JP2012533571A5 - インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
相互参照
本出願は、米国特許法第119(e)条のもとで、以下の仮特許出願:2009年7月16日に出願された「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第61/226,237号、2009年9月18日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/243,939号、2010年5月27日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/349,088号、及び2010年7月16日に出願された「インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第61/365,308号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
本出願は、米国特許法第119(e)条のもとで、以下の仮特許出願:2009年7月16日に出願された「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する出願番号第61/226,237号、2009年9月18日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/243,939号、2010年5月27日に出願された「胚性前駆細胞株をスクリーニングする改善された方法」と題する出願番号第61/349,088号、及び2010年7月16日に出願された「インビトロ及び生体内での軟骨形成のための方法及び組成物」題する出願番号第61/365,308号の利益を主張する。これら出願のそれぞれの全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
自家軟骨細胞療法(ACT)として知られる細胞に基づいた軟骨治療計画には、軟骨からの軟骨細胞の取り出し、インビトロでの細胞の増殖、及び支持マトリクス(又はそのほかのタンパク質若しくはプロテオグリカン)の存在下又は非存在下でのこれら増殖させた細胞の患者への投与が含まれる。ACT療法は、インビトロで培養される場合のヒト関節軟骨細胞の脱分化、並びにそれらが移植部位で豊富な軟骨マトリクスを産生するように細胞を再分化させることの困難さによって複雑なものとなっている。さらに、ヒトからはほんのわずかな数の軟骨細胞しか回収できないので、培養の開始にほんのわずかな数の軟骨細胞しか使用できない。従って、実際上、単離されたヒト軟骨細胞を移植療法に適用する困難さは継続する。
用語「割球/桑実胚の細胞」は、哺乳類の胚における割球若しくは桑実胚の細胞、又はこれらの細胞の分化誘導体を含む追加の細胞の存在下又は非存在下でインビトロにて培養された割球若しくは桑実胚の細胞を指す。
用語「細胞株」は、インビトロで増える及び増殖することが可能である細胞の死すべき集団又は不死の集団を指す。
用語「ICM細胞」は、哺乳類胚の内部細胞塊の細胞、又は周辺の栄養外胚葉細胞の存在下若しくは非存在下にてインビトロで培養した内部細胞塊の細胞を指す。
用語「原始幹細胞」は、1を超える分化した細胞種に分化することが可能である動物細胞を指す。そのような細胞には、hES細胞、割球/桑実胚の細胞及びそれらに由来するhED細胞、hiPS細胞、hEG細胞、hEC細胞、並びに間葉幹細胞、神経幹細胞及び骨髄由来幹細胞を含む成人由来細胞が挙げられる。原始幹細胞は非ヒト動物に由来してもよい。原始幹細胞は遺伝子操作されてもよいし、遺伝子操作されなくてもよい。遺伝子操作された細胞は、たとえば、蛍光タンパク質のようなマーカーを含んでインビトロ又は生体内での特定を円滑にしてもよい。
上記で言及したように、本発明の胚性の軟骨形成性前駆細胞は、インビトロ又は生体内で軟骨を生成する方法での使用を見い出す(本明細書では軟骨細胞誘導法と呼ぶことがある)。治療上の使用に好適なものを含む好都合な軟骨細胞誘導法を使用してもよい(多数の例となる軟骨細胞誘導/軟骨生成の方法が以下及び実施例の項で記載される)。
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞が治療応用に採用されて、対象者(たとえば、哺乳類、たとえば、ヒト対象者)において軟骨組織(たとえば、損傷された軟骨)を修復し、置き換え、又は整備する。インビトロで軟骨が生成され、その後冒された部位に移植されてもよく、特定の実施形態では、軟骨細胞が(たとえば、マトリクス又は足場の中に)移植されて対象者における所望の部位で軟骨を生成してもよい。軟骨産生細胞(又は軟骨細胞)を用いる多数の治療法が記載されており、その2,3を以下で要約する。
特定の実施形態では、本発明の軟骨産生細胞は、インビトロで培養されて合成軟骨(又は軟骨様の)材料を形成してもよい。得られた軟骨を続いて軟骨欠損の部位で対象者に埋め込んでもよい。この種のアプローチは、埋め込みの前に合成軟骨材料の成長がモニターされ得るという利点を有する。加えて、得られた軟骨は埋め込みに先立って生化学的に及び形態学的に性状分析され得る。インビトロで合成軟骨を増殖させるために2つの一般的な手順が開発されている。これらには、足場依存性の方法又は足場非依存性の方法のいずれかで軟骨産生細胞を増殖することが含まれる。
