JP5967861B2 - 分子のグリコシル化 - Google Patents

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Description

本発明は、グリコシル化分子、特にタンパク質および脂質分子を得る方法に関する。
現在開発中の大多数の生物製剤（例えば、組換えタンパク質）の生産には高性能発現システムが必要である。これらの生物製剤のうちの多くの生物活性は、それらの修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に依存する。酵母系発現系は、微生物の遺伝子操作および発酵の容易さとタンパク質を分泌および修飾する能力を兼ね備えている。しかし、酵母細胞において生産される組換え糖タンパク質は、主として、不均一な高マンノースおよび過マンノースグリカン構造を示し、これらは、特にグリコシル化が生物学的に有意な役割を果たす場合、タンパク質機能、下流のプロセッシングおよび後の治療使用に不利益であり得る。
本発明は、少なくとも一部分は、（ａ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞における単一遺伝子欠失（外鎖伸長部（ＯＣＨ１）欠失）が、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ；図１）骨格上にα−１，２−結合マンノース残基を有するグリコシル化タンパク質の実質的に均一な生産を生じさせたという発見；（ｂ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＯＣＨ１欠失を伴うものと伴わないものの両方）のＥＲにターゲッティングされた操作されたアルファ−１，２−マンノシダーゼの過剰発現が、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造（構造式ＩＶ；図１）を有するグリコシル化タンパク質の実質的に均一な生産を生じさせたという発見；（ｃ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるアスパラギン結合グルコシル化３（ＡＬＧ３）酵素の不活性化が、グルコシル化グリカンレベルを大いに増加させる結果となるという発見；および（ｄ）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける野生型形態のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ遺伝子（ＭＮＮ４）の過剰発現が、α−１，２−結合マンノース残基の過リン酸化を生じさせるという発見に基づく。従って、遺伝子操作された細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、または他の関連種二相性酵母細胞）は、同じ種の遺伝子操作されていない細胞において生産されるＮ−グリコシル化形態のターゲット分子と比較して改変されたＮ−グリコシル化形態を有するターゲット分子を生産する方法において使用することができる。代謝異常（例えば、リソソーム貯蔵障害）を有する患者へのＮ−グリコシル化ターゲット分子（例えば、Ｎ−グリコシル化タンパク質）の投与がこの疾患の症状を改善することは証明されているので、記載した方法および細胞は、とりわけ代謝異常、例えばリソソーム貯蔵障害の治療のためのＮ−グリコシル化ターゲット分子の調製に有用である。
本発明は、少なくとも一部分は、スプライスされた形態のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＡＣ１遺伝子の発見に基づく。ＨＡＣ１遺伝子によってコードされたタンパク質、Ｈａｃ１ｐは、小胞体ストレス反応（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）エレメントと呼ばれるＤＮＡ配列モチーフに結合することによって幾つかのターゲット遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子である。Ｈａｃ１ｐターゲット遺伝子には、シャペロンをコードするもの、フォールダーゼをコードするもの、ならびに脂質代謝およびイノシトール代謝に責任を負うタンパク質をコードするものなどがある。スプライスされた形態のＨａｃ１ｐは、スプライスされていないＨＡＣ１ ｍＲＮＡによってコードされた形態より強力な転写活性化因子であるので、スプライスされた形態のＨａｃ１ｐ転写因子の過剰発現は、天然および異種タンパク質の発現増加ならびにＥＲ膜における増加をもたらすことができる。従って、スプライスされた形態のＨａｃ１ｐを使用して、ターゲット分子のＵＰＲおよび発現の同時活性化により様々な真核生物細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａもしくは本明細書に記載する任意の他の酵母細胞）、植物細胞または動物細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞））において膜および分泌タンパク質の生産を増加させることができる。
本発明は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて発現されたときにＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）構造をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ；図４）、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｖ；図４）およびＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩ；図４）に転化させることができる突然変異形態のＭＮＳ１マンノシダーゼの発見にさらに基づく。従って、突然変異形態のマンノシダーゼ、例えばＭＮＳ１、を発現する遺伝子操作された真核生物細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａもしくは本明細書に記載する任意の他の酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞））は、同じ種の遺伝子操作されていない細胞において生産されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子と比較して改変されたＮ−グリコシル化形態を有するターゲット分子を生産する方法に使用することができる。従って、記載する細胞および方法は、とりわけ代謝異常、例えばリソソーム貯蔵障害（下記参照）の治療のためのＮ−グリコシル化ターゲット分子の調製に有用である。
１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法を特徴とする。この方法は、ターゲットタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する工程を含み、この場合、前記細胞は、ターゲットタンパク質を改変されたＮ−グリコシル化形態で生産し、および前記細胞は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含有するように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞（または関連種二相性酵母細胞）である。前記方法は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含有するように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（または関連種二相性酵母細胞）を提供する工程も含む場合がある。前記方法は、前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を単離する工程を含む場合もある。
一部の実施形態において、前記ターゲットタンパク質は、内因性タンパク質である場合もあり、外因性タンパク質である場合もある。前記ターゲットタンパク質は、ヒトタンパク質などの哺乳動物タンパク質であり得る。前記ターゲットタンパク質は、例えば、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合タンパク質であり得る。前記融合タンパク質は、例えば、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカインまたはケモカインと抗体またはその抗原結合フラグメントの融合体であり得る。前記ターゲットタンパク質は、例えば、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）に関連したものであり得る。前記ターゲットタンパク質は、例えば、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、またはリポタンパク質リパーゼであり得る。
一部の実施形態において、前記改変Ｎ−グリコシル化形態は、１つ以上のＮ−グリカン構造、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２など、を含有することができる。一部の実施形態において、前記改変グリコシル化は、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇｌｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２であり得る。
一部の実施形態において、前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質は、均一または実質的に均一であり得る。例えば、改変グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９０％以上であり得る。
一部の実施形態において、少なくとも１つのＮ−グリコシル化活性が欠損するように、前記細胞を遺伝子操作することができる。前記Ｎ−グリコシル化活性は、例えば、ＡＬＧ３活性、ＯＣＨ１活性、ＭＮＳ１活性、またはＭＮＮ９活性であり得る。
一部の実施形態において、少なくとも１つの修飾は、（ａ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の欠失；（ｂ）Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異形態のタンパク質の発現；（ｃ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現；（ｄ）Ｎ−グリコシル化活性（例えば、ＡＬＧ６またはアルファ−マンノシダーゼ（例えば、小胞体にターゲッティングされたアルファ−マンノシダーゼ））を有するタンパク質の発現であり得る。発現されるタンパク質は、その細胞内の外因性核酸によってコードされたタンパク質であり得る。発現されるタンパク質は、７．５未満の最適ｐＨ（例えば、５．１未満の最適ｐＨ）を有するアルファ−マンノシダーゼであり得る。前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、外因性タンパク質であり得る。前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）である場合もあり、または下等真核生物（例えば、真菌、原生動物もしくはトリパノソーマ）タンパク質である場合もある。前記下等真核生物は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、および本明細書に記載する任意の他の下等真核生物からなる群より選択することができる。
一部の実施形態において、前記Ｎ−グリコシル化活性は、グルコシルトランスフェラーゼ活性であり得る。一部の実施形態において、前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、ＡＬＧ６またはアルファ−マンノシダーゼである。前記アルファ−マンノシダーゼを小胞体にターゲッティングすることができる。例えば、前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、アルファ−マンノシダーゼポリペプチドおよびＨＤＥＬ小胞体貯留ペプチドを含む融合タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からグルコース残基を除去することができるタンパク質であり得る。例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、アルファ−１，３−グルコシダーゼ活性、例えば、グルコシダーゼＩＩ（例えば、グルコシダーゼＩＩのアルファおよびベータサブユニットの一方もしくは両方）またはムタナーゼ（しかし、これらに限定されない）、を有するタンパク質であり得る。
一部の実施形態において、少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性、例えば、本明細書に記載する修飾Ｎ−グリコシル化活性のいずれか、を含むように、前記細胞を遺伝子操作することができる。前記少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性は、例えば、ＡＬＧ３活性の欠損、および高レベルのＡＬＧ６活性を含み得る。
一部の実施形態において、少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性、例えば、本明細書に記載する修飾Ｎ−グリコシル化活性のいずれか、を含むように、前記細胞を遺伝子操作することができる。前記少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性は、例えば、ＡＬＧ３活性の欠損；高レベルのＡＬＧ６活性；および高レベルのグルコシダーゼＩＩ活性を含み得る。
一部の実施形態において、前記細胞は、ＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されない。
一部の実施形態において、修飾は、ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体の発現を含み得る。前記マンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体は、ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、またはＭＮＮ６であり得る。一部の実施形態において、糖タンパク質のマンノシル残基の少なくとも約３０％をリン酸化することができる。
一部の実施形態において、前記方法は、糖タンパク質の追加のプロセッシングをさらに含む場合がある。前記追加のプロセッシングは、インビトロで行われる場合もあり、またはインビボで行われる場合もある。前記追加のプロセッシングは、前記修飾糖タンパク質への異種部分の付加を含む場合がある。前記異種部分は、ポリマーまたは担体であり得る。前記追加のプロセッシングは、前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の酵素的または化学的処理を含む場合がある。例えば、前記追加のプロセッシングは、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、ホスホジエステラーゼ、グルコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼでの前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理を含む場合がある。前記追加のプロセッシングは、フッ化水素酸での前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理を含む場合がある。前記追加のプロセッシングは、前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質のリン酸化を含む場合がある。
もう１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作された真核生物細胞（例えば、真菌細胞、植物細胞または動物細胞）を提供する工程；および前記細胞にターゲットタンパク質をコードする核酸を導入する工程を含み、この場合、その細胞は、そのターゲットタンパク質を改変されたＮ−グリコシル化形態で生産する。
もう１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法を特徴とする。この方法は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞から調製された細胞溶解産物とターゲットタンパク質を接触させる工程を含み、この場合、そのターゲットタンパク質と細胞溶解産物の接触が、結果として、改変されたＮ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生じさせる。
