7月16日に出願された「インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第61/365,308号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
AFP:α−フェトタンパク質
BMP:骨形成性タンパク質
BRL:バファローラット肝臓
BSA:ウシ血清アルブミン
CD:クラスター指定
cGMP:適正製造基準工程
CNS:中枢神経系
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
DMSO:ジメチルスルホキシド
DPBS:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EC:胚性癌
EC Cells:胚性癌細胞、hEC細胞は、ヒト胚性癌細胞である
ECM:細胞外マトリクス
ED Cells:胚由来細胞;hED細胞はヒトED細胞である
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EG Cells:胚性生殖細胞;hEG細胞はヒトEG細胞である
EP Cells:胚性前駆細胞は、それらが、ヒトにおける場合、SSEA4、TRA1−60又はTRA−1−81のようなマーカーの血清陽性をもはや示さないという点で原始幹細胞より分化しているが、完全に分化しているわけではない、原始幹細胞由来の細胞である。胚性前駆細胞は、発生の新生児段階ではなく胚段階に相当する。
ES Cells:胚性幹細胞;hES細胞はヒトES細胞である
FACS:蛍光活性化細胞選別
EBS:ウシ胎児血清
GMP:製造管理及び品質管理に関する基準
hED Cells:ヒト胚由来細胞
hEG Cells:ヒト胚性生殖細胞は胚組織の原始生殖細胞に由来する幹細胞である
hEP Cells:ヒト胚性前駆細胞はヒト種からの胚性前駆細胞である。
hiPS Cells:ヒトから誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOX2、KLF4、OCT4、MYC又はNANOG、LIN28、OCT4及びSOXのようなhES特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるhES細胞に類似する特性を持つ細胞である。
HSE:ヒト皮膚同等物は、創傷修復の促進で試験目的又は治療適用にために製造される細胞と生物学的マトリクス又は合成マトリクスの混合物である。
ICM:哺乳類の胚盤胞段階の胚の内部細胞塊
iPS細胞:誘導された多能性幹細胞は、たとえば、SOX2、KLF4、OCT4、MYC又はNANOG、LIN28、OCT4及びSOXのようなhES特異的な転写因子に暴露した後の体細胞から得られるhES細胞に類似する特性を持つ細胞である。
LOH:ヘテロ接合性の消失
MEM:最少必須培地
NT:核移植
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PS線維芽細胞:瘢痕化前の線維芽細胞は、早期妊娠の皮膚に由来する、又は瘢痕形成することなく皮膚創傷の迅速な治癒を促進するという点で遺伝子発現の出生前のパターンを示すED細胞に由来する線維芽細胞である。
RA:レチノイン酸
RFU:相対的蛍光単位
SCNT:体細胞核移植
SFM:無血清培地
SPF:特定病原体未感染
SV40:シミアンウイルス40
Tag:ラージT抗原
T−EDTA:トリプシンEDTA
用語「分析用再プログラム技術」は、体細胞の遺伝子発現のパターンをさらに多能性状態、たとえば、iPS細胞、ES細胞、ED細胞、EC細胞又はEG細胞のそれに再プログラムする種々の方法を指し、その際、再プログラムは、複数の別個の工程で生じ、体細胞の卵母細胞への移植及びその卵母細胞の活性化に単純に頼らない(2001年11月26出願の米国特許出願第60/332,510号;2002年11月26日出願の同第10/204,020号;2003年11月26日出願のPCT出願番号PCT/US02/37899;2005年8月3日出願の米国特許出願第60/705625号;2005年8月20日出願の同第60/729173号;2006年7月5日出願の同第60/818813号;2006年8月3日出願のPCT/US06/30632を参照のこと。そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み入れられる)。
上記で要約したように、本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。
本発明の態様は、軟骨形成を経験することが可能である胚性前駆細胞株の産生、特定及び使用に関連する方法及び組成物を包含する。四肢及び関節の中心的調節因子と関連して間充組織の中心的調節因子を発現する多様なセットのクローン性細胞株、たとえば、関節特異的なマーカーGDF5を高レベルで発現する細胞株のサブセットを伴った、MSX1、MSX2、及びSOX9を発現する細胞株が記載されている(補完情報を含む、参照によって本明細書に組み入れられるWest et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308; 及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願第12/504,630号を参照)。これらのクローン性に精製された細胞株は、健全であり、その遺伝子発現パターンを維持しつつ40を超える継代について増殖させることができ、腫瘍形成性は示されておらず、遺伝子発現の胚性パターンを有する。従って、これらの細胞株は、研究及び治療で使用するための独特の分子組成を持った多様な軟骨の種類を産生するための組成物及び方法を提供する。
哺乳類には3種の軟骨が存在し、ガラス質軟骨、線維軟骨及び弾性軟骨が挙げられる。ガラス質軟骨は、フィルム状の弾性粘度を有する軟骨質の塊から成り、半透明であり、真珠のような青色である。ガラス質軟骨は、関節接合する関節の関節接合する表面に優勢に見い出される。それはまた、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、気管支軟骨及び鼻軟骨にも見い出される。線維軟骨は、軟骨に張力強度を付加するI型コラーゲンの原線維を含有することを除いてガラス質軟骨と本質的同じである。コラーゲン性の原線維が束に配置され、軟骨細胞が束の間に局在する。線維軟骨は一般に椎間円板の線維輪、腱と靭帯の挿入、半月板、恥骨結合、及び関節包の挿入に一般に見られる。弾性軟骨も、エラスチンの線維を含有することを除いてガラス質軟骨に類似する。それはガラス質軟骨より不透明であり、さらに柔軟性で曲げ易い。これらの特徴は、軟骨マトリクスに埋め込まれた弾性線維によって部分的には規定される。通常、耳介、咽頭蓋、及び喉頭には弾性軟骨が存在する。
1)10%(w/v)の濃度にて無菌PBSでマクロマーを混合することによってPEGDAポリマー、ポリ(エチレングリコール)−ジアクリレート(PRGDA:カタログ番号01010F12、米国、Nektar,Huntsville,AL)溶液又はRGDで修飾したPEGDA溶液を調製する。ポリマー溶液を光から保護し、それは、−20℃にて3ヵ月間保存することができる。
2)70%のフィルター滅菌したエタノール1mLに100mgの光開始剤、イグラキュア2959(製品番号1706673,Ciba Specialty Chemicals,Tarrytown,NY,USA)を溶解する。
3)その使用まで、粉砕した氷上にPEGDA溶液と光開始剤溶液の双方を置く。
5)PEGDA溶液に光開始剤を加え、十分に混合して最終濃度0.05%(w/v)とする。開始剤がマクロマー溶液と非常に良く混合されていることを確認する(5μLの光開始剤/ポリマー溶液のmL)。
6)光開始剤を含有するPEGDA溶液を細胞ペレットに加え、ピペットを用いて泡を創らずに十分に混合することによって前駆体(光開始剤を伴ったポリマー)溶液の中で細胞(2000〜3000万個/mL)を浮遊させる。
