JP6004449B2 - トリブロックコポリマー及びその使用 - Google Patents
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Description
CNR−PEG−CNR (I)
式中、
CNRは、独立して、少なくとも1つのイミノ基またはエーテル結合を有する連結基を介してポリマー主鎖に結合する環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含有する反復単位を含むポリマーセグメントであり、
PEGはポリ(エチレングリコール)を含むセグメントである、
で表されるトリブロックコポリマーまたはその塩を開示する。
ここで、ポリマー主鎖が重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖にフェニレンの未結合末端が結合していることを特徴とするトリブロックコポリマーまたはその塩が提供される。
上記連結基は、o−もしくはp−フェニレン−(C1−6アルキレン−NH)p−(C1−6アルキレン)qが好ましい。このような連結基を有するトリブロックコポリマーまたはその塩は一定の酸性水中でカチオン荷電性を示し当該ポリマーに追加の機能を付与する。
一般式(II)
L1は、独立して、単結合、−S−(CH2)c−、−S−(CH2)cCO−、−(CH2)cS−、−CO(CH2)cS−、からなる群より選ばれ、ここでcは1ないし5の整数であり、
L2は、独立して、−C1−6アルキレン−NH−(C1−6アルキレン)q−または−C1−6アルキレン−O−(C1−6アルキレン)q−であり、ここでqは0または1であり、そして
Rは、独立して、Rの総数nの少なくとも50%が2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル−4−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル−3−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリン−1−オキシル−3−イル及び2,4,4−トリメチル−1,3−オキサゾリジン−3−オキシル−2−イル、2,4,4−トリメチル−1,3−チアゾリジン−3−オキシル−2−イル及び2,4,4−トリメチル−イミダゾリンジン−3−オキシル−2−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのRが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
mは、20〜5,000の整数であり、そして
nは、独立して、3〜1,000の整数である、
で表されるトリブロックコポリマーまたはその塩を提供する。
本願発明にいう、ペンダント基は、当該技術分野で一般に認識されているとおりの、ある官能基を持った側鎖を意味する。具体的には、ペンダント基は、o−もしくはp−フェニレン−(C1−6アルキレン−NH)p−(C1−6アルキレン)q−またはo−もしくはp−フェニレン−(C1−6アルキレン−O)p−(C1−6アルキレン)q(ここで、pは1〜3の整数であり、qは0または1の整数である)の連結基に、その記載されている右末端において環状ニトロキシドラジカル残基が共有結合している基である。より具体的には、上記一般式(II)の−フェニレン−(C1−6アルキレン−NH)p−(C1−6アルキレン)q−Rまたは−C1−6アルキレン−O−(C1−6アルキレン)q−Rで表される側鎖を参照すれば、本発明にいうペンダント基をより明瞭に理解できるであろう。このようなペンダント基が結合する主鎖としては、限定されるものではない。本発明において、残基とは、それぞれ対応する化合物から水素原子が1個除去された状態にある基を意味し、例えば、典型的な環状ニトロキシドラジカルにあっては、一般式(II)のRについて定義する基を参照できる。
こうして、ペンダント基の好ましい態様のものとしては、前記環状ニトロキシドラジカルが、o−もしくはp−フェニレン−C1−6アルキレン−NH−(C1−6アルキレン)q−(ここで、qは0または1である)の連結基を介してポリマー主鎖に結合しており、かつ、環状ニトロキシドラジカルが、2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル−4−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル−3−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリン−1−オキシル−3−イル及び2,4,4−トリメチル−1,3−オキサゾリジン−3−オキシル−2−イル、2,4,4−トリメチル−1,3−チアゾリジン−3−オキシル−2−イル及び2,4,4−トリメチル−イミダゾリンジン−3−オキシル−2−イルからなる群より選ばれる。
L1は、独立して、単結合、−S−(CH2)c−、−S−(CH2)cCO−、−(CH2)cS−、−CO(CH2)cS−、からなる群より選ばれ、ここでcは1ないし5の整数であり(なお、単結合に続く前者の2つはそれらが記載されている方向性で結合される式中の左側のL1に相当し、後者の2つはそれらが記載されている方向性で結合される式中の右側のL1に相当する)、
