WO2018135592A1 - 側鎖に環状ニトロキシドラジカルとトリアルコキシシリルを含む共重合体およびその使用 - Google Patents

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nanoparticles
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長崎　幸夫
拓也 稲垣
ビン ロン ホン
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    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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    • C08F2438/02—Stable Free Radical Polymerisation [SFRP]; Nitroxide Mediated Polymerisation [NMP] for, e.g. using 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl [TEMPO]
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    • C08K2201/00—Specific properties of additives
    • C08K2201/011—Nanostructured additives

Definitions

  • the present invention relates to a copolymer in which a hydrophilic part is made of polyethylene glycol (PEG) and a hydrophobic part is made of polystyrene, and a cyclic nitroxide radical having a radical scavenging function and a trialkoxysilane are covalently bonded to the hydrophobic part side chain, and the copolymer.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention relates to the use of a polymer as a carrier for a physiologically active substance.
  • a copolymer containing a cyclic nitroxide radical with a hydrophilic moiety made of polyethylene glycol (PEG) and a hydrophobic part made of polystyrene and having a radical scavenging function in the side chain of the hydrophobic part is obtained by polymerizing the cyclic nitroxide radical. It has been confirmed that various disorders that can be attributed to the production and presence of excess active oxygen in the living body can be prevented or treated using the redox function that nitroxide radicals can exhibit, while obtaining stability under (For example, see Patent Document 1: WO 2009/133647).
  • Organic-inorganic hybrid composite nanoparticles containing such a copolymer and silica include organic nanoparticles obtained by automatically organizing in a system that contains the copolymer but does not contain silica. In comparison, stability has been improved under acidic conditions and the like, and it has also been confirmed that it can be used as a carrier for certain drugs (for example, Patent Document 2: WO 2013/118783 or Non-patent Document 1: Hossain A. et al. , J. Drug. Target, 2014; 22 (7): 638-647).
  • Cyclic nitroxide radicals that can efficiently encapsulate drugs (or physiologically active substances) under the above-mentioned problems, particularly under conditions that are less likely to adversely affect the activity of the drug, and are contained in the hydrophobic side chain It is desired to provide a copolymer capable of exhibiting the above functions.
  • the present inventors now have a copolymer in which the hydrophilic portion is made of polyethylene glycol (PEG) and the hydrophobic portion is made of polystyrene, and the hydrophobic portion side chain includes a cyclic nitroxide radical having a redox or radical scavenging function.
  • the hydrophobic portion side chain includes a cyclic nitroxide radical having a redox or radical scavenging function.
  • a physiologically active substance is efficiently produced at an ambient temperature or lower, for example, 10 ° C. to 30 ° C.
  • silica-containing redox nanoparticles encapsulating a drug at a high content can be provided.
  • A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkoxy, and when substituted, the substituent represents a formyl group, a formula R ′ R ′′ CH— group, wherein R ′ and R ′′ are independently C 1 -C 4 alkoxy or R 'and R "with the -OCH 2 CH 2 O together -, - O (CH 2) 3 O- or -O (CH 2) represents a 4 O-.
  • X individually comprises the groups described in the following (a), (b) and (c): (A) L 2 —R 1 , wherein L 2 is — (CH 2 ) a —NH— (CH 2 ) a — or — (CH 2 ) a —O— (CH 2 ) a —, R 1 is the formula
  • (B) is represented by L 3 -R 2
  • L 3 has the same meaning as L 2
  • R 2 is represented by the formula :-( CH 2) k -Si (O -Alk) 3
  • each Alk is the same
  • C represented by R 3
  • R 3 is chloro, bromo or hydroxyl.
  • the unit (unit) in the polymer main chain having (a), (b) and (c) is randomly present, the unit having (a) is in the range of 2 to 99, and (b) The unit having is in the range of 1 to 98, and the unit having (c) is not present or in the range of 1 to 20, provided that the total number of these units is n.
  • Each a is independently 0 or an integer of 1 to 5; b is an integer of 1 to 5, k is an integer from 1 to 18, m represents an integer of 2 to 10,000, n represents an integer of 3 to 100.
  • a pharmaceutical composition comprising a copolymer represented by formula (I) of (1) and a poly (quaternary amine) antibacterial active compound.
  • composition of (3), wherein the antibacterial active compound has the formula:
  • A is represented by — (CH 2 ) j —, j is 0 or an integer of 1 to 17, R is a hydrogen atom or methyl; In the phenyl, at least one of 1 to 5 hydrogen atoms may be substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or hydroxy.
  • a pharmaceutical composition comprising a copolymer represented by formula (I) in (1) and a hydrophobic anticancer agent.
  • composition according to (5), wherein the hydrophobic anticancer agent is BNS-22 [8-[(3,4-dihydro-2H-quinolin-1-yl) carbonyl] -5,7-dimethoxy-4- Propyl-2H-chromen-2-one], sorafenib, camptothecin, paclitaxel and an anticancer platinum complex.
  • silica-containing redox nanoparticles in which a bioactive substance is encapsulated or encapsulated, and the silica-containing nanoparticles are represented by the formula (I) defined in (1) in nano-sized silica particles.
  • Silica having a structure in which a physiologically active substance is bonded or adsorbed to the silica particles, and is fixed through the copolymer —L 3 — (CH 2 ) k —Si (O—Alk) 3 Contains redox nanoparticles.
  • a copolymer represented by the formula (I) which not only forms stable nanoparticles in various solutions by cross-linking itself, but also the copolymer.
  • Polymers alone or the copolymer and tetraalkoxysilane or nano-sized silica were further treated by coexisting a certain physiologically active substance in these systems to efficiently pack the physiologically active substance.
  • Silica-containing redox nanoparticles can be provided.
  • FIG. 19 shows the results of a toxicity evaluation test when intraperitoneal administration of Cation siRNP in Test 4 was performed.
  • A, L 1 , Z, m, L 2 -R 1 , L 3 -R 2 , R 3 are as defined for the above formula (I), and p is an integer of 2 to 99 , Q is an integer from 1 to 99, r is 0 (zero) or an integer from 1 to 20, provided that p + q + r is from 3 to 100 (n) and is a repeating unit to which p, q and r are attached. Are randomly arranged, but together form a block segment different from the block segment of the repeating unit with m.
  • nanosized particles or nanoparticles are the size range in which the average particle size is nanometers when analyzed by dynamic scattering light (DLS) in an aqueous solution or homogeneous dispersion containing them. Means the particles inside.
  • DLS dynamic scattering light
  • A is preferably unsubstituted C 1-12 alkoxy, more preferably C 1-6 alkoxy, and most preferably C 1 alkoxy (methyl).
  • alkyl when expressed as Ca-z alkoxy or alkyl, it means linear or branched alkoxy or alkyl having a to z carbon atoms.
  • alkyl moiety or alkyl include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl, undecyl and the like. Can be mentioned.
  • L 1 is preferably paraxylylene, metaxylylene, or — (CH 2 ) 2 S— linking group
  • L 2 is —NH— or —O in which a in the definition is zero (0).
  • -Is preferred, and -NH- is more preferred.
  • L 1 and L 2 they are intended to be bonded in the described direction, for example, a — (CH 2 ) 2 S— linking group In this case, it means that the S atom is bonded to the repeating unit labeled with n in formula (I).
  • a unit in the polymer main chain having the groups described in (a), (b) and (c) in formula (I), or in the units to which p, q and r are attached in formula (Ia) may not be present in order to achieve the object of the present invention. .
  • L 3 has the same meaning as L 2 , preferably —NH— or —O—, R 2 is — (CH 2 ) k —Si (O—Alk) 3 , k Is preferably an integer of 2 to 12, more preferably an integer of 3 to 8.
  • M is preferably 12 to 1000, more preferably 50 to 500, n is preferably 6 to 80, more preferably 10 to 60, p is an integer of 3 to 80, and q is an integer of 3 to 80.
  • r is preferably absent, and p and q are each preferably 5 or more.
  • Such copolymerization exists as nano-sized micelle particles or particles having a hydrophobic portion as a core and a hydrophilic portion as a shell in water, an aqueous medium or an aqueous solution containing an enhanced ionic strength or containing a buffer. obtain.
  • the copolymer is not limited, but the hydrophilic part thereof includes polyethylene glycol (PEG), the hydrophobic part includes polystyrene, and the copolymer containing halomethylene, particularly chloromethyl, in the hydrophobic part side chain (hereinafter referred to as a copolymer).
  • PEG-b-PCMS polyethylene glycol
  • a copolymer containing halomethylene, particularly chloromethyl, in the hydrophobic part side chain
  • PEG-b-PCMS can be generally produced by the method described in WO 2016/052463 or Patent Document 1. A typical method described in the former will be described in a production example described later.