7)100_Lの前駆細胞/ポリマー溶液を円筒状の金型に移し、4.4mW/cm2(Glowmark System,Upper Saddle River,NJ,USA)にて長波365nmの光に5分間暴露してゲル形成を完了させる。
8)「固化した」軟骨細胞前駆細胞を含むヒドロゲルをその金型から取り出し、10ng/mlのTGF−1を含有する軟骨形成性培地と共に12穴プレートのそれらを移し、37℃にて5%CO2でインキュベートする。2〜3日ごとに培地を交換する。
1)軟骨形成性細胞を50mlの円錐管に回収し、145gにて5分間遠心する。上清を取り除き、アルギン酸ポリマー又はRGD修飾したアルギン酸ポリマーの溶液を加え、(P−1000)ピペットマンを用いて細胞を穏やかに浮遊させる。液体中での泡立ちを回避する。
2)Transwell組織培養インサートトレーの1つを取り、1mLの塩化カルシウム溶液でウェルを満たす。
3)ピペットマンを用いて、100μlの細胞浮遊液を組織培養インサートに加える。インサートをすべて満たした後、無菌のピンセットを用いて、塩化カルシウム溶液を含有するウェルにインサートを移す。5%CO2にて37℃で20分間それらをインキュベートする。
4)薄い曲がったヘラと共に穏やかなテコのような動きを用いてインサートから構築物を取り外す。各ウェルに構築物1つを入れ、5%CO2にて37℃でインキュベートする。
たとえば、細胞株、4D20.8、MEL2、7SMOO32、SM30、SK11、7PEND24又はE15又は同一の若しくは類似のマーカーを持つヒト若しくは動物の細胞、又は本発明のそのほかの細胞の直接注入は、成人骨髄由来のMSC(軟骨原)で以前報告されたものに類似する治療有用性でもある。患者は、半月板切除を受け、その後、ヒアルロン酸(HA)又は低用量(5000万個の細胞)若しくは高用量(15000万個の細胞)のMSCの単回注入を受ける。患者は、安全性及び追加の予備的な有効性、たとえば、疼痛、軟骨の損傷、及び組織の修復について2年間モニターされる。半月板と軟骨の状態を調べるのに非侵襲性のMRIを用いる。手術の時点で変形性関節症(OA)のある患者では、1年で、対照、HAの注入を受けた患者に対してMSCの単回注入を受けた患者では、視覚的アナログ尺度(VAS)によって測定した場合、統計的に有意な20mmの疼痛低下が認められた(対照28mmに対してMSC48mm、p=0.05)。患者の関節でさらに重篤な変形性関節症がある場合、疼痛の低下は一層さらに37mmに増えた(p=0.004、対照19mmに対してMSC56mm)。因みに、HAのようなOAに対する現在利用可能な治療は、プラセボに対する9〜23mmの改善に基づいて食品医薬品局(FDA)によって認可された。MRIによる容量解析法は、読み取り間に高レベルの変動性が見られるので、コンピュータによる解析には不適当であると思われた。その結果、半月板の再生の意味のある評価を行うことはできない。成人MSCの有益な効果は、関節状態の物理的対策でも見られた。軟骨下硬化症及び骨棘形成のような変形性関節症に伴う生体の変化は、対照を受け取った患者の21%で報告されたが、MSC治療を受けた患者ではたった6%だった。陽性の用量反応効果もあった。1年で、損傷した半月板を取り出す手術に先立ったベースラインに比べた疼痛の改善は、高用量のMSCでは56mm、低用量のMSCでは26mm、及び対照では19mmだった。関節のための細胞に基づいた治療法は、関節特異的な及び患者特異的な細胞、関節組織を再生する改善された能力を持つ細胞、規模拡大及び凍結保存の改善された能力を持つ細胞を生成する技術から恩恵を受ける。本発明は、産業的な規模拡大に好適なSOX9、MSX1及びMSX2を発現する細胞株を提供する。
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる:「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第20080070303号;「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630;「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する2009年7月16日に出願された米国特許仮出願、出願番号61/226,237;「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する2006年4月11日に出願されたPCT出願、PCT/US2006/013519、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
使用したhES細胞は、以前記載したH9(米国国立衛生研究所、WA09として登録された)及びAdvanced Cell Technology(West et al., 2008, Regenerative Medicine vol. 3(3) pp. 287-308)に由来する株(MA03)だった。hES培地(KO−DMEM(CA、Carlsbad、Invitrogen)、1×非必須アミノ酸(CA、Carlsbad、Invitrogen)、1×Glutamax−1(CA、Carlsbad、Invitrogen)、55μMのβ−メルカプトエタノール(CA、Carlsbad、Invitrogen)、8%ノックアウト血清代替(CA、Carlsbad、Invitrogen)、8%プラスマネート、10ng/mlのLIF(MA、Billerica、Millipore)、4ng/mlのbFGF(MA、Billerica、Millipore)、50単位/mlのペニシリン/50単位/mlのストレプトマイシン(CA、Carlsbad、Invitrogen))にてhES細胞を日常的に培養した。hES細胞は、マイトマイシン−C処理したマウスの胚性線維芽細胞(MEF)上で10%のCO2と5%のO2の雰囲気にて37℃で維持し、トリプシン処理又はコロニーの定期的な手動選抜によって継代した。クローン性胚性前駆細胞の産生については、hES細胞を15mlのディッシュ当たり500〜10,000個の細胞を入れ、次いで、2工程プロトコールのもとで分化させ、第1の工程は、数々の条件下でhES細胞を分化させ、「候補培養物」と呼ばれる細胞の多様な不均質培養物を得ることである。候補培養物の生成は、MEF上で増殖する付着性のhES細胞(その場での分化のコロニー)と共に、又はhESに由来する胚様体と共に実施した。その場での分化のコロニー実験については、hES細胞を集密まで増殖させ、種々の方法(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWestら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308からの補完表Iに記載されたように)によって分化させた。非限定の例証として、10%のFCSを伴ったDMEMでのその場の分化でのコロニーの場合、マウスのフィーダー上のhES細胞のコロニーの培養から培養培地を吸引し、分化のために、種々の時間後(分化培地における1,2,3,4,5,7及び9日目)、10%FCSを含有するDMED培地で培地を置き換えた。次いで0.25%トリプシン(CA、Carlsbad、Invitrogen)によって細胞を剥離し、増殖のために150cm2のフラスコに入れた。150cm2のフラスコにおける各時点からの候補細胞を以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。EBの分化実験については、集密なhEC培養物を1mg/mlのコラゲナーゼIV(DMEM中、CA、Carlsbad、Invitrogen)によって37℃で15分間処理し、コロニーを分離した。剥離した無傷のコロニーを擦り取り、遠心(150×gで5分間)によって回収し、補完表I(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWestら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308)に記載された分化培地に再浮遊し、同一の分化培地を含有する6穴超低結合プレート(Corning、PA、Pittsburgh,Fisher Scientificによって流通)の単一ウェルに移した。実験に応じて4〜7日間、EBを分化させ、分化したEBを0.25%トリプシンで剥離し、種々の増殖培地を含有する6穴プレートに入れた。6穴プレートでの候補培養物を集密まで増殖させ、以下に記載するようにクローニングと増殖のために別のプレートに入れた。
