JP7028334B2 - 生体試料の前処理方法 - Google Patents
生体試料の前処理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7028334B2 JP7028334B2 JP2020547494A JP2020547494A JP7028334B2 JP 7028334 B2 JP7028334 B2 JP 7028334B2 JP 2020547494 A JP2020547494 A JP 2020547494A JP 2020547494 A JP2020547494 A JP 2020547494A JP 7028334 B2 JP7028334 B2 JP 7028334B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- pretreatment
- acetic acid
- biological sample
- solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
なお、ここでは、前処理の例として、生体試料から不要成分を除去する処理を挙げたが、それ以外の処理(例えばタンパク質を消化したり、アルキル化したりする処理)を前処理として行う場合も同様である。
生体試料に酢酸水溶液を添加して、酢酸の濃度が20~50重量%の範囲の前処理用試料を調製する工程を含むことを特徴とする。
本発明において、被検体は、主に哺乳動物であり、特にヒトである。
生体試料中のタンパク質には、被検体の体内に内在するタンパク質だけでなく、被検体に医薬として投与されたタンパク質も含まれる。
前記前処理を行った後の試料液に酢酸を添加して、該酢酸の濃度が20~50重量%の範囲となる分析用試料を調製する工程とを有することが好ましい。
上記方法によれば、前処理が終わった後、LC/MSへ導入されるまでの間にサンプル容器内の分析用試料に含まれるタンパク質がサンプル容器に吸着することを防止できる。
本発明の方法を用いることにより、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていた有機溶媒、界面活性剤、又はペプチドの生体試料への添加が不要となる、或いは添加量を低減することができる。また、従来、サンプル容器へのタンパク質やペプチドの吸着を防止するために行われていたサンプル容器の表面処理が不要となる。
<サンプル調製>
被検体から血液を採取する。血液の採取には、プロテアーゼ阻害剤カクテルが予め収容された採血管を用いる。採取した血液に、内部標準として安定同位体元素標識ペプチド等を加えた後、遠心分離により血漿と血球成分に分離する。そして血漿500μLを採取し、サンプル容器に入れる。
次に、サンプル容器に40%の酢酸水溶液を10μL添加し、5~10分間、常温で撹拌する。これにより、血漿中のタンパク質間の相互作用、ペプチド間の相互作用が解かれる。
続いて、5%のアンモニウム水和物500μLをサンプル容器内に添加し、ボルテックスで撹拌し、1000μLの前処理用試料を得る。
次に、固相抽出カラムを用いて、上記で得られた前処理用試料に含まれる不要成分を除去するための前処理を行う。固相抽出カラムには、C18担体等、非極性充填剤を使用した固相抽出カラム、或いは、陰イオン又は陽イオン交換充填剤を使用した固相抽出カラムを使用することができる。
次に、上記の前処理用試料(1000μL)を所定の流速で固相抽出カラムの充填剤に流す(サンプルロード)。
最後に、充填剤に溶離液を流して、該充填剤に保持されていた目的タンパク質を溶出する。溶離液としては、例えば、ACN:水:酢酸=45:25:30となるように調製された溶液を用いることができる。前記酢酸には例えば30%酢酸が用いられる。
[試料の調製(本発明の前処理)]
市販のグルカゴン標品(製品名「グルカゴン ヒト」、富士フイルム和光純薬株式会社)をポリプロピレン製のサンプル容器(製品名「Protein LoBind tubes」、Eppendorf)に入れ、その中に試薬調製溶媒を添加し、さらに、希釈溶媒で段階希釈して、グルカゴンの体積モル濃度が0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nMの5種類のグルカゴン溶液又は0.01nM、0.1nM、1nM、10nMの4種類のグルカゴン溶液をそれぞれ調製した。
試薬調製溶媒には、40%酢酸水溶液、0.1%ギ酸、生理食塩水、リン酸緩衝液のいずれかを用い、希釈溶媒には、40%酢酸水溶液または0.1%ギ酸を用いた。そして、試薬調製溶媒と希釈溶媒の組合せが異なる7組について、それぞれ上記の体積モル濃度のグルカゴン溶液を用意した。
上記で得られた7組のグルカゴン溶液を液体クロマトグラフ質量分析計(超高速トリプル四重極型LC/MS/MSシステム LCMS-8060、株式会社島津製作所)に導入して、LC/MS/MS分析を実施した。各試料について3回ずつLC/MS/MS分析を実施した。
市販のインスリン標品(製品名「ヒトインスリン」、シグマ アルドリッチ)について、実施例1と同じ試薬調製溶媒、希釈溶媒を用いて、インスリンの体積モル濃度が0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nMの5種類のインスリン溶液又は0.01nM、0.1nM、1nM、10nMの4種類のインスリン溶液をそれぞれ調製した。
このようにして得られた7組のインスリン溶液を、実施例1と同じ液体クロマトグラフ質量分析計に導入して、LC/MS/MS分析を実施した。そして、LC/MS/MS分析で得られたスペクトルからインスリンに由来するプリカーサイオン(m/z 1162.50)のプロダクトスペクトルからプロダクトイオン(m/z [0]345.15)の強度を求めた。各試料について3回ずつLC/MS/MS分析を実施して得られた結果を図3に示す。図3から分かるように、実施例2においても、試薬調製溶媒及び希釈溶媒の両方が40%酢酸水溶液であるときの検出強度(Area値)は、その他の組合せのときの検出強度に比べて劇的に増大していた。