L2は、独立して、−C1−6アルキレン−NH−(C1−6アルキレン)q−または−C1−6アルキレン−O−(C1−6アルキレン)q−であり、ここでqは0または1であり、そして
Rは、独立して、Rの総数nの少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは約100%が2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル−4−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル−3−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリン−1−オキシル−3−イル及び2,4,4−トリメチル−1,3−オキサゾリジン−3−オキシル−2−イル、2,4,4−トリメチル−1,3−チアゾリジン−3−オキシル−2−イル及び2,4,4−トリメチル−イミダゾリンジン−3−オキシル−2−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのRが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
mは、20〜5,000、好ましくは、20〜1000、より好ましくは50〜200の整数であり、そして
nは、独立して、3〜1,000、好ましくは、3〜100、より好ましくは3〜50の整数である、
で表される。
で表される基を挙げることができる。上記の最初の式で表される残基が、以下で、TEMPOと略称されることのある基である。
一方、ペンダント基にエーテル結合(−O−)を有するトリブロックコポリマーは、水中で、CNRセグメントに相当する部分が疎水性を示し、ポリイオンコンプレックスの形成を伴うことなく、それら自他疎水性のコアーとなり、水溶性のPEGはループ状に表層を形成するシェルとなることにより、図1の概念図に示されるような、所謂、フラワーミセルを形成する。上述したとおり、このような疎水性のコアーには、疎水性の低分子薬剤を封入することができる。したがって、環状ニトロキシドラジカル部分の悪玉活性酸素を消去するように作用を有したまま、限定されるものでないが、任意の難水溶性薬剤、例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、ゲムシタビン、シタラビン、テガフール、テガフール・ウラシル、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、アクラルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ぺプロマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン等の当該技術分野で公知の各種抗腫瘍性物質、ムコスタ(レバミピド)及びその類延体、ビタミンE、β-カロテン、ユビキノン(コエンザイムQ)、ビリルビン、カテキン、レスベラトール、タンニン、エブセレン、アミノステロイド、プロブコール、ビタミンE類縁化合物、エイコサノイド代謝阻害薬、カテノロイド、レチノイド、ピペリン、等の水難溶解性の抗酸化剤、ならびにビタミンE(アスコルビン酸)、グルタチオン、フラボノイド、尿酸、等の水溶性抗酸化剤、ならびにスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、セルロプラスミン、メタロチオネイン、チオレドキシン、等のタンパク質性抗酸化剤、ならびに白金コロイド、フラーレン、等の粒子状抗酸化剤のデリバリー用キャリヤーとして使用できる。
当該組成物は、炎症を惹起する活性酸素の消去伴う機序またはそれ以外の機序を介して炎症を抑制することができる。かような炎症は、限定されるものでないが、脳梗塞、心筋梗塞、急性・慢性腎不全、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患、糖尿病、動脈硬化、肝炎、消化管炎症等を挙がることができる。また、当該組成物は生体内局所での流動性を調整できるとともに、その場に滞留できるように調製できる。本発明者等が注視している生体内局所としては、限定されるものではないが、歯周ポケット、癌病巣部、関節炎、等を挙げることができる。
さらに、炎症を抑制することが必要な患者に当該組成物を投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、等の経路による)することにより、炎症を予防または治療することもできる。
PCMS−b−PEG−b−PCMSは、次の合成スキーム1に従い合成した:
(1)式(II)におけるL2が−CH2−NH−であるトリブロックコポリマー(PMNT−b−PEG−b−PMNT)
反応容器に、PCMS−b−PEG−b−PCMS(Mn:13800;1.45g,0.105mmol)を加えた。次に、4−アミノ−TEMPO(2.34g,13.69mmol)を12mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、反応容器に加え、室温で24時間攪拌を行った。反応終了後、反応溶液を透析膜(Spectra/Por molecular weight cut−off size 3,500 Spectrum Medical Industries Inc.,Houston TX)中に加え、2Lのメタノールに対して透析を行った。メタノールは2時間ごとに8回交換し、エバポレーションを行い、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、92.1%であった。
