CN105838799A - Kcnk2基因的新用途 - Google Patents

Kcnk2基因的新用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105838799A
CN105838799A CN201610284031.3A CN201610284031A CN105838799A CN 105838799 A CN105838799 A CN 105838799A CN 201610284031 A CN201610284031 A CN 201610284031A CN 105838799 A CN105838799 A CN 105838799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kcnk2
gene
application
thyroid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610284031.3A
Other languages
English (en)
Inventor
李曙光
杨承刚
边洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201610284031.3A priority Critical patent/CN105838799A/zh
Publication of CN105838799A publication Critical patent/CN105838799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Abstract

本发明涉及KCNK2基因的新用途，具体涉及KCNK2基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治***状甲状腺癌中的应用。为了能更精确诊断甲状腺癌，避免漏诊、误诊，发明人基于测序和数据分析筛选肿瘤分子标志物，结果表明，本发明KCNK2基因可用于制备甲状腺***状癌辅助诊疗制剂，具有很好的临床应用价值。

Description

KCNK2基因的新用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的本发明涉及KCNK2基因的新用途，更具体涉及KCNK2基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治***状甲状腺癌中的应用。
背景技术
***状癌是临床上常见的甲状腺癌的一种，约占所有甲状腺癌的90％。诊断甲状腺癌检查主要依靠超声检查，是甲状腺癌原发病灶诊断最有价值的方法之一。超声检查亦有一定的误诊率，临床医师要了解特殊类型甲状腺癌的超声表现，如囊性甲状腺***状癌、弥漫性甲状腺***状癌，临床极易与甲状腺囊肿或淋巴细胞性甲状腺炎相混淆。细针针吸细胞学活检(FNA)是评估甲状腺结节最精确且性价比最高的方法。不过也存在漏诊，FNA的漏诊原因时将其归纳为：穿刺针太细，细胞学检查的标本量不足；与甲状腺肿瘤大小及内部组织情况有关，甲状腺肿瘤体积越小，定位越困难，穿刺细胞学检查诊断率越低，特别对于内部有液化的甲状腺肿瘤，穿刺针穿入囊内后只抽出液体，无组织细胞，对诊断无意义；细胞学诊断对于细胞形态改变突出的疾病最能发挥作用，但对以组织结构改变为主的病变则有困难。
如何精确诊断甲状腺癌，避免漏诊、误诊的现象，是目前临床中亟待解决的问题。分子生物学的兴起，提供了一个新的解决途径，通过分子检测辅助诊断甲状腺癌，以达到精准诊疗的目的。鉴于此，发明人采用先进的HiSeq 2500对甲状腺***状癌(PTC)病例样本和健康人群进行测序，并对获得的数据进行深加工，筛选出差异显著表达的KCNK2基因。为了验证KCNK2与甲状腺***状癌的关系，又进行了定量实验及慢病毒载体构建及功能验证，结果表明KCNK2可用于制备甲状腺***状癌辅助诊疗制剂，本研究为临床甲状腺***状癌的辅助诊疗提供基础，具有很好的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供检测KCNK2基因或蛋白在制备甲状腺癌诊断制剂中的应用。
进一步，甲状腺癌为甲状腺***状癌。
为实现上述目的，发明通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到基因KCNK2，进而通过RT-PCR验证了KCNK2与甲状腺癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
进一步，甲状腺的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测甲状腺癌组织中KCNK2基因的表达。
用于荧光定量PCR方法检测甲状腺癌中KCNK2基因的产品含有一对特异性扩增KCNK2基因的引物；基因芯片包括与KCNK2基因的核酸序列杂交的探针。
优选的，荧光定量PCR方法检测基因KCNK2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