特定の実施形態では、本発明の軟骨療法は、米国特許第5,723,331号及び同第5,786,217号(双方共その全体が参照によって本明細書に組み入れられる「哺乳類における関節軟骨欠陥の修復のための方法及び組成物」と題する)に記載されたものを含む。これらの特許は、軟骨の欠陥の修復のために合成軟骨パッチをインビトロで調製する方法を記載している。本発明の軟骨産生細胞を採用する場合、方法は、(1)細胞の接触を有する事前に成形されたウェル、細胞付着性の表面に本発明の軟骨産生細胞を播く工程と、(2)細胞が細胞外マトリクスを分泌できるのに十分な時間、ウェルにて本発明の軟骨産生細胞を培養し、それによって合成軟骨の三次元の多層細胞パッチを形成する工程を含む。得られた合成軟骨(たとえば、合成関節軟骨)は、内因的に産生され、分泌された細胞外マトリクスの中に分散された本発明の軟骨産生細胞を含有する。続いて、得られた合成軟骨パッチを対象者(たとえば、哺乳類)における軟骨の欠陥の修復(置き換え)に使用してもよい。
ヒドロゲルに被包された軟骨細胞前駆細胞をインビトロで培養し、又は生体内で軟骨産生が望まれる部位に移植し、たとえば、損傷した又は失った軟骨を置き換えることができる。
Glycosan Biosystemsもまた、培養、組織工学の足場及び細胞療法で使用を見い出す三次元細胞培養用のヒドロゲルを提供している。この会社はたとえば、インビトロ及び生体内での細胞増殖及び分化で使用するためのヒアルロナン系、PEG系及びコラーゲン系のヒドロゲルを提供している。
胚性前駆細胞株の産生方法
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる:「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第20080070303号;「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630;「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する2009年7月16日に出願された米国特許仮出願、出願番号61/226,237;「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する2006年4月11日に出願されたPCT出願、PCT/US2006/013519、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
以下に記載する方法に加えて、本明細書で記載される細胞株の産生及び使用において使用を見い出す方法は、以下において見つけることができる:「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する米国特許公開第20080070303号;「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を加速する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願、出願番号12/504,630;「胚性前駆細胞株を用いたインビトロ及び生体内での軟骨形成に有用な方法及び組成物」と題する2009年7月16日に出願された米国特許仮出願、出願番号61/226,237;「遺伝子発現の出生前パターンを持つ細胞の新規使用」と題する2006年4月11日に出願されたPCT出願、PCT/US2006/013519、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株の増殖
本発明の態様は、単一細胞(クローン性)、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常2〜1,000個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する2以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いでインビトロで増殖させ、通常、元々の細胞数の1/3〜1/4に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願第12/504,630号及びWestら、2008,Regenerative Medicine vol.3(3)pp.287−308に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の21を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。
