JP2012223137A - デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸、プライマー対、抑制剤およびモチ性ソバ属植物 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
【解決手段】特定の塩基配列、またはそのバリアントのアミノ酸配列に対応する塩基配列、あるいは異なった特定の塩基配列からなる核酸、該核酸に基づき作製されたプライマー対、抑制剤およびモチ性ソバ属植物。
【選択図】なし
Description
〔1〕 デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする単離された核酸であって、
(A)配列番号:3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(B)配列番号:2に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の配列であり、コードされたポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列、および
(C)配列番号:3のアミノ酸番号76〜602からなる第1配列に対応する領域における前記第1配列に対する配列同一性が少なくとも76%であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる核酸、
〔2〕 ソバ属植物のデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸を同定または増幅するのに用いられるプライマー対であって、
前記〔1〕に記載の核酸の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第1のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、
前記〔1〕に記載の核酸に対応する相補鎖の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第2のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと
を含有するプライマー対、
〔3〕 (A)配列番号:3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(B)配列番号:2に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の配列であり、コードされたポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列、および
(C)配列番号:3のアミノ酸番号76〜602からなる第1配列に対応する領域における前記第1配列に対する配列同一性が少なくとも76%であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列からなる遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされてなるモチ性ソバ属植物、ならびに
〔4〕 ソバ属植物における前記〔1〕に記載の核酸の機能を抑制する抑制剤であって、
(I)前記〔1〕に記載の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、
(II)前記〔1〕に記載の核酸の塩基配列に基づき設計された21〜23塩基対の二本鎖RNAからなり、前記〔1〕に記載の核酸の発現をRNAi効果により抑制するsiRNA、または
(III)前記〔1〕に記載の核酸に含まれる遺伝子に対する変異型対立遺伝子の核酸
を含有していることを特徴とする抑制剤
に関する。
本発明の核酸は、デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする単離された核酸であって、
(A)配列番号:3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(B)配列番号:2に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の配列であり、コードされたポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列、および
(C)配列番号:3のアミノ酸番号76〜602からなる第1配列に対応する領域における前記第1配列に対する配列同一性が少なくとも76%であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有している核酸である。本発明の核酸は、単離された核酸である。
本発明のプライマー対は、ソバ属植物のデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸を同定または増幅するのに用いられるプライマー対であって、前記核酸〔前記(A)〜(C)のいずれかの塩基配列からなる核酸〕の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第1のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、前記核酸に対応する相補鎖の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第2のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含有することを特徴としている。