上述した部分的に分化した候補細胞培養物を0.25%トリプシンで単一細胞に剥離し、補完表I(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWestら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308)に示された種々の増殖培地にてさらなる分化と増殖のためにプレート当たりおよそ500及び/又は1,000及び/又は2,000及び/又は5,000個の細胞のクローニング密度で2つ組の15cmゼラチン被覆プレートに入れた。クローン性密度の細胞を増殖させ、10〜14日間そのままにし、発達しているコロニーを特定し、標準的な技法を用いてクローニングシリンダーとトリプシンによって回収した。クローニングしたコロニーを増殖のためにゼラチン被覆した24穴プレートに移した。24穴プレートでクローンが集密になるにつれて(しかし、2日を超えて細胞を集密のままにすることなく)、それらを順次12穴、6穴、T−25フラスコ、T−75フラスコ、T−150フラスコ又はT−225フラスコ、及び最終的にローラーボトルに拡大した。ローラーボトルの段階まで増殖しているクローン性細胞株に独特にACTC特定番号を割り当て、写真撮影し、後の使用のためにアリコートで凍結保存した。細胞がいったん6穴ディッシュで集密に達すると、それらをT−25フラスコに継代し、遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化6cmディッシュに入れるために細胞の分画(5×105)を取り出した。或いは、一部の細胞を先ずT−225フラスコに継代し、次いで遺伝子発現の特性分析のためにゼラチン化6cmディッシュに入れるために細胞の分画(5×105)を取り出した。従って、細胞が経験した集団の倍増は18〜21PDであると判定された。クローニングプレートからの細胞クローンの取り出しに続いて、製造元の指示書当たり100%エタノールにてクリスタルバイオレット染色(Sigma、HT9132−IL)によって残りのコロニーを視覚化した。実験に利用した培養培地は以下を含み、平滑筋基礎培地(カタログ番号C−22062B)と増殖補完剤(カタログ番号C−39267)、骨格筋基礎培地(カタログ番号C−22060B)と増殖補完剤(カタログ番号C−39365)、内皮細胞基礎培地(カタログ番号C−22221)と増殖補完剤(カタログ番号C−39221)、色素細胞基礎培地(カタログ番号C−24010B)と増殖補完剤(カタログ番号C−39415)はPromoCell社(ドイツ、Heidelberg)から入手した。EpiLife、カルシウム/フェノールを含まない培地(カタログ番号M−EPIcf/PRF−500)と低血清増殖補完剤(カタログ番号S−003−10)は、Cascade Biologics(Oregon、Portland)から購入した。Mesencult基本培地(カタログ番号05041)と補完剤(カタログ番号5402)は、Stem Cell Technologies(Vancouver,BC)から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地(カタログ番号11960−069)とウシ胎児血清(カタログ番号SH30070−03)はそれぞれ、Invitrogen(Carlsbad,CA)とHyclone(Logan,UT)から購入した。培地及び補完剤は製造元の指示書に従って組み合わせた。
別の記号表示を伴った本発明の細胞株は、バイオインフォマティクス解析の結果生じる名称の操作の結果生じる瑣末な改変を表す異名と共に表4に列記するが、それには、「.」について「−」の置換及びその逆、アラビア数字で細胞株の名称を開始する前の「x」の包含、並びに並行する解析で同一細胞株の凍結アンプルが融解され、伝播され、使用される場合の例である同一細胞株の生物学的複製を示す、「biol1」又は「biol2」、及び所与の細胞株から単離されたRNAが、融解することなく、又はさもなければ、細胞の新しい培養で開始することなく、反復する解析で2回目に利用される技術的複製を示す「Rep1」又は「Rep2」のような接尾辞が含まれる。細胞株の継代数(細胞がトリプシン処理され、再びプレートに入れられる回数)は普通、文字Pに続くアラビア数字で指定されるが、それに対して、集団の倍増数(1つの細胞からクローンで増殖する際、細胞株が経験する推定倍増の数を指す)は、文字「PD」に続くアラビア数字で指定される。継代におけるPDの数は、実験ごとに異なったが、一般に、それぞれのトリプシン処理と再プレート培養は、1:3〜1:4の比率(それぞれ1.5と2のPDの増加に相当する)だった。クローンの増殖では、クローニングシリンダーによって組織培養から元々のコロニーを取り出し、上述のように24穴プレート、次いで12穴プレート、そして6穴プレートに移した。第1の集密な24穴プレートをP1と名付け、第1の集密な12穴プレートをP2と名付け、第1の集密な6穴プレートをP3と名付け、次いで6穴培養物を第2の6穴プレート(P4)とT25(P4)に分けた。P4での第2の6穴プレートをRNA抽出に利用し(その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願第12/504,630号を参照)、クローン性増殖のおよそ18〜21PPDを表す。典型的な、推定されるその後の継代とPDは、T75フラスコへの以下の分割(19.5〜22.5PD)、T225フラスコへの細胞のP6継代(21〜24PD)、次いでローラーボトルへの細胞のP7継代(850cm2、23〜26PD)、及び4つのローラーボトルへのP8の分割(25〜28PD)である。括弧内に上記で示す範囲は、細胞の大きさ、付着効率及び計数誤差による細胞計数の推定範囲を表す。
本発明の態様は、単一細胞(クローン性)、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常2〜1,000個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する2以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いでインビトロで増殖させ、通常、元々の細胞数の1/3〜1/4に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願第12/504,630号及びWestら、2008,Regenerative Medicine vol.3(3)pp.287−308に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の21を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。