进一步，检测KCNK2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的KCNK2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被KCNK2单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，检测KCNK2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的KCNK2单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗KCNK2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测***的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样 法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
进一步，甲状腺癌的诊疗制剂包括用免疫方法检测甲状腺***状癌中KCNK2蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测甲状腺***状癌中KCNK2蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。
常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
本发明的目的在于提供一种检测甲状腺***状癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测基因KCNK2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ ID NO.4。
本发明目的是提供了一种甲状腺***状癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测KCNK2蛋白。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测甲状腺***状癌的基因芯片，基因芯片包括与KCNK2基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供促进KCNK2基因或蛋白表达试剂在制备抗甲状腺癌制剂中的应用。
进一步，甲状腺癌为甲状腺***状癌。
进一步，抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的增殖。
进一步，抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的迁移。
优选的，采用构建过表达载体等方法促进KCNK2基因或蛋白表达。
本发明的目的在于提供一种抗甲状腺***状癌制剂，抗甲状腺***状癌制剂促进甲状腺***状癌细胞中KCNK2基因的表达。
附图说明
图1是KCNK2基因在癌组织及正常组织中相对表达量图(KCNK2mRNA相对表达情况)
图2是细胞增殖曲线图(两组细胞增殖曲线)
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1病例的收集
取5例甲状腺***状癌病例样本及8例健康对照组织。病例样本为术中冰冻快速病理以及术后石蜡慢病理确认为甲状腺***状癌的患者，选择经甲功八项和甲状腺彩超检查确认的。
实施例2高通量测序及分析
使用Reagent提取样本RNA，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
采用Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台进行高通量转录组深度测序，测序后运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量情况，PCR duplication含量情况，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析。最后，综合以上数据分析结果，结合检索文献情况，本发明选取了在甲状腺***状癌组下调表达显著的基因KCNK2作为研究对象。
实施例3甲状腺***状癌组及对照组KCNK2基因表达情况
一、材料和方法
1、材料
取2013年5月到2015年11月期间在医院因甲状腺肿瘤住院手术，选取45例甲状腺***状癌组织及18例健康对照组织，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1甲状腺***状癌组及对照组总RNA的提取
使用Reagent提取样本RNA，操作参考说明书，具体如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温静置5min；
②每毫升Trizol加0.2ml氯仿，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；
③4℃12000rpm高速离心15min后EP管分3层，吸取上层水相到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，充分颠倒混匀，冰上静置10min；
