JP6019412B2 - 悪性腫瘍に対する高選択的細胞毒性を有するインディルビン誘導体 - Google Patents
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Description
で表されるインディルビン誘導体又はその塩を提供するものである。
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供するものである。
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩の、医薬、特に悪性腫瘍治療剤、アポトーシス誘導剤製造のための使用を提供するものである。
また本発明は、悪性腫瘍治療又はアポトーシス誘導のための、上記インディルビン誘導体又はその塩を提供するものである。
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍治療方法又はアポトーシス誘導方法を提供するものである。
(1)インディルビンの製造
LRMS(EI):262([M]+).HRMScalcd for C16H10N2O2:262.0742,found:262.0740.
LRMS(EI):277([M]+).HRMS calcd for C16H11N3O2:277.0851,found:277.0848.
LRMS(EI):333([M]+).HRMS calcd for C19H15N3O3:333.1113,found:333.1113.
抗腫瘍活性は、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム ブロミド)法により測定した。
96−wellプレートにRPMI 1640培地に懸濁した腫瘍細胞(1×104cells/well)を100μL播き、24時間培養(5%CO2,37℃,飽湿条件下)した。その後、被験化合物(終濃度1×10-5〜1×10-8M)及びコントロールとしてDMSOを0.2μLずつそれぞれ添加し、48時間腫瘍細胞に作用させた。次に、0.5%MTT液を10μL加え、3時間後に反応停止液(0.04N HCl/イソプロパノール)を100μL加え反応を停止させた。よくピペッティングをした後、マイクロプレートリーダーにより570nm(top)及び655nm(bottom)における 吸光度を測定した。各検体の各濃度における細胞生存率は、コントロール群に対する百分率により求め、そこからEC50値を算出した。腫瘍細胞としては、ヒト神経芽腫細胞であるIMR−32、SK−N−SH、LA−N−1、NB−39ならびにヒト肝がん細胞HepG−2を用いた。また、非腫瘍細胞であるヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)、ヒト膵帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた。
(1)培養液
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM,Sigma社)にウシ胎児血清(FBS)を終濃度10%となるように加え、さらにPenicillin−Streptomycin溶液(GIBCO)を0.1mg/mLとなるように加えた。
(2)試薬
Alamar Blue液は和光純薬工業製を用いた。
(3)操作
ヒト肝癌細胞株HepG2細胞をDMEM培地に懸濁し(1.0×105個/mL)、96well culture plateに100μLずつ分注した。37℃、5%CO2飽湿条件下にて培養してplateに付着させた。24時間培養後培地を吸引除去し、被験化合物を含む培地(1%DMSO含有)100μLを添加し、37℃、5%CO2飽湿条件下にて培養した。24時間培養後培地を吸引除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline:PBS)で洗浄した。培地で10倍希釈したAlamar Blue試液(100μL)を各wellに添加して先と同様の条件下にて培養した。1時間後、励起波長577nm、検出波長612nmの蛍光強度を測定した。なお細胞生存率はvehicle(1%DMSO含有)添加wellの値を100%として算出した。
ヒト肝癌細胞株HepG2に対する細胞傷害活性(IC50:50%傷害濃度)は、HS−2が1.0μMであり、シスプラチン(CDDP)が10μMであった。
アポトーシス誘導能は、Hoechst33342染色法で核染色することにより試験した。
6−WellプレートにRPMI 1640培地に懸濁した細胞(IMR−32:1×105cells/well)を2mL播き、24時間培養(5%CO2,37℃、飽湿条件下)した。その後、被験化合物(終濃度1×10-5M〜1×10-7M)及びコントロールとしてDMSOを4μLずつそれぞれに添加し、24時間細胞に作用させた。次に、0.02%Hoechst 33342溶液を100μL加え、15分後に蛍光顕微鏡にて位相差像及び蛍光像を撮影し、細胞の形態変化を観察した。その結果、図2に示すように、本発明化合物(HS−2)は、0.1μMで、核の凝集化及び断片化が認められることから、IMR−32細胞に対する細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであることが判明した。
本発明化合物(HS−2)について、ヒト神経芽腫細胞であるIMR−32細胞に対するアポトーシス誘導能をフローサイトメトリーにより検出した。すなわち、6−WellプレートにRPMI 1640培地に懸濁した細胞(IMR−32:1×106cells/well)を2mL播き、24時間培養(5%CO2,37℃、飽湿条件下)した。その後、化合物(HS−2)を終濃度1×10-5M〜1×10-7Mとなるように加え、37℃、5%CO2条件下で24時間インキュベーションした。細胞をトリプシンで剥離してPBSで洗浄した後、アネキシンV−FITC及びヨウ化プロピジウム(PI)を加え、フローサイトメトリーを行った。この方法によれば、アポトーシスの初期段階の細胞はアネキシンV−FITCの蛍光のみが観察され、アポトーシスの後期段階の細胞はアネキシンVとPIの両方の蛍光が観察される。
その結果、化合物(HS−2)は濃度依存的なアポトーシス誘導能が認められ、10μMで顕著なアポトーシス誘導効果が示された。この結果を図3に示す。
Claims (7)
- 一般式(1)
で表されるインディルビン誘導体又はその塩。 - Aがメチレン基である請求項1記載のインディルビン誘導体又はその塩。
- R1〜R4がそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基である請求項1又は2記載のインディルビン誘導体又はその塩。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とする医薬。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とする悪性腫瘍治療剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のインディルビン誘導体又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
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