さらにもう１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法を特徴とし、この方法は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲットタンパク質を接触させる工程を含み、この場合、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞から得られ、そのＮ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲット分子の接触が、結果として、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生じさせる。
もう１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化を有する単離されたタンパク質を提供し、この場合、そのタンパク質は、上に記載した方法のいずれかによって生産される。
さらにもう１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞（または他の関連種二相性酵母細胞）を提供する。前記Ｎ−グリコシル化活性は、例えば、ＡＬＧ３活性、ＯＣＨ１活性、ＭＮＳ１活性、またはＭＮＮ９活性であり得る。前記修飾は、本明細書に記載するもののいずれかであり得る。例えば、前記修飾としては、（ａ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の欠失、（ｂ）Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異形態のタンパク質の発現、（ｃ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入もしくは発現、または（ｄ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を挙げることができる。前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、例えばＡＬＧ６であり得る。前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、ヒトタンパク質などの哺乳動物タンパク質であり得る。前記修飾は、修飾糖タンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるタンパク質（例えば、ＭＮＮ４もしくはＰＮＯ１）またはその生物学的に活性な変異体の発現も含む場合がある。
もう１つの態様において、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる疾患を治療する方法を提供する。この方法は、上に記載した方法のいずれかによって得られたタンパク質を被験体に投与する工程を含み、この場合、その被験体は、改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる疾病を有する、または有することが疑われる被験体である。この方法は、（ａ）被験体を提供する工程、および／または（ｂ）その被験体が、改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる疾病を有するかどうかを決定する工程も含む場合がある。前記被験体は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。前記疾患は、例えば、癌、免疫学的疾患（例えば、炎症性状態）または代謝異常であり得る。前記代謝異常は、本明細書に記載するもののいずれか、例えば、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）、例えば、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ポンペ病、ニーマン−ピック病またはファブリ病であり得る。前記タンパク質は、ＬＳＤに関連したタンパク質である場合があり、例えば、前記タンパク質は、例えば、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼであり得る。前記タンパク質は、例えば、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、またはリポタンパク質リパーゼであり得る。
もう１つの態様において、本開示は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞（または他の関連種二相性酵母細胞）の実質的に純粋な培養物を提供し、前記細胞の相当数が、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性（例えば、本明細書に記載する修飾のいずれか）を含むように遺伝子操作される。前記細胞の培養物は、細胞の１つ以上の亜集団を含み得、各亜集団は、異なる修飾グリコシル化活性を含む。
さらにもう１つの態様において、本開示は、（ａ）配列番号１もしくは配列番号２を含む、単離されたヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２と少なくとも８０％同一である配列を含む、単離されたヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の単離されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、前記単離された核酸配列は、配列番号１または配列番号２である。
もう１つの態様において、本開示は、（ａ）配列番号１もしくは配列番号２の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または（ｂ）そのヌクレオチド配列の相補体を含有する、単離された核酸を特徴とする。
さらにもう１つの態様において、本開示は、（ａ）本明細書に示す核酸配列のいずれかを含む（もしくは、から成る）、単離されたヌクレオチド配列；（ｂ）本明細書に示す核酸配列のいずれかと少なくとも８０％同一である配列を含む、単離されたヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の単離されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、前記単離された核酸配列は、本明細書に示す核酸配列のいずれかである。
もう１つの態様において、本開示は、（ａ）本明細書に示す核酸配列のいずれかの相補体に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または（ｂ）そのヌクレオチド配列の相補体を含有する、単離された核酸を特徴とする。
さらにもう１つの態様において、本開示は、（ａ）上に記載した核酸配列のいずれかを含むベクター、または（ｂ）（ａ）のベクターを含有する培養細胞を提供する。前記ベクターは、発現ベクターであり得る。前記ベクター中の核酸配列は、発現制御配列に作動可能に連結させることができる。
もう１つの態様において、本開示は、タンパク質を生産するための方法を提供する。この方法は、上に記載した細胞のいずれかを、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。この方法は、前記細胞を培養した後、前記細胞またはその細胞を培養した培地から前記ポリペプチドを単離する工程も含む場合がある。前記細胞は、例えば、上に記載した核酸配列のいずれかを含むベクターを含有する培養細胞であり得る。
本明細書に記載するターゲット分子（例えば、ターゲットタンパク質）、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質、および改変Ｎ−グリコシル化分子（総称して、「本発明の分子」と呼ぶ）は、単離することが、必要ではないが、できる。本明細書に記載する本発明の分子のいずれかに適用する場合、用語「単離される」は、自然にそれに随伴する成分（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生物学的な分子または有機分子）から分離または精製された分子またはそのフラグメントを指す。組換え分子（例えば、組換えタンパク質）は、常に「単離される」であろうと解釈する。典型的に、本発明の分子は、それが、調製品中の同じタイプの全分子の少なくとも６０重量％、例えばサンプル中の同じタイプの全分子の６０％、を構成するとき、単離されている。例えば、改変グリコシル化タンパク質は、それが、調製品またはサンプル中の全タンパク質の少なくとも６０重量％を構成するとき、単離されている。一部の実施形態において、前記調製品中の本発明の分子は、調製品中の同じタイプの全分子の少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９９重量％を構成する。
本明細書において用いる場合、「改変Ｎ−グリコシル化形態」のターゲット分子は、遺伝子操作された宿主細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、または別の関連二相性酵母細胞種の細胞）によって生産されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子であり、これは、その遺伝子操作された細胞と同じ種の遺伝子操作されていない細胞において生産されるＮ−グリコシル化形態のターゲット分子とは異なる。従って、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子は、例えば、Ｎ−グリコシル化されていない形態のターゲット分子である場合がある。さらに、改変グリコシル化形態のターゲット分子は、例えば、１つ以上のＮ結合グリカンの改変リン酸化を有する形態のターゲット分子である場合がある。
本明細書において用いる場合、用語「他の関連二相性酵母細胞種」は、Ｄｉｐｏｄａｓｃａｃｅａｅ科、例えば、Ａｒｘｕｌａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ（例えば、Ｄ．ａｌｂｉｄｕｓ、Ｄ．ｉｎｇｅｎｓ、またはＤ．ｓｐｅｃｉｆｅｒ）、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｇ．ｒｅｅｓｉｉまたはＧ．ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｃｉｆｅｒｉｉ）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、およびＺｙｇｏａｓｃｕｓに属する、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓに関連した酵母を指す。具体的に言うと、クレードＭｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉａ（例えば、Ｍ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａまたはＭ．ａｇａｖｅｓ）およびＳｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ（Ａｒｘｕｌａ（例えば、Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓまたはＡ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）などの種の２６Ｓ−ｒＤＮＡ配列のＤ１／Ｄ２ドメインの分析によって、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが割り当てられたクレード）および一部のＣａｎｄｉｄａ種（例えば、Ｃ．ａｐｉｃｏｌａだが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｍｅｌｔｏｓａ、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓではない）の酵母。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に用いており、長さまたは翻訳後修飾に関係なくアミノ酸のペプチド結合鎖を意味する。
本開示は、本明細書に記載する野生型、完全長、成熟「ターゲットタンパク質」または「Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質」の、（ｉ）生物学的に活性な変異体および（ｉｉ）生物学的に活性なフラグメントまたはそれらの生物学的に活性な変異体も提供する。完全長、成熟、野生型タンパク質またはそれらのタンパク質のフラグメントの生物学的に活性な変異体は、付加、欠失または置換を含有する場合がある。置換を有するタンパク質は、一般に、５０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０以下）の保存的アミノ酸置換を有するであろう。保存的置換は、あるアミノ酸を類似した特徴を有する別のアミノ酸の代わりに用いることである。保存的置換は、次の群の中での置換を含む：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上述の極性、塩基性または酸性群のうちのあるメンバーの同じ群の別のメンバーによる任意の置換を保存的置換と考えることができる。対照的に、非保存的置換は、あるアミノ酸での類似していない特徴を有する別のものの置換である。
欠失変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の（アミノ酸２個以上の）アミノ酸セグメントまたは連続していない単一のアミノ酸を欠失している場合がある。
付加（付加変異体）としては、（ａ）少なくとも５個のアミノ酸を含有する完全長、野生型、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグメント；および（ｂ）内部または末端（ＣまたはＮ）無関連または異種アミノ酸配列を含有する、融合タンパク質が挙げられる。このような融合タンパク質に関連して、用語「異種アミノ酸配列」は、（ａ）以外のアミノ酸配列を指す。従って、本明細書に記載するペプチドと異種アミノ酸配列とを含有する融合タンパク質は、配列の点で、天然タンパク質のすべてまたは一部に対応しない。異種配列は、例えば、組換えタンパク質の精製に用いられる配列［例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）］であり得る。異種配列は、診断または検出可能マーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）である場合もある。一部の実施形態において、前記融合タンパク質は、別のタンパク質からのシグナル配列を含有する。一定の宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用により、前記ターゲットタンパク質の発現および／または分泌を増加させることができる。一部の実施形態において、前記融合タンパク質は、例えば、免疫反応（例えば、抗体産生のために；下記参照）または小胞体もしくはゴルジ装置貯留シグナルを惹起する際に有用な担体（例えば、ＫＬＨ）を含有する場合がある。異種配列は、可変長のものである場合があり、一部の実施形態では、その異種配列が付いている完全長ターゲットタンパク質より長い配列である場合がある。
本明細書において用いる場合、「フラグメント」は、完全長未成熟タンパク質より短いポリペプチドのセグメントを指す。タンパク質のフラグメントは、末端（カルボキシもしくはアミノ末端）および／または内部欠失を有する場合がある。一般に、タンパク質のフラグメントは、長さが少なくとも４（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、または少なくとも１００以上）アミノ酸であろう。
ターゲットタンパク質またはＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質の生物学的に活性なフラグメントまたは生物学的に活性な変異体は、その野生型、完全長、成熟タンパク質の活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％もしくは１００％またはさらにそれ以上）を有する。ターゲットタンパク質の場合、その関連活性は、遺伝子操作された細胞においてターゲットタンパク質が改変Ｎ−グリコシル化を受ける能力である。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の場合、その関連活性は、Ｎ−グリコシル化活性である。