ソバ属植物において、本発明の核酸の機能を欠損または低減させた場合、デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性が発現しないことが期待される。そのため、種子の胚乳のデンプンは、アミロペクチンのみからなるデンプンであるか、アミロースの含有量が極めて低いデンプンとなる。したがって、本発明の核酸の機能が欠損または低減したソバ属植物は、モチ形質を示すことが期待される。
(1−1) 前記(A)〜(C)からなる群より選ばれた塩基配列に基づいて設計されたアンチセンス核酸、siRNA、変異型対立遺伝子の核酸などをソバ属植物に導入して、前記(A)〜(C)からなる群より選ばれた塩基配列からなる遺伝子の機能を破壊または抑制すること;
(1−2) 重イオンビームをソバ属植物に照射して、前記(A)〜(C)からなる群より選ばれた塩基配列からなる遺伝子を欠損させるか、または前記遺伝子に機能欠失変異を導入すること;および
(1−3) 変異原物質をソバ属植物に接触させて、前記(A)〜(C)からなる群より選ばれた塩基配列からなる遺伝子を欠損させるか、または前記遺伝子に機能欠失変異を導入すること。
(2−1) 前記(A)〜(C)のいずれかの塩基配列に特異的であること
(2−2) ガイド鎖の5’末端がアデニン残基またはウラシル残基であること、
(2−3) パッセンジャー鎖の5’末端がグアニン残基またはシトシン残基であること、
(2−4) アンチセンス鎖の5’領域にアデニン残基またはウラシル残基の存在量が多くなっていること、
(2−5)長いGCの連続配列がないこと。
(3−1) 対象となるソバ属植物において、デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性が検出されないか、または野生型のソバ属植物におけるデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性よりも低いことを確認すること、および
(3−2) 対象となるソバ属植物の種子の胚乳のデンプンにおいて、アミロースが含まれていないか、または野生型のソバ属植物の種子の胚乳におけるデンプンにおけるアミロース含有量よりも低いことを確認すること、
(3−3) 対象となるソバ属植物の種子の胚乳において、デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸の発現が検出されないことを確認すること。
本発明の抑制剤は、ソバ属植物における本発明の核酸の機能を抑制する抑制剤であって、
(I)本発明の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、
(II)本発明の核酸の塩基配列に基づき設計された21〜23塩基対の二本鎖RNAからなり、本発明の核酸の発現をRNAi効果により抑制するsiRNA、または
(III)本発明の核酸に含まれる遺伝子に対する変異型対立遺伝子の核酸
を含有していることを特徴とする。
(1)高分子量DNAの調製
普通ソバの葉約10gを液体窒素で凍結させ、磨り潰して微細粉を得た。得られた微細粉を洗浄用緩衝液〔組成:0.15体積% 2−メルカプトエタノール、0.5体積%ポリオキシエチレン−p−イソオクチルフェノール(Triton X)、0.5Mスクロース、0.01Mトリス、0.08M塩化カリウム、0.01Mエチレンジアミン4酢酸(EDTA)、1mMスペルミジン、1mMスペルミン、pH9.4〕300mLに懸濁した。得られた懸濁液を氷上で10分間冷却し、つぎに、8層のチーズクロス〔白十字社製、商品名:FCガーゼ〕で濾過して大きいデブリスを除去した。その後、得られた濾過物を1800×g、4℃で10分間の遠心分離に供して細胞核を含む画分を回収した。
前記(1)で得られたDNAブロックを、MboI平衡化緩衝液〔組成: 100 mM塩化ナトリウム、1mMジチオスレイトール(DTT)、50mMトリス、pH7.9〕中、4℃で一晩浸漬させた。DNAブロックを小片に分けた。得られた小片を、MboI平衡化緩衝液1mLを含む新しいチューブに移し、氷上で30分間静置した。ついで、10ユニット、20ユニットまたは40ユニットのMboI(ニュー・イングランド・バイオ・ラボ社製)を前記チューブ内のMboI平衡化緩衝液に添加した。そして、DNAブロックへの制限酵素の侵入を促進させるために時々かき回しながら、前記チューブを、氷上で30分間静置した。
ソバ属植物以外の植物におけるデンプン合成に関連する酵素をコードする核酸の塩基配列の一部を含む種々のプライマー対をデザインした。調製例1で得られたBACライブラリーと各プライマー対とを用い、PCRを行なった。
1) 95℃3分間のインキュベーション
2) つぎに、95℃0.5分間の熱変性と、66℃0.5分間のアニーリングと、72℃2分間の伸長とを1サイクルとする12サイクルの反応(ただし、サイクル毎にアニーリング温度を0.5℃ずつ下げる)
3) つぎに、95℃0.5分間の熱変性と、60℃0.5分間のアニーリングと、72℃2分間の伸長とを1サイクルとする12サイクルの反応
4) その後、72℃5分のインキュベーション