(2)式(II)におけるL2が−CH2−O−であるトリブロックコポリマー
4−アミノ−TEMPOに代え、4−ヒドロキシ−TEMPOを用い、反応溶液にNaHを溶解したジメチルホルムアミド(DMF)を用いる他は、上記(1)に記載のものと同様な操作を繰返すことにより、目的のトリブロックコポリマーを製造する。
PMNT−b−PEG−b−PMNTトリブロックポリマーの粉末を0.1M HCl水溶液に溶解し、PMNT鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、PMNT−b−PEG−b−PMNTトリブロックポリマーとポリアクリル酸(PAA;Mn:5000)をそれぞれNa2HPO4バッファー(0.1M,pH6.28)に溶解し、濃度を5mg/mlにしたカチオンPMNT−b−PEG−b−PMNT水溶液とアニオンPAA水溶液を調製した。PAA水溶液にPMNT−b−PEG−b−PMNTトリブロックポリマー水溶液を攪拌しながら滴下し、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、PMNT−b−PEG−b−PMNTとPAAのモル比rが4:1、2:1、1:1、1:2となるように4つのポリイオンコンプレックスミセルを調製した(モル比r=[PAAの活性化されたカルボキシル基のモル数]/[PMNT−b−PEG−b−PMNTの活性化されたアミノ基のモル数])。得られたポリイオンコンプレックスミセルのゼータ電位を測定した(下記表1参照)。さらに、各モル比のポリイオンコンプレッスミセル溶液を5つのグループに分け、0.01M HCl/NaOHによりそれぞれのpHを4から8まで調整した。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱(DLS)測定により行ったところ、平均粒径が45〜80nmの単峰性の粒子であることが確認された(図5参照)。
上記で調製した各モル比およびpHを有するポリイオンコンプレックスミセル(モル比r=4:1、2:1、1:1;pH4−8)溶液(5mg/ml)を遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を150mMに調整し、温度37℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。イオン強度150mMかつ温度37℃の環境下で不可逆的ゲル化したポリイオンコンプレックスミセルのモル比に対するpH及び濃度の最適な条件を検討したところ、モル比rが4:1の場合が40mg/mlとpH5、モル比rが2:1の場合が50mg/mlとpH4−5、モル比rが1:1の場合が60mg/mlとpH5−6の条件でゲル化することを見出した(下記表2および図6参照)。
製造例3にしたがい、PMNT−b−PEG−b−PMNTとPAAのモル比rが1:1のポリイオンコンプレックス(5mg/ml、9ml)を調製し、2つのグループに分けて0.1M HCl水溶液によりpHを5と6に調整し、遠心エバポレーションにより50mg/mlに濃縮した。濃縮した各pHのミセル溶液をマウスの左腿に100μl皮下注射したところ、マウスの体内でゲルの形成を確認し、また組織接着性を示した(表3、図7)。しかしながら、モル比rが2:1(pH4、5、6)の条件ではゲル化は確認されなかった。
またゲルの生体毒性評価実験において、モル比rが1:1、pH6、60mg/mlのポリイオンコンプレックスを調製し、10匹のマウスの左腿と右後足にそれぞれ100μlと50μlずつ皮下注射し、4週間にわたってマウスの体重変化を記録した。その結果、マウスの体重が徐々に増加し、生存率が100%であることが確認された(図8参照)。この結果から、本発明により開発されたインジェクタブルゲルの毒性が非常に低いことが示される。
各群3匹のマウスを使用した。試験1で用いたニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックスミセル(PMNT−b−PEG−b−PMNTとPAAのモル比rが=1:1(RIG)、pH6、60mg/ml)の溶液を3匹のマウスの左後足に70μl皮下注射した。比較群として、3匹のマウスの右後足にそれぞれ低分子のニトロキシドラジカル化合物(4−aminoTEMPO;5.45mg/ml)、ニトロキシドラジカル含有高分子(PEG−b−PMNT両親媒性ブロック子ポリマーから透析法を用いて高分子ミセルを形成させたもの)のミセル溶液(RNPN;60mg/ml)、および低分子の4−aminoTEMPOを物理的にニトロキシドラジカルなしのポリイオンコンプレックスミセルに内包させたものに混ぜた溶液(TEMPOの代わりにアミノエタノールを導入したポリマーを用いて形成させたTEMPOの含有されていないフラワーミセル(nRIG)と4−aminoTEMPOを混合し、そのままゲル化させることにより、ゲル中に4−aminoTEMPOを内包させることにより形成した。)(nRIG+4−aminoTEMPO;モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)を、それぞれ、70μl注射した。