試薬調製用溶媒及び希釈溶媒をいずれも10%、20%、30%、40%、50%の酢酸水溶液とし、実施例1と同様の手順で市販のグルカゴン標品をポリプロピレン(PP)製のサンプル容器(製品名「TORAST-H Bio Vial」、株式会社島津ジーエルシー)内で調製及び希釈してグルカゴンの体積モル濃度が100nMのグルカンゴン溶液を得た。
また、試薬調製用溶媒及び希釈溶媒をいずれも10%、30%、50%の酢酸水溶液とし、実施例1と同様の手順で市販のグルカゴンをガラス製のサンプル容器(製品名「1.5mL 試料びん」、株式会社島津ジーエルシー)内で調製及び希釈して体積モル濃度が100nMのグルカンゴン溶液を得た。
試薬調製溶媒及び希釈溶媒をいずれも40%酢酸水溶液として、グルカゴンの体積モル濃度が100nMの6個のグルカゴン溶液を調製した。そして3個のグルカゴン溶液は調製後すぐに液体クロマトグラフ質量分析計に導入し、残り3個は4℃の温度下で19時間放置した後、前記液体クロマトグラフ質量分析計に導入して、LC/MS/MS分析を実行した。その結果を図5に示す。なお、本実施例で使用したグルカゴン標品及びサンプル容器、液体クロマトグラフ質量分析計は実施例1と同じであった。
Claims (4)
- 生体試料中のタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析によって測定するための試料の前処理方法であって、
生体試料に酢酸水溶液を添加して、酢酸の濃度が20~50重量%の範囲の前処理用試料を調製する工程を含む、生体試料の前処理方法。 - 請求項1に記載の生体試料の前処理方法において、
前記前処理用試料の酢酸の濃度範囲が35~45重量%である、生体試料の前処理方法。 - 請求項1に記載の生体試料の前処理方法において、さらに、
前記前処理用試料を用いて前処理を行う工程と、
前記前処理を行った後の試料液に酢酸水溶液を添加して、該酢酸の濃度が20~50重量%の範囲となる分析用試料を調製する工程とを有する、生体試料の前処理方法。 - 請求項3に記載の生体試料の前処理方法において、
前記分析用試料の酢酸の濃度範囲が35~45重量%である、生体試料の前処理方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2018/034434 WO2020059013A1 (ja) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | 生体試料の前処理方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2020059013A1 JPWO2020059013A1 (ja) | 2021-08-30 |
JP7028334B2 true JP7028334B2 (ja) | 2022-03-02 |
Family
ID=69886970
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020547494A Active JP7028334B2 (ja) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | 生体試料の前処理方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210302286A1 (ja) |
JP (1) | JP7028334B2 (ja) |
WO (1) | WO2020059013A1 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014238338A (ja) | 2013-06-07 | 2014-12-18 | 株式会社Lsiメディエンス | 質量分析計を用いた生体試料中の蛋白質測定法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006089468A (ja) * | 2004-08-26 | 2006-04-06 | Toray Ind Inc | タンパク質分画デバイス用緩衝液およびそれを用いるタンパク質の分画方法 |
JP2017161447A (ja) * | 2016-03-11 | 2017-09-14 | 株式会社島津製作所 | 分析方法 |
-
2018
- 2018-09-18 WO PCT/JP2018/034434 patent/WO2020059013A1/ja active Application Filing
- 2018-09-18 US US17/264,887 patent/US20210302286A1/en active Pending
- 2018-09-18 JP JP2020547494A patent/JP7028334B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014238338A (ja) | 2013-06-07 | 2014-12-18 | 株式会社Lsiメディエンス | 質量分析計を用いた生体試料中の蛋白質測定法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
白浜博幸,合成高分子表面へのタンパク質の吸着,膜,1993年,Vol.18/No.1,PP.53-63 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210302286A1 (en) | 2021-09-30 |
WO2020059013A1 (ja) | 2020-03-26 |
JPWO2020059013A1 (ja) | 2021-08-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6401230B2 (ja) | 広範囲の疎水性を有する被検成分の精製及び検出のためのlc−ms構成 | |
