JP5995232B2 - 麹菌細胞株の効率的融合方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は以下の態様を含むものである。
[態様1]2種類のアスペルギルス属細胞株(菌糸)の融合において、融合する該細胞株の少なくとも一方において菌核形成促進因子SclRの発現を増加させることにより、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる方法。
[態様2]アスペルギルス属細胞株がアスペルギルス・オリゼである、態様1の方法。
[態様3]プロモーター制御下に連結されたsclR遺伝子を含むプラスミドベクターでアスペルギルス属細胞株を形質転換することによって、該細胞株における菌核形成促進因子SclRの発現を増加させる、態様1又は2の方法。
[態様4]菌核内又は菌核の形成過程でアスペルギルス属細胞株(菌糸)の融合が行われる、態様1〜3のいずれかの方法。
[態様5]MEA培地を用い25℃・暗所・通気条件下でのアスペルギルス属細胞株の対峙培養においてアスペルギルス属細胞株(菌糸)の融合を行なわせる、態様1〜4のいずれかに記載の方法。
[態様6]更に、融合する2つのアスペルギルス属細胞株(菌糸)が夫々別の表現型により互いに識別可能な形質転換体であり、融合した細胞においては該表現型が相補されること、及び/又は、融合した細胞が2つの表現型を有することを基準として、融合細胞を同定する、態様1〜5のいずれかの方法。
[態様7]表現型が形質転換マーカー及び/又は標識物質の発現に基づくものである、態様6の方法。
[態様8]形質転換マーカーに基づく表現型が栄養要求性である、態様7の方法。
[態様9]融合した細胞においては該表現型が相補されることを、寒天CD最少培地における培養によって確認する、態様8の方法。
[態様10]標識物質が蛍光タンパク質である、態様7の方法。
[態様11]融合した細胞が2つの標識物質を有することを蛍光顕微鏡による核の観察によって確認する、態様10の方法。
[態様12]2種類のアスペルギルス属細胞株(菌糸)の融合において、融合する2つのアスペルギルス属細胞株が夫々別の表現型により互いに識別可能な形質転換体であり、融合した細胞においては該表現型が相補されること、及び/又は、融合した細胞が2つの表現型を有することを基準として融合細胞を同定する方法。
[態様13]以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のDNAを含み、宿主であるアスペルギルス属細胞株への形質導入又は形質転換によって、該細胞株の融合効率を増加させる機能を有する組換えベクター:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと90%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、又は
(e)(d)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA。
[態様14]態様13記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して融合効率が増加されていることを特徴とするアスペルギルス属細胞株。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと90%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、又は
(e)(d)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスペルギルス属細胞株の融合効率を増加させる機能を有する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
核の可視化のため、核ヒストンH2Bに赤色蛍光タンパク質mDsRedおよび緑色蛍光タンパク質EGFPをそれぞれ融合させた融合タンパク質を恒常的に発現するよう2つのプラスミドを設計した(pgHHDRS, pgHHGS; 図1A, 図2A)。形質転換用の選択マーカーにはA. oryzae由来のsC遺伝子 (以降AosCと記述)を用いた。
核の可視化によって得られたNPlD-HR1(H2B-mDsRed)およびNPlD-HG1(H2B-EGFP)の2種類の株のniaD遺伝子座に、amyBプロモーター下でSclRを過剰発現するためのプラスミド(pamy215;図3A)を挿入し、それぞれの株に対しSclRの過剰発現を試みた。形質転換の後、図3Bに示したコンストラクトによるサザン解析にてniaD遺伝子座にSclR過剰発現プラスミドがシングルコピーで挿入された株の取得を確認した。親株NPlD-HR1およびNPlD-HG1の2株に対し、取得したSclR過剰発現株をそれぞれPlD-HR1-sR (H2B-mDsRed, SclR OE)、PlD-HG1-sR (H2B-EGFP, SclR OE)と命名した。