投与直後のマウスを用いてL−bandの電子スピン共鳴法(ESR)によりマウスの足におけるニトロキシドラジカルの局所滞留性をイメージング化した。その結果、低分子の4−aminoTEMPO溶液は投与後に30分以内にマウスの足からESRシグナルが消失した。4−aminoTEMPOをミセル化したRNPN溶液は少し滞留性が上がったものの、1時間でシグナルが消失した。同様に4−aminoTEMPOを混合したnRIG含有ゲルも拡散により1時間までしか滞留性が見られなかった。これらに対し、本発明にしたがうポリイオンコンプレックスミセル溶液を注射してマウスの足底内でRIGをゲル化させた結果、測定中の5時間の間ずっと強いESRシグナルが検出されていた。したがって、本発明にしたがうポリイオンコンプレックスミセルから形成されるゲルは優れた局所滞留性をもつことが確認された。当該イメージングを示す図面に代わる写真を添付する(図9参照)。
このように、非侵襲的なイメージングを用いる評価方法は、通常、薬剤残存量を評価したり、また酸化ストレス度合を評価することに適するものと認識されている。
4つのグループ(4−aminoTEMPO、RNPN、RIG、nRIG+4−aminoTEMPO)につき、各グループ3匹のマウス(n=3)を使用した。低分子のニトロキシドラジカル化合物である4−aminoTEMPO(5.45mg/ml)、ニトロキシドラジカル含有高分子ミセル溶液(RNPN;60mg/ml)、ニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックスミセル(RIG:モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)溶液、低分子の4−aminoTEMPOを物理的にニトロキシドラジカルなしのポリイオンコンプレックスミセル(nRIG+4−aminoTEMPO:モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)に混ぜた溶液を50μlずつマウスの右後足に皮下注射した。投与後に異なる時間帯(0h、1h、3h、12h、24h、72h)においてマウスを解剖し、採取した右後足の組織に酸化剤のフェリシアン化カリウム(200mM)を入れてホモジナイズした溶液をX−band電子スピン共鳴法により各時間帯の局所滞留性を定量化した。結果を図10に示す。
低分子化合物(4−aminoTEMPO)および4−aminoTEMPO混合nRIGゲル(nRIG+4−aminoTEMPO)のほうでは1時間以内投与部位から拡散により消失したことが分かった。またTEMPO含有ジブロックポリマーから成る高分子ミセル(RNP)では12時間以内に投与部位から消失したのに対し、RIGは72時間後にも40%残存していることが明らかとなった。これらの結果から、RIGは優れた局所滞留性を示すことが改めて確認できた。
9つのグループ(対照(Control)、RIG、nRIG、Saline@Carr、RIG@Carr、nRIG@Carr、4−amino−TEMPO@Carr、RNPN@Carr、nRIG+4−amino−TEMPO@Carr)につき、各5匹のマウス(n=5)を使用した。
試験した各グループは、それぞれ次の意味を有する:
Control:後述
RIG:TEMPO含有フラワーミセルを投与して、TEMPO含有ゲルが生体内で形成されたもの
nRIG:TEMPOが含有されていないフラワーミセルを投与して、TEMPOの含有されていないゲルが生体内で形成されたもの
Saline@Carr:生理食塩水を投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
RIG@Carr:TEMPO含有フラワーミセルを投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
nRIG@Carr:TEMPOが含有されていないフラワーミセルを投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
4−amino−TEMPO@Carr:4−amino−TEMPOを投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
RNPN@Carr:TEMPO含有高分子ミセルを投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
nRIG+4−amino−TEMPO@Carr:4−amino−TEMPOが内包されたTEMPO非含有フラワーミセルを投与して18時間後にカラギーナンが投与されたもの
まずマウスを6時間絶食させ、ホットプレートによる熱刺激試験(51℃)を用いる正常なマウスの後足の痛覚過敏を評価した。マウスがホットプレートの上で後足を舐めたり、引っ張ったり、震えたりするまでの時間をPaw Withdrawal Latencies(PWL)とした。そして、RIGゲルを形成するニトロキシドラジカル含有ポリイオンコンプレックスミセル(RIG;モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)、nRIGゲルを形成するニトロキシドラジカルなしのポリイオンコンプレックスミセル(nRIG;モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)、食塩水(Saline)、低分子ニトロキシドラジカル化合物溶液(4−aminoTEMPO;5.45mg/ml)、ニトロキシドラジカル含有高分子ミセル溶液(RNPN;60mg/ml)、低分子の4−aminoTEMPOを物理的にニトロキシドラジカルなしのポリイオンコンプレックスミセル(nRIG+4−aminoTEMPO;モル比r=1:1、pH6、60mg/ml)に混ぜた溶液をマウスの右後足に50μlずつ皮下注射した。