  • the copolymer represented by the formula (I) can form nano-sized particles by itself, but when forming these particles, Si (O—Alk) 4 (Wherein each Alk is the same or different C 1-4 alkyl, preferably the same) tetraalkoxysilane or nanosized silica (silica sol) in the core. It is possible to control and increase the content of silica which can be present in the particle, and in particular, when tetraalkoxysilane is used, particles having a silica content which increases according to the amount of use can be obtained.
  • the core region contains silica, and there are hydrophobic segment portions derived from the copolymer of the formula (I) in the periphery thereof, and the hydrophilic segment portion is formed in the shell portion surrounding the core.
  • Nano-sized silica-containing particles can be provided in which PEG chains are present. Such nano-sized silica-containing particles are also useful in that they can be used, for example, to adsorb and remove contaminants in the body using the silica contained in them.
  • the conventional silica-containing particle Redox particles are prepared at a relatively high temperature (for example, 80 ° C.) that is easily affected by a general physiologically active substance.
  • a relatively high temperature for example, 80 ° C.
  • the target nano-sized silica-containing particle Redox particles can be produced at a relatively low temperature (below ambient temperature, for example, 10 ° C. to 30 ° C.), and the silica content obtained using tetraalkoxysilane It has the feature that it can be controlled.
  • a copolymer of formula (I) (optionally together with silica derived from nano-sized silica (silica sol)) and poly (fourth) can form nanoparticles as described above.
  • a pharmaceutical composition comprising a secondary amine) antibacterial active compound or a hydrophobic anticancer agent can also be provided.
  • the mixing ratio of the copolymer of formula (I) in the composition, the silica derived from the nano-sized silica (silica sol) optionally contained, and the physiologically active substance varies depending on each component selected, but the aqueous medium If it can form a nano micelle in it, it will not be limited, and this suitable ratio can be determined with reference to the below-mentioned manufacture example and test example.
  • Nanosized micelle particles formed from such a composition in an aqueous medium provide the silica-containing redox nanoparticles of the above aspect (8) by, for example, lyophilization, centrifugation, and the like. You can also.
  • Biologically active substances or drug-containing or non-containing nanoparticles are stable particles that do not aggregate under high ionic strength and do not disintegrate even in the protonated state of an amino group under acidic conditions.
  • it when it contains an anticancer agent, it exhibits the desired physiological activity, while it is hardly toxic to normal human endothelial cells.
  • the silica-containing particle redox nanoparticles encapsulating or encapsulating the antibacterial agent or anticancer agent thus provided can be provided as a solubilized or uniformly dispersed solution or solution in an aqueous medium, so that the parenteral formulation is in any form Or it can be used to prepare oral formulations.
  • the silica-containing particle redox nanoparticles can be provided as a solid by freeze-drying, they are provided as tablets, pills, granules using their own excipients and diluents commonly used in the art. You can also.
  • the terms encapsulating and enclosing are used as interchangeable terms.
  • Such nanoparticles can be conveniently provided by the production method of the embodiment described in (10) above.
  • the copolymer of formula (I), tetraalkoxysilane or nano-sized silica particles and the physiologically active substance are dialyzed as a solution of a water-soluble organic solvent such as dimethylformamide (DMF) or tetrahydrofuran (THF).
  • the container is filled.
  • the shape of the container is not limited, and any container can be used as long as it can be used.
  • it can be a dialysis tube having a fractional molecular weight of 12 kDa to 14 kDa. Dialysis is performed against water and is performed for a sufficient time and a sufficient number of times to form the target silica-containing redox nanoparticles. Specific conditions will be described later, and those skilled in the art can refer to them and modify them if necessary.
  • the physiologically active substance can be applied to a poly (quaternary amine) fungicide or a hydrophobic anticancer agent having completely different chemical characteristics.
  • a poly (quaternary amine) fungicide or a hydrophobic anticancer agent having completely different chemical characteristics. Any antibacterial agent or hydrophobic anticancer agent that complies with the object of the present invention is included.
  • the antibacterial agent has the formula
  • A is represented by — (CH 2 ) j —, j is 0 or an integer of 1 to 17, R is a hydrogen atom or methyl; In the phenyl, at least one of 1 to 5 hydrogen atoms may be substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or hydroxy.
  • An antibacterial compound represented by on the other hand as a hydrophobic anticancer agent, BNS-22 [8-[(3,4-dihydro-2H-quinolin-1-yl) carbonyl] -5,7-dimethoxy-4-propyl-2H-chromen-2-one ], Sorafenib, camptothecin, paclitaxel, anticancer platinum complexes (for example, cisplatin, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin) and the like.
  • the antibacterial agent can be generally produced according to the following reaction scheme.
  • hydrophobic anticancer agent is known per se, and any compound having low water solubility as seen in BNS-22 can be used.
  • the silica-containing redox nanoparticles encapsulating a physiologically active substance cannot be specified as the maximum encapsulation amount varies depending on the characteristics and chemical structure of the physiologically active substance.
  • the physiologically active substance is BDMA-PEG-b-PTMAEMA described later.
  • the copolymer of formula (I) to the bioactive substance can be in a mass ratio of 2: 1 to 400: 1, preferably 4: 1 to 200: 1. .
  • antibacterial peptides are known to have a bactericidal action by selectively destroying bacterial membranes by electrostatic action due to their amphipathic and cationic properties.
  • Conventional antibiotics such as penicillin exert antibacterial activity on the basis of protein function inhibition, etc., so it has often been a major problem to create resistant bacteria. Because it is based, it is considered that it is relatively difficult to create resistant bacteria.
  • not only peptides but also antibacterial polymers mimicking them have been developed. The nanoparticles packed with the antibacterial agent of the present invention are in line with such trends.
  • the silica-containing redox nanoparticles packed or encapsulated with an anticancer agent are stable under high ionic strength under acidic conditions and, as described above, can be administered orally in addition to parenteral administration. It can be suitably used for the prevention and / or treatment of cancer.
  • the dose of silica-containing redox nanoparticles packed with a physiologically active substance when used for the treatment of the above-mentioned diseases is not limited because the optimum value varies depending on the type of disease, etc.
  • a specialist can make a decision based on data obtained by conducting animal experiments.
  • Dehydration was performed by evacuating methoxypolyethylene glycol (PEG-OH) (Mn: 5000; 3 mmol, 15 g) having a hydroxy group at the terminal at 110 ° C. for 12 hours. Then, after making the nitrogen atmosphere, 60 mL of tetrahydrofuran (THF) was added. Next, n-butyllithium (BuLi) (0.384 g, 6 mmol) was added thereto. Further, ⁇ , ⁇ ′-dichloroparaxylene (5.25 g, 30 mmol) was added to synthesize polyethylene glycol-chloroparaxylene (PEG-Cl).
  • PEG-OH methoxypolyethylene glycol
  • Production Example 2 Synthesis of diblock polymer (PEG-b-PMNT-Si) having a styrene polymer in which TEMPO and silica are randomly bonded.
  • PEG-b-PMNT-Si was synthesized according to the following scheme 2;
  • PEG-b-PCMS (Mn: 8878; 1.191 g, 0.14 mmol) was added to the reaction vessel. Dissolved with 8 mL of N, N-dimethylformamide (DMF). Next, 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (Amino-TEMPO) (2.5 g, 14.6 mmol) was dissolved in 4 mL of DMF and added to the reaction vessel. Methoxysilane (APTMS) (0.261 g, 1.46 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours.
  • ATMS Methoxysilane
  • BMA-PEG-b-PDMAEMA benzylmethylamine-PEG-b-polymethacrylic acid [2- (N, N-dimethyl) aminoethyl]
  • BDMA-PEG-b-PTMAEMA Benzyldimethylamine-PEG-b-polymethacrylic acid [2- (N, N, N-trimethyl) aminoethyl]
  • SiRNP silica-containing redox nanoparticles
  • the ESR intensity did not change at all before and after the preparation, and it became possible to produce stable silica-containing redox nanoparticles without the heat treatment that was a problem until now.
  • the average particle size and surface zeta potential under high ionic strength are 73.1 nm and 1.26 mV, and the average particle size and surface zeta potential under acid are 45.9 nm and 20.2 mV. It is confirmed that the particles are stable particles that do not aggregate under high ionic strength and do not collapse even in the protonated state of an amino group under acidic conditions.
  • Test 1 Evaluation of Antibacterial Effect of Silica-Containing Cationic Redox Nanoparticles (Cation siRNP) against Staphylococcus aureus (JCM2151) Dilute and dispense 50 ⁇ L each, and 1 ⁇ 10 6 CFU / mL Staphylococcus aureus (JCM2151) (obtained from National Institute of Physical and Chemical Research, Bioresource Center, Microbial Materials Development Department) 96 ⁇ m 96 Mixed in well plate. The antibacterial ability was confirmed by culturing for 20 hours and calculating the minimum growth inhibitory concentration (MIC). The concentration is based on PEG-b-PMNT-Si polymer conversion. The results are shown in Table 4.