本発明の態様は、単一細胞(クローン性)、又はクローニングした細胞株が遺伝子発現マーカーのような見分けがつかないマーカーを有し、培養での細胞数を増やす目的でそれらを組み合わせて単一の細胞培養にすることを意味する「プールされたクローン性」である、又は株が、少数の通常2〜1,000個の類似細胞から生成され、細胞株として増殖させるオリゴクローン性、又は遺伝子発現のパターンのような見分けがつかないマーカーを有する2以上のオリゴクローン性細胞株を組み合わせることによって生成される株である「プールされたオリゴクローン性」株である、細胞株に由来する胚性前駆細胞株を特定し、分化させる方法を提供する。それらが付着する基材からの細胞の取り外しを介して、前記クローン性、プールしたクローン性、オリゴクローン性及びプールしたオリゴクローン性の細胞株を次いでインビトロで増殖させ、通常、元々の細胞数の1/3〜1/4に減らした密度で細胞を再びプレート培養してさらなる増殖を円滑にする。前記細胞株及び関連する細胞培養培地の例は、補完情報も含めて、双方共参照によって本明細書に組み入れられる、「多能性幹細胞からの新規の細胞株の単離を促進する方法及びそれによって得られる細胞」と題する2009年7月16日に出願された米国特許出願第12/504,630号及びWestら、2008,Regenerative Medicine vol.3(3)pp.287−308に開示されている。本発明の組成物及び方法は、クローン性増殖の21を超える倍増を別にして、記載されたように培養された前記細胞株に関する。
軟骨細胞の分化を誘導する例となる条件
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成(又は軟骨産生)を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に(生体内又はインビトロのいずれかで)採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。
本明細書で記載される前駆細胞株を用いて軟骨形成(又は軟骨産生)を誘導する好都合な方法を研究又は治療のいずれかの目的に(生体内又はインビトロのいずれかで)採用してもよいので、この点での限定は意図されないことが言及される。従って、以下に記載されるアッセイは、軟骨形成のための条件の例となる非限定例を表す。
本発明の特定の実施形態では、単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、それらが治療上の有用性を示すために通常存在している組織に導入される。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の細胞が、ほかの多能性幹細胞の分化の誘導に利用される。インビトロで増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団は、ほかの多能性幹細胞の分化を誘導することにおいて有用である。細胞と細胞の相互作用は、早期胚において分化を指向する一般的な手段である。脊髄ニューロン、心臓細胞、膵臓β細胞及び限定的な造血細胞を含む多数の医学的に有用である可能性がある細胞種は、正常な胚発生の間での誘導シグナルに影響される。インビトロで増殖することが可能である一方で遺伝子発現の胚性パターンを維持している細胞の単一細胞由来の集団を種々のインビトロ、胚内、又は生体内での条件で培養してそのほかの多能性幹細胞が所望の細胞種又は組織種になる分化を誘導することができる。誘導細胞を標的細胞と並置する種々の方法にて誘導を行ってもよい。非限定の例証として、誘導細胞を組織培養にてプレート培養し、マイトマイシンC又は放射線で処理して細胞のさらなる複製を妨げる。次いで細胞***上不活化された誘導細胞の上で標的細胞をプレート培養する。或いは、細胞のさらに大きな培養又は元々の単一細胞由来のコロニーから取り外し可能な膜の上で単一細胞由来の誘導細胞を培養してもよく、標的細胞を誘導細胞の上でプレート培養してもよく、又は標的細胞で覆った別の膜を、直接接触にて2つの細胞層を挟むように並置してもよい。細胞の得られる二重層をインビトロで培養し、SPFの鳥類の卵に移し、血管支援を受けながら三次元への増殖を可能にする条件で培養してもよい(たとえば、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる2005年7月28日に公開された国際特許公開番号WO2005068610を参照)。誘導細胞はまた、誘導細胞を任意で取り除くことができるように自殺構築物が導入されている、hES及びhED細胞を含む多能性幹細胞の起源に由来してもよい。単一細胞由来の及びオリゴクローン性細胞由来の誘導に有用な細胞種には、正常な胚発生で天然に生じることが当該技術で周知である誘導の場合が挙げられてもよい。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法によって導かれる単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞は、多能性幹細胞を含むそのほかの細胞種の増殖を支援する「フィーダー細胞」として使用される。本発明の単一細胞由来の細胞及びオリゴクローン性細胞由来の細胞のフィーダー細胞としての使用は、そのほかの哺乳類起源のフィーダー細胞からの病原体の標的細胞への伝染のリスクの可能性を緩和する。フィーダー細胞は、たとえば、γ線照射によって又はマイトマイシンC処理によって不活化されて複製を限定され、多能性幹細胞と共培養されてもよい。
実施例6.
qPCRによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2及びZ3と名付けられた本発明の細胞株は、hES由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを10倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらをインビトロで>21の倍増でクローン増殖させた。インビトロで軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように14日間、軟骨形成を誘導した。これら2つの条件のそれぞれからのRNAをcDNAに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子(すなわち、COL2A1、COMP、CILP、SCX、CRTL1、SOX9、BARX2)の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはInvitrogenから入手した。cDNAのRNA同等物30ng,プライマー当たり0.4μM、超純度蒸留水(Invitrogen)から成り、全反応容量25μlでAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを組み入れる12.5μlのPowerSYBR GreenPCR Masterミックス(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、カタログ番号4367659)で1:1に希釈した試験用試料を標準の光学96穴反応プレート(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、PN4306737)にて調製した。SDSv1.2ソフトウエアを採用するApplied Biosystems7500リアルタイムPCR方式を用いてリアルタイムqPCRを実行した。増幅条件は、50℃にて2分間(段階1)、95℃で10分間(段階2)、95℃で15秒間、次いで60℃で1分間を40サイクル(段階3)、95℃で15秒間、60℃で1分間、95℃で15秒間の解離段階(段階4)にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のCt値を3つのハウスキーピング遺伝子(GAPD、RPS10及びGUSB)のCt値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞(Lonza)及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。
qPCRによる軟骨形成性前駆細胞のスコア化のための低処理能力選抜
10RPE8、4D20.8、4D20.9、4SKEL20、7PEND12、7PEND24、7PEND30、7PEND9、7SKEL4、7SKEL7、7SMOO25、7SMOO32、7SMOO7、7SMOO9、B16、C4.4、C4ELS5.1、C4ELS5.6、C4ELSR10、C4ELSR2、CMO2、E109、E111、E120、E15、E164、E33、E44、E68、E69、E85、EN1、EN13、EN16、EN18、EN2、EN22、EN23、EN26、EN27、EN31、EN4、EN42、EN47、EN5、EN51、EN55、EN7、EN8、F15、J16、MEL2、MEL2、MW1、RAD20.16、RAD20.19、RAD20.4、RAD20.5、RAD20.6、RAPEND10、RAPEND15、RAPEND18、RASKEL8、RASMO12、RASMO19、SK11、SK17、SK18、SK25、SK31、SK35、SK43、SK44、SK46、SK47、SK49、SK50、SK52、SM17、SM2、SM22、SM28、SM28、SM30、SM33、SM8、T14、T20、T36、T42、T43、T44、T7、U31、W10、W11、W8、Z1、Z11、Z2及びZ3と名付けられた本発明の細胞株は、hES由来の細胞から単離し、集密まで増殖させ、本明細書で記載されるような血清又はそのほかのマイトジェンを10倍減らして補完した培地で培地を置き換えることによって静止期に同期化させたので、それらをインビトロで>21の倍増でクローン増殖させた。インビトロで軟骨形成が可能である細胞についての低処理能力選抜では、細胞を微細塊条件で培養し、本明細書で記載されるように14日間、軟骨形成を誘導した。これら2つの条件のそれぞれからのRNAをcDNAに変換し、次いで軟骨形成に一般に関連する遺伝子(すなわち、COL2A1、COMP、CILP、SCX、CRTL1、SOX9、BARX2)の発現について調べた。遺伝子特異的なプライマー対プローブはInvitrogenから入手した。cDNAのRNA同等物30ng,プライマー当たり0.4μM、超純度蒸留水(Invitrogen)から成り、全反応容量25μlでAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを組み入れる12.5μlのPowerSYBR GreenPCR Masterミックス(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、カタログ番号4367659)で1:1に希釈した試験用試料を標準の光学96穴反応プレート(CA、Carlsbad、Applied Biosystems、PN4306737)にて調製した。SDSv1.2ソフトウエアを採用するApplied Biosystems7500リアルタイムPCR方式を用いてリアルタイムqPCRを実行した。増幅条件は、50℃にて2分間(段階1)、95℃で10分間(段階2)、95℃で15秒間、次いで60℃で1分間を40サイクル(段階3)、95℃で15秒間、60℃で1分間、95℃で15秒間の解離段階(段階4)にて設定した。当該遺伝子の増幅産物のCt値を3つのハウスキーピング遺伝子(GAPD、RPS10及びGUSB)のCt値の平均に対して標準化し、早期継代の正常ヒト膝関節軟骨細胞(Lonza)及び培養されたヒト骨髄間葉幹細胞に対して遺伝子発現を解析した。