1)ソバ属植物はフェロニア遺伝子を保持していない可能性、
2)ソバ属植物がフェロニア遺伝子を保持していたとしても、他の植物のフェロニアタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が極めて低い可能性、または
3)ソバ属植物がフェロニア遺伝子を保持していたとしても、他の植物のフェロニア遺伝子の塩基配列との配列同一性が極めて低い可能性(すなわち、ソバ属植物におけるコドン使用頻度は、ソバ属植物以外の植物におけるコドン使用頻度と異なっている可能性)があること
が示唆される。
参考例1の結果を考慮し、プライマー設計支援ソフトCODEHOP〔ウェブページアドレスhttp://blocks.fhcrc.org/codehop.htmlにて利用可能〕を用い、ソバ属植物におけるデンプン合成に関連する酵素をコードする核酸の塩基配列を増幅するためのプライマー対をデザインした(表2参照)。調製例1で得られたBACライブラリーと各プライマー対とを用い、PCRを行なった。
1) 95℃3分間のインキュベーション
2) つぎに、95℃0.5分間の熱変性と、66℃0.5分間のアニーリングと、72℃2分間の伸長とを1サイクルとする12サイクルの反応(ただし、サイクル毎にアニーリング温度を0.5℃ずつ下げる)
3) つぎに、95℃0.5分間の熱変性と、60℃0.5分間のアニーリングと、72℃2分間の伸長とを1サイクルとする12サイクルの反応
4) その後、72℃5分のインキュベーション
普通ソバの種子の胚乳0.2gと、RNA抽出キット〔プロメガ社製、商品名:SV Total RNA Isolation System〕とを用い、全RNAを抽出した。抽出された全RNA4.3μgと、RT−PCR用キット〔タカラバイオ(株)社製、商品名:PrimeScript RT−PCR Kit〕とを用いて逆転写反応を行ない、cDNAを得た。得られたcDNAの1/10量のcDNAを鋳型とし、プライマーGBSSI_4F〔5'-CCGGATCAAAGATTTATGGACCTAC-3'(配列番号:18)〕とプライマーGBSSI_10R〔5'-TCGCCTTTTCAGGGTATTCTATTTC-3'(配列番号:19)〕とからなるプライマー対と、RT−PCR用キット〔タカラバイオ(株)社製、商品名:PrimeScript RT−PCR Kit〕とを用い、製造者のプロトコールにしたがってPCRを行なった。
1) 95℃で2分間のインキュベーション、
2) つぎに、95℃で30秒間の熱変性と、62℃で30秒間のアニーリングと、72℃で180秒間の伸長とを1サイクルとする35サイクルの反応、
3) その後、72℃で5分間のインキュベーション
普通ソバの種子の胚乳の全RNAと、プライマーGBSS_5RACE_RV476〔5'-TCCACAAAAACGCGATCAACACCTC-3'(配列番号:20)と、5’RACE用キット〔タカラバイオ(株)製、商品名:SMARTer RACE cDNA Amplification Kit〕とを用い、5’RACEを行ない、転写開始点を決定した。また、普通ソバの種子の胚乳の全RNAと、プライマーGBSS_3RACE_F2〔5'-ATGTCCAGGAATGGAACCCAGCATCT-3'(配列番号:21)〕と、3’RACE用キット〔タカラバイオ(株)製、商品名:SMARTer RACE cDNA Amplification Kit〕とを用い、3’RACEを行ない、転写終結点を決定した。
1) 98℃で2分間のインキュベーション、
2) つぎに、98℃で30秒間の熱変性と、60℃で5秒間のアニーリングと、72℃で180秒間の伸長とを1サイクルとする38サイクルの反応、
3) その後、72℃で3分間のインキュベーション
アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のTiプラスミドのT−DNA領域にβ-グルクロニダーゼをコードする核酸を挿入した。得られた構築物をアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入した。
配列番号:2に示される塩基配列に基づいて、前記塩基配列を有する遺伝子に、欠損、置換などを有する変異植物をスクリーニングする。得られた変異植物を栽培し、種子を回収する。得られた種子について、種子中に含まれるデンプンの組成を調べる。その結果、種子中に含まれるデンプンがアミロペクチンのみからなる場合、かかる種子は、モチ性を発現するモチ性ソバ属植物の種子であることが示唆される。
普通ソバの種子に、重イオンビームを照射する。その後、得られた種子を播種し、M1植物を得る。同じ親から得られたM1植物を交配し(姉妹交配)、M2種子を回収する。回収されたM2種子を栽培し、同じ親から得られた個体を交配し(姉妹交配)、M3種子を回収する。
配列番号:5は、プライマーAlice−9Rの配列である。
配列番号:6は、プライマーFer−F1の配列である。
配列番号:7は、プライマーFer−F2の配列である。
配列番号:8は、プライマーFer−F3の配列である。
配列番号:9は、プライマーFer−F4の配列である。34番目のnは、a、c、gまたはtである。
配列番号:10は、プライマーFer−R1の配列である。36番目のnは、a、c、gまたはtである。
配列番号:11は、プライマーFer−R2の配列である。33番目のnは、a、c、gまたはtである。