  • Test 2 Toxicity evaluation of silica-containing redox nanoparticles on bovine aortic endothelial cells The toxicity at the determined MIC concentration was evaluated using a normal tissue cell, Bovine aortic endothelial cell (BAEC).
  • BAEC Bovine aortic endothelial cell
  • Production Example 9 Design of BNS-22 and silica-containing redox nanoparticles (BNS-22 siRNP) (1) Production Example of Nanoparticles PEG-b dissolved in DMF to encapsulate BNS-22 in the nanoparticles -10 mg (20 wt% with respect to polymer weight) or 20 mg (40 wt% with respect to polymer weight) of BNS-22 was added to the PMNT-Si (50 mg) solution, and the mixture was stirred for 24 hours. Next, dialysis was performed against water for 24 hours. The nanoparticles thus obtained are abbreviated as siRNP.
  • TEOS 90 ⁇ L (83.97 mg) and BNS-22 10 mg or 20 mg were added to a PEG-b-PMNT-Si (50 mg) solution dissolved in DMF, and the mixture was stirred for 24 hours.
  • dialysis was performed against water for 24 hours.
  • the nanoparticles thus obtained had an average particle size of about 80 nm as determined by DLS.
  • siRNP + TEOS such particles are referred to as siRNP + TEOS.
  • BNS-22 encapsulation was evaluated by measuring absorbance using the characteristics of BNS-22 having a maximum absorption wavelength of 315 nm. The results are shown in FIG.
  • FIG. 11 shows that siRNP and siRNP + TEOS are more stable under low acid conditions than RNP-N that can be produced by the conventional method.
  • Test 3 Evaluation of antibacterial activity of silica-containing cationic redox nanoparticles (Cation siRNP) in the mouse abdominal cavity This test was carried out intraperitoneally in peritoneal dialysis patients using the produced cationic silica-containing redox nanoparticles (Cation siRNP). The antibacterial activity was evaluated using a mouse assuming the situation where bacteria enter. ICR mice were injected with 1 ⁇ 10 8 CFU of Staphylococcus aureus (JCM2151 strain) which is a bacterium.
  • Cation siRNP was administered in terms of PEG-b-PMNT-Si concentration and administered at 250 mg / Kg (mouse body weight), 125 mg / Kg, and 61.25 mg / Kg. After 12 hours, the abdominal cavity was washed with physiological saline, and the washings were cultured in TSB-agar medium to compare the number of colonies.
  • Test 4 Toxicity Evaluation of Cationic Silica-Containing Redox Nanoparticles When Intraperitoneally Administered Cationic siRNP Intraperitoneally, toxicity was evaluated by measuring blood marker and blood electrolyte concentrations. That is, ICR mice (9 weeks old, ICR (Cr); 5 mice per group) were intraperitoneally 250 mg / Kg (mouse body weight) in terms of PEG-b-PMNT-Si concentration (G.2 group), 62.5 mg / Kg Cationic siRNP was administered in (G.3 group). The non-treated control was set as (G.1 group).
  • sorafenib an oral kinase inhibitor
  • sorafenib an oral kinase inhibitor
  • it is also known to exhibit antifibrotic activity in animal liver fibrosis models.
  • its use in clinical settings has been limited due to its extremely low solubility in water and low bioavailability.
  • sorafenib @ siRNP could be dissolved in phosphate buffered saline (PBS), but free sorafenib had to be dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • sorafenib @ siRNP maintains the activity of sorafenib that inhibits the growth of TWNT-1 and exhibits an antifibrotic effect.
  • sorafenib @ siRNP exhibits significantly superior low toxicity to normal endothelial cells compared to free sorafenib. This result indicates that the use of siRNP can solubilize a hydrophobic drug like sorafenib, while at the same time retaining the biological activity of the drug while suppressing adverse effects on normal cells.

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Abstract

【課題】親水性と疎水性ブロックを含む共重合体であって、生理活性物質を効率よく詰め込むことのでき、かつ、酸性条件下で安定なナノ粒子を形成できる共重合体を提供する。 【解決手段】親水部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部がポリスチレンからなり、その疎水部側鎖にラジカル消去機能を有する環状ニトロキシドラジカルおよびトリアルコキシシランがそれぞれ共有結合した共重合体が提供される。

Description

側鎖に環状ニトロキシドラジカルとトリアルコキシシリルを含む共重合体およびその使用
　本発明は、親水部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部がポリスチレンからなり、その疎水部側鎖にラジカル消去機能を有する環状ニトロキシドラジカルおよびトリアルコキシシランがそれぞれ共有結合した共重合体、並びに当該共重合体の生理活性物質のキャリヤーとしての用途に関する。
　親水部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部がポリスチレンからなり、その疎水部側鎖にラジカル消去機能を有する環状ニトロキシドラジカルを含む共重合体は、環状ニトロキシドラジカルが高分子化されることにより生体環境下で安定性を獲得した上で、ニトロキシドラジカルが発揮し得るレドックス機能を利用して、生体内における過剰な活性酸素等の産生、存在に起因するとみなせる各種障害を予防または治療できることが確認されている（例えば、特許文献１：ＷＯ　２００９／１３３６４７参照）。このような共重合体とシリカを含む有機－無機ハイブリッド複合体のナノ粒子は、当該共重合体を含むが、シリカを含まない系で自動的に組織化して作製して得られる有機ナノ粒子に比べ、酸性条件下等において安定性が向上し、また、一定の薬剤のキャリヤーとして使用できることも確認されている（例えば、特許文献２：ＷＯ　２０１３／１１８７８３又は非特許文献１：Ｈｏｓｓａｉｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｔａｒｇｅｔ，２０１４；２２（７）：６３８－６４７参照）。
　しかし、必ずしも、当該複合体のナノ粒子中に薬剤を効率よく詰め込む（または内包する）ことができない場合があり、特に、処理条件下で薬剤が変性等することにより活性に悪影響を受ける可能性のある薬剤を対象とするときには改良の余地がある。
ＷＯ　２００９／１３３６４７ ＷＯ　２０１３／１１８７８３
Ｈｏｓｓａｉｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｔａｒｇｅｔ，２０１４；２２（７）：６３８－６４７
　前述の問題点、特に、薬剤の活性に悪影響を及ぼす可能性のより少ない条件下で薬物（又は生理活性物質）を効率よく封入することができ、かつ、疎水部側鎖に含まれる環状ニトロキシドラジカルの機能を発現できる共重合体を提供することが望まれる。
　本発明者等は、今ここに、親水部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部がポリスチレンからなり、その疎水部側鎖にレドックスまたはラジカル消去機能を有する環状ニトロキシドラジカルを含む共重合体において、前記疎水部側鎖に環状ニトロキシドラジカルに加え、トリアルコキシシリル基を共有結合的に導入すると、当該共重合体それら自体が架橋することにより各種溶液中で安定なナノ粒子を形成するだけでなく、当該共重合体とテトラアルコキシシラン若しくはナノサイズのシリカとを、また、これらの系にさらに一定の薬物を共存させて処理すると、周囲温度以下、例えば、１０℃～３０℃において、効率よく生理活性物質または薬物を高含有率で封入したシリカ含有レドックスナノ粒子を提供できることを見出した。
　したがって、本発明によれば、次の態様の発明が提供される。
（１）　下記式（Ｉ）で表される共重合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
式中、
　Ａは、非置換または置換Ｃ1－Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'およびＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシまたはＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－もしくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表す。
　Ｌ1は、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
で表される基から選ばれるか、または
単結合、－（ＣＨ2）bＳ－、－ＣＯ（ＣＨ2）bＳ－、－（ＣＨ2）bＮＨ－、－（ＣＨ2）bＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－からなる群より選ばれてもよい。
　Ｘは、個々に次の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載される基を含んでなり：
　（ａ）Ｌ2－Ｒ1で表され、Ｌ2は－（ＣＨ2）a－ＮＨ－（ＣＨ2）a－または－（ＣＨ2）a－Ｏ－（ＣＨ2）a－であり、Ｒ1は、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
のいずれかである。
　（ｂ）Ｌ3－Ｒ2で表され、Ｌ3はＬ2と同義であり、Ｒ2は式：－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3で表され、各Ａｌｋは同一であるか、若しくは異なるＣ1-4アルキルである。
　（ｃ）Ｒ3で表され、Ｒ3はクロロ、ブロモまたはヒドロキシルである。
　且つ、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、（ａ）を有する単位は２～９９の範囲内にあり、（ｂ）を有する単位は１～９８の範囲内にあり、（ｃ）を有する単位は存在しないか、若しくは１～２０の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなる。
　ＺはＨ、ＳＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
　各ａは、独立して０又は１～５の整数であり、
　ｂは１～５の整数であり、
　ｋは１～１８の整数であり、
　ｍは２～１０，０００の整数を表し、
　ｎは３～１００の整数を表す。
（２）　Ｌ1がパラキシリレン，メタキシリレンまたは－ＣＨ2ＣＨ2Ｓ－であり、Ｌ2が－ＮＨ－または－Ｏ－であり、Ａｌｋが同一である、上記（１）に記載の共重合体。
（３）　（１）の式（Ｉ）で表される共重合体とポリ（第四級アミン）抗菌活性化合物とを含んでなる製薬学的組成物。
（４）　（３）の組成物であって、前記抗菌活性化合物が式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　式中、
　Ａは－（ＣＨ2）j－で表され、ｊは０又は１～１７の整数であり、
　Ｒは水素原子またはメチルであり、
　フェニルは、水素原子の１～５個の少なくとも１つがＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシまたはヒドロキシで置換されていてもよい、
で表される、化合物である、組成物。
（５）　（１）の式（Ｉ）で表される共重合体と疎水性抗癌剤とを含んでなる製薬学的組成物。
（６）　（５）の組成物であって、疎水性抗癌剤がＢＮＳ－２２〔８－［（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－キノリン－１－イル）カルボニル］－５，７－ジメトキシ－４－プロピル－２Ｈ－クロメン－２－オン〕、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセルおよび抗癌性白金錯体からなる群より選ばれる、組成物。
（７）　（３）～（６）のいずれか１の組成物であって、水性媒体中でナノサイズのミセル粒子を形成する、組成物。
（８）　生物活性物質が封入または内包された医療用シリカ含有レドックスナノ粒子であって、該シリカ含有ナノ粒子は、ナノサイズのシリカ粒子に（１）で定義した式（Ｉ）で表される共重合体の－Ｌ3－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3を介して固定されており、かつ、該シリカ粒子に生理活性物質が結合または吸着されている構造を有する、シリカ含有レドックスナノ粒子。
（９）　上記（８）に記載のシリカ含有レドックスナノ粒子であって、生理活性物質が式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　式中、
　Ａは－（ＣＨ2）j－で表され、ｊは０又は１～１７の整数であり、
　Ｒは水素原子またはメチルであり、
　フェニルは、水素原子の１～５個の少なくとも１つがＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシまたはヒドロキシで置換されていてもよい、
で表される、抗菌化合物、またはＢＮＳ－２２、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセルおよび抗癌性白金錯体からなる群より選ばれる抗癌剤である、ナノ粒子。
（１０）　（１）に記載の共重合体単独または当該共重合体と
　（ｉ）Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）4で表され、各Ａｌｋは同一であるか、若しくは異なるＣ1-4アルキルである、テトラアルコキシシラン、または
　（ｉｉ）ナノサイズのシリカ粒子を含有する透析容器中の水可溶性溶液に生理活性物質としてのポリ（第四級アミン）抗菌性化合物または疎水性抗癌剤を共存させ、周囲温度以下の温度において水に対して透析する工程を含んでなる、生物活性物質が詰め込まれたシリカ含有レドックスナノ粒子の製造方法。
　本発明によれば、式（Ｉ）で表される共重合体が提供され、当該共重合体はそれら自体が架橋することにより各種溶液中で安定なナノ粒子を形成するだけでなく、当該共重合体それら単独または当該共重合体とテトラアルコキシシラン若しくはナノサイズのシリカとを、また、これらの系にさらに一定の生理活性物質を共存させて処理することにより、効率よく生理活性物質を詰め込んだシリカ含有レドックスナノ粒子を提供できる。
製造例１で製造されたＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムによる分離スペクトルと1Ｈ　ＮＭＲスペクトル。 製造例３で製造されたＢＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＤＭＡＥＭＡの1Ｈ　ＮＭＲスペクトル。 製造例４で製造されたＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡの1Ｈ　ＮＭＲスペクトル。 製造例５で製造されるＴＥＯＳを用いたシリカ含有レドックスナノ粒子（ｓｉＲＮＰ）の光散乱スペクトル（左：高イオン強度下、右：ｐＨ＝２下）。 製造例５で製造されるＴＥＯＳを用いたシリカ含有レドックスナノ粒子（ｓｉＲＮＰ）について、左図は各粒子のポリマー当りのＳｉ含有量を示し、右図各粒子の粒子径を示す。 製造例６で得られたｓｉＲＮＰの高イオン強度下での光散乱スペクトル（左図）であり、酸性下での光散乱スペクトル（右図）。 製造例７で得られたｓｉＲＮＰの高イオン強度下での光散乱スペクトル（左図）であり、酸性下での光散乱スペクトル（右図）。 試験２における、ＢＡＥＣによる毒性評価の結果。 試験２における、ＢＡＥＣによるより高い濃度での毒性評価の結果。 製造例９（１）におけるシリカ含有レドックスナノ粒子の薬物封入効率を示す。 製造例９（２）における薬物封入シリカ含有レドックスナノ粒子の酸性下での安定性試験の結果。 製造例９（３）における、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの薬物放出試験の結果。 製造例９（４）における、ｉｎ　ｖｉｖｏ　での薬物放出試験の結果。 製造例９（４）におけるＡＵＣ分析の結果。 試験３におけるＣａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰのマウス腹腔内における抗菌能評価試験のプロトコールの概要 試験３の抗菌能評価試験の結果。 ～[図19]　試験４におけるＣａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰのマウス腹腔内投与時の毒性評価試験の結果。 製造例１０で調製されたｓｏｒａｆｅｎｉｂ　ｓｉＲＮＰの線維症に対する評価試験の結果。
発明の詳細な記述
（Ａ）共重合体について
　　式（Ｉ）で表される共重合体は、代替的に、次の式で表すことができる。
（Ｉ－ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　式中、Ａ、Ｌ1、Ｚ、ｍ、Ｌ2－Ｒ1、Ｌ3－Ｒ2、Ｒ3は上記式（Ｉ）について定義したのと同義であり、ｐは２～９９の整数であり、ｑは１～９９の整数であり、ｒは０（ゼロ）又は１～２０の整数であり、ただし、ｐ＋ｑ＋ｒは３～１００（ｎ）であり、ｐ、ｑおよびｒの付された反復単位は、ランダムにそんざいするが、一体となって、ｍの付された反復単位のブロックセグメントとは別のブロックセグメントを形成する。
　この共重合体は、水性溶液または均質な分散体において、高イオン強度下（例えば、０．３Ｍの水溶液）および酸性下（ｐＨ＝２．０）において、簡単に崩壊することのないナノサイズ（平均約２５～約４５ｎｍ）の粒子を形成する。
　本発明に関して、ナノサイズの粒子またはナノ粒子とは、それらを含む水性溶液または均質な分散体において、動的散乱光（ＤＬＳ）による解析を行った場合に、平均粒径がナノメートルのサイズ範囲内にある粒子を意味する。
　当該粒子表面が化学反応性を示さないことが望ましい場合には、Ａは、非置換Ｃ1-12アルコキシが好ましく、Ｃ1-6アルコキシがより好ましく、Ｃ1アルコキシ（メチル）が最も好ましい。
　Ａの定義に限定されるものでなく、本発明全体を通して、Ｃａ－ｚアルコキシ若しくはアルキルのように表示される場合、炭素原子数ａ個～ｚ個を有する直鎖若しくは分岐のアルコキシ若しくはアルキルを意味し、アルキル部分若しくはアルキルとしては、限定されるものでないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。
　Ｌ1としては、パラキシリレン若しくはメタキシリレン、または－（ＣＨ2）2Ｓ－の連結基であることが好ましく、Ｌ2としては，定義中のａがゼロ（０）である、－ＮＨ－または－Ｏ－であることが好ましく、－ＮＨ－がより好ましい。Ｌ1及びＬ2の様に結合の方向性により、異なる意味を有する場合には、記載された方向性において結合するものと意図されており、例えば、－（ＣＨ2）2Ｓ－の連結基にあっては、Ｓ原子が式（Ｉ）のｎの付された反復単位と結合することを意味する。
　式（Ｉ）において（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載される基を有するポリマー主鎖中の単位、または式（Ｉ－ａ）においてｐ、ｑ及びｒの付された単位の中、（ｃ）に記載される基を有するポリマー主鎖中の単位、または式（Ｉ－ａ）においてｒの付された単位は、本発明の目的を達成するためには存在しなくてもよい。
　Ｌ３－Ｒ2において、Ｌ３はＬ２と同義であり、好ましくは－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、Ｒ２は－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3であり、ｋは２～１２の整数が好ましく、３～８の整数がより好ましい。また、ｍは１２～１０００が好ましく、５０～５００がより好ましく、ｎは６～８０が好ましく、１０～６０がより好ましく、ｐは３～８０の整数であり、ｑは３～８０の整数であり、ｒは存在しないものが好ましく、ｐおよびｑはそれぞれ５以上であることが好ましい。
　このような共重合は、水、イオン強度の高められたまたは緩衝剤を含む水性媒体または水性溶液中で、疎水部をコアとし、親水部をシェルとするナノサイズのミセル粒子または粒子として存在し得る。
　前記共重合体は、限定されるものでないが、その親水部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水部がポリスチレンを含んでなり、その疎水部側鎖にハロメチレン、特にクロロメチルを含む共重合体（以下、ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳともいう）を原料とし、ＰＣＭＳのハロメチレンを介して環状ニトロキシドラジカルおよび基－Ｌ３－Ｒ２であって、Ｌ3がＮＨ又はＯであり、Ｒ２が（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3である基を共有結合的に導入することにより首尾よく提供できる。Ｌ3は、ＰＣＭＳに当該基を導入する際に、Ｌ3の相当する部分にアミノまたはヒドロキシル基を有する化合物を反応体として利用すればよい。ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳは、一般的には、ＷＯ　２０１６／０５２４６３または前記特許文献１に記載された方法により製造できる。前者に記載の方法の典型的なものは、後述する製造例において説明する。
（Ｂ）共重合体の使用について
　式（Ｉ）で表される共重合体は、それら自体でナノサイズの粒子を形成できるが、これらの粒子を形成する際に、Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）4（ここで、各Ａｌｋは同一であるか、若しくは異なるＣ1-4アルキルであり、好ましくは、同一である。）のテトラアルコキシシランまたはナノサイズのシリカ（シリカゾル）を共存させることによる、コア中に存在し得る、シリカの含有量を制御、増大でき、特に、テトラアルコキシシランを用いると、その使用量に応じて増大するシリカ含有量の粒子を得ることができる。こうして、本発明によれば、コア領域にシリカを含有し、その周辺に式（Ｉ）の共重合体に由来する疎水性セグメント部が存在し、当該コアを取り巻くシェル部に親水性セグメント部のＰＥＧ鎖が存在する、ナノサイズのシリカ含有粒子を提供できる。かようなナノサイズのシリカ含有粒子は、それらに含まれるシリカを利用して、例えば、体内の汚染物質を吸着除去するのに使用できる点でも、有用である。
　ところで、例えば、非特許文献１に記載されるように、従来のシリカ含有粒子レッドクス粒子は、一般的な生理活性物質にとっては悪影響を受けやすい比較的に高い温度（例えば、８０℃）で作成する必要があるが、式（Ｉ）の共重合体では、基Ｌ３－Ｒ２の、－ＮＨ－若しくは－Ｏ－を介した－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3の存在により、比較的低い温度（周囲温度以下、例えば、１０℃～３０℃）において目的とするナノサイズのシリカ含有粒子レッドクス粒子を作製できる点、さらには、テトラアルコキシシランを用いて得られるシリカ含有量を制御できる点に特徴がある。また、かような特徴は、粒子の形成できる系に種々の生理活性物質〔ポリ（第四級アミン）殺菌剤や疎水性抗癌剤のようにまったく化学的特徴を異にする〕を共存させて粒子を形成しても失われない。したがって、本発明によれば、上記のようなナノ粒子を形成するこができる、式（Ｉ）の共重合体（必要により、ナノサイズのシリカ（シリカゾル）由来のシリカと共に）とポリ（第四級アミン）抗菌活性化合物または疎水性抗癌剤とを含んでなる製薬学的組成物も提供できる。組成物における式（Ｉ）の共重合体、場合により含まれるナノサイズのシリカ（シリカゾル）由来のシリカおよび生理活性物質の混合比は、選択される各成分によって最適値が変動するが、水性媒体中でナノミセルを形成することが出来るものであれば限定されず、このましい比率は後述の製造例、試験例を参照して決定することが出来る。
　かような組成物から水性媒体中で形成されたナノサイズのミセル粒子は、例えば、凍結乾燥、遠心分離、等をすることにより、上記の（８）の態様のシリカ含有レドックスナノ粒子を提供することもできる。
　生物活性物質若しくは薬物含有または非含有ナノ粒子は、高イオン強度下での凝集がなく、酸性下でアミノ基のプロトン化状態でも崩壊しない安定な粒子であり、しかも、生理活性物質として抗菌活性化合物または抗癌剤を含有するときには、所期の生理活性を発揮する一方で、正常なヒト内皮細胞に対しては毒性を殆ど示さない点に特徴を有する。
　したがって、こうして提供される、抗菌剤や抗癌剤を封入または内包したシリカ含有粒子レドックスナノ粒子は、水性媒体中で、可溶化または均一に分散した溶液または液剤として提供できるのであらゆる形態にある非経口製剤または経口製剤を調製するのに使用できる。前記シリカ含有粒子レドックスナノ粒子は凍結乾燥することにより固形物として提供できるので、それ自体の当該技術分野で常用されている賦形剤、希釈剤を利用して錠剤、丸薬、顆粒剤として提供することもできる。なお、本発明に関し、封入と内包の語は、互換可能な語として用いられている。
　かようなナノ粒子は、上記の（１０）に記載した態様の製造方法により、都合よく提供できる。ここで、式（Ｉ）の共重合体とテトラアルコキシシランまたはナノサイズのシリカ粒子と生理活性物質は、水可溶性の有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の溶液として透析容器に充填される。当該容器の形状は問わないが、使用に耐えられる形態にあるものであればいずれでもよく、例えば、分画分子量１２ｋＤａ～１４ｋＤａの透析チュ―ブであることができる。透析は水に対して行われ、目的のシリカ含有レドックスナノ粒子が形成されるのに十分な時間、十分な回数行われる。具体的な条件についは、後述するので、当業者であれば、それらを参照して、必要があれば改変して、実施できる。
　生理活性物質には、上述するとおり、化学的特徴を全く異にするポリ（第四級アミン）殺菌剤や疎水性抗癌剤に上記方法が適用できるので、それ自体公知のポリ（第四級アミン）殺菌剤や疎水性抗癌剤であって、本発明の目的に沿うものであればいずれも包含される。代表的な、前記抗菌剤は、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　式中、
　Ａは－（ＣＨ2）j－で表され、ｊは０又は１～１７の整数であり、
　Ｒは水素原子またはメチルであり、
　フェニルは、水素原子の１～５個の少なくとも１つがＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシまたはヒドロキシで置換されていてもよい、
で表される、抗菌化合物を挙げることができる。他方、疎水性抗癌剤としては、ＢＮＳ－２２〔８－［（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－キノリン－１－イル）カルボニル］－５，７－ジメトキシ－４－プロピル－２Ｈ－クロメン－２－オン〕、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセル、抗癌性白金錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン）等を挙げることができる。
　前記抗菌剤に関して、一般的には、次の反応スキームに従い、製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　また、疎水性抗癌剤は、それ自体公知であり、ＢＮＳ－２２に見られるような低い水溶性を有する化合物であればいずれも利用することできる。
　生理活性物質を封入したシリカ含有レドックスナノ粒子は、生理活性物質の特性、化学構造により最大封入量が変動するのと特定できないが、例えば、生理活性物質が後述するＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡであり、毒性が低いものは、式（Ｉ）の共重合体対生理活性物質は、質量比にて、２：１～４００：１、好ましくは、４：１～２００：１とすることができる。
　当該技術分野では、抗菌ペプチドはその両親媒性とカチオン性によって選択的に静電的作用によってバクテリアの膜を破壊し殺菌作用を持つことが知られつつある。従来のペニシリンなどに代表される抗生物質は、タンパク質の機能阻害などをもとに抗菌能を発揮するため、しばしば耐性菌を作り出すことが大きな問題とされてきたが、抗菌ペプチドは物理的破壊に基づくため比較的耐性菌を創出しにくいことが考えられいくつかの研究が進められている。近年ではペプチドのみならず、これを模倣した抗菌ポリマーの開発も進められている。上記の本発明の抗菌剤が詰め込まれたナノ粒子は、かようなトレンドに沿うものでもある。くわえて、当該粒子内に同時に含有される、環状ニトロキシドラジカルのレドックス機能、また、シリカの吸着機能が発揮されることから、例えば、細菌性腹膜炎、特に、腹膜透析患者の腹腔内感染症の予防および／または治療に好適に使用できる。また、抗癌剤が詰め込まれたまたは内包されたシリカ含有レドックスナノ粒子は、酸性条件下、高イオン強度下で安定であり、前述したとおり、非経口投与に加えて、経口投与できることから、消化器系の癌の予防および／または治療に好適に使用できる。