6穴プレートで増殖させる際、細胞が集密に達する日に、細胞周期の人為性による遺伝子発現の変動を抑え、早期の遺伝子発現特性を把握するために、元々の血清濃度が>5%である場合、血清濃度を0.5%に減らした培地に細胞を入れた。ほかのすべての場合では、血清及び/又はそのほかの増殖因子は、その元々の値の10%に減らした。これらの静止条件を5日間課し、回収に先立って2日間培養物すべてを元どおり培養し、培養差による人為性を減らした。だから、例証として、元々の培地が10%FCSを伴うDMEM培地であれば、静止同期化培地は、0.5%FCSを伴うDMEMだった。全RNAは、製造元の指示書に従って、QiagenRNeasyミニキットを用いて、6穴プレート又は6cm組織培養プレートで増殖している細胞から直接抽出した。BeckmanDU530又はNanodrop分光光度計を用いてRNA濃度を測定し、変性アガロースゲル電気制動又はAgilent2100バイオアナライザによってRNAの質を判定した。Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip(登録商標)方式、Illumina Human−6 v1及びHumanRef−8 v1 Beadchips(Illumina1)及びIllumina Human−6 v2 Beadchips(Illumina2)を用いて全ゲノム発現解析を実施し、特定の遺伝子についてのRNAレベルを定量PCRによって確認した。Illumina BeadArraysについては、全RNAを線形に増幅し、Illumina TotalPrep kits(Ambion)を用いてビオチン標識し、Agilent2100バイオアナライザを用いてcRNAの質的制御を行った。cRNAをIllumina BeadChipsとハイブリッド形成させ、処理し、製造元の指示書(Illumina)に従ってBeadStationアレイリーダーを用いて読み取った。共通プローブセットによる細胞株すべての相対蛍光単位(RFU)を標準化した。
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成(又は軟骨産生)を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に(生体内又はインビトロのいずれかで)採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。
以下の分化プロトコールは単に「d14MM」と呼ばれる(たとえば、本明細書に記載されるマイクロアレイ表にて)。
1)細胞を、ゼラチン(0.1%)被覆したCorning組織培養処理した培養器具で培養し、PBS(Gibco、Ca,Mgを含まず)によって1:3に希釈された0.25%トリプシン/EDTA(Gibco)で剥離する。剥離と増殖培地の添加の後、Coulterカウンタを用いて細胞を数え、実験に必要とされる適当な数の細胞(たとえば、10×106個以上の細胞)を増殖培地中で20×106個の細胞/mlの細胞密度で再浮遊する。
2)塊又は「微細塊」として10μlのアリコートをCorning組織培養処理したポリスチレンプレート又はディッシュに播く。25以上の微細塊アリコート(200,000個の細胞/10μlアリコート)を播く。
3)播いた微細塊を付着のために、5%O2及び10%CO2にて37℃の加湿インキュベータに90分間〜2時間入れる。
4)増殖培地を加え、翌朝、吸引し、PBS(Ca,Mgを含まず)で洗浄した後、軟骨形成用完全培地(ペレット微細塊用に以下で記載するように調製される)で置き換える。たとえば、10cmディッシュ当たり6mlの軟骨形成用完全培地を加える。5%O2及び10%CO2にて37℃の加湿インキュベータで細胞を維持し、2〜3日ごとに新しく調製した培地で軟骨形成用培地を置き換える。
5)軟骨形成用培地にて種々の時間の後、Qiagenハンドブックに記載されたようにQiagenRNeasyキット(Qiagen、カタログ番号74104)を用いてRNAを抽出する。RNAの抽出に先立ってQiagenのQiaShredder(カタログ番号79654)を用いて、試料をホモジネートし、次いでRLT緩衝液(RNeasyミニキットで提供される)によって微細塊を溶解することによってRNAの収率を最大化する。
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「d14MM」と呼ばれる。
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「d14CS」と呼ばれる。
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「d14Pel」と呼ばれる。
2)上清を吸引し、捨てる。補完剤(Lonza,Basel,Switzerland,Poietics Single−Quots,カタログ番号PT−4121)を添加するhMSC Chondro BulletKit(PT−3925)から成る軟骨形成用不完全培地の添加によって細胞を洗浄する。補完剤:デキサメタゾン(PT−4130G)、アスコルビン酸塩(PT−4131G)、ITS+補完剤(4113G)、ピルビン酸塩(4114G)、プロリン(4115G)、ゲンタマイシン(4505G)、グルタミン(PT−4140G)を加えて軟骨形成用不完全培地を調製する。
3)細胞を室温にて150gで遠心し、上清を吸引し、7.5×105個の細胞当たり1.0mlの軟骨形成用不完全培地に細胞を再浮遊し(もう一度)、150×gで5分間遠心する。上清を吸引し、捨てる。若干の改変と共に、Lonzaによって記載されたような軟骨形成培養プロトコールに従う(以下に記述するように)。
4)ml当たり5.0×105個の細胞の濃度に細胞ペレットを軟骨形成用不完全培地に再浮遊させる。軟骨形成用不完全培地はLonza不完全培地+TGFβ3(Lonza、PT−4124)から成る。1mg/mlのBSAを含有する無菌の4mMのHClの添加によって、無菌の凍結乾燥したTGFβ3を20μg/mlの濃度に再構築し、等分した後−80℃で保存する。軟骨形成用不完全培地の各2mlについて1μlのTGFβ3の添加(TGFβ3の最終濃度は10ng/ml)によって使用直前に軟骨形成用不完全培地を調製する。
5)細胞浮遊液の0.5ml(2.5×105個の細胞)のアリコートを無菌の15mlポリプロピレン培養チューブに入れる。室温にて150×gで5分間、細胞を遠心する。
6)遠心に続いてチューブのフタを半回転緩め、ガス交換を可能にする。10%CO2及び5%O2にて37℃の加湿雰囲気にチューブを入れる。24時間ペレットをかき回さない。
7)無菌の1〜200μlのピペットチップによって古い培地を吸引し、各チューブに0.5mlの新しく調製した軟骨形成用完全培地を加えることによって各チューブの培地を完全に置き換えることにより、細胞ペレットに2〜3日ごとに養分を与える。
8)培地を置き換え、ペレットが自由に浮いていることを確認した後、フタを緩め、チューブをインキュベータに戻す。
9)軟骨形成用培地にて種々の時点の後、ペレットを回収し、中性の緩衝化ホルマリンによる固定によって組織学用に調製し、及び/又はペレットを合わせ、RNeasyミニキット(MD,Germantown,Qiagen,カタログ番号74104)を用いたRNA抽出用に調製する。
以下の分化プロトコールは本明細書で記載されるマイクロアレイ表にて単に「d14アルギン酸」と呼ばれる。
本明細書に記載されるようなマイクロアレイ又はqPCRによって軟骨細胞の遺伝子発現をアッセイしてもよい。qPCRプライマー配列は当該技術で既知の手段で選択してもよく、非限定の例証として、以下であってもよい。
