JP6002567B2 - 試料前処理方法 - Google Patents
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Description
生体試料を液相で塩酸を用いて処理すること、および
酸処理した試料を、強酸性陽イオン交換樹脂に添加し、非酸性条件下で溶出すること
を含む方法を提供する。
また本発明は、上記方法により調製された試料を液体クロマトグラフィー−質量分析することを含む、最終糖化産物の分析方法を提供する。
(試料の調製)
−80℃のディープフリーザで凍結保存されていた血清を室温で溶解した。2mLチューブに、解凍した血清を50μLずつ分注した。全てのサンプルに20質量%塩酸溶液を1mLずつ添加し、よく懸濁して塊をつぶした後、チューブをボルテックスにかけ、血清の塊がなくなるまでしっかりと溶かした。次いで、サンプルを入れたチューブをドライバスにセットし、100℃で一晩(18時間)、加水分解を行った。反応中にチューブの上部に塊が形成した場合、チューブを指で弾いて塊を液中に落とした。加水分解反応後、試料を遠心エバポレーターにて乾固させ、室温保存した。
強酸性陽イオン交換樹脂充填カラム(Oasis(商標)MCX 1cc、型番186001881、日本ウォーターズ社)をサンプル数分用意し、バキュームマニホールドにセットした。カラムの洗浄のため、カラムにメタノールを1mLずつ滴下し、バキュームマニホールドの減圧を開始した状態でチューブとの接続部のコックを開いてメタノールを通過させた。続いて、カラムに超純水を1mLずつ滴下し、通過させた。
乾固サンプルの入った2mLチューブに1mLの純水を添加し、ソニケーターをかけて乾固サンプルを溶解させた。乾固サンプルが完全に溶けたら、遠心機で10,000rpmで5分間遠心した。上清を回収し、洗浄済みカラムへ滴下して通過させた。続いて、洗浄液(0.1N塩酸水溶液)を3mLを通過させて洗浄を行った。
バキュームマニホールドのそれぞれのカラムの下に、溶出液回収用チューブをセットした。カラムに溶離液(7質量%アンモニア水溶液)3mLを滴下し、溶出した液を回収した。回収した溶出液は2mLチューブに1mL分注し、吹付式試験管濃縮装置にセットして乾固させた。
乾固したサンプルを、ボルテックスまたはソニケーターを使って80体積%アセトニトリル+0.1質量%ギ酸水溶液500μLに溶解した。孔径0.22μmのフィルター付き遠心チューブに溶解液を全量入れ、遠心機で10,000rpmで5分間遠心した。フィルターを通過した溶液を回収し、回収液に80体積%アセトニトリル+0.1質量%ギ酸水溶液500μLを添加した。この溶液をAGE分析用試料とした。
〔N−ε−(カルボキシメチル)リジン(CML)〕
市販品(PolyPeptide Laboratories社、US、品番:SC1505)を標準試料とした。
〔S−(2−スクシニル)システイン(2SC)〕
チューブにN‐acetyl-Cys(48.9mg)、N-ethylmaleimide(75mg)を入れ、純水で10mLまでメスアップした。室温で2時間インキュベートした後、等量ずつ4本のネジ栓付チューブに分け、遠心式濃縮装置で乾燥させた。各乾燥サンプルに6N塩酸水溶液を1mL加え110℃で24時間加水分解させた後、加水分解産物を遠心濃縮した。各乾燥サンプルを5mLの1質量%TFAに溶解させた。予め10質量%塩酸水溶液で洗浄し、約5倍量の1質量%TFAで平衡化させたDOWEX50カラム(The Dow Chemical Company)にサンプルのTFA溶液をアプライし、通過画分を回収した。1質量%TFAを流し、回収液量が50mL程度になるまで通過画分を回収した。次に、5Mアンモニア水溶液(約25mL)を添加後、溶出液を吸着画分として回収した。薄層クロマトグラフィーで2SCの存在を確認した。吸着画分は凍結乾燥させ、これを標準試料とした。
〔メチルグリオキサール−イミダゾロン(MG−H)〕