18時間後、Saline@Carr、RIG@Carr、nRIG@Carr、4−amino−TEMPO@Carr、RNPN@Carr、およびnRIG+4−aminoTEMPO@Carrの各グループ(n=5)のマウスの右後足に5%カラギーナン(Carrageenan)懸濁液を50μl皮下注射した。Controlグループ(n=5)は何も投与しないグループにした。カラギーナン投与6時間後、再びホットプレートによる熱刺激試験を行った。炎症発生後のPWL時間を炎症発生前のPWL時間を引いた後のPaw Withdrawal latency(PWL)の時間差をグラフの縦軸に表す。この時間差が大きいほど、炎症が高いことを示している。そして、採取したマウスの右後足の組織をホモジナイズし、遠心分離により取った上澄みについて、好中球の浸潤の指標であるミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性及び炎症性サイトカイン量(TNF−αとIL−1β)をELISAキットにより測定した。結果を図11に示す。
図から、ニトロキシドラジカルを含有しないnRIGのみのグループでは、MPOの活性惹起が局所の足及び血中の両方において確認された。一方で、RIGグループはその活性化を有意に抑制した。これらの結果はRIG自身が炎症惹起を引き起こすことがないことを示唆する。また、Saline@Carr、nRIG@Carr、4−amino−TEMPO@Carr、RNPN@Carr、nRIG+4−amino−TEMPO@Carrのグループではカラギーナンにより誘起されたMPO活性を有意に抑制することができなかったのに対して、RIG@CarrのグループではMPOの活性の有意な抑制が確認された。
同様な傾向として、RIGゲルは炎症性サイトカインであるTNF−αとIL−1βの発生も有意に抑制し、カラギーナン誘発の痛覚過敏を効果的に予防した。これらの結果から、RIGゲルが好中球やマクロファージの産生する活性酸素を効果的に消去していることを示唆する。
Claims (8)
- 一般式(II)
L1は、独立して、−S−(CH2)c−、−S−(CH2)cCO−、−(CH2)cS−、−CO(CH2)cS−から選ばれ、ここでcは1ないし5の整数であり、
L2は、独立して、−C1-6アルキレン−NH−(C1-6アルキレン)q −であり、ここでqは0または1の整数であり、そして
Rは、独立して、Rの総数nの少なくとも50%が2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル−4−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル−3−イル、2,2,5,5−テトラメチルピロリン−1−オキシル−3−イル及び2,4,4−トリメチル−1,3−オキサゾリジン−3−オキシル−2−イル、2,4,4−トリメチル−1,3−チアゾリジン−3−オキシル−2−イル及び2,4,4−トリメチル−イミダゾリンジン−3−オキシル−2−イルから選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのRが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
mは、20〜5,000の整数であり、そして
nは、独立して、3〜1,000の整数である、
で表され、かつ、
水性媒体中において、ポリイオンコンプレックスミセルの形態にあるポリイオンコンプレックスを数平均分子量5000のポリアクリル酸と形成する
ことを特徴とするトリブロックコポリマー。 - 請求項1または2に記載のトリブロックコポリマーおよびポリアニオンを含むポリイオンコンプレックスであって、水性媒体中においてポリイオンコンプレックスミセルの形態にあることを特徴とするポリイオンコンプレックス。
- ポリアニオンが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、DNA、RNAおよびアニオン性蛋白質から選ばれる請求項3に記載のポリイオンコンプレックス。
- ポリアニオンが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸またはポリスルホン酸である請求項3または4に記載のポリイオンコンプレックス。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスと生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む組成物。
- 請求項3〜5のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを有効成分として含む生体内局所の炎症を抑制するための製薬学的製剤。
- 生体内局所が、歯周ポケット、癌病巣部および関節炎の発症部位から選ばれる請求項7に記載の製薬学的製剤。
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