　上記のような疾患の治療に使用する場合の、生理活性物質の詰め込まれたシリカ含有レドックスナノ粒子の用量は、疾患の種類程度等により最適値が変動するので限定的でなく、例えば、小規模の動物実験を実施して得られるデータ等に基づいて専門医が決定することができる。
　以下、具体例を参照に本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、それらに限定されることを意図するものでない。
製造例１：ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（クロロメチルスチレン）（ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ） ジブロック共重合体の合成
　ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　末端にヒドロキシ基を持つメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＯＨ）（Ｍｎ：５０００；３ｍｍｏｌ，１５ｇ）を１１０℃で１２時間真空引きすることによって脱水を行った。その後窒素雰囲気にした後テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を６０ｍＬ加えた。次いで、そこにｎ－ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）（０．３８４ｇ，６ｍｍｏｌ）を加えた。更にα，α’－ジクロロパラキシレン（５．２５ｇ，３０ｍｍｏｌ）を加えることによりポリエチレングリコール－クロロパラキシレン（ＰＥＧ－Ｃｌ）を合成した。イソプロピルアルコールに対して沈殿させることで精製処理を行った（収量１３．７７ｇ、収率９１．８％）。二硫化炭素（０．９７４ｇ，１２．８ｍｍｏｌ）とベンゾマグネシウムブロマイド（末端に連鎖開始剤をもつポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＣＴＡ）を回収した（収量７．７６ｇ，収率 ９７％）。ＰＥＧ－ＣＴＡ（Ｍｎ：５０００；０．７ｍｍｏｌ，３．５ｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（１１４．９ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）とクロロメチルスチレン（２１ｍｍｏｌ，３ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、肌色の粉体を得た。これによりポリエチレングリコール－ポリクロロメチルスチレン（ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ）の合成が完了し、収量は、４．４５ｇだった（収率７２％）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムによる分離スペクトルとＮＭＲスペクトルを図１に示す。
製造例２：ＴＥＭＰＯとシリカをランダムに結合させたスチレンポリマーを有するジブロックポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ）の合成
　ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉは以下のスキーム２に従って合成した；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　反応容器に、ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ（Ｍｎ：８８７８；１．１９１ｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。８ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で溶解した。次に、４－アミノ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン １－オキシル（Ａｍｉｎｏ－ＴＥＭＰＯ）（２．５ｇ，１４．６ｍｍｏｌ）を４ｍＬのＤＭＦに溶解し反応容器に加え、アミノプロピルトリメトキシサイレーン（ＡＰＴＭＳ）（０．２６１ｇ，１．４６ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌を行った。
製造例３：ベンジルメチルアミン－ＰＥＧ－ｂ－ポリメタクリル酸［２－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）アミノエチル］ （ＢＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＤＭＡＥＭＡ）の合成
　ＢＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＤＭＡＥＭＡは以下のスキーム３に従って合成された:
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　反応器に１５０ｍＬのＴＨＦ、１－フェニルエチレンジアミン０．３ｇおよびカリウムナフタレン（３ｍＬ、０．９Ｍ）を加え、更にエチレンオキシド１２ｇを入れて室温で２４時間撹拌し、アニオン重合により末端がベンジルメチルアミンのポリエチレングリコールを合成した。その後ジメチルアミノエチルメタクリル酸（１２ｇ）を入れて室温で２４時間撹拌し、ベンジルメチルアミンポリエチレングリコール－ｂ－ポリメタクリル酸［２－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）アミノエチル］を合成した。ジエチルエーテルによる沈殿精製を行った。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムによる分離スペクトルとＮＭＲスペクトルを図２に示す。
製造例４：ベンジルジメチルアミン－ＰＥＧ－ｂ－ポリメタクリル酸［２－（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル）アミノエチル］（ＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡ）の合成
　ＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡは以下のスキーム４にしたがって合成された：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　反応器にＢＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＤＭＡＥＭＡ（６ｇ）を入れて、ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解しヨウ化メチル（５ｇ）を追加した。室温で２４時間撹拌した。イソプロピルアルコールによって沈殿精製を行い、黄色の粉体を得た。ＮＭＲスペクトルを図３に示す。
製造例５：ＴＥＯＳを用いたシリカ含有レドックスナノ粒子（ｓｉＲＮＰ）の設計
　製造例２で得られたＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ反応混合物を２．８ｇ（活性成分４８０ｍｇ含有）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を３３３ｍｇおよびＤＭＦ４８ｍＬを混合し、透析チューブ（分画分子量１２ＫＤａ－１４ｋＤａ）に入れ、２Ｌの水に対して透析した。１２時間ごとに水を５回交換した。得られた溶液を高イオン強度水（ＮａＣｌ＝０．３Ｍ）および酸性水（ｐＨ＝２．０）に調製し、２４時間後に光散乱およびゼータ電位を測定した結果を図４に纏める。
　図４から高イオン強度下での平均粒径および表面のゼータ電位は、それぞれ３８．３ｎｍ、－０．６ｍＶであり、ｐＨ＝２．０下での平均粒径および表面のゼータ電位は、それぞれ３９．８ｎｍ、１４．６ｍＶであり、高イオン強度下での凝集がなく、酸性下でアミノ基のプロトン化状態でも崩壊しない安定な粒子であることが確認される。調製前後でＥＳＲ強度は全く変化せず、これまでの問題であった熱処理なしに安定なシリカ含有レドックスナノ粒子の作製が可能となった。
　次に同様にして透析し（Ｉ）ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴのミセル、（ＩＩ）ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉのナノ粒子、（ＩＩＩ）ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－ＳｉとＴＥＯＳを６０％（ＳｉＯ2 ｗｅｉｇｈｔ/ｐｏｌｙｍｅｒ ｗｅｉｇｈｔ）混合したナノ粒子の３種類の透析物を得た。その結果、動的散乱光（ＤＬＳ）による解析によると図５右図の通りの粒子径をもつ粒子を得ることが出来これらのＳｉ含有量を誘導結合プラズマ発行分光分析（ＩＣＰ－ＭＡＳＳ）によって解析した結果、ＴＥＯＳ導入量に応じて図５の通りのシリカ含有量の粒子を得ることが出来た。
製造例６：シリカゾルを用いたｓｉＲＮＰの設計
　製造例２で得られたＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ反応混合物を２．８ｇ（活性成分４８０ｍｇ含有）、メタノールシリカゾル（日産化学製、１０－１５ｎｍ）を３２０ｍｇおよびＤＭＦ４８ｍＬを混合し、透析チューブ（分画分子量１ＫＤａ－１４ｋＤａ）に入れ、２Ｌの水に対して透析する。１２時間ごとに水を５回交換した。得られた溶液を高イオン強度水（ＮａＣｌ＝０．３Ｍ）および酸性水（ｐＨ＝２．０）に調製し、２４時間後に光散乱およびゼータ電位を測定した結果を図６に纏める。図６から高イオン強度下での平均粒径および表面のゼータ電位は、それぞれ４２．０ｎｍ、－０．１７ｍＶであり、ｐＨ＝２．０下での平均粒径および表面のゼータ電位は、それぞれ３６．２ｎｍ、１５．２ｍＶであり、高イオン強度下での凝集がなく、酸性下でアミノ基のプロトン化状態でも崩壊しない安定な粒子であることが確認される。
　調製前後でＥＳＲ強度は全く変化せず、これまでの問題であった熱処理なしに安定なシリカ含有レドックスナノ粒子の作製が可能となった。
製造例７