④4℃12000rpm高速离10min后小心弃掉上清液，加入75％DEPC乙醇洗沉淀，振荡混合，4℃12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入20-40微升DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
2.2一步法Real-Time PCR
2.2.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。
2.2.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001017424，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
KCNK2基因引物：
5’-ATTCGCATCATCTCAACAAT-3’(SEQ ID NO.1)
5’-ACTCCAGCCTTCTATGTG-3’(SEQ ID NO.2)
扩增长度为96bp。
GAPDH基因引物：
5’-TCTCTGATTTGGTCGTAT-3’(SEQ ID NO.3)
5’-TTGATGGCAACAATATCC-3’(SEQ ID NO.4)
扩增长度为78bp。
UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号：CW2624S)操作步骤：
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step Buffer、UltraSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.反应体系：
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4.RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为两步法)，反转录45℃10min；预变性96℃5min；30个循环(变性95℃10s，退火和延伸60℃45s)；反应结束后4℃恒温。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较KCNK2基因在甲状腺***状癌组和正常组中的表达水平。结果显示(具体见图1)：KCNK2在癌组织中的表达水平显著低于对照组，约为对照组的五分之一，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析KCNK2在甲状腺***状癌组织中低表达的结果。
实施例4构建重组慢病毒表达载体
一、材料
TPC-1细胞株、293T细胞株购自上海慧颖生物科技有限公司。
二、实验方法
1.重组质粒的构建
针对基因KCNK2(NM_001017424)的序列，设计扩增目的基因的引物序列，引物含有交换配对碱基以及AgeⅠ酶切位点。进行PCR扩增，纯化PCR产物，将PCR产物交换入线性表达载体后进行重组质粒的构建，加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1:3。通过T4DNA连接酶将经双酶切线性化的慢病毒空载体GV208空载体和退火形成的双链DNA片段在适当的缓冲液中进行连接反应，16℃过夜连接，获得的重组慢病毒载体命名为GV208- KCNK2。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态中，转化后涂布在AMP抗性的LB培养基上，37℃倒置培养箱中孵育，挑取长出的菌落进行PCR鉴定。使用慢病毒载体的通用引物进行菌落PCR鉴定转化子以及测序鉴定。
2.慢病毒载体包装
细胞复苏
迅速取出放于液氮罐中TPC-1、293T细胞的冻存管，放入37℃恒温水浴锅中，快速摇动，在两分钟内使管内冻存液完全融化。将两只冻存管放入离心机中，1000rpm/min离心3min后，快速转移至细胞室，进行酒精消毒后，在无菌超净台中吸弃旧液，分别加入含血清的RPMI-1640，DMEM培养基各1ml，轻轻吹打细胞。转入50T培养瓶，然后加入适量的培养液进行培养。第二天观察细胞状态并进行换液。
细胞培养
TPC-1、293T细胞分别用含10％胎牛血清的RPM1640培养液和DMEM培养液，大小为50ml的培养瓶中进行培养，并放置于条件为5％的CO2浓度、恒温37℃的培养箱中培养，两到三天后进行换液。
细胞冻存
当细胞处于对数生长期并铺满瓶壁达80％-90％时，用PBS洗涤三次，然后加入适量胰酶进行消化，待细胞出现轻微脱落时，立即加入lml培养液终止消化，之后轻轻吹打细胞直至吹散成单细胞悬液，然后转移至离心管中，800rpm/min离心5min，吸弃旧液，加入刚配制的细胞冻存液，轻轻吹打细胞直至混匀，分装入冻存管中进行封口、标记。冻存时注意缓慢降温：4℃条件下30min，转入-20℃条件下2h，然后在-80℃条件下过夜。第二天转入液氮罐中长期保存。
DNA载体共转染293丁细胞
(1)转染前一天，将对数生长期的293T细胞用PBS洗两遍，然后加入胰酶进行消化，镜下细胞计数后用含10％FBS的培养基调整细胞浓度至6×105个/ml，转移至细胞培养皿中，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。当观察到细胞密度达到80％左右时可用于转染。