1N水酸化ナトリウム溶液(49mL)と40質量%Methyl Glyoxal溶液(862μl)を混合し、これにL-Argine(871mg)を添加して攪拌し、37℃で1時間インキュベートした。塩酸でサンプル溶液を中性にした。予め10質量%ピリジン水溶液と10質量%塩酸水溶液で洗浄し、純水で平衡化させたDOWEX50カラム(The Dow Chemical Company)にサンプル溶液25mLをアプライし、カラム2倍量の純水を流した後、10質量%ピリジン水溶液で溶出させ、約3mLずつ分取した。各分画を濾紙にスポットし、ここに0.5質量%ニンヒドリン−水飽和ブタノール溶液を噴霧し、加熱、発色させた。発色した画分とMG−Hのアイソフォーム1の市販品(PolyPeptide Laboratories社、US、品番:SC1528)とをシリカゲルプレートにスポットし、クロロホルム:メタノール:水=4:6:2の混合溶媒で展開させ、ここに0.5質量%ニンヒドリン−水飽和ブタノール溶液を噴霧し、加熱、発色させた。市販品と同じ位置に発色した部分を削り取って回収し、エバポレーターでピリジンを蒸発させた後に−80℃で凍結させ、次に凍結乾燥をさせた。この凍結乾燥サンプル500mgを約1mLの純水に溶解させ、シリカゲルカラム(内径17mm、ベッド高440mm)にアプライし、90体積%アセトニトリル(50mL)で、次に80体積%アセトニトリル(150mL)で、次に70体積%アセトニトリル(150mL)で溶出を行い、溶出液を約8mLずつ分取した。分取した各画分を濾紙にスポットし、ここに0.5質量%ニンヒドリン−水飽和ブタノール溶液を噴霧した。発色した画分を選択し、前述の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、MG−Hの存在を確認した。選択した画分は、凍結乾燥させ、再度シリカゲルカラムで精製を行い、分取した各画分を濾紙にスポットし、ここに0.5質量%ニンヒドリン−水飽和ブタノール溶液を添加した。発色した画分を選択し、前述の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、MG−Hの存在を確認した。確認できた画分を集め、これを標準試料とした。
CML、2SC、MG−Hの各標準試料は、質量分析計にて分子量を調べ、目的とする物質であることを確認した。
実施例1で得られたAGE分析用試料の全量をLC−MS/MSにかけ、CML、2SCおよびMG−Hを測定した。対照として、酸加水分解を行わなかった以外は実施例1と同じ手順で調製した試料、および強酸性陽イオン交換樹脂の代わりにC18化シリカ担体充填カラムSep−Pak(登録商標)C18(日本ウォーターズ社)を用いた以外は実施例1と同じ手順で調製した試料について、同様に測定した。
LC−MS/MS測定の条件は以下のとおりである。
(HPLC条件)
クロマトグラフィーカラム:SeQuant、ZIC−HILIC,150×2.1mm、5μm、200A Peek Hplc Column
カラム温度:40℃
移動相:A:0.1質量%ギ酸水溶液、B:0.1質量%ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジュエント条件:A:10%+B:90%
流速:200μL/min
インジェクション量:10μL
分析時間:20分
溶出時間:MG−H(約12分)、2SC(約10分)、CML(約12分)
(質量分析条件)
イオン化方法:H−ESI
インジェクション量:10μL
キャピラリー温度:300℃
イオン化エネルギー:約3500V(陽性イオン化時)
(検出ピーク(m/z))
MG−H:70(23)、166(14)、114(14)
2SC:121(19)、103(25)
CML:84(16)、130(11)
Claims (7)
- 最終糖化産物分析のための試料の調製方法であって、
生体試料を液相において塩酸を用いて処理すること、および
液相において処理した試料を強酸性陽イオン交換樹脂に添加し、非酸性条件下で溶出すること
を含む試料の調製方法。 - 液相中での処理が65〜100℃で6〜24時間の処理である、請求項1記載の方法。
- 生体試料が血清である、請求項1又は2記載の方法。
- 強陽イオン交換樹脂から溶出された溶出液をさらに濾過処理することを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の方法により調製された試料を液体クロマトグラフィー−質量分析することを含む、最終糖化産物の分析方法。
- 液体クロマトグラフィー−質量分析が、液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析である、請求項5記載の方法。
- 最終糖化産物がN−ε−(カルボキシメチル)リジン、S−(2−スクシニル)システインおよびメチルグリオキサール−イミダゾロンからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
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