　製造例２で得られたＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ反応混合物を２．８ｇ（活性成分４８０ｍｇ含有）、ＤＭＦ４８ｍＬを混合し、透析チューブ（分画分子量１２ＫＤａ－１４ｋＤａ）に入れ、）の水に対して透析する。１２時間ごとに水を）５回交換した。得られた溶液を高イオン強度水（ＮａＣｌ＝０．３Ｍ）および酸性水（ｐＨ＝２．０）に調製し、２４時間後に光散乱およびゼータ電位を測定した結果を図７に纏める。図７から高イオン強度下での平均粒径および表面のゼータ電位は、７３．１ｎｍ、１．２６ｍＶであり、酸性下の平均粒径および表面のゼータ電位は４５．９ｎｍ、２０．２ｍＶであり、高イオン強度下での凝集がなく、酸性下でアミノ基のプロトン化状態でも崩壊しない安定な粒子であることが確認される。
　調製前後でＥＳＲ強度は全く変化せず、これまでの問題であった熱処理なしに安定なシリカ含有レドックスナノ粒子の作製が可能となった。
製造例８：シリカ含有カチオン性レドックスナノ粒子（Ｃａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰ）の設計
　ＤＭＦ中に溶解したＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ（１３０．９ｍｇ）とＴＨＦに溶解したＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡ（１０４ｍｇ）とＴＥＯＳを混合した後アンモニア水（０．７ｍＬ）を加えて撹拌し透析膜に入れて水に対して透析を行った。混合量は表１に従う。１２時間後６時間後３時間後と２Ｌの水を３回交換し、動的散乱光によって平均粒子径を測定した。これにより３０～６０ｎｍのナノ粒子が形成されていることを確認した。シリカの混合量依存的に粒子径が変わることを確認した。これらの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　同様の方法にして、ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－ＳｉとＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡの導入量の比率を異なったものを複数作成した。比率は表２に従う。ＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡの減少によりゼータ電位が変化すること、粒子径に影響を与えないことを観察した。結果を下記の表３にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
試験１：シリカ含有カチオン性レドックスナノ粒子（Ｃａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰ）のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）（ＪＣＭ２１５１）に対する抗菌効果の評価
　上記のように作製したＣａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰをミューラーヒントン培養液と混合して段階希釈し、５０μＬごと分注し、そこに同培養液中の１×１０6 ＣＦＵ/ｍＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＪＣＭ２１５１）（国立研究開発法人　理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室から入手）を５０μずつ９６ウェルプレート中で混合した。２０時間培養し最小増殖阻止濃度（ＭＩＣ）を算出することによりその抗菌能を確認した。濃度はＰＥＧ―ｂ―ＰＭＮＴ―Ｓｉポリマー換算による。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
試験２：シリカ含有レドックスナノ粒子のウシ大動脈内皮細胞（Ｂｏｖｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に対する毒性評価
　決定したＭＩＣ濃度での毒性を正常組織細胞であるＢｏｖｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＢＡＥＣ）を用いて評価した。
　ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ)中Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））濃度１０％の培養液を用いて培養を行った。９６　ｗｅｌｌプレートに細胞を５０００細胞ずつまいた後２４時間後に細胞に対して各ナノ粒子をＭＩＣ濃度投与した。その後、２４時間後にＷＳＴ－８ ｋｉｔ試薬を用いて、試薬滴下後２時間後の４５０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクの測定値を引いた後に、Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）の値で割ることで、生存比率を算出した。その結果を図８に示す。図８よりＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－ＳｉとＢＤＭＡ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＴＭＡＥＭＡの導入比率によって毒性と抗菌能を調整できることがわかった。このことにより、毒性が低く抗菌能を持つ最適な比率を決定し、シリカ含有レドックスナノ粒子を創出した。また、より高い２倍３倍ＭＩＣ濃度でのナノ粒子の毒性を評価しけた結果、毒性が出ない傾向があることを示唆する。結果を図９に示す。
製造例９：ＢＮＳ－２２およびシリカ含有レドックスナノ粒子（ＢＮＳ－２２　ｓｉＲＮＰ）の設計
（１）ナノ粒子の製造例
　ナノ粒子中にＢＮＳ－２２を封入するために、ＤＭＦ中に溶解したＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ（５０ｍｇ）溶液中にＢＮＳ－２２を１０ｍｇ（ポリマー重量に対して２０重量％）若しくは２０ｍｇ（ポリマー重量に対して４０重量％）加えて２４時間撹拌した。次いで、２４時間水に対して透析を行った。こうして得られたナノ粒子をｓｉＲＮＰと略称する。
　また、ＤＭＦ中に溶解したＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ（５０ｍｇ）溶液中にＴＥＯＳ　９０μＬ（８３．９７ｍｇ）および、それぞれＢＮＳ－２２を１０ｍｇもしくは２０ｍｇ加え、２４時間撹拌した。次いで、２４時間水に対して透析を行った。こうして得られるナノ粒子はＤＬＳ測定により約８０ｎｍの平均粒径を有していた。以下、かような粒子をｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳと称する。透析後、ＢＮＳ－２２の封入は３１５ｎｍの最大吸収波長をもつＢＮＳ－２２の特性を利用し吸光度を測定することによって評価した。結果を図１０に示す。
　図１０から、ＢＮＳ－２２の封入効率は従来法のナノ粒子であるＲＮＰ（Ｎ）（例えば、特許文献１参照）が７～８％なのに対しｓｉＲＮＰは１０～１２％と有意に増加することを確認した。ＴＥＯＳをナノ粒子形成系に共存させることにすることによって、得られるｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳ粒子においては、更に封入効率が１７～１８％と増加した。ＲＮＰ（Ｎ）に高量で薬物を封入させようとしたときは白濁したが、ｓｉＲＮＰの時にそれが透明の液体となっていることからもｓｉＲＮＰがＲＮＰ（Ｎ）に比べて高い薬物封入効率を有することがわかる。
（２）ナノ粒子の酸性条件下での安定性試験
　（１）にしたがって得られた各ナノ粒子含有溶液を酸性水（ｐＨ＝２．５：胃の中の状態）に調製し、粒子の形状を経時的にＤＬＳ測定により評価した。結果を図１１に示す。
　図１１からｓｉＲＮＰおよびｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳは従来法により作製できるＲＮＰ－Ｎに比べて低酸性条件下でより安定であることがわかる。
（３）ナノ粒子からの薬物の放出試験
　ｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳを０．５重量％の水溶液（ｐＨ＝２．５およびｐＨ＝７．５）を室温下に静置し、遊離の薬物量を経時的に測定した。その結果を図１２に示す。
　図１２から、ｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳは、ｐＨ＝２．５およびｐＨ＝７．５いずれにおいてもナノ粒子から徐々に放出されることがわかる。
（４）ナノ粒子の薬物動態試験
　上記（１）で得られるＢＮＳ－２２含有ｓｉＲＮＰ（ＢＮＳ－２２＠ｓｉＲＮＰ＋ＴＥＯＳ：上記で一番薬物内包率の高かったもの）の０．７５重量％の水溶液を８週齢のマウス（ＩＣＲ　ｍｉｃｅ）に経口摂取させた。動物から経時的に血液を採取し、薬物の血漿濃度を検出した。対照として、薬物０．５重量％のカルボキシメチルセルロース液（ＢＮＳ－２２（ＣＭＣ０．５％））を同様に経口摂取させた。結果を図１３に示す。
　結果を、ＡＵＣ分析の結果と共に図１４に示す。
　図から、ＢＮＳ－２２＠ｓｉＲＮＰの経口投与後、高濃度のＢＮＳ－２２が血中で検出された。生物学的利用能を厳密に評価するため、血中薬物濃度時間面積（Ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ：　ＡＵＣ）による分液を行った結果、ＢＮＳ－２２＠ｓｉＲＮＰのＡＵＣはＢＮＳ－２２と比べて大幅に増加することが確認された。これらの結果は、ｓｉＲＮＰによるＢＮＳ－２２の生物学的利用能の向上を示唆する。
試験３：シリカ含有カチオン性レドックスナノ粒子（Ｃａｔｉｏｎ　ｓｉＲＮＰ）のマウス腹腔内における抗菌能評価
　この試験は、作製したカチオン性シリカ含有レドックスナノ粒子（Ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｓｉＲＮＰ）を用いて、腹膜透析患者において腹腔内に菌が入り込む状況を想定しマウスを用いて抗菌能の評価を行った。
　ＩＣＲマウスの腹腔内にバクテリアであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＪＣＭ２１５１株)を１×１０８　ＣＦＵ注射した。その後Ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｓｉＲＮＰをＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ濃度に換算して２５０ｍｇ／Ｋｇ（マウス体重)，１２５ｍｇ／Ｋｇ，６１．２５ｍｇ／Ｋｇ投与した。１２時間後に腹腔内を生理食塩水で洗浄し、洗浄液をＴＳＢ－ａｇａｒ培地で培養しコロニー数を比較した。
　プロトコール：
　８週齢のＩＣＲ（Ｃｒ）マウスの腹腔内にＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＪＣＭ２１５１）　１×１０８　ＣＦＵ（５００μＬ）を注入。試験は、１群６匹で実施した。プロトコールの概要を図１５に示し、試験の結果を図１６に示す。
　図１６から、２５０ｍｇ／Ｋｇの濃度で顕著に抗菌能を示しそれ以下の濃度においてもその傾向が見られたことがわかる。