ウリジン/ウラシル要求性からアデニン要求性への変換
A. oryzaeではこれまでに薬剤耐性マーカーや栄養要求性マーカーを含めた多くの形質転換マーカー、およびそれらを有するベクター系が開発されてきている。栄養要求性も前述のアルギニン生合成経路に関わるargB遺伝子やピリミジン生合成経路に関わるpyrG遺伝子、そのほかにもアデニン生合成経路に関わるadeA遺伝子やadeB遺伝子が栄養要求性マーカーとして開発されている (Jin et al., 2004a, 2004b; Kubodera et al., 2000)。これらの栄養要求性マーカー遺伝子のうち、adeA遺伝子は、NSPlD1株においては本来の第6染色体上のadeA遺伝子座と第3染色体上のargB遺伝子座にはUV照射による変異が導入されたadeA-遺伝子が存在し、正常に機能しているadeA遺伝子は最終的に第7染色体上のpyrG遺伝子座に存在している。煩雑化を防ぐためにも上項目のargB遺伝子以外に栄養要求性を付与できる遺伝子としてadeB遺伝子を用い、ΔpyrGでウリジン/ウラシル要求性株の第1染色体adeB遺伝子座に存在するadeB遺伝子をpyrG遺伝子により置換することで、ΔadeBでアデニン要求性に変換することにした。
amyBプロモーター下でのSclR過剰発現をおこなった株の菌核形成に適した培地条件を検討した。他のアスペルギルス属でA. parasiticusや、A. oryzaeと近縁であるA. flavusでは有性生殖の誘導にMCA (Mixed Cereal Agar; 幼児の離乳食用のシリアルを水に溶かし寒天を加えたもの)培地を用いて異なる接合型どうしで対峙培養を行うことで有性世代の発見に至っている (O’Gorman et al., 2009; Horn et al., 2009a, 2009b; 実験材料及び方法)。一方でJinらは菌核形成促進因子SclRの同定およびその機能解析にマルツエキスを含むMEA (Malt Extract Agar)培地を用いている。そこで、これらの培地にPD培地を加えたMCA培地、MEA培地およびPD培地の3つの培地にSclR過剰発現株とコントロール株それぞれの分生子懸濁液を植菌し暗所・通気条件で培養した。この際、それぞれの寒天培地に植菌する分生子数を103個/5μlとしたが、これは植菌する分生子数が多すぎると菌核形成数が減少するというA. flavusやA. parasiticusで報告されている実験結果に基づいている (Brown et al., 2008, 2009)。2週間ほど培養したところ、成熟した黒色の菌核の形成数はMEA培地で最も多く、PD培地でも多少の菌核は形成される傾向を示した (図9)。これはマルツエキスに含まれるマルトースによりamyBプロモーター下のSclRの発現が強力に誘導されたためだと考えられる。また30℃と25℃のそれぞれの温度で暗所・通気条件での菌核形成を比較したところ、PD培地とMCA培地では変化はあまり見られなかったが、MEA培地においては25℃での培養では分生子形成が抑えられ菌核の形成数の上昇が観察された。また同様の条件で20℃以下ではどの培地でも菌核はほとんど形成されなかった。
以上の結果から、菌核形成を促進させ有性生殖を誘導し、さらにA. oryzaeの菌糸融合能におけるSclRの効果を評価するため、MEA培地を用い25℃・暗所・通気での培養条件を用いることとした。
アスペルギルス属ではA. flavusなどで分生子形成と菌核形成の間には負の相関があることが示唆されている (Brown et al., 2008, 2009)。ΔpyrG (ウリジン/ウラシル要求性)の株において、SclR過剰発現株とコントロール株の間で分生子形成量を比較したところ、PD培地ではコントロール株がSclR過剰発現株に比べ約7倍の分生子を形成した。また、SclR過剰発現株のほうがコロニーの形成速度が低下していた。コロニー形成速度の低下はCD培地でより顕著であった。炭素源にグルコースを用いたCD最少培地では生育初期(30℃、3日培養)の段階でコントロール株に比べSclR過剰発現株の生育が若干低下し、炭素源にマルトースを用いたCD最少培地では同様の生育初期の段階でコントロール株に比べSclR過剰発現株の生育が顕著に低下していることが観察された (図10)。またΔadeB (アデニン要求性)の株においても同様の結果が得られたが、ΔpyrGのSclR過剰発現株にくらべΔadeBのSclR過剰発現株が形成する菌核数は若干減少しており、また白色の菌核から黒色の菌核に成熟しないものが多かった。アデニン生合成の経路を途中で阻害することでアデニン要求性を付与しているが、このアデニン生合成経路が菌核の色の変化などに影響を及ぼしている可能性が考えられた。