驚くべきことに、COL2A1の誘導とSOX9のような関節形成間充組織の一般に使用されるマーカーとの相関はほとんどないか、少なかった。同様に、軟骨形成性間葉細胞のマーカーであると推測されているAQP1のようなマーカーは、微細塊軟骨形成条件でCOL2A1を誘導しない***皮膚線維芽細胞のRFU値にて存在したが、分化前及び分化後の本発明の細胞株には存在しなかった。たとえば、分化に先立って、AQP1の発現は、クローン増殖の18〜21の倍増にて、細胞株SM30には存在せず(バックグランドであるRFU135)、SK11には存在せず(126のRFU)、細胞株E15には存在しなかった(RFU139)(Westら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308からの補完表IIを参照)。どちらも、本発明の細胞株は軟骨形成が可能であるかどうかを予測することにおいて予測値の本発明の未分化細胞株におけるSOX9の発現レベルではなかった。実際、軟骨細胞になってそのような予後を予測するこれら細胞株の可能性と十分に相関する、分化に先立つ未分化の細胞株では遺伝子を見つけることができなかった。部位特異的なホメオボックス遺伝子発現を含むSK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30及びE15の群の範囲内での遺伝子発現マーカーの多様性は、各細胞株が独特で且つ識別可能な軟骨形成性前駆細胞を代表することを示唆している。同様に驚くべきことは、たとえば、COMP及びCILPのようなインビトロでの軟骨形成のマーカーとして一般に使用される遺伝子の多くが、COL2A1の発現によって及び軟骨形成の組織学的証拠を示すことによって証拠付けられるのと同一の条件下で皮膚線維芽細胞が、たとえば、本当の軟骨形成を経験することが可能であるかどうかにかかわりなく、培養された皮膚線維芽細胞を含む事実上任意の細胞種にて非特異的な方法での培養条件で誘導されることであった。加えて、細胞株SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30及びE15は、分化の前と後の双方での遺伝子発現マーカーに関して培養された骨髄MSCとは明瞭に識別可能だった。骨髄のMSCは一般にALCAM(CD166)陽性として記載されるが、たとえば、SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30及びE15のような未分化状態での本発明の細胞株は、CD166の発現は細胞株SM30では存在せず(バックグランドであるRFU125)、SK11では存在しなかった(164のRFU)(Westら、2008,Regenerative Medicine、vol.3(3)pp.287−308からの補完表IIを参照)。非限定の例証としてMSCと比較した場合の本発明の細胞株の追加の差異は、実際には特異的ではない一般的に使用されるマーカーの多くよりもさらに正確なMSCのマーカーであることが明らかにされているCD74の発現である(Ishii et al, 2005 BBRC 332:297-303)。表3に示されるように、未分化のMSCは実際非常に高いレベルのCD74転写物を発現し、脂肪細胞幹細胞は低レベルで同様にCD74を発現し、歯髄幹細胞は検出の限界でCD74を発現したが、その転写物は、SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30及びE15を含むCOL2A1を誘導可能な本発明の未分化細胞でも、培養された皮膚線維芽細胞でも非軟骨形成性の胚性前駆細胞株7SMOO7でも全く検出されなかった。細胞株の多様性及び本明細書で検討される成人幹細胞種での際立った差異を示す追加の非限定例は、細胞株E15にて高レベルで発現されるが、たとえば、MSC、脂肪細胞幹細胞、歯髄幹細胞又は皮膚線維芽細胞では発現されない発生遺伝子NNAT(NM_181689.1)の発現である。当該技術における幹細胞種からCOL2A1の発現を誘導することが可能である本発明の細胞株の顕著な差異の別の非限定例は、MSCのマーカーとして知られる遺伝子KCNK2(NM_001017425.2)の発現を測定することによって理解することができる。表3に示されるように、KCNK2は、MSC、脂肪細胞幹細胞及び歯髄肝細胞にて高レベルで発現されるが、SM30、E15、4D20.8、MEL2及びSK11のようなCOL2A1の発現を誘導することが可能である本発明の幾つかの細胞株では検出可能ではなかった。本発明の細胞株と骨髄由来のMSCの際立った差異は、細胞種における重要な治療上の差異を示す遺伝子においても見られる。MSCはインビトロで分化すると肥大軟骨細胞への形質転換を受けることに悩まされる。肥大軟骨細胞は、血管形成を誘導するのに有用な遺伝子を発現し、後に骨芽細胞によって侵襲されて骨を作る一時的なマトリクスを提供する。従って、関節に注入する場合、又はさもなければ関節軟骨に移植する場合、関節軟骨の外傷、関節炎の治療、又は関連する用途で組織を再生する尽力においてMSCは上手く機能しない。MSCが肥大軟骨細胞のマーカーであるIHHを非常に高いレベルで発現する一方で、本発明の細胞株は本明細書の軟骨形成条件で誘導される場合、ほとんどIHHを発現しないか、発現してもわずかである。同様に、細胞株4D20.8は肥大軟骨細胞の別のマーカーであるCOL10A1を検出可能なレベルで発現しなかったが、MSCはその転写物を非常に高いレベルで発現した。従って、7SMOO32、4D20.8、SM30及びE15のような本発明の細胞株は、関節軟骨の病理の修復のための永続軟骨に分化するその能力でMSCより優れているマーカーを示す。培養されたヒト骨髄MSC、脂肪細胞幹細胞、及び成人歯髄幹細胞と比べた細胞株SK11、7SMOO32、4D20.8、MEL2、SM30及びE15における差異のさらなる非限定例は、表3に示される、又は表3におけるような本明細書で記載されるものと細胞の遺伝子発現マーカーを比較することによって理解することができる。従って、これらの結果は、この選抜で特定された細胞株は新規であり、MSCを特定するのに一般に使用されるマーカーはヒトの胚性前駆細胞株において軟骨形成能を予測せず、前記細胞株が、軟骨形成の真のマーカーを発現する軟骨形成刺激に応答する株の小さなサブセットであることを予測するマーカーは現在存在しないことを示唆している。証拠は、軟骨形成の組織学的証拠の実施例7で提供される。