試験４：カチオン性シリカ含有レドックスナノ粒子のマウス腹腔内投与時の毒性評価
　腹腔内にＣａｔｉｏｎｉｃ　ｓｉＲＮＰを投与したときの毒性を血中マーカー及び血中電解質濃度を測定することで評価した。すなわちＩＣＲマウス（９週齢、ＩＣＲ（Ｃｒ）；１群５匹）腹腔内にＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ－Ｓｉ濃度換算で２５０ｍｇ／Ｋｇ（マウス体重）（Ｇ．２群）、 ６２．５ｍｇ／Ｋｇ（Ｇ．３群）でＣａｔｉｏｎｉｃ　ｓｉＲＮＰの投与を行った。なお、非処置対照を（Ｇ．１群）とした。２４時間後に心臓より採血を行い、次いで遠心分離を行って血球細胞を除去した後、血清中のタンパクについてＦＵＪＩＦＩＬＭ乾式臨床化学分析装置富士ドライケム７０００Ｖ（富士フィルム株式買会社製）を用いて測定した。結果を図１７、１８、１９に示す。これらの図から、Ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｓｉＲＮＰはマウス腹腔内において抗菌性を示す濃度において顕著な全身毒性が認められないものとみなせる。
製造例１０：ソラフェニブおよびシリカ含有レドックスナノ粒子（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ　ｓｉＲＮＰ）の設計
（１）はじめに
はじめに、経口キナーゼ阻害剤であるソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）は、進行性肝癌や腎癌の使用されてきた。最近、動物の肝線維症モデルにおいて抗線維症活性を示すことも知られている。しかし、水中での極めて低い溶解性や低いバイオアベイラビティーに起因して臨床環境下でのその使用は限定されていた。
　本製造例および試験では、前述のｓｉＲＮＰ中へのソラフェニブの封入および可溶化について試みる。
（２）ナノ粒子の製造例及びそれらの特性の決定
　種々のＴＥＯＳ（ＳｉＯ２の～７５％）含有ＤＭＦの１ｍＬ中にＰＥＧ－ｓｉＰＭＮＴの１００ｍｇを入れたバイアルにソラフェニブ１０ｍｇを加えた。次いで、ＮＨ３２０μＬを加え、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を透析膜チューブ（ＭＷＣＯ　３．５ｋＤａ）に移し、蒸留水に対し透析した。透析中、透析液を数度交換した。
　薬物封入効率（ＥＥ）および薬物封入能（ＬＣ）を２５４ｎｍにおけるＵＶの検出を用いるＨＰＬＣによって決定した。結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
注：　薬物内包率（ＥＥ）（％）＝ナノ粒子中の薬物重量／用いた薬物重量
　　　薬物詰め込み能（％）＝ナノ粒子中の薬物重量／用いたナノ粒子重量
（３）抗線維症活性の評価
　肝線維症の病原において重要な役割を担う肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａ　ｃｅｌｌ）の不死化細胞株：ＴＷＮＴ－１（ＣＶＣＬ　Ｊ３６４）を用いソラフェニブおよびｓｏｒａｆｅｎｉｂ＠ｓｉＲＮＰについて抗線維症活性を評価した。増殖アッセイ（ＭＭＴ　ｋｉｔ）を用い、種々の濃度のソラフェニブおよびｓｏｒａｆｅｎｉｂ＠ｓｉＲＮＰを９６－ウエルプレート（５０００細胞／ｗｅｌｌ）に加え、２日間インキュベートした。このアッセイでは、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ＠ｓｉＲＮＰはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解できたが、遊離のソラフェニブはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する必要があったことに注意する必要がある。評価の結果を図２０に示す。左図はＴＷＮＴ－１に対する評価結果であり、右図は正常な内皮細胞（ＢＡＥＣ）に対する評価結果である。
　左図からｓｏｒａｆｅｎｉｂ＠ｓｉＲＮＰはＴＷＮＴ－１の増殖を阻害するソラフェニブの活性を維持し、抗線維症効果を示すことがわかる。他方、右図からｓｏｒａｆｅｎｉｂ＠ｓｉＲＮＰは遊離のソラフェニブに比べて正常な内皮細胞に対して有意に優れた低毒性を示す。この結果は、ｓｉＲＮＰの使用がソラフェニブのように疎水性薬物を可溶化できると同時に、薬物の生物活性を保持する一方で、正常細胞に対する悪影響を抑制できることを示している。

Claims (10)

  1. 　下記式（Ｉ）で表される共重合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    式中、
    　Ａは、非置換または置換Ｃ1－Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'およびＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシまたはＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－もしくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表す。
    　Ｌ1は、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    で表される基から選ばれるか、または
    単結合、－（ＣＨ2）bＳ－、－ＣＯ（ＣＨ2）bＳ－、－（ＣＨ2）bＮＨ－、－（ＣＨ2）bＣＯ－、－ＣＯ－、－ＯＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－からなる群より選ばれてもよい。
    　Ｘは、個々に次の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載される基を含んでなり：
    　（ａ）Ｌ2－Ｒ1で表され、Ｌ2は－（ＣＨ2）a－ＮＨ－（ＣＨ2）a－または－（ＣＨ2）a－Ｏ－（ＣＨ2）a－であり、Ｒ1は、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    のいずれかである。
    　（ｂ）Ｌ3－Ｒ2で表され、Ｌ3はＬ2と同義であり、Ｒ2は式：－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3で表され、各Ａｌｋは同一であるか、若しくは異なるＣ1-4アルキルである。
    　（ｃ）Ｒ3で表され、Ｒ3はクロロ、ブロモまたはヒドロキシルである。
    　且つ、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、（ａ）を有する単位は２～９９の範囲内にあり、（ｂ）を有する単位は１～９８の範囲内にあり、（ｃ）を有する単位は存在しないか、若しくは１～２０の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなる。
    　ＺはＨ、ＳＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）－Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
    　各ａは、独立して０又は１～５の整数であり、
    　ｂは１～５の整数であり、
    　ｋは１～１８の整数であり、
    　ｍは２～１０，０００の整数を表し、
    　ｎは３～１００の整数を表す。
  2. 　Ｌ1がパラキシリレン，メタキシリレンまたは－ＣＨ2ＣＨ2Ｓ－であり、Ｌ2が－ＮＨ－または－Ｏ－であり、Ａｌｋが同一である、請求項１の共重合体。
  3. 　請求項１の式（Ｉ）で表される共重合体とポリ（第四級アミン）抗菌活性化合物とを含んでなる製薬学的組成物。
  4. 　請求項３の組成物であって、前記抗菌活性化合物が式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    　式中、
    　Ａは－（ＣＨ2）j－で表され、ｊは０又は１～１７の整数であり、
    　Ｒは水素原子またはメチルであり、
    　フェニルは、水素原子の１～５個の少なくとも１つがＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシまたはヒドロキシで置換されていてもよい、
    で表される、化合物である、組成物。
  5. 　請求項１の式（Ｉ）で表される共重合体と疎水性抗癌剤とを含んでなる製薬学的組成物。
  6. 　請求項５の組成物であって、疎水性抗癌剤がＢＮＳ－２２〔８－［（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－キノリン－１－イル）カルボニル］－５，７－ジメトキシ－４－プロピル－２Ｈ－クロメン－２－オン〕、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセルおよび抗癌性白金錯体からなる群より選ばれる、組成物。
  7. 　請求項３～６のいずれか１の組成物であって、水性媒体中でナノサイズのミセル粒子を形成する、組成物。
  8. 　生物活性物質が封入または内包された製薬学的シリカ含有レドックスナノ粒子であって、該シリカ含有ナノ粒子は、ナノサイズのシリカ粒子に請求項１で定義した式（Ｉ）で表される共重合体の－Ｌ3－（ＣＨ2）k－Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）3を介して固定されており、かつ、該シリカ粒子に生理活性物質が結合または吸着されている構造を有する、シリカ含有レドックスナノ粒子。
  9. 請求項８のシリカ含有レドックスナノ粒子であって、生理活性物質が式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    　式中、
    　Ａは－（ＣＨ2）j－で表され、ｊは０又は１～１７の整数であり、
    　Ｒは水素原子またはメチルであり、
    　フェニルは、水素原子の１～５個の少なくとも１つがＣ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシまたはヒドロキシで置換されていてもよい、
    で表される、抗菌化合物、またはＢＮＳ－２２、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、カンプトテシン、パクリタキセルおよび抗癌性白金錯体からなる群より選ばれる抗癌剤である、ナノ粒子。
  10. 　請求項１の共重合体単独または当該共重合体と
    　（ｉ）Ｓｉ（Ｏ－Ａｌｋ）4で表され、各Ａｌｋは同一であるか、若しくは異なるＣ1-4アルキルである、テトラアルコキシシラン、または
    　（ｉｉ）ナノサイズのシリカ粒子を含有する透析容器中の水可溶性溶液に生理活性物質としてのポリ（第四級アミン）抗菌性化合物または疎水性抗癌剤を共存させ、周囲温度以下の温度において水に対して透析する工程を含んでなる、生物活性物質が封入または内包されたシリカ含有レドックスナノ粒子の製造方法。
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