境界線特異的な菌核の形成
上記で作製したSclR過剰発現株とコントロール株のうち、ΔpyrGでウリジン/ウラシル要求性を持ち核が赤色蛍光で可視化されている株、ΔadeBでアデニン要求性を持ち核が緑色蛍光で可視化されている細胞株を用いた。MEA培地に異なる栄養要求性を持つ株どうし、且つSclR過剰発現株どうしとコントロール株どうしが向き合うように25℃暗所・通気条件で対峙培養した (図11A)。培養7日ほどでそれぞれの株はコロニー内に黒色もしくは白色の菌核を形成し始める。そして培養14日ほどで異なる栄養要求性を持つ株の境界線特異的な菌核の形成が観察された (図11B、赤線内)。境界線上に形成された菌核はコロニー内部に形成された菌核に比べ形成が観察され始めた時期が遅く、またサイズも若干大きいものが多く観察された。またコロニー内部に形成された菌核は培養初期およそ7日で黒色に成熟したのに対し、1ヶ月以上の長期培養を行っても、境界線上に特異的に形成された菌核は白色のままであった。
図11BではSclR過剰発現株どうしの境界線と、コントロール株どうしの境界線に形成される菌核数に違いが観察された (図11B, 赤線内)。よって次に図12に示した株の組み合わせで境界線特異的に形成される菌核数を比較した。その結果、コントロール株どうしの組み合わせに比べ、過剰発現株どうしかもしくはどちらか一方が過剰発現株を含む組み合わせでは境界線特異的に形成される菌核数が有意に上昇した (図12)。
CD最少培地での栄養要求性の相補の確認
それぞれの株のコロニー内に形成される菌核とは異なり、異なる栄養要求性を持つ株の境界線特異的に形成された菌核はそれぞれの株の菌糸どうしが密接に絡み合い形成されている。その菌核内部では異なる栄養要求性を持つ株の菌糸どうしの一部が融合していることも予想される。もし仮にこれらの菌核内で菌糸・細胞が融合して異なる栄養要求性を持つ株の菌糸間でヘテロカリオンが形成されれば、栄養要求性が相補される可能性が予測される。そこで、過剰発現株どうし・コントロール株どうしそれぞれの境界線特異的に形成された菌核をウリジン/ウラシルとアデニンを含まない寒天CD最少培地にシフトしたところ、シフトした菌核を中心にコロニー・菌糸成長が認められた (図13)。また各株のコロニー内部からシフトした菌核は菌糸成長を示さなかった (図13)。このことから、境界線上に形成された菌核内もしくは菌核形成の過程で菌糸が融合していることが示唆された。しかし、過剰発現株どうしとコントロール株どうしで、それぞれの境界線で形成された菌核のうち培地シフト後に菌糸成長を示す菌核の数に差が観察された (図13)。
作製したSclR過剰発現株とコントロール株のうち、ΔpyrGでウリジン/ウラシル要求性を持ち核が赤色蛍光で可視化されている株、ΔadeBでアデニン要求性を持ち核が緑色蛍光で可視化されている株を用いている。前項では、栄養要求性の相補が確認されたことで、異なる栄養要求性を持つ株の境界線上に形成された菌核内部もしくは菌核の形成過程で菌糸融合が行われたことが示唆された。接合型の組み合わせ、およびSclR過剰発現株とコントロール株のそれぞれの組み合わせで、栄養要求性の異なる株の境界線特異的に形成された菌核のうち、図13でウリジン/ウラシルとアデニンを含まない寒天CD最少培地で生育を示した菌糸を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、大多数の菌糸においては、1つの菌糸中の核の色が赤色及び緑色両方の蛍光で観察された (図15)。
大腸菌 Escherichia coli
大腸菌組換えプラスミドの取得にはE. coli DH5α(supE44 ΔlacU169(Ф80 lacZ ΔM15)hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) を用いた。
本研究で使用したA. oryzae菌株一覧を表1に示した。形質転換のための親株としてはNSPlD1株(niaD- sC- adeA- ΔargB::adeA- ΔligD::argB ΔpyrG::adeA) (Maruyama and Kitamoto, 2008)を用いた。
[E. coli DH5α用]
LB培地: 1% Bacto tryptone、0.5% Yeast Extract、0.5% NaCl(プレート用寒天培地には2.0% Agarを含む。また必要に応じてkanamycinあるいはampicillinを終濃度50 mg/mlとなるように添加した。)