それらの所期の用途に依存して、前記タンパク質、それらの生物学的に活性なフラグメントまたは生物学的に活性な変異体は、例えば、真菌（酵母を含む）、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、または哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サルもしくはヒト）などのいずれの種であってもよい。一部の実施形態において、生物学的に活性なフラグメントまたは生物学的に活性な変異体は、前記タンパク質の免疫原性および抗原性フラグメントを含む。免疫原性フラグメントは、対象となる動物において免疫反応（例えば、抗体反応または細胞免疫反応）を刺激する関連完全長、未成熟タンパク質の能力の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％もしくは１００％またはさらにそれ以上）を有するものである。タンパク質の抗原性フラグメントは、そのタンパク質に特異的な抗体またはそのタンパク質に特異的なＴ細胞によって認識される関連完全長、未成熟タンパク質の能力の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％もしくは１００％またはさらにそれ以上）を有するものである。
本明細書において用いる場合、「Ｎ−グリコシル化活性」は、（ｉ）Ｎ結合グリカンをターゲット分子に付加させることができる（すなわち、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性）；（ｉｉ）ターゲット分子からＮ結合グリカンを除去する、（ｉｉｉ）ターゲット分子上の１つ以上のＮ結合グリカンを修飾する、（ｉｖ）ドリコール結合オリゴ糖を修飾する；または（ｖ）（ｉ〜ｉｖ）の活性についてその活性を助長することができる、任意の活性を指す。従って、Ｎ−グリコシル化活性としては、例えば、Ｎ−グリコシダーゼ活性、グルコシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性、糖ヌクレオチド合成、修飾、または輸送体活性が挙げられる。ターゲット分子上の１つ以上のＮ結合グリカンの修飾は、マンノシルホスホリルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、またはホスファターゼ活性、例えば、ターゲット分子上のＮ結合グリカンのリン酸化状態を改変するマンノシルホスホリルトランスフェラーゼ、キナーゼまたはホスファターゼ活性、の作用を含む。
本明細書において用いる場合、細胞を「遺伝子操作する」ことまたは「遺伝子操作（された）細胞」などの専門用語は、細胞において、遺伝子操作されていない細胞［例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞もしくは他の関連種二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）］と比較して修飾されているＮ−グリコシル化活性を少なくとも１つ生じさせる結果となる、細胞の任意の人工的に生じさせる遺伝子改変を指す。従って、人工的に生じさせる遺伝子改変は、例えば、自然突然変異を含まないと解釈する。人工的遺伝子改変の例は、下で説明する（「遺伝子操作細胞」参照）。
本明細書において用いる場合、用語「野生型」は、核酸またはポリペプチドに適用されるとき、生物が自然界に存在するときにその生物体内で発生するまたはその生物によって生産される核酸またはポリペプチドをそれぞれ指す。
本明細書において宿主細胞における核酸または宿主細胞によって生産されるポリペプチドに適用されるときの用語「異種の」は、その宿主細胞と同じ種の細胞からは得られない任意の核酸またはポリペプチド（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質）を指す。従って、本明細書において用いる場合、「同種」核酸またはタンパク質は、その宿主細胞と同じ種の細胞において発生するまたは該細胞によって生産されるものである。
用語「外因性」は、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書において用いる場合、自然界で見つけられるようなその特定の細胞では発生しない（およびその特定の細胞からは得ることはできない）任意の核酸を指す。従って、非天然核酸は、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞にとって外因性であると見なされる。非天然核酸は、その核酸が全体として自然界に存在しないという前提で、自然界で見つけられる核酸サブ配列または核酸配列のフラグメントを含有する場合があることに留意することが重要である。例えば、発現ベクター内のゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は、非天然核酸であり、従って、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞にとって外因性である。その核酸分子は、自然界では全体（ゲノムＤＮＡ＋ベクターＤＮＡ）として存在しないからである。従って、自然界に全体として存在しない任意のベクター、自律複製プラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）は、非天然核酸であると見なされる。ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されたゲノムＤＮＡフラグメントならびにｃＤＮＡは、自然界では見つけられない別個の分子として存在するので、非天然核酸と見なされることになる。プロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列を自然界で見つけられない配置で含有する任意の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、非天然核酸ということになる。自然に発生する核酸が特定の細胞にとっては外因性である場合がある。例えば、酵母ｘの細胞から単離された全染色体は、その染色体が酵母ｙの細胞に導入されると、酵母ｙの細胞に対しては外因性核酸である。
「外因性」核酸が、「同種」核酸である場合もあり、「異種」核酸である場合もあることは、上で述べたことから明らかであろう。対照的に、用語「内因性」は、核酸または遺伝子（またはそれらの核酸もしくは遺伝子によってコードされたタンパク質）および特定の細胞に関して本明細書において用いる場合、自然界で見つけられるようなその特定の細胞において発生する（および該細胞から得ることができる）任意の核酸または遺伝子を指す。
上の概念の実例として、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞に形質転換されるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＬＧ６タンパク質をコードする発現プラスミドは、その細胞に対して、外因性核酸である。しかし、前記ＡＬＧ６タンパク質コーディング配列およびそれによって生産されるＡＬＧ６タンパク質は、その細胞に対して同種である。類似して、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞に形質転換されるＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ ＡＬＧ６タンパク質をコードする発現プラスミドは、その細胞に対して、外因性核酸である。しかし、前の例とは対照的に、そのＡＬＧ６タンパク質コーディング配列、およびそれによって生産されるＡＬＧ６タンパク質は、その細胞に対して異種である。
本明細書において用いる場合、「プロモーター」は、遺伝子を転写することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、その後、それが転写を開始させる。従って、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに直接結合している、またはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与する、いずれかのＤＮＡ配列を含有する。プロモーター配列は、遺伝子クラスター内の遺伝子の転写レベルを増す（よって、この名がある）タンパク質（すなわち、１セットの転写因子とほぼ同じ、トランス作用因子）と結合することができるＤＮＡの１つ以上の領域である「エンハンサー領域」も含む場合がある。前記エンハンサーは、典型的にはコーディング領域の５’末端にあるが、プロモーター配列から離れている場合もあり、例えば、遺伝子のイントロン領域内、またはその遺伝子のコーディング領域に対して３’にある場合もある。
本明細書において用いる場合、「作動可能に連結される」は、発現制御配列が対象となるコーディング配列の発現を有効に制御するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
本明細書に記載する任意の核酸配列（例えば、配列番号１または配列番号２で示されるようなＨＡＣ１配列）の変異体は、相同である配列を有することができ、例えば、その野生型核酸配列に少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）相同な（同一の）配列を有する。そのような野生型配列は、自然界から単離される場合もあり、または組換え法もしくは合成法によって生産される場合もある。従って、野生型配列核酸は、天然ヒト核酸配列、サル核酸配列、マウス核酸配列、または対象となる野生型核酸の相同体を含有する任意の他の種の核酸配列を有する場合がある。本明細書において用いる場合、「相同な」または「相同な核酸配列」または類似の用語は、少なくとも指定の百分率のヌクレオチドレベルでの相同性によって特徴づけられる配列を指し、配列同一性と交換可能に用いている。
パーセント相同性または同一性は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９）を用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、デフォルト設定を用いて決定することができる。一部の実施形態において、プローブとターゲット（下記参照）との相同性は、約５０％から約６０％の間である。一部の実施形態において、プローブとターゲット核酸との相同性は、約５５％から約６５％の間、約６５％から約７５％の間、約７０％から約８０％の間、約７５％と約８５％の間、約８０％と約９０％の間、約８５％と約９５％の間、または約９０％と約１００％の間である。
用語「プローブ」は、本明細書において用いる場合、可変長の核酸配列を指す。一部の実施形態において、プローブは、少なくとも１０、および６，０００ほども多くのヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、プローブは、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０または少なくとも７５または１００の隣接するヌクレオチドを含む。より長いプローブは、通常、（直接、化学合成とは対照的に）天然または組換え源から得られ、ターゲット配列に非常に特異的であり、およびより長いオリゴマーに比べてはるかにゆっくりとターゲットにハイブリダイズする。プローブは、１本鎖核酸分子である場合もあり、または２本鎖核酸分子である場合もある。
一部の実施形態において、本明細書に記載する変異体核酸は、対象となる野生型核酸（例えば、配列番号１または配列番号２で示すようなＨＡＣ１核酸配列）の領域、部分、ドメインまたはセグメントに対して部分的相補性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補性）を有する一方または両方の鎖を含む配列を有する場合がある。一部の実施形態において、対象となる変異体核酸配列は、野生型核酸配列の領域、部分、ドメインまたはセグメントに対して完全相補性（すなわち、１００％相補性）を有する一方または両方の鎖を含む配列を有する場合がある。配列「相補性」は、それらの水素結合特性（すなわち、アデニンとウラシル（または、ＤＮＡもしくは修飾ＲＮＡの場合は、チミン）が互いに対置しており、グアニンとシトシンが互いに対置している逆平行２本鎖が形成できるような、塩基配列を有する２本の核酸鎖の特性）の結果としての特定の窒素含有塩基間の化学的親和性を指す。従って、完全に相補的な配列は、ヌクレオチド配列が逆平行２本鎖を形成するときに塩基配列の完全な１対１対応（すなわち、アデニン対ウラシル／チミジン、およびグアニン対シトシン）を有する２つの配列であろう。
ハイブリダイゼーションも、２つの核酸配列間の相同性の尺度として用いることができる。本明細書に記載する核酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体は、標準ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。試験源（例えば、真核生物細胞）からのＤＮＡまたはＲＮＡへの対象となる一定のプローブ（例えば、ＨＡＣ１ヌクレオチド配列、例えば、配列番号１または配列番号２に示すようなＨＡＣ１ヌクレオチド配列、のプローブ）のハイブリダイゼーションは、その試験源におけるそのプローブに対応するＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ＨＡＣ１ヌクレオチド配列）の存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９９１において見つけることができる。中等度ハイブリダイゼーション条件は、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、３０℃でのハイブリダイゼーション、続いての１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での洗浄と等価と定義する。高ストリンジェント条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、４５℃でのハイブリダイゼーション、続いての０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄と等価と定義する。
別段定義していない限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価の方法および材料を本発明の実施または試験の際に用いることができるのだが、具体例としての方法および材料を下で説明する。本明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号、および他の参考文献は、それら全体が参照により援用されている。矛盾する場合、定義を含めて本出願が支配することとなる。材料、方法および実施例は、単に例証となるものであり、限定と解釈されない。
本発明、例えば改変Ｎ−グリコシル化分子の生産方法、の他の特徴および利点は、後続の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞を提供すること；および
ターゲットタンパク質をコードする核酸を該細胞に導入すること
を含み、
該細胞が、該ターゲットタンパク質を改変Ｎ−グリコシル化形態で生産する、
改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法。
（項目２）
上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を単離することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ターゲットタンパク質が、外因性タンパク質である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記ターゲットタンパク質が、内因性タンパク質である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記ターゲットタンパク質が、哺乳動物タンパク質である、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記ターゲットタンパク質が、ヒトタンパク質である、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記ターゲットタンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合タンパク質である、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記融合タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカインまたはケモカインと抗体またはその抗原結合フラグメントとの融合体である、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記ターゲットタンパク質が、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）に関連したタンパク質である、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記ターゲットタンパク質が、グルコセレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼである、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記ターゲットタンパク質が、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼからなる群より選択される、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記改変Ｎ−グリコシル化形態が、１つ以上のＮ−グリカン構造を含む、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｍａｎ ８ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｍａｎ ９ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｍａｎ ３ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｇｌｃ １ Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