軟骨関連のプロテオグリカンの検出では、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片のサフラニンOによる染色の周知の技法が一般に使用されるが、それは、ムチン、肥満細胞顆粒、及びおそらくそのほかの細胞種におけるそのほかの物質も染色するので、アッセイは軟骨に絶対に特異的であるわけではない。軟骨とムチンが橙色〜赤色に染色され、核が黒く染色され、背景が緑色に染色されるプロトコールの非限定例は、ホルマリン固定した細胞の微細塊、ペレット又は類似の凝集体を使用する。使用される試薬には、Weigertの鉄ヘマトキシリン溶液:その中では、95%アルコール100ml中の1グラムのヘマトキシリンから構成されるストック溶液A;蒸留水95mlと濃塩酸1.0mlで希釈した29%塩化第二鉄水溶液4mlで構成されるストック溶液B;等量のストック溶液AとBで構成され、4週間以内に使用されるWeigertの鉄ヘマトキシリン使用液;1000mlの蒸留水中の0.01グラムのFastGreen、FCF、C.I.42053で構成される0.001%FastGreen(FCF)溶液;99mlの蒸留水中1.0mlの氷酢酸で構成される1%酢酸溶液;及び100mlの蒸留水中0.1グラムのサフラニンO、C.I.50240で構成される0.1%サフラニンO溶液が含まれる。試料を脱パラフィンし、蒸留水で水和する。Weigertの鉄ヘマトキシリン使用液でそれらを10分間染色し、次いで流水で10分間洗浄し、FastGreen(FCF)溶液で5分間染色し、10〜15秒間以下で1%酢酸溶液にて迅速にすすぎ、0.1%サフラニンO溶液で5分間染色し、それぞれ2回交換し、それぞれ2分間、95%エチルアルコール、無水アルコール及びキシレンで脱水し、透徹し、樹脂媒体を用いて標本にし、上述のような染色について画像解析する。軟骨関連のプロテオグリカンは暗赤色〜橙色に染まる。
1,2,3,4,5又は好ましくは10を超える多様な分化条件にて、<21、又は好ましくは>21のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69又は70の倍増(細胞のクローン性増殖の29倍増前は、限定された量でしか利用できず、70倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので)における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。分化条件には、「微細塊分化」、「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として記載されるものが含まれてもよい。
10、20、30、40、50又は好ましくは100を超える多様な分化条件(たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2006年11月21日に出願された米国特許出願、出願番号11/604,047;及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630に記載された分化条件を参照)にて、<21、又は好ましくは>21のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69又は70の倍増(細胞のクローン性増殖の29倍増前は、限定された量でしか利用できず、70倍増を超えると細胞は一般に老化に近づくので)における本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を同時にスクリーニングする。前記分化条件にて、1〜6週間、最も好ましくは4週間、細胞を培養する。
<21、又は好ましくは>21のクローン性又はオリゴクローン性増殖の倍増のいずれか、最も好ましくはクローン性増殖の29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69又は70の倍増にて上述されたものを含むが、これらに限定されない本発明のクローン性、オリゴクローン性、又はプールしたクローン性又はプールしたオリゴクローン性の胚性前駆細胞株を12ウェル培養プレートに入れ、各ウェルは250,000細胞の10微細塊(すなわち、ウェル当たり250万個の細胞)を有する。或いは、ほかの培養条件(たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2006年11月21日に出願された米国特許出願、出願番号11/604,047;及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630に記載されたような;表IIIで列記された培養培地の組み合わせに暴露された同一数の細胞を用いた表II及びこれらの出願の表IVで列記された補完された因子を参照)によって細胞を処理する。前記分化条件にて、1〜6週間、最も好ましくは4週間、細胞を培養する。
動物の細胞及び組織の培養に関して開示される方法は、たとえば、変形性関節症のような関節炎、椎間組織の変性、一時的な下顎関節の疾患、鼻、外耳、下顎関節、気管、輪状軟骨、胸骨、又はそのほかの滑膜関節、たとえば、肩、肘、手首、指及び体重がかかる関節、たとえば、尻、膝、足首及び足指を含むが、これらに限定されない整形外科症状の治療に有用なヒト細胞及び細胞に由来する製剤を生成することに限定されない、哺乳類及びヒトの細胞療法において細胞又はその前駆細胞を生成することに有用である。
明瞭性のために別々の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態における組み合わせにて提供されてもよいことが十分に理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴はまた別々に又は好適な下位の組み合わせで提供されてもよい。対象となる胚性軟骨細胞前駆細胞の遺伝子発現パターンに関する実施形態の組み合わせはすべて本発明によって包含され、それぞれ及びあらゆる組み合わせが個々に且つ明白に開示されたかのように本明細書で開示される。従って、記載されるマーカーを示す胚性軟骨細胞前駆細胞が本明細書で提供される。
本発明によって提供されるのはまた、本明細書で記載されるような種々の応用で使用するために設計されたシステム及びキットである。
本出願で記載される細胞株は、ブタペスト条約のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(「ATCC」:米国、VA、20108,Manassas,P.O.Box1549)に寄託されている。細胞株4D20.8(ACTC84としても知られる)は、継代11で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−10231を有する。細胞株SM30(ACTC256としても知られる)は、継代12で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−10232を有する。細胞株7SMOO32(ACTC278としても知られる)は、継代12で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−10233を有する。細胞株E15(ACTC98としても知られる)は、継代20で2009年9月15日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−10341を有する。細胞株MEL2(ACTC268としても知られる)は、継代22で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−11150を有する。細胞株SK11(ACTC250としても知られる)は、継代13で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−11152を有する。細胞株7PEND24(ACTC283としても知られる)は、継代11で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受入番号PTA−11149を有する。
以下の実施例は、本発明を如何に作製し、使用するかの完全な開示と記載を当業者に提供できるように提起されるものであって、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された実験すべて、又はそれのみであることを表すことを意図するものではない。使用された数(たとえば、量、温度等)について精度を確保するように尽力したが、一部の実験の誤差及び偏差は説明されるべきである。特に指示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近い。