SOC培地: 2% Tryptone、0.5% Yeast Extract、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM Glucose(混合後、フィルター滅菌した)
各株の栄養要求性にあわせて以下のものをそれぞれの培地に添加した。
ウリジン/ウラシル要求性;0.5% uridine + 0.2% uracil
アデニン要求性;0.01% adenyl sulfate
DPY培地:2% Dextrin、1% Polypeptone、0.5% Yeast Extract、0.5% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O(pH 5.5)
CD培地:0.3% NaNO3、0.2% KCl、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、0.002% FeSO4・7H2O、2% Glucose or Maltose(pH 5.5)
M培地:0.2% NH4Cl、0.1% (NH4)2SO4、0.05% KCl、0.05% NaCl、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、0.002% FeSO4・7H2O、2% Glucose(pH 5.5)
M + Met培地:0.2% NH4Cl、0.1% (NH4)2SO4、0.05% KCl、0.05% NaCl、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4・7H2O、0.002% FeSO4・7H2O、2% Glucose、0.15% methionie(pH 5.5)
PD培地:日水製薬社の『真菌用 ポテトデキストロース寒天培地 「ニッスイ」』を使用法に従って作製した(組成:39.0 g中、ポテト浸出液末4.0 g・Glucose 20.0 g・Agar 15.0 g)。
MCA培地
5% Gerber mixed grain cereal (Gerber Products Co., Freemont, Michigan)、2.0% Agar
MEA培地
8.0% Malt Extract (オリエンタル酵母工業(株) バイオ事業部の微生物用培地、培地用 マルツエキス)、2.0% Agar、0.002% CuSO4、0.00004% Na2B4O7・10H2O、0.00087% FePO4、0.00095% MnSO4、0.0008% Na2MoO4、0.008% ZnSO4 (pH 6.0)
[プラスミドの作製]
本研究で使用したプライマーは表2、プラスミドは表3に示した。これらのプラスミドのうち、pgHHDRS、pgHHGS、pgABpGはMultiSite Gateway(商標)cloning system を用いて作製した。
核を赤色蛍光で標識するためのプラスミドpgHHDRSは、5' entry clone (pg5'PH)、center entry clone (pgH2B) 、3' entry clone (pg3'DRM-CF)と形質転換用選択マーカーとしてAosCマーカーを含むdestination vector (pgDSO)を混合してLR反応を行い、作製した。
pgHHGS
核を緑色蛍光で標識するためのプラスミドはpgHHGSは、5' entry clone (pg5'PH)、center entry clone (pgH2B) 、3' entry clone (pg3'E)と形質転換用選択マーカーとしてAosCマーカーを含むdestination vector (pgDSO)を混合してLR反応を行い、作製した。
adeB遺伝子上流1.0 kbをプライマーattB4-5aB-FとattB1-5aB-Rで、adeB遺伝子下流1.0 kbをプライマーattB2-3aB-FとattB3-3aB-Rでそれぞれ増幅し、adeB遺伝子上流のDNA断片の増幅産物を5' entry vector (pDONR P4-P1R)にBP反応により挿入することで5' entry clone (pg5’AB4)、adeB遺伝子下流のDNA断片の増幅産物を3' entry vector (pDONR P2R-P3)にBP反応により挿入することで3' entry clone (pg3’AB4)を作製した。さらに5' entry clone (pg5'AB4)、3' entry clone (pg3'AB4)、center entry clone (pgEpG)とdestination vector (pDEST R4-R3)を混合してLR反応を行った。以上によってadeB遺伝子破壊用プラスミドpgABpGを作製した。pgABpGを鋳型とし、プライマーattB4-5aB-FとattB3-3aB-Rを用いてPCRでadeB遺伝子破壊のための遺伝子断片を増幅した。