配列番号:12は、プライマーFag_GBSSI−FW1の配列である。
配列番号:13は、プライマーFag_GBSSI−FW3の配列である。
配列番号:14は、プライマーFag_GBSSI−RV1の配列である。
配列番号:15は、プライマーFag_GBSSI−FW2の配列である。
配列番号:16は、プライマーFag_GBSSI−RV2の配列である。23番目のnは、a、c、gまたはtである。
配列番号:17は、プライマーFag_GBSSI−RV3の配列である。25番目のnは、a、c、gまたはtである。
配列番号:18は、プライマーGBSSI_4Fの配列である。
配列番号:19は、プライマーGBSSI_10Rの配列である。
配列番号:20は、プライマーGBSS_5RACE_RV476の配列である。
配列番号:21は、プライマーGBSS_3RACE_F2の配列である。
配列番号:22は、プライマーGBSS Full_length FW1の配列である。
配列番号:23は、プライマーGBSS Full_length RV1の配列である。
Claims (4)
- デンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸であって、
(A)配列番号:3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(B)配列番号:2に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の配列であり、コードされたポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列、および
(C)配列番号:3のアミノ酸番号76〜602からなる第1配列に対応する領域における前記第1配列に対する配列同一性が少なくとも76%であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる核酸。 - ソバ属植物のデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素をコードする核酸を同定または増幅するのに用いられるプライマー対であって、
請求項1に記載の核酸の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第1のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、
請求項1に記載の核酸に対応する相補鎖の連続した一部を含有し、かつ少なくとも15ヌクレオチド長の第2のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと
を含有するプライマー対。 - (A)配列番号:3に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(B)配列番号:2に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の配列であり、コードされたポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列、および
(C)配列番号:3のアミノ酸番号76〜602からなる第1配列に対応する領域における前記第1配列に対する配列同一性が少なくとも76%であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドがデンプン顆粒結合型デンプン合成酵素の活性を示す塩基配列
からなる群より選ばれた塩基配列からなる遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされてなるモチ性ソバ属植物。 - ソバ属植物における請求項1に記載の核酸の機能を抑制する抑制剤であって、
(I)請求項1に記載の核酸の相補鎖もしくはその一部からなるアンチセンス核酸、
(II)請求項1に記載の核酸の塩基配列に基づき設計された21〜23塩基対の二本鎖RNAからなり、請求項1に記載の核酸の発現をRNAi効果により抑制するsiRNA、または
(III)請求項1に記載の核酸に含まれる遺伝子に対する変異型対立遺伝子の核酸
を含有していることを特徴とする抑制剤。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2015093607A1 (ja) * | 2013-12-20 | 2017-03-23 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | ウコギ科薬用植物の栽培方法 |
WO2022176997A1 (ja) * | 2021-02-22 | 2022-08-25 | 国立大学法人京都大学 | 機能欠損型顆粒性澱粉合成酵素遺伝子及びこれを利用したソバ属植物 |
-
2011
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Non-Patent Citations (3)
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JPN6015024954; Genes Genet. Syst. vol.83, no.5, 2008, pp.393-401 * |
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