軟骨形成分化条件の低処理能力選抜におけるヒトのクローン性胚性前駆細胞株のマイクロアレイ解析
細胞株、10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2及びZ3を「微細塊分化プロトコール1」として上述のように選抜し、サブセットを「ペレット分化」及び「アルギン酸ビーズ分化」として分化させた。手短には、対照の細胞種:継代3のヒト骨髄間葉幹細胞(Lonza)、脂肪細胞幹細胞(ASC)、歯髄幹細胞(DPSC)、***皮膚線維芽細胞(XgeneFB)、及び正常ヒト関節軟骨細胞(NHAC)を選抜に含めた。本明細書で記載されるように、同様にそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2006年11月21日に出願された米国特許出願、出願番号11/604,047;及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630に記載されたように、選抜される細胞株並びに上述の対照の細胞種を5%の外気酸素を伴ったインキュベータにて、増殖停止又は微細塊及びペレットの軟骨形成条件にて同期化した。例証として、静止における同期化を誘導する条件については、通常製造元に推奨された濃度で補完剤を伴い、完全キットとして(カタログ番号C−22022)として販売されているPromocell内皮MV2培地にて細胞が集密に達するまで、細胞株7PEND24(ACTC283)を培養した。集密に達した際、培地を取り除き、元々の補完剤ミックスの10%を伴った同一のPromocell培地に置き換えた。3日後、培地を吸引し、さらに2日間(合計静止条件で5日間)、同一培地(すなわち、10%の通常補完剤)で置き換えた。細胞株4D20.8(ACTC84)の場合、細胞が集密に達するまで、20%FCSを補完したDMEM培地で細胞を培養した。集密に達すると、培地を取り出し、元々の濃度の10%(すなわち、2%FCS)を伴った同一のDMEM培地に置き換えた。3日後、培地を吸引し、同一の培地(すなわち、2%FCSを伴ったDMEM)でさらに2日間(すなわち、合計で静止条件の5日間)、置き換え、又はペレット若しくは微細塊として軟骨形成条件にて12日間若しくは14日間分化させた。本明細書で記載されるようにRNAを回収し、qPCRによってアッセイし、本明細書で記載されるように遺伝子発現解析のためにIlluminaマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。骨髄の間葉幹細胞は、軟骨細胞遺伝子発現の顕著な上方調節と共にペレット及び微細塊双方の軟骨形成条件に反応した。軟骨細胞の分化マーカーの例には、軟骨に特異的ではないが、軟骨形成中に上方調節されるMGP及びPENK、軟骨の発生に相対的に特異的であるCOL2A1、MATN4、EPYC、COL9A2及びLECT1が挙げられる。細胞株4D20.8における未分化条件と14日目の微細塊条件における遺伝子発現の比較は、>479倍のMGPの発現、>10倍のMATN4の発現、>369倍のPENKの発現、>60倍のCOL2A1の発現、>42倍のEPYCの発現、>25倍のCOL9A2の発現、>24倍のLECT1の発現を示し、同様に、MSCでは、分化は、5倍のMGPの発現(4D20.8とは異なって、未分化のMSCは発現の相対的に高いベースレベルを示したが)、20倍のMATN4の発現、6倍のPENKの発現(再び、未分化の4D20.8では未発現であるのに比べて未分化のMSCでは相対的に高いレベル)、613倍のCOL2A1の発現、48倍のEPYCの発現、117倍のCOL9A2の発現、34倍のLECT1の発現の上方調節を示した。それに対して、皮膚線維芽細胞は、37倍のMGPの発現の上方調節を示したが、実験処理の前後でCOL2A1、EPYC、LECT1又はCOL9A2の発現は示されなかった。従って、皮膚線維芽細胞とは異なって、4D20.8は、MSCとは同一ではないが、MSCと類似の多様な軟骨特異的遺伝子を発現した。24,526個の評価した遺伝子の中で、265個の遺伝子はMSCの分化の間に発現の上昇を示し、191は4D20.8の分化の間に発現の上昇を示したが、共通するのはたった47個の遺伝子だった。従って、細胞株4D20.8は、LHX8の発現を示さないが、代わりにたとえば、HOXA10、HOXB7、HOXC8及びHOXD13のような尾部HOX遺伝子、及び下肢に特徴的なPITX1の発現を示したMSCとは異なって、口蓋及び下顎の部位特異的LHX8ホメオボックス遺伝子の発現を伴い、HOX又はPITX1を発現しないMSCとは識別可能な細胞株を代表する。細胞株7PRND24も低レベルで軟骨形成の誘導を示した。
hMSCで以前明らかにしたように、外因性細胞の投与を用いて、ヒツジにおける中央若しくは外側の半月板切除又はACL切除の後の関節の軟骨及び半月板の傷害と修復を判定することができる(双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられるGhosh, et al., Clin. Orthop., Vol. 252, pgs. 101-113, 1990; Little, et al., J. Rheumatol., Vol. 11, pgs. 2199-2209, 1997)。hESに由来する細胞に対するヒツジにおける寛容は、hES由来細胞の出生前移植によって達成される。ヘクステンド、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン又はそのほかの足場/マトリクス(たとえば、脱細胞化した半月板)を含む1以上の医薬キャリアと共に、たとえば、7PEND24、7SMOO32、SM30、E15、4D20.8のようなhES−、iPS−に由来する胚性前駆細胞、並びにhMSC及びHAの対照の漸増用量を寛容化したヒツジの関節に注入する。傷害の修復速度を漸増投与量に反応して時間をかけて測定する。ヒト成人MSC及び媒体対照と比べた再注入、奇形腫の形成、及び効率について移植した細胞を組織学的に評価する。
長い継代にわたって胚性軟骨細胞前駆細胞の安定性をアッセイすること
我々が30の倍増を超えて成人の骨髄MSCを継代するのは不可能だったが、我々は、4D20.8と称する本発明の細胞株を33回の継代を超えて培養した。我々は、COL2A1の発現によって測定され、継代12と継代33にて本明細書で記載されるようなqPCRによってアッセイされる軟骨を誘導するその細胞の能力を比較した。長い継代での細胞は並行した実験におけるMSCのそれとは異なって、匹敵するレベルのCOL2A1を産生した。各継代が1.5の倍増である継代12での使用細胞集合からさらなる継代21以上に細胞を規模拡大する能力は、使用細胞集団よりおよそ52倍増又は250多い細胞に相当する。従って、細胞は、多数の患者における同種移植について商業的に規模拡大されるその可能性において独特である。
本発明の選択された軟骨形成性細胞株におけるCD抗原を認識する抗体のスクリーニング
本発明の軟骨形成性細胞株をCD抗原に対する抗体のライブラリに対して中程度の処理能力法にてアッセイし、陽性細胞の比率を以下(表2)に示すが、それらは、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2006年11月21日に出願された米国特許出願、出願番号11/604,047;及び「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630に記載された予測された抗原の一般的な有用性を明らかにしている。しかしながら、例外も特定することができる。特に、抗原CD56(NCAM1)は細胞株4D20.8の80%に結合するが、調べたほかの細胞株の極一部しか結合しない。このことは、マイクロアレイのデータにおけるNCAM1(Illuminaプローブ、ID4040725)の相対的に高いレベルと一致する。従って、CD56に対する抗体は、本明細書で記載される細胞株4D20.8の遺伝子発現マーカーを持つ細胞のアフィニティ精製に有用である。