(2)当细胞达到转染要求时，需提前2h将细胞培养基更换为无血清无抗生素培养基。
(3)进行转染时，向一无菌Ep管中加入所制备的GV208-KCNK2载体20ug，pHelperl.0载体15ug，pHelper2.0载体l0ug的DNA链接液，与相同体积的Opti-MEM培养基混合，调整总体积至2.5ml，混合混匀，室温孵育5min。
(4)向一无菌离心管中加入100ug Lipofeetamine2000，与2.4m1Opti-MEM培养基混合后轻轻进行混匀，室温下孵育5min。
(5)接下来要在5分钟之内将(3)和(4)中的两管液体轻轻地进行混合均匀，然后室温孵20min。
(6)将(5)中形成的DNA与Lipofeetamine2000混合液加入培养有293T细胞的培养皿中，将混合液轻轻充分混匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(7)培养8h后倒掉培养基，向每瓶细胞加PBS进行洗涤，重复一遍，然后加入含有10％FBS的新鲜培养基25m1，在培养箱内继续培养48小时。
病毒的收获、浓缩
(1)48h后从培养箱中取出培养皿，收集上清液。
(2)将上清液在4℃，4000rpm离心l0min后，用0.45um滤器进行过滤，然后用移液器将过滤后的上清液转移至40m1超速离心管中。
(3)从离心管中吸取过滤液至过滤杯中，盖紧盖子，然后将过滤杯小心***过滤液收集管中。
(4)组合好收集管后直接置于离心机上，调整至4000rpm离心10min。
(5)离心机停止转动后，取出离心装置以及收集管，将滤过液收集杯分开。
(6)当过滤杯与收集管分开后将过滤杯倒扣在样品收集杯上，1000rpm离心2min，之后移开过滤杯，在样品收集杯上观察到的残留液体即为病毒浓缩液，分装后在-80℃低温中冰箱中保存。
病毒滴度测定
(1)测定滴度前一天，将293T细胞接种于预先准备好的96孔板，选择10个孔进行接种，使每孔细胞为4×104扩个，体积为100ul。
(2)对病毒滴度进行测定时，准备好10个无菌的Ep管，然后用移液器向各个Ep管加入90u1无血清的DMEM培养基。
(3)迅速从-80℃冰箱中取出一管GV208慢病毒原液，向准备好的第一个Ep管中加入10u1，轻轻吹打混匀，然后再向第二个Ep管中加入10u1，以此类推直至第十个Ep管。
(4)用移液器小心从每个细胞培养孔中吸掉90u1培养基，然后按1-10依次进行编号，并加入相对应号码的己稀释好的病毒溶液，确认编码无误后置于培养箱中培养24小时。
(5)24小时后向每个细胞培养孔轻轻加入100u1的完全培养基，注意不要吹起细胞。
(6)第5天时，荧光显微镜下观察各个培养孔中细胞的荧光表达情况，并对荧光细胞进行计数，根据相对应孔的稀释倍数即可计算出病毒滴度，然后进行记录比较。
3.重组质粒慢病毒载体表达效果测定
(1)准确把握好目的细胞换液时间，使进行病毒感染时细胞状态处于对数生长期。
(2)收集状态最佳的细胞并离心，然后加入含10％FBS的新鲜培养基，并接种于6孔板内，根据细胞计数情况使每孔细胞数约为5×104。
(3)根据慢病毒感染TPC-1细胞的MOI值(MOI值＝1)，计算所需要加入病毒液，用含10％FBS的培养基将每孔总体积补足至2m1，放入培养箱培养12小时后进行换液。
(4)将感染后的细胞72h后从培养箱中取出，倒置荧光显微镜下对GFP表达情况进行观察，同时与白光视野下细胞数目进行对比，估算转染效率。
(5)实验过程中还要设置不加病毒液的空白对照组和加入阴性对照病毒液的阴性对照组，并各设置三个复孔。
4.RT-PCR检测KCNK2mRNA的表达情况
(1)收集转染空载体对照和转染KCNK2的慢病毒48h后的TPC-1细胞，用Trizol分别提取各组细胞总RNA，然后，一步法Real-Time PCR，具体操作参照实施例3。
三、实验结果
重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定双重确认后，送测序公司测序，测序结果与Genbank KCNK2(NM_001017424)的序列比对，结果完全一致，表明重组质粒构建成功。
选取慢病毒载体pGV-208，pHelperl.0，pHelper2.0三质粒共同转染293T细胞，转染48h后在荧光显微镜下观察293T细胞发出的绿色荧光。对浓缩后的慢 病毒进行测定，荧光显微镜下计数各孔中发出荧光的细胞数换算得到病毒滴度约为5×108TU/ml。
通过Real-Time PCR检测到相应基因的Ct值，经计算目的基因KCNK2与内参基因GAPDH的扩增效率一致。计算各组细胞KCNK2mRNA的相对表达水平，以阴性对照组为标准化样品，其余组为该组KCNK2基因表达量相对于标准组的倍数关系，以阴性对照组为1，其余实验组与阴性对照组的比值反映KCNK2的过表达效果。经计算得知阴性对照组KCNK2mRNA的相对表达量为1，实验组为15.12，统计结果显示携带有KCNK2基因的实验组表达量明显高于阴性对照组(P<0.0001)。
实施例5KCNK2基因过表达对TPC-1细胞生物学功能的影响
一、实验方法
1.检测细胞增殖