各遺伝子のクローニングには、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR (TaKaRa)を用いた。テンプレートとしてA. oryzae RIB40株の染色体DNAを用いた。また、A. oryzaeのコロニーPCRにはKOD FX Neo (TOYOBO)を用いた。反応液の組成は全て添付の説明書に従った。
98℃ 2 min、{98℃ 10 sec、(アニーリング温度)15 sec、72℃ 1 kb/min;30 cycle}、4℃
KOD FX Neo温度条件
94℃ 5 min、{98℃ 10 sec、(アニーリング温度)30 sec、68℃ 2 kb/min;45 cycle}、4℃
テンプレートには、20 μlスケールあたり50 μl TEに白金耳懸濁した溶液2 μlを用いた。
大腸菌プラスミドDNAの調製は、アルカリSDS法もしくはPromega社のキット (Cat. No. A1222) を用いて行った。
ファスマック社による受注シークエンスを行った。
MultiSite Gateway(商標)systemを用いた場合の形質転換は、以下の方法を用いた。その他の形質転換についてはHanahanの方法 (Hanahan, 1983)に従った。
100 μlのコンピテントセルに5 μlの酵素反応 (BP反応およびLR反応)液を加えて混合し、氷上で30分間放置後、42℃で1分間インキュベートして素早く氷上へ移す。
SOC培地250 μlを加えて37℃で1時間振盪培養した後、LB 選択培地 (LB + kanamycinあるいはampicillin)に塗布。37℃、一晩の培養によりコロニーを得る。
プロトプラストPEG法
親株を100 mlのDPY液体培地を用いて30℃で18〜20時間振盪培養し、ミラクロス (CALBIOCHEM)を用いて菌体を回収する。
回収した菌体を滅菌水で洗浄後、10 ml TF Solution 1 (1% Yatalase (TaKaRa), 0.6 M (NH4)2SO4, 50mM Maleate buffer (pH 5.5))により30℃で3時間処理してプロトプラスト化する。
ミラクロスを用いてプロトプラストを回収して10 ml TF Solution 2 (1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl2, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、遠心して沈殿を回収する。同様の操作でプロトプラストをさらに2回洗い、1.0-5.0×107個/ mlとなるようにTF Solution 2 に懸濁する。
200 μlのプロトプラスト懸濁液に1-5 μg/10μlの形質転換用DNAを10μl加えて、氷中に30分間静置する。
250、250、850 μlと3回に分けてTF Solution 3 (60% PEG4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、室温で20分間静置する。
5 mlのTF Solution 2を加えて遠心後、ペレットを500μlのTF Solution 2 に再懸濁し、懸濁液をあらかじめ45℃で保温しておいたTop agar (1.2 M Sorbitol, 0.8% Agar入り選択培地)と混和して下層培地 (1.2 M Sorbitol, 1.5% Agar入り選択培地)に重層する。30℃で3-7日間培養して形質転換体を取得し、選択培地で1〜3回程度植え継ぐことにより、形質を安定させる。
回収した形質転換体の染色体DNA 25 μgを一晩で制限酵素処理した後、0.8%アガロースゲルで電気泳動を行った。その後の操作は、ECL direct nucleic acid labeling and detection systems (Healthcare Bioscience)及びPositively charged Nylon transfer membrane Hybond-N+ (Healthcare Bioscience)を用いて、説明書に従って行った。また、バンドの検出には、ルミノイメージアナライザーLAS-1000plus (Fujiflim)を用いた。トランスファーは一晩、メンブレンの乾熱固定は100℃で 2時間、プレハイブリダイゼーション1時間そしてハイブリダイゼーション 8時間もしくは一晩で行った。