上記１つ以上のＮ−グリカンが、Ｇｌｃ ２ Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質が、均一である、項目１２〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質が、実質的に均一である、項目１２〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
上記改変グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも約２０％である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記改変グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも約３０％である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
上記改変グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも約４０％である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
上記改変グリコシル化が、Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
上記改変グリコシル化が、Ｍａｎ ８ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
上記改変グリコシル化が、Ｍａｎ ９ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
上記改変グリコシル化が、Ｍａｎ ３ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
上記改変グリコシル化が、Ｇｌｃ １ Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
上記改変グリコシル化が、Ｇｌｃ ２ Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ である、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
上記細胞が、少なくとも１つのＮ−グリコシル化活性が欠損するように遺伝子操作される、項目１〜２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＯＣＨ１活性である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＭＮＳ１活性である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＭＮＮ９活性である、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
上記少なくとも１つの修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の欠失を含む、項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
上記少なくとも１つの修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異形態のタンパク質の発現を含む、項目１〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
上記少なくとも１つの修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現を含む、項目１〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
上記少なくとも１つの修飾が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含む、項目１〜３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
発現されるタンパク質が、上記細胞内の外因性核酸によってコードされたタンパク質である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、グルコシルトランスフェラーゼ活性である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、ＡＬＧ６である、項目３８〜４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−マンノシダーゼである、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
上記アルファ−マンノシダーゼが、小胞体にターゲッティングされる、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−マンノシダーゼポリペプチドおよびＨＤＥＬ小胞体貯留ペプチドを含む融合タンパク質である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
上記アルファ−マンノシダーゼが、５．１未満の最適ｐＨを有する、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ からグルコース残基を除去することができるタンパク質である、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−１，３−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である、項目３８または４６に記載の方法。
（項目４８）
上記タンパク質が、グルコシダーゼＩＩである、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
上記タンパク質が、グルコシダーゼＩＩのアルファおよびベータサブユニットの一方または両方を含む、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
上記タンパク質が、ムタナーゼである、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
上記細胞が、少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作される、項目１に記載の方法。
（項目５２）
上記少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性の欠損および高レベルのＡＬＧ６活性を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記細胞が、少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作される、項目１に記載の方法。
（項目５４）
上記少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性の欠損；高レベルのＡＬＧ６活性；および高レベルのグルコシダーゼＩＩ活性を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、外因性タンパク質である、項目３８〜５４のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、哺乳動物タンパク質である、項目３８〜５４のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、ヒトタンパク質である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、下等真核生物タンパク質である、項目３８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
上記下等真核生物が、真菌、トリパノソーマ、または原生動物である、項目４５に記載の方法。
（項目６０）
上記下等真核生物が、Ｔｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからなる群より選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
上記修飾が、上記ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体の発現を含む、項目１〜６０のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
上記マンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体が、ＭＮＮ４である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
上記マンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体が、ＰＮＯ１である、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
上記マンノシルリン酸化を果たすことができるタンパク質またはその生物活性変体が、ＭＮＮ６である、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
糖タンパク質のマンノシル残基の少なくとも約３０％が、リン酸化される、項目６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
上記細胞が、ＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されない、項目１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
上記糖タンパク質の追加のプロセッシングをさらに含む、項目１〜６６のいずれかに記載の方法。
（項目６８）
上記追加のプロセッシングが、インビトロで行われる、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
上記追加のプロセッシングが、インビボで行われる、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
上記追加のプロセッシングが、上記修飾糖タンパク質への異種部分の付加を含む、項目６７〜６９のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
上記異種部分が、ポリマーまたは担体である、項目５５に記載の方法。
（項目７２）
上記追加のプロセッシングが、上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の酵素的または化学的処理を含む、項目６７〜７１のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
上記追加のプロセッシングが、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、ホスホジエステラーゼ、グルコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼでの上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７４）
上記追加のプロセッシングが、フッ化水素酸での上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
上記追加のプロセッシングが、上記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質のリン酸化を含む、項目６７〜７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
項目１〜７５のいずれかに記載の方法によって生産される、改変Ｎ−グリコシル化を有する単離されたタンパク質。
（項目７７）
少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞。
（項目７８）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性である、項目７７に記載の単離された細胞。
（項目７９）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＯＣＨ１活性である、項目７７または７８に記載の単離された細胞。
（項目８０）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＭＮＳ１活性である、項目７７〜７９に記載の単離された細胞。
（項目８１）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、ＭＮＮ９活性である、項目７７〜７９に記載の単離された細胞。
（項目８２）
上記修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の欠失を含む、項目７７〜７９に記載の単離された細胞。
（項目８３）
上記修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異形態のタンパク質の発現を含む、項目７７〜７９に記載の単離された細胞。
（項目８４）
上記修飾が、上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現を含む、項目７７〜８３に記載の単離された細胞。
（項目８５）
上記修飾が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含む、項目７７〜８３に記載の単離された細胞。
（項目８６）
上記Ｎ−グリコシル化活性が、グルコシルトランスフェラーゼ活性である、項目８５に記載の単離された細胞。
（項目８７）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、ＡＬＧ６である、項目８５または８６に記載の単離された細胞。
（項目８８）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−マンノシダーゼである、項目８５に記載の単離された細胞。
（項目８９）
上記アルファ−マンノシダーゼが、小胞体にターゲッティングされる、項目８８に記載の単離された細胞。
（項目９０）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−マンノシダーゼポリペプチドおよびＨＤＥＬ小胞体貯留ペプチドを含む融合タンパク質である、項目８８または８９に記載の単離された細胞。
（項目９１）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ からグルコース残基を除去することができるタンパク質である、項目８５に記載の単離された細胞。
（項目９２）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、アルファ−１，３−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である、項目８５または９１に記載の単離された細胞。
（項目９３）
上記タンパク質が、グルコシダーゼＩＩである、項目９１または９２に記載の単離された細胞。
（項目９４）
上記タンパク質が、グルコシダーゼＩＩのアルファおよびベータサブユニットの一方または両方を含む、項目９１〜９３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目９５）
上記タンパク質が、ムタナーゼである、項目９１に記載の単離された細胞。
（項目９６）