実施例10
インビトロの連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び14の微細塊及び上述のような(実施例9)アルギン酸ビーズにて、定期的にRNAを単離しながら、細胞株4D20.8、E15、SM30及びhbmMSCを連続継代した。アルギン酸ビーズにてP12と比較した継代33の細胞株4D20.8はほぼ同一レベルのCOL2A1を示したが、hbmMSCは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。
インビトロの連続継代に対する細胞株の安定性を判定するために、未分化状態及び14の微細塊及び上述のような(実施例9)アルギン酸ビーズにて、定期的にRNAを単離しながら、細胞株4D20.8、E15、SM30及びhbmMSCを連続継代した。アルギン酸ビーズにてP12と比較した継代33の細胞株4D20.8はほぼ同一レベルのCOL2A1を示したが、hbmMSCは、老化のために匹敵する継代で比較することはできなかった。
Claims (23)
- 軟骨を生成する医薬の製造における、
(a)軟骨を生成することができるクローン性に精製した胚性前駆細胞株であって、CD74、CD90、CD166、ITGA2、KCNK2及びそれらの組み合わせから成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と、
(b)薬学上許容可能なキャリア
を含む胚性前駆細胞株組成物の使用。 - 胚性前駆細胞株がCD74の発現について陰性である請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株がさらに、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項2の使用。
- 胚性前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株が、SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株組成物が軟骨の損傷を有する対象者に投与される請求項1の使用。
- 軟骨の損傷が関節軟骨の損傷である請求項6の使用。
- 薬学上許容可能なキャリアが、ヘタスターチ;ヒアルロナン及びそのポリマー;コンドロイチン硫酸;I型コラーゲン;II型コラーゲン;III型コラーゲン;ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマー;アルギン酸;アガロース;ポロキサマー;フィブリン;キチン;及びキトサン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される組成物を含む請求項1の使用。
- 胚性前駆細胞株が、対象者への投与に先立って軟骨細胞を誘導する条件下で培養される請求項6の使用。
- 損傷された軟骨を時間とともに修復する速度を測定する、請求項6の使用。
- インビトロで軟骨を産生する方法であって、軟骨産生条件下にて、SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択され、かつ、CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である、クローン性に精製した胚性前駆細胞株を培養することを含む方法。
- 胚性前駆細胞株が、CD74の発現について陰性である請求項11の方法。
- 胚性前駆細胞株がさらに、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項12の方法。
- 胚性前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項13の方法。
- 軟骨産生条件が、軟骨細胞培養条件;胚性前駆細胞株を合成マトリクス又は生体吸収性不動化媒体に含浸させること;及び胚性前駆細胞株を成形構造に入れることから成る群の1以上から選択される請求項11の方法。
- 方法がさらに、胚性前駆細胞株によって産生された軟骨をヒトを除く対象に移植することを含む請求項11の方法。
- キットであって、
(a)CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である胚性前駆細胞株と
(b)前記細胞株から軟骨産生を誘導する試薬
を含むキット。 - 胚性前駆細胞株が、SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項17のキット。
- 軟骨産生を誘導する試薬が軟骨細胞培養試薬を含む請求項17のキット。
- SM30、E15、4D20.8、7SMOO32、MEL2、SK11及び7PEND24及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるクローン性に精製した軟骨細胞前駆細胞株。
- CD74、CD90、CD166、ITGA2及びKCNK2から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現について陰性である請求項20の細胞株。
- 前記軟骨細胞前駆細胞株が、HOX遺伝子及びPITX1から成る群から選択される1以上の遺伝子の発現についてさらに陰性である請求項20の細胞株。
- 軟骨細胞前駆細胞株が、COL10A1マーカーの発現の非存在下で軟骨を生成する請求項20の細胞株。
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