取对数生长期的各组细胞经胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整TPC-1细胞密度为1×103个/ml。向两组各4个96孔板中的各孔中加入细胞悬液，使目的细胞数达2×103个。细胞贴壁后，取0h，24h，48h，72h后时间段，超净台中向每孔中加入10微升CCK-8溶液，细胞培养箱内继续孵育2h。设定酶联免疫检测仪的波长为450nm，测定各个孔吸光度(OD值)。以OD值为纵坐标，时间点为横坐标，绘制实验组和阴性对照组细胞的生长曲线，对两组细胞的增殖情况进行对比统计。
2.Transwe ll细胞迁移实验
(1)将己分组的各组细胞培养24小时后，进行消化、离心收集，在对细胞进行计数后用无血清的培养液稀释细胞，使细胞数为2×105个，然后吸取200微升细胞悬液加入Transwell小室上室中，下室均加入600微升的含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基，每组细胞均设置3个复孔。置于入恒温37℃，5％的CO2浓度的培养箱中孵育24h。
(2)将孵育好的小室取出，用医用棉签小心地拭去上室内的细胞以及液体，超净台内晾干。将小室置于4％多聚甲醛中浸泡30分钟，可以使细胞固定的效果。细胞固定完成后用PBS冲洗3遍，晾干后加入0.1％的结晶紫溶液进行染色，时间为30分钟。染色结束后取出小室用PBS液再次冲洗3遍，晾干后在倒置显微 镜下进行观察，先了解下小室内细胞的整体情况，然后高倍镜下随机选取巧个视野，对每个视野内的细胞量进行计数并计算处出平均细胞数。
二、实验结果
阴性对照组和实验组细胞分别于接种后第1-5天，按照CCK-8检测试剂盒说明书进行操作，然后通过酶标仪检测各组细胞的密度(OD)值，统计各组细胞OD值绘制细胞的生长曲线，两组结果进行对比后显示实验组生长曲线较平缓，细胞生长速度较阴性对照组显著降低(p<0.05)，这表明KCNK2基因的过表达具有抑制TPC-1细胞增殖的作用，具体见图2。
Transwell小室迁移结果显示，在实验组与阴性对照组进行比较发现实验组穿透滤过膜细胞数量明显减少。统计结果显示两组差异具有统计学意义(P<0.01)。结果表明过表达KCNK2基因后TPC-1细胞的迁移运动能力减弱。
本发明采用高通量测序筛选出甲状腺***状癌致病相关基因KCNK2，结合分子细胞生物学实验验证，证实了KCNK2是甲状腺***状癌密切的标志物。本发明为甲状腺***状癌临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.检测KCNK2基因或蛋白的制剂在制备甲状腺癌诊断制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲状腺癌为甲状腺***状癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲状腺癌诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测KCNK2基因的表达。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于荧光定量PCR方法检测甲状腺癌中KCNK2基因的产品含有一对特异性扩增KCNK2基因的引物；基因芯片包括与KCNK2基因的核酸序列杂交的探针，优选的，特异性扩增KCNK2基因的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲状腺癌诊疗制剂包括用免疫方法检测KCNK2蛋白的表达，优选的，用ELISA或胶体金方法检测KCNK2蛋白表达。
6.促进KCNK2基因或蛋白表达试剂在制备抗甲状腺癌制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，甲状腺癌为甲状腺***状癌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的增殖。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗甲状腺癌制剂抑制甲状腺癌细胞的迁移。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用构建过表达载体的方法促进KCNK2基因或蛋白表达。
CN201610284031.3A 2016-04-29 2016-04-29 Kcnk2基因的新用途 Pending CN105838799A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610284031.3A CN105838799A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 Kcnk2基因的新用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610284031.3A CN105838799A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 Kcnk2基因的新用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105838799A true CN105838799A (zh) 2016-08-10