上記細胞が、少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作される、項目７７〜９５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目９７）
上記少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性の欠損および高レベルのＡＬＧ６活性を含む、項目９６に記載の単離された細胞。
（項目９８）
上記細胞が、少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作される、項目７７〜９７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目９９）
上記少なくとも３つの修飾Ｎ−グリコシル化活性が、ＡＬＧ３活性の欠損；高レベルのＡＬＧ６活性；および高レベルのａグルコシダーゼＩＩ活性を含む、項目９８に記載の単離された細胞。
（項目１００）
上記細胞が、ＯＣＨ１活性が欠損するように遺伝子操作されない、項目７７〜９９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目１０１）
上記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質が、ヒトタンパク質である、項目８５〜１００のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目１０２）
上記修飾が、上記修飾糖タンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるタンパク質またはその生物学的に活性な変異体の発現を含む、項目７７〜１０１のいずれかに記載の単離された細胞。
（項目１０３）
上記マンノシルリン酸化を果たすタンパク質またはその生物学的に活性な変異体が、ＭＮＮ４である、項目１０２に記載の単離された細胞。
（項目１０４）
上記マンノシルリン酸化を果たすタンパク質またはその生物学的に活性な変異体が、ＰＮＯ１である、項目１０３に記載の単離された細胞。
（項目１０５）
改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる疾患を有するまたは有することが疑われる被験体に項目７６に記載のタンパク質を投与することを含む、改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる障害を治療する方法。
（項目１０６）
上記疾患が、代謝異常である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
上記代謝異常が、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）である、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
上記リソソーム貯蔵障害が、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ポンペ病、ニーマン−ピック病、またはファブリ病である、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
上記タンパク質が、ＬＳＤに関連したものである、項目１０５〜１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
上記タンパク質が、グルコセレブロシダーゼまたはアルファ−ガラクトシダーゼである、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
上記タンパク質が、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼからなる群より選択される、項目１０９に記載の方法。
（項目１１２）
上記被験体が、改変Ｎ−グリコシル化を有するタンパク質の投与によって治療することができる疾病を有するかどうかを決定することをさらに含む、項目１０５〜１１１のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
上記被験体がヒトである、項目１０５〜１１２のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞から調製された細胞溶解産物とターゲットタンパク質を接触させることを含み、該細胞溶解産物とターゲットタンパク質の接触が、結果として、改変されたＮ−グリコシル化形態の該ターゲットタンパク質を生じさせる、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法。
（項目１１５）
Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲットタンパク質を接触させることを含み、該Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質が、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞から得られ、および該Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲット分子の接触が、結果として、改変されたＮ−グリコシル化形態の該ターゲットタンパク質を生じさせる、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法。
（項目１１６）
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞の実質的に純粋な培養物であって、これらのうちの実質的な数が少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作される、培養物。
（項目１１７）
細胞の１つ以上の亜集団を含有し、それぞれの亜集団が、異なる修飾グリコシル化活性を含む、項目８７に記載の細胞の実質的に純粋な培養物。
（項目１１８）
配列番号１または配列番号２を含む、単離されたヌクレオチド配列。
（項目１１９）
配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％同一である配列を含む、単離されたヌクレオチド配列。
（項目１２０）
項目１１８または１１９に記載の単離されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド。
（項目１２１）
（ａ）配列番号１もしくは配列番号２の相補体に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または
（ｂ）該ヌクレオチド配列の相補体
を含む、単離された核酸。
（項目１２２）
項目１１８〜１２１のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１２３）
項目１１８〜１２１のいずれかに記載の核酸配列を含む発現ベクター。
（項目１２４）
上記ポリペプチドを発現する、項目１２３に記載の発現ベクターを含む培養細胞または該細胞の子孫。
（項目１２５）
上記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で項目１２４に記載の細胞を培養することを含む、タンパク質の生産方法。
（項目１２６）
上記細胞を培養した後、該細胞または該細胞を培養した培地から上記ポリペプチドを単離することをさらに含む、項目１２５に記載の方法。
酵母小胞体でのＮ−グリカン前駆体合成を示す略図である。コードされているタンパク質が図示酵素的変換を媒介する活性を有する遺伝子は、影付きの囲みの中である（例えば、ＡＬＧ７；左上）。「ＵＤＰ」および「ＵＭＰ」は、それぞれ、ウリジン二リン酸およびウリジン一リン酸を指す。「ＧＤＰ」および「ＧＭＰ」は、それぞれ、グアノシン二リン酸およびグアノシン一リン酸を指す。「Ｇｎ」は、Ｎ−アセチルグルコサミンを指す。「Ｍ」は、単量体マンノースを指し、Ｇは、グルコースを指し、Ｐｉは、ホスフェートを指す。 酵母小胞体におけるＮ−グリカンプロセッシングを示す略図である。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゴルジ装置におけるＮ−グリカンプロセッシングを示す略図である。コードされているタンパク質が図示酵素的変換を媒介する活性を有する遺伝子は、影付きの囲みの中である（例えば、ＯＣＨ１；左中央）。 本明細書に記載する様々なＮ−グリカン構造の構造を示す略図である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＯＣＨ１遺伝子破壊のためのクローニング戦略を示す略図である。「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。 ＭＮＮ９遺伝子破壊フラグメントのためのクローニング戦略を示す図である。「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。 野生型Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞またはグリコシル化突然変異体（例えば、Δｏｃｈ１ ｃＩ９、Δｍｎｎ９ １およびΔｏｃｈ１ Δｍｎｎ９）細胞およびＭＴＬＹ６０株細胞から得たマンノプロテインのＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。場合によっては、前記Ｎ−グリカンをα−１，２マンノシダーゼでさらに処理した。分析は、ＤＮＡシーケンサー援用、蛍光体援用炭水化物電気泳動法（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）を用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、基礎Ｎ−アセチルグルコサミン構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＳ１発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。 示されているとおりの野生型（ＷＴ）Ｍｎｓ１ｐまたは様々な突然変異形態（すなわち、Ｒ２７３Ｇ、Ｒ２７３Ｌ、またはＲ２６９Ｓ／Ｓ２７２Ｇ／Ｒ２７３Ｌ）のＭｎｓ１ｐを発現しているＭＴＬＹ６０細胞から得た分泌糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、「Ｍ９」は、基礎Ｎ−アセチルグルコサミン構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 ＭＮＮ４発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。 示されているとおりの野生型ＭＴＬＹ６０細胞またはグリコシル化突然変異細胞から得た分泌糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、「Ｍ９」は、キトビオースコア構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。「Ｐ」は、１つのリン酸残基を含有するマンノプロテインを指し、「ＰＰ」は、２つのリン酸残基を含有するマンノプロテインを指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 α−ガラクトシダーゼ発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。 示されているとおりの野生型ＭＴＬＹ６０細胞からまたはグリコシル化突然変異細胞の様々なクローンから得たマンノプロテインおよびホスホマンノプロテインのＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。「ａｌｇ３」は、その細胞がＡＬＧ３ノックアウトであることを示す。「ＡＬＧ６過剰発現」は、ＡＬＧ６のタンパク質産物がその細胞において過剰発現されていることを示す。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、基礎Ｎ−アセチルグルコサミン構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ポリアクリルアミドゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 示されているとおりの野生型ＭＴＬＹ６０細胞またはグリコシル化突然変異細胞の様々なクローンから得たマンノプロテインおよびホスホマンノプロテインのＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。「ａｌｇ３」は、その細胞がＡＬＧ３ノックアウトであることを示す。「ＡＬＧ６過剰発現」は、ＡＬＧ６のタンパク質産物がその細胞において過剰発現されていることを示す。１つのピークは、ＲＮＡｓｅＢマーカーのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と同じ位置に生じ、α−１，２−マンノシダーゼ処理後に２グルコース単位およびアルファ−マンノシダーゼ（ＪＢ）消化後に４グルコース単位シフトする。これは、予想通りＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造と一致する。追加の２つのピークが約１および２グリコ単位離れて生じ、これらはａ−１，２−マンノシダーゼ消化による影響を受けない。両方のピークが、ａ−マンノシダーゼ（ＪＢ）消化によって１グルコース単位シフトする。小さなシフトは、添加された酵素、例えばＪＢマンノシダーゼ、のより高い塩濃度に起因する。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、キトビオースコア構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 ゲノムＨＡＣ１ ＤＮＡ配列（配列番号５）を有する小胞体ストレス反応（ＵＰＲ）誘導株Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａから得た、単離されたＤＮＡフラグメント（配列番号１）配列の配列アラインメントである。枠で囲われた配列は、非常例的にスプライスされたイントロンに相当する。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの予測５’（上部）および３’（下部）スプライス部位の一連の配列アラインメントである。太い下線が引かれたヌクレオチドは、ループ構造内に存在する。 ＤＴＴ誘導（Ｉ）（配列番号２）および非誘導（ＮＩ）（配列番号６）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養物から得たＨＡＣ１ ｃＤＮＡの配列アラインメントの２つの部分図である。 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１８アミノ酸Ｃ末端領域の配列アラインメントである。保存アミノ酸は、太字であり、下線が引かれている。 ＫＡＲ２ ｍＲＮＡの相対発現レベルの比較を示す棒グラフである。炭素源としてメタノールを用いてクローン３、４および５（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳＭ５細胞）を増殖させた。「３＋」、「４＋」、および「５＋」は、炭素源としてメタノールを用いて増殖させたそれぞれのクローンを指し、これに対して「３−」、「４−」および「５−」は、炭素源としてグルコースを用いて増殖させたそれぞれのクローンを指す。Ｙ軸は、実時間ＰＣＲを用いるＫＡＲ２遺伝子の相対発現を表す。 ２つのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓクローン（クローン６および８）におけるＫａｒ２およびＨＡＣ１ ｍＲＮＡの相対発現レベルを示す棒グラフである。「６＋」および「８＋」は、炭素源としてメタノールを用いて増殖させたそれぞれのクローンを指し、これに対して「６−」および「８−」は、炭素源としてグルコースを用いて増殖させたそれぞれのクローンを指す。Ｙ軸は、実時間ＰＣＲを用いるＫＡＲ２遺伝子の相対発現を表す。 ＹｌＭＮＮ６発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。 示されているとおりのΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、単独、またはＹｌＭＮＮ６を発現しているΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの様々なクローン（Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｕ５、Ｕ６およびＵ８）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 ＭＦＭａｎＨＤＥＬ発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。 示されているとおりのΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、単独、またはＭＦＭａｎＨＤＥＬを発現しているΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの様々なクローン（９、１１、１０、３、５および６）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 ＬＩＰ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ発現ベクターのためのクローニング戦略を示す略図である。 示されているとおりのΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、単独、またはＬＩＰ２ＭａｎＨＤＥＬを発現しているΔｏｃｈ１ Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの様々なクローン（１、５、１０および１１）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、キトビオースコア構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（図２７Ａ；配列番号３）およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（図２７Ｂ；配列番号４）のＨＡＣ１タンパク質のアミノ酸配列である。 様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＭＴＬＹ６０、ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３およびＭＴＬ Ｙ６０Δａｌｇ３ＡＬＧ６）培養物におけるＬｉｐ２ｐ過剰発現の結果を示す、クマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルの写真である。以下のサンプルをゲル中で分離した：レーン１（「ラダー」）、既知分子量のタンパク質の組み合わせ；レーン２（「ＷＴ」）、Ｌｉｐ２ｐを過剰発現しているＷＴ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＭＴＬＹ６０）から得たＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン３（「ＷＴ＋ＰＧａｓｅ Ｆ」）、Ｌｉｐ２ｐを過剰発現しているＷＴ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得て、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素で処理したＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン４（「ａｌｇ３−ＡＬＧ６」）、ａｌｇ３が欠損しており、Ｌｉｐ２ｐとＡＬＧ６の両方を過剰発現しているＹａｒｒｏｗｉａ細胞（ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３ＡＬＧ６）から得たＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン５（「ａｌｇ３−ＡＬＧ６＋ＰＮＧａｓｅ Ｆ」）、ａｌｇ３が欠損しており、Ｌｉｐ２ｐとＡＬＧ６の両方を過剰発現しているＹａｒｒｏｗｉａ細胞（ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３ＡＬＧ６）から得て、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素で処理したＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン６（「ａｌｇ３」）、ａｌｇ３が欠損しており、Ｌｉｐ２ｐを過剰発現しているＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３）から得たＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン７（「ａｌｇ３＋ＰＮＧａｓｅ Ｆ」）、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素で処理した、ａｌｇ３が欠損しており、Ｌｉｐ２ｐを過剰発現しているＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３）から得たＬｉｐ２ｐタンパク質；レーン８（「Ｌｉｐ２ｐ過剰発現を伴わないＷＴ」）、ＭＴＬＹ６０細胞から得たタンパク質；およびレーン９（「Ｌｉｐ２ｐ過剰発現なし＋ＰＮＧａｓｅ ＦのＷＴ」）、ＭＴＬＹ６０細胞から得、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素で処理したタンパク質。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＷＴ（ＭＴＬＹ６０）；Δａｌｇ３；Δａｌｇ３ ＡＬＧ６過剰発現；およびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙｌ）またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｔｂ）由来のグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットと共にＡＬＧ６を過剰発現するΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、キトビオースコア構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３；Δａｌｇ３ ＡＬＧ６過剰発現；およびＨＤＥＬ配列を含有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙｌ）由来のグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットと共にＡＬＧ６を過剰発現しているΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３；Δａｌｇ３ ＡＬＧ６過剰発現；およびＨＤＥＬ配列を含有するＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｔｂ）由来のグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットと共にＡＬＧ６を過剰発現しているΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。 示されているとおりの異なる濃度のムタナーゼでインビトロで処理したａｌｇ３ＡＬＧ６ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３；Δａｌｇ３ ＡＬＧ６過剰発現；およびＨｐ４ｄまたはＴＥＦプロモーターの制御下で発現されたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙ．ｌ．）からのグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットおよびＹ．ｌ．からのグルコシダーゼＩＩのベータサブユニットと共にＡＬＧ６を過剰発現しているΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３ ＡＬＧ６過剰発現；およびＨｐ４ｄまたはＴＥＦプロモーターの制御下で発現されたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙ．ｌ．）からのグルコシダーゼＩＩのＨＤＥＬ含有アルファサブユニットおよびＹ．ｌ．からのグルコシダーゼＩＩのベータサブユニットと共にＡＬＧ６を過剰発現しているΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３、ならびにＴＥＦプロモーターの制御下で発現されたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙ．ｌ．）からのグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットおよびＹ．ｌ．からのグルコシダーゼＩＩのベータサブユニットを過剰発現しているΔａｌｇ３のクローン）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためのコドン最適化ｃＤＮＡである、成熟形態のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（シグナルペプチドを欠失）グルコシダーゼＩＩαをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）の図示である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためのコドン最適化ｃＤＮＡである、成熟形態のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（シグナルペプチド欠失）グルコシダーゼＩＩβをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）の図示である。 示されているとおりの様々なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（Δａｌｇ３、およびＴＥＦまたはｈｐ４ｄプロモーターの制御下で発現されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（Ａｎ）からのグルコシダーゼＩＩのアルファサブユニットと共に過剰発現しているＡＬＧ６）から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。一番下の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 ＷＴ（ＭＴＬＹ６０）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるまたはｈｐ４ｄプロモーターの発現制御下のスプライスされた形態のＨＡＣ１ ｃＤＮＡを含有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の２つのクローン（クローン７およびクローン２）におけるＨＡＣ１（３９Ａ）またはＫＡＲ（３９Ｂ）遺伝子の相対発現レベル（Ｙ軸）を示す一対の棒グラフである。 空ベクターで形質転換された野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞の増殖を、Ｈａｃ１ｐタンパク質を発現しているＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞の増殖と比較して示す線グラフである。 ｍＩＬ−１０タンパク質を発現するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５細胞の培養物からのマウスＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０）タンパク質の発現レベルと、誘導性プロモーター、ＡＯＸ１の制御下でＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のスプライスされたＨＡＣ１タンパク質およびｍＩＬ−１０を発現するＧＳ１１５細胞の培養物から得たｍＩＬ−１０タンパク質の発現とを比較する、クマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルの写真である。以下のサンプルをゲル中で分離した：レーン１（「ラダー」）、既知分子量のタンパク質の組み合わせ；レーン２（「参照」）参照ｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＧＳ１１５）から得たタンパク質；レーン３（「参照」）、参照ｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株からそれらのタンパク質のＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素処理後に得たタンパク質；レーン４（「クローン１」）、ＨＡＣ１タンパク質を誘導可能に発現するｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から得たタンパク質；レーン５（「クローン１」）、ＨＡＣ１タンパク質を誘導可能に発現するｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から、そのタンパク質のＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素での処理後に得たタンパク質；レーン６（「クローン２」）、ＨＡＣ１タンパク質１を誘導可能に発現するｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から得たタンパク質；レーン７（「クローン２」）、ＨＡＣ１タンパク質を誘導可能に発現するｍＩＬ−１０発現Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞から、それらのタンパク質のＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素での処理後に得たタンパク質。 ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列を含有する、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンが最適化された、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２マンノシダーゼをコードする、具体例としてのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（配列番号９）の図示である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＧＡＰプロモーターについての具体例としてのヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（配列番号１０）の図示である。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２マンノシダーゼをコードし、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンが最適化されており、且つ、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列を含有する、ｃＤＮＡ配列を含有する、発現ベクターｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬについての具体例としての核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１１）の図示である。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２マンノシダーゼをコードし、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンが最適化されており、且つ、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列を含有する、ｃＤＮＡ配列を含有する、発現ベクターｐＹＬＧＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬについての具体例としての核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１２）の図示である。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２マンノシダーゼをコードし、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンが最適化されており、且つ、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列を含有する、ｃＤＮＡ配列を含有する、発現ベクターｐＹＬＰＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬについての具体例としての核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１３）の図示である。 