寒天培地での対峙培養
MEA培地上に4 cmの間隔で異なる接合型株の分生子を103 個/5 μlずつ植菌した。10日から14日25℃・暗所・通気条件で培養した後、異なる栄養要求性を持つ株の境界線上に形成された菌核を、ウリジン/ウラシル・アデニンを含まないCD最少培地に滅菌したピンセットで菌核をシフトし、その後の生育を見た。シフト後、約3-5日30℃で培養して菌糸成長を示した株の菌糸を、蛍光顕微鏡を用いて核の色を赤・緑色の波長で観察した。
[使用機器]
共焦点レーザー顕微鏡によるEGFP蛍光、mDsRed蛍光の観察においては、対物レンズNeofluor 40x、100x (Olympus)と共焦点スキャナシステムCSU22 (Yokogawa)を装備したIX71N倒立型顕微鏡 (Olympus)を用いた。解析ソフトウェアはAndor iQ (Andor Technology PLC)を使用した。また、蛍光像を取得する際にはAndor iXon cooled digital charge-coupled-device camera (Andor Technology PLC)を用いた。
[培養方法]
ガラスベースディッシュ (IWAKI Glass-base dish)をUV照射により15分以上滅菌した後、培地100 μlを滴下し、分生子あるいは菌糸を植菌した。その後、パラフィルムでガラスベースディッシュを密閉し、静置培養を行った。
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Claims (9)
- 2種類のアスペルギルス・オリゼ細胞株(菌糸)を対峙培養し、境界線上に特異的に形成される菌核内又は該菌核の形成過程における該2種類のアスペルギルス・オリゼ細胞株の融合によって、同一細胞内に異なる細胞株由来の核が存在する異核共存体(ヘテロカリオン)である融合菌糸を作製する方法であって、
該2種類のアスペルギルス・オリゼ細胞株が夫々別の表現型により互いに識別可能な形質転換体であり、且つ、該2種類のアスペルギルス・オリゼ細胞株の少なくとも一方において菌核形成促進因子SclRの発現を増加させることにより、該2種類のアスペルギルス・オリゼ細胞株の融合効率を増加させることを特徴とする、前記方法。 - プロモーター制御下に連結された以下の(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のDNA:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、アスペルギルス・オリゼ細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと90%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、アスペルギルス・オリゼ細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、又は
(e)(d)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アスペルギルス・オリゼ細胞株の融合効率を増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、
を含むプラスミドベクターでアスペルギルス・オリゼ細胞株を形質転換することによって、該細胞株における菌核形成促進因子SclRの発現を増加させる、請求項1に記載の方法。 - MEA培地を用い25℃・暗所・通気条件下での対峙培養においてアスペルギルス・オリゼ細胞株(菌糸)の融合を行なわせる、請求項1又は2に記載の方法。
- 更に、融合した細胞においては該表現型が相補されること、及び/又は、融合した細胞が2つの表現型を有することを基準として、融合細胞におけるヘテロカリオンの形成を同定することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 表現型が形質転換マーカー及び/又は標識物質の発現に基づくものである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 形質転換マーカーに基づく表現型が栄養要求性である、請求項5に記載の方法。
- 融合した細胞において該表現型が相補されることを寒天CD最少培地における培養によって確認する、請求項6に記載の方法。
- 標識物質が蛍光タンパク質である、請求項5に記載の方法。
- 融合した細胞が2つの標識物質を有することを蛍光顕微鏡による核の観察によって確認する、請求項8に記載の方法。
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