Family

ID=56590672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610284031.3A Pending CN105838799A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 Kcnk2基因的新用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105838799A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652552A (zh) * 2018-07-27 2019-04-19 四川大学华西医院 一种人类map2k5第961位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒
CN109762902A (zh) * 2018-07-27 2019-05-17 四川大学华西医院 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020028485A1 (en) * 1998-01-27 2002-03-07 Meadows Helen Jane Novel compounds
WO2005054866A2 (en) * 2003-11-25 2005-06-16 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with two-pore domain potassium channel (kcnk2)
WO2007050706A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 University Of Missouri-Columbia Dna methylation biomarkers in lymphoid and hematopoietic malignancies
CN101443771A (zh) * 2004-12-16 2009-05-27 新星筛生物科技公司 调节离子通道活性的药物的鉴定和功能表征的方法
CN102844036A (zh) * 2009-07-16 2012-12-26 生物时代股份有限公司 用于体外和体内软骨发生的方法和组合物
CN104093706A (zh) * 2011-12-30 2014-10-08 克莱蒙费朗国立高等化工学校 疼痛缓解化合物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020028485A1 (en) * 1998-01-27 2002-03-07 Meadows Helen Jane Novel compounds
WO2005054866A2 (en) * 2003-11-25 2005-06-16 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with two-pore domain potassium channel (kcnk2)
CN101443771A (zh) * 2004-12-16 2009-05-27 新星筛生物科技公司 调节离子通道活性的药物的鉴定和功能表征的方法
WO2007050706A2 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 University Of Missouri-Columbia Dna methylation biomarkers in lymphoid and hematopoietic malignancies
US20090264306A1 (en) * 2005-10-27 2009-10-22 Curators Of The University Of Missouri Dna methylation biomarkers in lymphoid and hematopoietic malignancies
CN102844036A (zh) * 2009-07-16 2012-12-26 生物时代股份有限公司 用于体外和体内软骨发生的方法和组合物
CN104093706A (zh) * 2011-12-30 2014-10-08 克莱蒙费朗国立高等化工学校 疼痛缓解化合物

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652552A (zh) * 2018-07-27 2019-04-19 四川大学华西医院 一种人类map2k5第961位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒
CN109762902A (zh) * 2018-07-27 2019-05-17 四川大学华西医院 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒
CN109762902B (zh) * 2018-07-27 2022-07-05 四川大学华西医院 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒
CN109652552B (zh) * 2018-07-27 2022-07-05 四川大学华西医院 一种人类map2k5第961位碱基突变基因的arms-pcr检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105779618A (zh) 一种舌鳞癌的新诊治靶标基因及其应用
CN106191067B (zh) 环状RNA circ-NFATC3及其用途
CN105524924A (zh) 环状RNA circ-ZKSCAN1的用途
CN106834486A (zh) 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用
CN105838799A (zh) Kcnk2基因的新用途
CN105288659A (zh) Tenm1基因及其表达产物在诊治***状腺癌的应用
CN109613236A (zh) 一种核酸杂交捕获免疫荧光检测方法、免疫荧光层析试条及试剂盒
CN106399485A (zh) 一种在舌鳞癌癌旁组织中高表达的基因及其应用
CN114002431B (zh) Tnnt1在制备病毒型肝细胞癌诊断试剂盒及制备或筛选抗肝癌药物中的应用
CN107083428B (zh) Pak5在癌症诊断预后治疗及药物筛选中的应用
CN106148337A (zh) 长非编码rna ay927503及其用途
CN105233290B (zh) C22orf26基因及其表达产物在制备帕金森诊疗试剂中的应用
CN114085909A (zh) Top1作为***标志物和/或治疗靶点的应用
CN105132547A (zh) Stac2基因及其编码蛋白在抑制盆腔脱垂中的应用
CN105695617A (zh) ***状癌的肿瘤标志物及其应用
JP5316749B2 (ja) シスプラチン耐性遺伝子診断方法及びシスプラチン治療効果遺伝子診断キット
CN219709496U (zh) 一种用于pd-1/pd-l1表达量检测的rna试剂盒
CN104740649A (zh) Plekha5在制备肿瘤诊断试剂中的应用
CN113599523B (zh) GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用
CN104721836B (zh) 伴侣素CCTγ在制备肿瘤诊断试剂中的应用
CN106702015A (zh) Ipcef1在诊治骨肉瘤中的应用
CN105506171A (zh) Lyrm2基因及其表达产物的新用途
CN113249474A (zh) Pcdh20在预测肝癌化疗敏感性中的应用
CN113789377A (zh) 一种食管癌的分子标志物及其应用
CN117431322A (zh) 生物标志物tmx2在肝细胞癌诊断和治疗中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Applicant before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200401

Address after: Room 2503, Qianshan building, building D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No. 1, Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province

Applicant after: Qingdao Yangshen biomedical Co.,Ltd.

Address before: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160810

RJ01 Rejection of invention patent application after publication