NNAT陽性軟骨形成性前駆細胞株の発見
元々クローン増殖させたのと同じ培地である20%血清を補完したDMEM培地にて連続継代を行うことにとって継代17での細胞株E15(ACTC98としても知られる)を増殖させた(参照によって本明細書に組み入れられるWestら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308かの補完表Iを参照)。継代14と17にて、細胞がいったん集密に達すると培地を取り除き、10倍低下した血清(2%)を補完した新鮮なDMEMによって培地を置き換えることによって細胞を静止期に同期化した。3日後、培地を吸引し、2%のFCSを補完した新鮮なDMEMでさらに2日間置き換えた。同一継代の細胞を微細塊条件及びペレット条件の双方でプレート培養し、本明細書で記載されるように軟骨形成を誘導した。微細塊培養の14日後、同一条件下で培養した細胞株E15と正常ヒト関節軟骨細胞(NHAC)対照を特異的マーカー(以下の実施例6を参照)の発現についてqPCRによってアッセイした。E15は、NHAC対照よりも>10,000多いCOL2A1のmRNAを発現することが認められた。14日目の微細塊を固定し、上述のようにサフラニンOで染色した。試料は、軟骨プロテオグリカンを強く染色した。細胞をさらに特徴付けるために、本明細書で記載されるように、RNAをIlluminaマイクロアッセイとハイブリッド形成させた。
qPCRによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2及びZ3と名付けられた本発明の細胞株は、hES由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを10倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらをインビトロで>21の倍増でクローン増殖させた。インビトロで軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように14日間、軟骨形成を誘導した。これら2つの条件のそれぞれからのRNAをcDNAに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子(すなわち、COL2A1、COMP、CILP、SCX、CRTL1、SOX9、BARX2)の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはInvitrogenから入手した。cDNAのRNA同等物30ng,プライマー当たり0.4μM、超純度蒸留水(Invitrogen)から成り、全反応容量25μlでAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを組み入れる12.5μlのPowerSYBR GreenPCR Masterミックス(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、カタログ番号4367659)で1:1に希釈した試験用試料を標準の光学96穴反応プレート(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、PN4306737)にて調製した。SDSv1.2ソフトウエアを採用するApplied Biosystems7500リアルタイムPCR方式を用いてリアルタイムqPCRを実行した。増幅条件は、50℃にて2分間(段階1)、95℃で10分間(段階2)、95℃で15秒間、次いで60℃で1分間を40サイクル(段階3)、95℃で15秒間、60℃で1分間、95℃で15秒間の解離段階(段階4)にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のCt値を3つのハウスキーピング遺伝子(GAPD、RPS10及びGUSB)のCt値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞(Lonza)及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。
ヒト脂肪細胞(ACS)、ヒト骨髄間葉幹細胞(MSC)、ヒト成人歯髄幹細胞(DPSC)、培養されたヒト***線維芽細胞(Fibro)、COL2A1の誘導が可能ではないクローン性hEP細胞株7SMOO7、並びにそれぞれCOL2A1の発現を誘導することが可能であるヒト胚性前駆細胞SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2及びSK11における遺伝子発現マーカーの比較。数字はRFU値である。陰性の発現は影付きボックスで示す(ND平均値はデータなし)。
軟骨形成の組織学的な及び免疫化学的な確認
たとえば、7PEND24、7SMOO32、MEL2、SM30、E15、SK11及び4D20.8のようなCOL2A1の中程度から堅実な誘導を示すような上記実施例6における低処理能力選抜で発見されたもののような本発明の細胞株、並びにたとえば、MSC、脂肪細胞幹細胞、及びそのほかの細胞株、たとえば、***皮膚線維芽細胞、Z11、歯髄幹細胞、7SMOO7、E44などのような対照を、1、8、14及び21日間を含む様々な時間、本明細書で記載されるような微細塊及びペレットの軟骨形成条件を経験させ、及びSCIDマウスの腎臓被膜に移動させた場合の前記ペレットのサブセットを経験させて、長時間の分化を促進した。前記微細塊とペレットをホルマリンで固定し、H&E染色、上述のようなプロテオグリカンを染色するサフラニンOによって、及び特異抗体と対照としての非特異抗体を用いた免疫反応性COL2A1について組織学的に解析した。サフラニンOに対する強い反応性及び/又はCOL2A1免疫反応性が細胞株4D20.8の14日目と21日目のペレットで認められ、サフラニンOの強い染色が細胞株E15の14日目の微細塊で認められた。驚くべきことに、細胞株RAD20.6は、14日目のペレットでCOL2A1に対する免疫反応性及びサフラニンO染色を示した。図2は、ペレットとしてすべて21日目の分化にて継代6でのMSCと比較した継代14での細胞株4D20.8と比較した脂肪組織幹細胞のサフラニンO染色及び細胞株4D20.8とMSCの14日目ペレットにおけるアイソタイプ対照を伴った免疫染色の例を示す。
関節軟骨を修復する能力について以下のように本発明の細胞株を調べた:提供されたヒト関節組織を外植した。細胞株SM30、E15、及び4D20.8の5×105個の細胞を10%FBS/DMEM/F12にて15mlの円錐チューブ中で400×gにて5分間遠心し、一晩インキュベートして細胞の凝集体を生成した。Arthrex Single Use OATSシステム(Naples、Fl)によって6mm径の円筒状片を関節外植片からくり抜いた。外科用掻爬器を用いて関節表面におよそ2mmの大きさの部分的な厚み欠損を作った。SM30、E15、及び4D20.8の細胞凝集体、又はヒト一次関節軟骨細胞、hES由来の軟骨細胞の塊培養、若しくは脂肪細胞由来の幹細胞(hASC)から成る対照によって欠損を満たした。TGFβ3の存在下又は非存在下で10%FBS/DMEM/F12にて関節外植片をインキュベートした。4週間後、外植片を固定し、パラフィン包埋し、切片にし、スコア化のためにサフラニンOで染色した。クローン性の前駆細胞株SM30、E15、及び4D20.8を用いた選択されたクローン性細胞株における遺伝子発現レベル及びマトリクスの染色は、不均質なhESC及びASCより高く、hACで見られるレベルに近づいた。軟骨外植片では、修復組織は関節軟骨に類似し、周辺の宿主組織と上手く統合した。