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２マンノシダーゼをコードし、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンが最適化されており、且つ、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列を含有する、ｃＤＮＡ配列を含有する、発現ベクターｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬについての具体例としての核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１４）の図示である。 示されているとおりの異なる発現ベクター：「ｈｐ４ｄＬ２ＭａｎＨＤＥＬ」（ｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ、図４４Ａ−４４Ｃ）；「ＧＡＰＬ２ＭａｎＨＤＥＬ」（ｐＹＬＧＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ、図４５Ａ−４５Ｃ）；「ＴＥＦ１Ｌ２ＭａｎＨＤＥＬ」（ｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ、図４７Ａ−４７Ｃ）で形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのデキストランの分析である。一連の二番目の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 安定して組み込まれた発現ベクターｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（図４７Ａ−４７Ｃ）を含有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１細胞から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。糖タンパク質サンプルは、細胞培養物から２４、４８、７２および９６時間の時点で得た。一番上の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのデキストランの分析である。一連の二番目の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして化学合成した、ヒトグルコセレブロシダーゼについての具体例としての核酸配列（ＧＬＣＭ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０４０６２；配列番号１５）である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０（ＷＴ；レーン４および６）およびＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１（Δｏｃｈ１；最初の３つのレーン）において発現されたヒトグルコセレブロシダーゼの移動度パターンを示す免疫ブロットの写真である。これらのタンパク質の分子量（ｋＤａ）を、分子量マーカーにより、この免疫ブロットの右端に示す。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして化学合成した、ヒトエリスロポエチンについての具体例としての核酸配列（Ｅｐｏ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０１５８８；配列番号１６）である。 Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして化学合成した、ヒトα−ガラクトシダーゼＡについての具体例としての核酸配列（ＡＧＡＬ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０６２８０；配列番号１７）である。 野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞またはスプライスされた形態のＨａｃ１ｐタンパク質を過剰発現しているＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の一連の電子顕微鏡写真である。細胞内に離散した積層脂質膜領域を枠で囲う。 示されているとおりのＷＴ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ｐｏｌ１ｄ）およびにアルファ−１，２−マンノシダーゼとＨＤＥＬ配列の融合タンパク質を発現しているＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得た糖タンパク質のＮ−グリカン分析を示す一連の電気泳動図である。分析は、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて行った。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」、および「Ｍ９」は、キトビオースコア構造にコンジュゲートしたマンノース残基の数を指す。Ｙ軸は、マンノース構造のそれぞれについての量の指標としての相対蛍光単位を表す。Ｘ軸は、ゲルによるそれぞれの複合マンノース構造の相対移動度を表す。一番上の電気泳動図は、ＲＮＡｓｅ Ｂの分析である。一番下の電気泳動図は、移動度標準として使用するためのオリゴマルトースの分析である。
本明細書に記載する方法および遺伝子操作細胞は、遺伝子操作されていない細胞において生産されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子と比較して改変されたＮ−グリコシル化形態を有するターゲット分子（例えば、ターゲットタンパク質またはターゲットドリコール）を生産するために用いることができる。代謝異常（例えば、リソソーム貯蔵障害）を有する患者へのグリコシル化ターゲット分子（例えば、グリコシル化タンパク質）の投与がそれらの疾患の症状を改善することは証明されている。従って、記載する方法および細胞は、とりわけ代謝異常、例えばリソソーム貯蔵障害、の治療のための改変Ｎ−グリコシル化ターゲット分子の調製に有用である。そのような改変Ｎ−グリコシル化分子は、多種多様な他の分野、例えば、ほんの少し例を挙げれば、食品および飲料産業；製薬産業（例えば、ワクチン）；農産業；および化学産業、においても有用である。
改変Ｎ−グリコシル化分子
本明細書において用いる場合、ターゲット分子は、遺伝子操作細胞（例えば、真菌細胞、例えばＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａもしくはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（もしくは他の関連種二相性酵母）細胞；植物細胞；または動物細胞）からの１つ以上のＮ−グリコシル化活性によって改変Ｎ−グリコシル化を受ける任意の分子を指す。一部の実施形態では、前記ターゲット分子をＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（または他の関連種二相性酵母）分泌経路の１つ以上の工程によって輸送することができ、その結果、その宿主細胞機械によってそれらの改変Ｎ−グリコシル化が生ずる。前記ターゲット分子は、内因性である場合もあり、または外因性である場合もある。
ターゲットタンパク質、それらの生物学的に活性なフラグメント、またはそれらの生物学的に活性な変異体は、上で説明したように付加、欠失または置換を含有するタンパク質を含む場合がある。適するターゲットタンパク質としては、病原体タンパク質（例えば、破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ウイルス表面タンパク質（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ、ＨおよびｇＣＩＩＩ；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）エンベロープ糖タンパク質；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）エンベロープ糖タンパク質；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）エンベロープ糖タンパク質；水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）エンベロープ糖タンパク質；ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）エンベロープ糖タンパク質；インフルエンザウイルス糖タンパク質；ならびに肝炎ファミリー表面抗原）、リソソームタンパク質（例えば、グルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼ、またはガラクトセレブロシダーゼ）、インスリン、グルカゴン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはそのフラグメント、または前記タンパク質のいずれかと抗体もしくは抗体のフラグメントとの融合体（例えば、タンパク質−Ｆｃ）が挙げられる。成長因子としては、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。サイトカインとしては、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−３３（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１５））が挙げられる。ケモカインとしては、例えば、Ｉ−３０９、ＴＣＡ−３、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｃ１０、ＭＲＰ−２、ＭＡＲＣ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−２、ＭＲＰ−２、ＣＣＦ１８、ＭＩＰ−１γ、エオタキシン、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−４、ＮＣＣ−１、Ｃｋβ１０、ＨＣＣ−１、ロイコタクチン−１、ＬＥＣ、ＮＣＣ−４、ＴＡＲＣ、ＰＡＲＣ、またはエオタキシン−２が挙げられる。腫瘍糖タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）、例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）［Ｒ．Ａ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｏ．Ｊ．Ｆｉｎｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，ｐｐ．２１７−５６（１９９６）］も挙げられる。一部の実施形態において、前記ターゲットタンパク質は、リソソーム貯蔵障害に関連したものである場合があり、このターゲットタンパク質としては、例えば、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼが挙げられる。
ターゲットタンパク質は、融合タンパク質である場合もある。融合タンパク質としては、例えば、（ｉ）本明細書に記載する任意のタンパク質またはそのフラグメントと（ｉｉ）抗体またはそのフラグメントとの融合体が挙げられる。本明細書において用いる場合、用語「抗体フラグメント」は、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを指す。ｓｃＦｖフラグメントは、そのｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含む１本のポリペプチド鎖である。加えて、ダイアボディー［Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１−１１２３；Ｈｕｄｓｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（１−２）：１７７−１８９（この両方の開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている］およびイントラボディー［Ｈｕｓｔｏｎら（２００１）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １０（３−４）：１２７−１４２；Ｗｈｅｅｌｅｒら（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８（３）：３５５−３６６；Ｓｔｏｃｋｓ（２００４）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ９（２２）：９６０−９６６（これらのすべての開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている］を本発明の方法において用いることができる。
ターゲットタンパク質をポリマー、担体、アジュバント、免疫毒素または検出可能（例えば、蛍光、発光もしくは放射性）部分の一つ以上に連結させることもできる。例えば、ターゲットタンパク質をポリエチレングリコール（このポリマー部分を用いることができる）に連結させて、例えば、小タンパク質の分子量を増加させることおよび／または循環滞留時間を増加させることができる。
一部の実施形態において、前記ターゲット分子は、ドリコールである、またはドリコールを含有する、場合がある。
遺伝子操作細胞
少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を有する遺伝子操作細胞を本明細書に開示し、これらの細胞は、改変Ｎ−グリコシル化形態を有する１つ以上のターゲット分子の生産に有用である。遺伝子操作に適する細胞としては、例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａもしくは本明細書に記載する任意の他の関連二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サルもしくはヒト））が挙げられる。前記細胞は、初代細胞、不死化細胞、または形質転換細胞である場合がある。前記細胞は、動物、例えば、非ヒト哺乳類におけるものである場合がある。そのような細胞は、本明細書に明記するような遺伝子操作に先立ち、様々な市場の供給業者および研究資源施設、例えば米国微生物系統保存機関（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））などから得ることができる。ターゲット分子としては、タンパク質、例えば、本明細書に記載するターゲットタンパク質のいずれか（上記参照）が挙げられる。ターゲット分子としては、ドリコールも挙げられる。
細胞の遺伝子操作としては、遺伝子修飾、例えば、（ｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子の欠失；（ｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異形態のタンパク質（例えば、内因性または外因性タンパク質）をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異タンパク質を発現する）組換え核酸の導入；（ｉｉｉ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入または発現；（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内因性または外因性）タンパク質をコードする（すなわち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する）組換え核酸の導入；または（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内因性遺伝子のプロモーターエレメントもしくはエンハンサーエレメントを改変して、例えば、それらのコードされたタンパク質の発現を改変することが挙げられる。ＲＮＡ分子としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。項目（ｉｉ）が、例えば、内因性遺伝子の（例えば、相同組換えによる）、そのように置換される内因性遺伝子に比べて大きいＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子での置換を含むことは、理解される。遺伝子操作としては、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子を、付加（例えば、異種配列）、欠失、または置換（例えば、突然変異、例えば点突然変異；保存的または非保存的突然変異）を有するタンパク質を生産するように改変することも挙げられる。突然変異は、特異的に導入することができ（例えば、部位特異的突然変異誘発または相同組換え；添付の実施例参照）、またはランダムに導入することもできる（例えば、細胞を、例えばＮｅｗｍａｎ ａｎｄ Ｆｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５（４）：１５８７（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている）に記載されているように、化学的に突然変異誘発することができる）。