Heresztyn et al. | Determination of l-arginine and NG, NG-and NG, NG′-dimethyl-l-arginine in plasma by liquid chromatography as AccQ-Fluor™ fluorescent derivatives | |
CN101467048B (zh) | 改良的维生素d测量方法 | |
CN101273267B (zh) | 样品溶液中白蛋白的分析方法 | |
JP6462020B2 (ja) | 質量分析による逆トリヨードサイロニンの検出法 | |
US8409865B2 (en) | Methods and kits for the determination of the presence and quantity of vitamin D analogs in samples | |
Calderón-Santiago et al. | Determination of essential amino acids in human serum by a targeting method based on automated SPE–LC–MS/MS: discrimination between artherosclerotic patients | |
JP2017049024A (ja) | 最終糖化産物分析のための試料の調製方法及び最終糖化産物の分析方法 | |
EP3356831A1 (en) | Amyloid beta detection by mass spectrometry | |
EP2553468A1 (en) | Measurement of 25-hydroxyvitamin d3 and c3-epi-25-hydroxyvitamin d3 | |
EP2435832A1 (en) | Methods and reagents for the quantitative determination of metabolites in biological samples | |
JP7028334B2 (ja) | 生体試料の前処理方法 | |
US20130186186A1 (en) | Methods and kits for the determination of the presence and quantity of vitamin d analogs in samples | |
CN110726799A (zh) | 同时检测血液中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 | |
CN116973464A (zh) | 一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法 | |
EP3929589A1 (en) | Method for measuring amyloid-beta peptide and use of reagent composition in the method | |
JP7499774B2 (ja) | 無傷のタンパク質レベルでのLC-MSに基づくHbA1c測定の自動化試料ワークフロー | |
US20170234893A1 (en) | Weak Affinity Chromatography | |
CN113917008A (zh) | 质谱检测尿液中代谢物水平的产品在制备用于早期评估肠道息肉和结直肠癌产品中的应用 | |
Becerra et al. | Miniaturized imprinted solid phase extraction to the selective analysis of Coenzyme Q10 in urine | |
JP7460566B2 (ja) | 終末糖化産物の分析方法 | |
MODEBRLU et al. | Analytical Techniques in Pharmaceutical Analysis for Samples Separation, Characterization, Determination and its Handling | |
AU2017100545A4 (en) | Method of determining histamine in a sample and kit for doing the same | |
Ortega et al. | Determination of 27 bovine plasma amino acids and metabolites using zwitterionic-hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with isotope dilution electrospray ionization triple quadrupole liquid chromatography-mass spectrometry and the effect of deproteinization timing | |
WO2023213702A1 (en) | Method for determining a dilution factor of a sample |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210121 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210121 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220118 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220131 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7028334 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |