JP7353602B1 - ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
[項1]真核細胞のゲノム内の標的DNA配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
(1)配列番号1に記載の塩基配列5’-NNACNN-3’(ここで「N」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の1塩基を意味する。)を含むPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列を認識するCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸、および、
(2)ゲノム内の前記標的DNA配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的DNA配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的DNA配列において改変することを含む方法。
[項2]前記Casタンパク質が、アビシコッカス(Abyssicoccus)属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス(Abyssicoccus albus)に由来する、項1に記載の方法。
[項3]前記Casタンパク質が、核局在化シグナル(NLS)を含む、項1または2に記載の方法
[項4]前記Casタンパク質が、配列番号4に記載のアミノ酸配列と80%以上、又は85%以上、又は90%以上、又は92%以上、又は95%以上、又は96%以上、又は97%以上、又は98%以上、又は99%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項1~3の何れか一項に記載の方法。
[項5]前記Casタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、項1~4の何れか一項に記載の方法。
[項6]前記PAM配列が、配列番号2に記載の塩基配列5’-NNACGN-3’または配列番号3に記載の塩基配列5’-NNACAN-3’を含む、項1~5の何れか一項に記載の方法。
[項7]前記ガイドRNAが、1本鎖ガイドRNA(sgRNA)であると共に、crRNAおよびtracrRNAを含む、項1~6の何れか一項に記載の方法。
[項8]前記crRNAが、標的DNA相補鎖と二本鎖を形成することが可能な15~30ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、項7に記載の方法。
[項9]前記crRNAが、12~36ヌクレオチド長のステムループを含む、項7又は8に記載の方法。
[項10]前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、項1~9の何れか一項に記載の方法。
[項11]前記Casタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、項1~10の何れか一項に記載の方法。
[項12]項1~11の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
[項13]前記のガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸を更に含む、項12に記載の組成物。
本発明の一側面は、真核細胞のゲノム内の標的DNA配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集方法(以下適宜「本発明のゲノム編集方法」又は「本発明の方法」と略称する。)に関する。本方法は、真核細胞中に、
(1)特定のPAM配列を認識するCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸、および、
(2)ガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的DNA配列において改変することを含むことを主な特徴とする。
本明細書において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されないが、好ましくは真核細胞が使用される。原核細胞の例としては、細菌、古細菌が挙げられる。真核細胞の例としては、微生物細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられる。微生物細胞としては、酵母、真菌、原生動物等の各種微生物に由来する細胞が挙げられる。植物細胞としては、種子植物、シダ・コケ類、藻類等の各種植物に由来する細胞が挙げられる。動物細胞としては、脊椎動物(哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等)、節足動物(昆虫等)、軟体動物等の各種動物に由来する細胞が挙げられる。特に哺乳動物細胞の具体例としては、CHO細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞等が挙げられる。細胞の態様も特に制限されず、生体内(インビボ)細胞、培養細胞(インビトロ)、初代培養細胞(インビトロおよびエクスビボ)、移植細胞等の何れの態様であってもよい。斯かる各種の細胞は、当該技術分野において一般的に使用される。
本明細書において「ゲノム編集」とは、部位特異的DNA修飾タンパク質等を用いて、各種細胞内のゲノム上の標的部位に所望の改変を導入することにより、ゲノムを編集する技術を意味する。ここで「改変」の例としては、限定されるものではないが、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して遺伝子を破壊すること、ゲノム上の標的部位のDNA断片を挿入又は置換すること、点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変すること等が挙げられる。ここで「標的部位」とは、ゲノム編集の対象となる真核細胞のゲノム内の所定の部位を意味する。ここで「切断」とは、ヌクレオチド分子の共有結合性の主鎖の切断を指す。
本明細書において「Casタンパク質」とは、細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するCasタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、PAM配列を認識して、その上流又は下流で二本鎖DNAを切断する標的特異的エンドヌクレアーゼである。Casタンパク質は、RNA誘導型ヌクレアーゼ(RNA-guided nuclease:RGN)であり、ガイドRNA(gRNA)と共にCRISPR/Casシステムを構成する。該CRISPR/Casシステムを標的細胞内に導入又は構築することにより、ガイドRNAがゲノム内の標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたCasタンパク質によって標的部位のDNAを切断することができる。
本発明に用いられるCasタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼ活性を有するCas9タンパク質は、ガイドRNAにより誘導され、標的となるDNA鎖の途中を切断する酵素活性を有することが好ましい。
本発明に用いられるCasタンパク質は、特定のPAM配列を認識する。本明細書において、「PAM配列」(プロトスペーサー隣接モチーフ配列)とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Cas9タンパク質により認識可能な配列である。Casタンパク質が認識可能なPAM配列の長さや塩基配列は、Casタンパク質の種類によって異なる。
ガイドRNAは、Casタンパク質等の部位特異的DNA修飾タンパク質をゲノム上の標的核酸の標的部位に誘導(ガイド)する機能を有するRNAである。部位特異的DNA修飾タンパク質は、通常は斯かるガイドRNAと結合して、リボ核タンパク質又はリボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。ここで、ガイドRNAがゲノム上の標的部位をターゲティングし、Casタンパク質等の部位特異的DNA修飾タンパク質がゲノム上の標的部位のDNAを開裂することで、ゲノム上の標的部位のDNA配列を変更又は改変することができる。
一般に、CRISPR/Casシステムにおける部位特異的改変の対象となる標的DNA配列は制限されず、二本鎖DNA配列、一本鎖RNA配列、または一本鎖DNA配列のいずれであってよい。但し、本発明では、真核細胞のゲノム内の二本鎖DNA配列が標的配列となる。中でも通常は、ゲノム内のDNA配列のうち、Casタンパク質が認識するPAM配列の近傍に位置するDNA配列が、標的DNA配列として選択される。
本発明の方法は、部位特異的改変の対象となる標的DNA配列をゲノム内に含む真核細胞中に、前記のCasタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドRNAまたはそれをコードする核酸とを導入することにより実施される。これにより、ガイドRNAが真核細胞ゲノム内の標的DNA部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたCasタンパク質によって当該真核細胞のゲノムを標的DNA部位で切断し、当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能となる。
以上、本発明のゲノム編集方法について説明したが、斯かるゲノム編集方法に使用される各種のゲノム編集手段、例えば前記のCasタンパク質またはそれをコードする核酸や、前記のガイドRNAまたはそれをコードする核酸も、本発明に含まれるものとする。
配列番号4に記載のアビシコッカス・アルバス(Abyssicoccus albus)由来のアミノ酸配列の情報を基に、当該Casタンパク質をコードする配列番号5に記載のDNA配列を人工合成した。当該DNA配列はNCBI(国立バイオテクノロジー情報センター)のGenBankなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。また、斯かるアビシコッカス・アルバス由来Cas9遺伝子を、大腸菌コドンについて最適化したDNA配列(配列番号6)、ヒトコドンについて最適化したDNA配列(配列番号7)、及び、シロイヌナズナについて最適化したDNA配列(配列番号8)も、それぞれ合成した。塩基配列の決定にはサンガー法又は次世代シーケンス法を用いた。なお、AalCas9タンパク質は、SpyCas9(1368アミノ酸)などの他のCas9オルソログと比べて、比較的小さな(1059アミノ酸)であった。
以下に詳述する手順により、配列番号6のAalCas9遺伝子に、公知のN末端核移行シグナル配列、C末端核移行シグナル配列、およびHis-tagを付加し、pETベクターに組み込んだAalCas9生産用ベクターを構築した。当該ベクターの構成を図1に模式的に示す。
5’-TCCTCCAGAGACTTTCCGCTTCTTCTTTGGGGCTTTATGATTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG-3’
・プライマー2(配列番号10):
5’-TCTGGCGGCTCAAAAAGAACCGCCGACGGCAGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCCTCGAGCACCACCAC-3’
5’-CGGAAAGTCTCTGGAGGA-3’
・オリゴヌクレオチドB(C末端核移行シグナル配列、配列番号12):
5’-GCGCTAAGAACGAGCGCG-3’
得られたプラスミドベクターpET-AalCas9を、常法により大腸菌ROSETTA2(DE3)pLYSS株に導入した。得られた組換株を50μg/mLカナマイシンを含むLB培地で培養し、OD値0.8になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside;IPTG)(終濃度0.25mM)を添加し、20℃で20時間培養した。培養後、当該大腸菌を遠心分離(8,000g、10分間)により回収した。回収した菌体を緩衝液A(50mM Tris-HCl、pH8.0、500mM NaCl、5mM MgCl2)で懸濁し、超音波破砕した。遠心分離(12,000g、30分間)により上清を回収し、緩衝液Aで平衡化したNi-アフィニティカラム、次にHeparinアフィニティカラムを用いて精製した後、緩衝液B(20mM Tris-HCl、pH7.5、300mM NaCl、1mM MgCl2、10% グリセロール)で平衡化したゲルろ過カラムにより精製した。精製したタンパク質は遠心式限外ろ過フィルターユニット(メルクミリポア)を用いて濃縮することにより、AalCas9を取得した。このようにして得られたAalCas9は-80℃で保存した。
AalCas9遺伝子のPAM配列を同定するために、以下の手順でプラスミドライブラリーを作製した。
5’-pGATCGTTGGTCTTTGCTCCTGCAGAGG-3’
・オリゴヌクレオチドD(配列番号14):
5’-pAATTCCTCTGCAGGAGCAAAGACCAAC-3’
5’-ACATCTGACGCTGCCGACGACAAGCTTGGCACTGGCCGTCG-3’
・プライマー4(配列番号16)
5’-CCGGAAGCATAAAGTGTAAAGC-3’
5’-CTTGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCATGCCTGCAGGTCGACTCGAGAGG-3’
・プライマー6(配列番号18)
5’-ACACTTTATGCTTCCGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG-3’
5’-GGTCTTTGCTCCTGCAG-3’
・オリゴヌクレオチドF(配列番号20):
5’-AGCTATGACCATGATTACGAATTCNNNNNNNCTGCAGGAGCAAAGACC-3’
5’-CTGCAGGAGCAAAGACC-3’
・プライマー8(配列番号22):
5’-GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC-3’
プラスミドライブラリーpUC18-NGS-OsPDS-7N切断用のAalCas9のsgRNA(配列番号23)を、Guide-itTM sgRNA In Vitro Transcription Kit(タカラバイオ社製)を用いて試験管内転写により調製した。AalCas9 sgRNAの構成を図2に、塩基配列を配列番号23に示す。なお、配列番号23では、5’末端側のポリNは省略して示している。このAalCas9 sgRNAを用いて、2.5μM AalCas9、12.5μM sgRNAとなるように、RNase-freeのCas9バッファー(20mM HEPES-Na、pH7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM EDTA)で希釈し、25℃で20分間放置して、複合体を形成させ、第1のRNP溶液を調製した。
5’-GUUUUAGUACUCUGCGAAAUUUAGUGAAAACUAGAUUUCGCAGAAUCUAUUAAAACAAGGCUUUAUGCCGUAUUUAACUCCAUCCUAUGGGUGGGGUAUUUUUU-3’
上記(2)で調製した第1のRNP溶液に、濃度20nMとなるようにプラスミドライブラリーとCas9バッファーを加え、30℃で2時間酵素反応させた。反応溶液に、濃度60mMとなるようにEDTAを加え、60℃で5分間インキュベート後、アガロース電気泳動にて、未切断のプラスミドを精製した。
5’-GCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3’
・プライマー10(配列番号25)
5’-ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG-3’
実施例2で作成したpUC18-NGS-OsPDS-7Nを鋳型に、AalCas9のPAM配列を含む以下のプライマー11(配列番号26)とプライマー12(配列番号27)からなるプライマーセット、又は、公知のSpyCas9のPAM配列を含む以下のプライマー13(配列番号28)とプライマー12(配列番号27)からなるプライマーセットを用いてPCR反応を実施し、各々約120bpのDNA断片を含むPCR増幅産物を調製した。調製したDNA断片はFastGene Gel/PCR エクストラクションキット(日本ジェネティクス)を用いて精製し、DNA切断活性測定の基質として用いた。
・プライマー11(配列番号26)
5’-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTGCGTTACTGCAGGAGC-3’
・プライマー12(配列番号27)
5’-GCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3’
・プライマー13(配列番号28)
5’-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTTTCCCACTGCAGGAGC-3’
・プライマー12(配列番号27)
5’-GCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3’
インビトロDNA切断活性用のAalCas9のsgRNA(配列番号23)を、Guide-itTM sgRNA In Vitro Transcription Kit(タカラバイオ社製)を用いて試験管内転写により調製した。このAalCas9 sgRNAを用いて、2μM AalCas9、2μM sgRNAとなるように、RNase-freeのCas9バッファー(20mM HEPES-Na、pH7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM EDTA)で希釈し、25℃で20分間放置して、複合体を形成させ、第2のRNP溶液を調製した。
上記(2)の第2のRNP溶液に、濃度1μM RNP、10nM 基質DNAとなるように、基質DNAとCas9バッファーを加えた。反応溶液は25℃および37℃でインキュベートし、5分後、10分後、15分後、30分後に反応溶液の一部を回収し、濃度が50mMとなるようにEDTAを加え、65℃で5分間インキュベートすることで反応を停止させた。回収した反応液は、MultiNA(島津)を用いて未切断DNAと切断DNAを定量し、DNA切断活性を測定した。
下記の公知のシロイヌナズナ由来PDS3遺伝子上のPAM配列ACGNを含むsgRNA(配列番号29)を、Guide-itTM sgRNA In Vitro Transcription Kit(タカラバイオ社製)を用いて試験管内転写により調製した。このsgRNAを用いて、10μM AalCas9、20μM sgRNAとなるようにRNase-freeのCas9バッファー(20mM HEPES-Na、pH7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、0.1mM EDTA)で希釈し、25℃で20分間放置して、複合体を形成させ、第3のRNP溶液を調製した。なお、配列番号29では、5’末端側のポリNは省略して示している。
5’-GUAGCGAGUAAUCGUGAAGUAGAGAAACAGGGUUUUAGUACUCUGCGAAAUUUAGUGAAAACUAGAUUUCGCAGAAUCUAUUAAAACAAGGCUUUAUGCCGUAUUUAACUCCAUCCUAUGGGUGGGGUAUUUUUU-3’
5’-GGACUUUUGCCAGCCAUGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU-3’
30日間生育させたシロイヌナズナの葉より表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を1.0%セルラーゼ-オノズカR-10(ヤクルト社製)、0.25% マセロザイムR-10(ヤクルト社製)、10mM メルカプトエタノール、400mMマンニトール、20mM KCl、10mM CaCl2、20mM MES(pH5.7)溶液に浸し、22℃、50rpmで振とうしながら、1時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径70μmのナイロンフィルターで濾した後、50mL容チューブに集め、100×g、10分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、150mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES(pH5.7)緩衝液(W5緩衝液)で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは100×g、5分間遠心後、同緩衝液で再度懸濁した。この緩衝液による洗浄を2度繰り返した後、4℃で10分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、100×g、5分間遠心後、400mMマンニトール、15mM MgCl2、4mM MES(pH5.7)緩衝液で再懸濁した。その後、100×g、5分間遠心することでプロトプラストを回収した後、2.0~3.0×105細胞/mLになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。
上記(2)で得られたプロトプラスト懸濁液35μLと前記第3又は第4のRNP溶液各10μLを混合後、40%(w/v)PEG4000、200mM マンニトール、100mM CaCl2溶液を45μLずつ、それぞれ96穴プレート(ヌンク社製、丸底)に入れ、900rpm、15秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は10分間室温で静置した。静置後の混合液にW5緩衝液200μLを勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、100×g、5分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清200μLを捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計4回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、22℃で18時間静置し、ゲノムDNAへの変異導入を行った。
上記(3)のRNP導入後、22℃で18時間静置したプロトプラスト懸濁液を200μL容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー(200mM Tris-HCl、pH7.5、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5%SDS)と混合後、95℃で10分間インキュベートした後、氷上で5分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムDNAを回収した。回収したゲノムDNAは滅菌水で懸濁し、AalCas9については以下のプライマー14(配列番号31)およびプライマー15(配列番号32)からなるプライマーセット、SpyCas9については以下のプライマー16(配列番号33)およびプライマー17(配列番号34)からなるプライマーセットを用いてPCR反応を実施し、約300bpのDNA断片を増幅した。得られた約300bpのDNA断片について、iSeq100システム(Illmina社)により次世代シーケンス解析を行い、ゲノム編集の有無を検出した。
・プライマー14(配列番号31)
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGAAAAGAATCATATGGTCATCAATTCG-3’
・プライマー15(配列番号32)
5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGGACTTGAATTAAAGGGGCTATAGTAG-3’
・プライマー16(配列番号33)
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAAATAATTAAAGTTGTTGCTGTTGG-3’
・プライマー17(配列番号34)
5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTAGCCTACTTGCCTGCTTTTC-3’
Claims (12)
- 真核細胞(但しヒト生体内(インビボ)細胞を除く)のゲノム内の標的DNA配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
(1)配列番号1に記載の塩基配列5’-NNACNN-3’(ここで「N」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の1塩基を意味する。)を含むPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列を認識するCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸、および、
(2)ゲノム内の前記標的DNA配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的DNA配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的DNA配列において改変することを含むと共に、
前記Casタンパク質が、配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上、又は92%以上、又は95%以上、又は96%以上、又は97%以上、又は98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。 - 前記Casタンパク質が、アビシコッカス(Abyssicoccus)属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス(Abyssicoccus albus)に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が核局在化シグナル(NLS)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記PAM配列が、配列番号2に記載の塩基配列5’-NNACGN-3’または配列番号3に記載の塩基配列5’-NNACAN-3’を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、1本鎖ガイドRNA(sgRNA)であると共に、crRNAおよびtracrRNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記crRNAが、標的DNA相補鎖と二本鎖を形成することが可能な15~30ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記crRNAが、12~36ヌクレオチド長のステムループを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記Casタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項1に記載の方法。
- 請求項1~10の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
- 前記のガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸を更に含む、請求項11に記載の組成物。
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