人工的なマトリクスにて軟骨形成を経験する能力について、軟骨形成が可能である本発明の細胞株を調べた。細胞株4D20.8及び7PEND24の細胞を増殖させ、低速での遠心によってペレットにし、NaCl(155mM)で洗浄し、再び遠心し、1.2%アルギン酸(Lonza)にて20×106でペレットを再浮遊させた。22gの針を介して細胞浮遊液を1mlのシリンジに引き入れ、CaCl2槽(102mM)に一滴ずつ分配した。ゲル化は即座である。ビーズをNaCl(155mM)で3〜5回洗浄し、次いで軟骨形成用培地(TGFを含まず)で1回洗浄し、その後軟骨形成用培地に浸漬した。ビーズを6穴プレートの複数のウェルに入れ、1週間に3日、14日間養分を与えた。次いでビーズをNaClで複数回洗浄し、その後クエン酸ナトリウム(55mM)に20分間暴露することによって脱重合した。遠心の後、RLT(Qiagen)によって細胞ペレットを溶解し、QiaShredderを用いた粉砕工程を行って収率を改善したのに続いて、RNeasyマイクロキット(Qiagen)を用いて全RNAを抽出した。上記のようにqPCRによってCOL2A1の発現を測定した。細胞株4D20.8の場合、正常な微細塊条件に比べてCOL2A1の発現で51倍の上昇があった。細胞株7SMOO32の場合、正常な微細塊条件に比べてRGD−アルギン酸を用いたCOL2A1の発現で2.88倍の上昇があった。細胞株SK11の場合、正常な微細塊条件に比べてアルギン酸を用いたCOL2A1の発現で179倍の上昇があった。Lonzaアルギン酸に加えて、RGD結合したアルギン酸(NovaMatrix)ビーズも調製した。7PEND24の場合、微細塊条件ではCOL2A1を弱くしか誘導しないが、アルギン酸ビーズでは、微細塊条件に比べて45倍の上昇を示した。RGD−アルギン酸複合体に被包された7PEND24は、微細塊条件上で高いCOL2A1の発現を示さなかったが、正常なヒト関節軟骨細胞(NHAC)に比べて17倍高いCOL2A1の発現を示した。同様に、微細塊条件で軟骨形成性が弱かった7SMOO32は、RGD−アルギン酸ビーズではCOL2A1を堅実に発現した。
Illuminaのプラットホームを用いて、RGDアルギン酸は細胞株4D20.8にてCOL2A1の印象的な449倍の上方調節を示した。
インビトロの連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び14の微細塊及び上述のような(実施例9)アルギン酸ビーズにて、定期的にRNAを単離しながら、細胞株4D20.8、E15、SM30及びhbmMSCを連続継代した。アルギン酸ビーズにてP12と比較した継代33の細胞株4D20.8はほぼ同一レベルのCOL2A1を示したが、hbmMSCは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。
アルギン酸に被包された軟骨形成性hEPの生体内s.c.埋め込み
hES細胞前駆細胞株、4D20.8、E15、SM30、7PEND24、MEL2及び対照のヒト骨髄MSC、及びx−遺伝子皮膚線維芽細胞を増やし、剥離し、ペレットにし、20×106個の細胞/mlでアルギン酸調製物(RGDペプチド結合アルギン酸を伴ったLonza1.2%又はNovaMatrix1.5%)に再浮遊させた。ゲル化と細胞の被包のために、1mlの無菌シリンジを用い、シリンジに負荷した後、アルギン酸浮遊液を22Gの針を介して一滴ずつCaCl2(102mM)溶液に排出し、又は予めCaCl2で濡らした大腿形状のシリコーン金型に入れ、次いで完全で迅速なゲル化のために102mMのCaCl2で覆った。
Claims (21)
- 軟骨を生成する医薬の製造における、
(a)軟骨を生成することができるクローン性に精製した胚性前駆細胞株であって、SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、CD74、CD90、CD166、ITGA2、KCNK2及びそれらの組み合わせから成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と、
(b)薬学上許容可能なキャリア
を含む胚性前駆細胞株組成物の使用。 - 胚性前駆細胞株がCD74の発現について陰性である請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株がさらに、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項2の使用。
- 胚性前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株組成物が軟骨の損傷を有する対象者に投与される請求項1の使用。
- 軟骨の損傷が関節軟骨の損傷である請求項5の使用。
- 薬学上許容可能なキャリアが、ヘタスターチ;ヒアルロナン及びそのポリマー;コンドロイチン硫酸;I型コラーゲン;II型コラーゲン;III型コラーゲン;ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー;アルギン酸;アガロース;ポロキサマー;フィブリン;キチン;及びキトサン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される組成物を含む請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株が、対象者への投与に先立って軟骨細胞を誘導する条件下で培養される請求項5の使用。
- 損傷された軟骨を時間とともに修復する速度を測定する、請求項5の使用。
- インビトロで軟骨を産生する方法であって、軟骨産生条件下にて、SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、かつ、CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である、クローン性に精製した胚性前駆細胞株を培養することを含む方法。
- 胚性前駆細胞株が、CD74の発現について陰性である請求項10の方法。
- 胚性前駆細胞株がさらに、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項11の方法。
- 胚性前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項12の方法。
- 軟骨産生条件が、軟骨細胞培養条件;胚性前駆細胞株を合成マトリクス又は生体吸収性不動化媒体に含浸させること;及び胚性前駆細胞株を成形構造に入れることから成る群の1以上から選択される請求項10の方法。
- 方法がさらに、胚性前駆細胞株によって産生された軟骨をヒトを除く対象に移植することを含む請求項10の方法。
- キットであって、
(a)SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と
(b)前記細胞株から軟骨産生を誘導する試薬
を含むキット。 - 軟骨産生を誘導する試薬が軟骨細胞培養試薬を含む請求項16のキット。
- SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるクローン性に精製した軟骨細胞前駆細胞株を含む軟骨形成組成物。
- CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項18の組成物。
- 前記軟骨細胞前駆細胞株が、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項18の組成物。
- 軟骨細胞前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項18の組成物。
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