本明細書に記載する遺伝子修飾は、結果として、（ｉ）遺伝子修飾された細胞における１つ以上のＮ−グリコシル化活性の増加、（ｉｉ）遺伝子修飾された細胞における１つ以上のＮ−グリコシル化活性の減少、（ｉｉｉ）遺伝子修飾された細胞における１つ以上のＮ−グリコシル化活性の局在もしくは細胞内分布の変化、または（ｉｖ）遺伝子修飾細胞における１つ以上のＮ−グリコシル化活性の比率の変化のうちの１つ以上を生じさせることができる。Ｎ−グリコシル化活性の量の増加が、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の過剰発現に起因する場合もあり、内因性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）に起因する場合もあり、またはその遺伝子によってコードされたタンパク質の発現の増加を刺激する内因性遺伝子のプロモータもしくはエンハンサーの改変に起因する場合もあることは理解される。１つ以上のＮ−グリコシル化活性の減少は、Ｎ−グリコシル化改変活性を有する突然変異形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の１つ以上のタンパク質の過剰発現に起因する場合もあり、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の発現を減少させる１つ以上の干渉ＲＮＡ分子の導入もしくは発現に起因する場合もあり、またはＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の内因性遺伝子の欠失に起因する場合もある。
１つ以上の内因性遺伝子を欠失させるまたは破壊する方法は、添付の実施例において説明する。例えば、相同組換えによって遺伝子を破壊するために、選択可能マーカー遺伝子を含めるような方法で「遺伝子置換」ベクターを構築することができる。選択可能マーカー遺伝子は、相同組換えを媒介するために十分な長さの遺伝子の部分の５’末端と３’末端の両方に、作動可能に連結させることができる。前記選択可能マーカーは、宿主細胞栄養要求を補足するか、抗生物質抵抗性をもたらす任意の数の遺伝子（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３遺伝子を含む）の１つであり得る。他の適する選択可能マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現に起因してブルーコロニーを生じさせるｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。その後、当該技術分野において周知の方法を用いて、遺伝子置換ベクターの線形化ＤＮＡフラグメントを細胞に導入する（下記参照）。ゲノムへの線形フラグメントの組み込みおよび遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定することができ、ならびに例えばサザンブロット分析によって、検証することができる。
添付の実施例において詳述するように、選択可能マーカーは、選択にそれを使用した後、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系（下記参照）によって、宿主細胞のゲノムから除去することができる。
あるいは、遺伝子の破壊される部分を含むように遺伝子置換ベクターを構築することができ、前記部分には内因性遺伝子プロモーター配列が一切無く、また前記部分は、その遺伝子のコーディング配列のフラグメントを一切コードしない、または前記配列の不活性フラグメントをコードする。「不活性フラグメント」は、その遺伝子の完全長コーディング配列から生成されるタンパク質の、例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントである。遺伝子のそのような部分をベクターに、いずれの既知プロモーター配列もその遺伝子配列に作動可能に連結されないが、停止コドンおよび転写終結配列がその遺伝子配列のその部分に作動可能に連結されるように挿入する。その後、このベクターのその遺伝子配列のその部分を線形化し、細胞に形質転換する。単一の相同組換えによって、その後、この線形化ベクターをその遺伝子の内因性対応物に組み込む。
発現ベクターは、自律型である場合もあり、または組込み型である場合もある。
組換え核酸（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有する野生型または突然変異形態のタンパク質をコードするもの）は、細胞に導入される際、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形態である場合がある。その組換え核酸は、染色体外に維持される場合もあり、または酵母細胞染色体ＤＮＡに組み込まれる場合もある。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下で細胞生存能に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含有する場合がある（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号参照）。発現ベクターは、自律複製配列（ＡＲＳ）を含む場合もある。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号には、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてプラスミドを維持するために適する手段となる自律複製配列が記載されている。米国特許第４，８３７，１４８号の開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
組込みベクターは、例えば、米国特許第４，８８２，２７９号に開示されている（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている）。組込みベクターは、少なくとも第一の挿入可能ＤＮＡフラグメント、選択可能マーカー遺伝子および第二の挿入可能ＤＮＡフラグメントが連続的に配置された配列を一般に含む。前記第一および第二挿入可能ＤＮＡフラグメントは、それぞれ、長さが約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、または約１０００以上）ヌクレオチドであり、ならびに形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分に相同なヌクレオチド配列を有する。発現の対象となる遺伝子（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を含有するヌクレオチド配列を、このベクターの、マーカー遺伝子の前であろうと、後ろであろうと、第一挿入可能ＤＮＡフラグメントと第二挿入可能フラグメントの間に挿入する。組込みベクターを酵母形質転換前に線形化して、対象となるヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを助長することができる。
発現ベクターは、酵母において発現され得る、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、または他の関連二相性酵母種）プロモーターの制御下にある組換え核酸を特徴とし得る。適する酵母プロモーターとしては、例えば、ＡＤＣ１、ＴＰＩ１、ＡＤＨ２、ｈｐ４ｄ、ＰＯＸ、およびＧａｌ１０（例えば、Ｇｕａｒｅｎｔｅら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（２３）：７４１０参照）プロモーターが挙げられる。追加の適するプロモーターは、例えば、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５（７−８）：６０８−６１１および米国特許第６，２６５，１８５号に記載されており、これらのそれぞれの開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。発現ベクターを動物細胞、例えば哺乳動物細胞、に導入することとなる場合、その発現ベクターは、対象となる宿主細胞における発現に適する動物細胞プロモーターの制御下にある組換え核酸を特徴とし得る。哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。
プロモーターは、構成的である場合もあり、誘導性（条件付き）である場合もある。構成プロモーターは、その発現が標準培養条件下で一定であるプロモーターであると解釈する。誘導性プロモーターは、１つ以上の誘導キューに反応するプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節される場合もあり（例えば、その転写活性が、化学的誘導剤、例えばアルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の小分子、の存在または不在によって調節されるプロモーター）、または物理的に調節される場合もある（例えば、その転写活性が、物理的誘導因子、例えば光または高もしくは低温、の存在または不在によって調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターは、化学的または物理的キューによってそれら自体が直接調節される１つ以上の転写因子によって、間接的に調節される場合もある。
細胞の遺伝子操作としては、宿主細胞内に存在するが、通常はそれらの細胞において発現されない、またはそれらの細胞において有意なレベルで発現されない内因性遺伝子（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）を活性化することも挙げられる。例えば、内因性遺伝子の調節配列（例えば、遺伝子プロモーターまたはエンハンサー）を、その作動可能に連結されたコーディング配列が発現増加を示すように、修飾することができる。相同組換えまたはターゲッティングは、遺伝子に通常随伴する調節領域を、遺伝子操作されていない対応する細胞で明らかであるレベルより高いレベルで遺伝子を発現させる、または遺伝子修飾されていない対応する細胞で明らかであるパターンとは異なる調節もしくは誘導パターンを遺伝子に示させる調節配列で置換または無力化するために用いることができる。遺伝子の調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の改変の導入に適する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３０１４７８６８号に記載されており、この開示はその全体が参照により本明細書に援用されている。
他の遺伝子操作修飾も条件付きである場合があることが理解される。例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：１５３−１７３および米国特許出願公開第２００６００１４２６４号参照。これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている）などの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用して、条件付きで遺伝子を欠失させることができる。
様々な方法、例えば、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法を用いて、本明細書に記載する細胞に組換え核酸を導入することができる。細胞へのプラスミドまたは線形核酸ベクターの形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；米国特許第４，８７９，２３１号；およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５９：１１５に記載されており、これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。Ｃｒｅｇｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．２７−３９（１９９８）によって記載されているような、エレクトロポレーションおよびＰＥＧ１０００全細胞形質転換手順も用いることができ、この開示はその全体が参照により本明細書に援用されている。動物細胞のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、リポソーム、またはトランスフェクション試薬、例えばＦＵＧＥＮＥ（登録商標）もしくはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）を使用する、あるいは溶液中で細胞と裸核酸ベクターを接触させることによる、細胞へのベクターの導入を特徴とする場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ．１，２ ａｎｄ ３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｎｏｖ．１９８９参照。この開示はその全体が参照により本明細書に援用されている）。
形質転換酵母細胞は、形質転換後の（細胞の栄養要求のために）必要な生化学生成物が不在の状態での栄養要求性細胞の培養、新たな表現型の選択および検出、またはその形質転換体に含まれている耐性遺伝子が不在の状態でその酵母に対して毒性である抗生物質が存在する状態での培養をはじめとする（しかし、これらに限定されない）適切な技術を用いることにより、選択することができる。形質転換体は、発現カセットをゲノムに組み込み、それを例えばサザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価することによって、選択および／または検証することもできる。
対象となるターゲット細胞に前記ベクターを導入する前に、それらのベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞において増殖させる（例えば、増幅させる）ことができる。そのベクターＤＮＡを細菌細胞から、その細菌環境からベクターＤＮＡを精製する結果となる当該技術分野において公知の任意の方法によって、単離することができる。その精製されたベクターＤＮＡをフェノール、クロロホルムおよびエーテルで入念に抽出して、そのプラスミドＤＮＡ調製品中にＥ．ｃｏｌｉタンパク質が確実に存在しないようにすることができる。これらのタンパク質は、哺乳動物細胞にとって毒性である場合があるからである。
本明細書に記載する場合の遺伝子操作は、任意の数の遺伝子、例えばＮ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、を発現させる（例えば、過剰発現させる）、遺伝子に修飾を導入する、または該遺伝子を欠失させるために用いることができる。そのような遺伝子としては、例えば、ＡＬＧ７、ＡＬＧ１３、ＡＬＧ１４、ＡＬＧ１、ＡＬＧ２、ＡＬＧ１１、ＲＦＴ１、ＡＬＧ３、ＡＬＧ９、ＡＬＧ１２、ＡＬＧ６、ＡＬＧ８、ＡＮＬ１、ＡＬＧ１０、ＡＬＧ５、ＯＳＴ３、ＯＳＴ４、ＯＳＴ６、ＳＴＴ３、ＯＳＴ１、ＯＳＴ５、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１、ＯＳＴ２、ＤＰＭ１、ＳＥＣ５９、ＯＣＨ１、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＭＮＮ８、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＭＮＮ６、ＫＴＲ１、ＹＵＲ１、ＭＮＮ４、ＫＲＥ２、ＫＴＲ２、ＫＴＲ３、ＭＮＮ１、ＭＮＳ１、ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ９、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、またはエンドマンノシダーゼが挙げられる。前記Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、そのような遺伝子を含有する任意の種（例えば、下等真核生物（例えば、真菌（酵母を含む）もしくはトリパノソーマ）、植物、または動物（例えば、昆虫、鳥類、爬虫類、または哺乳動物（例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、またはヒト））からのものであり得る。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる具体例としての真菌種としては、
、または当該技術分野において公知であるもしくは本明細書に記載する任意の他の真菌（例えば、酵母）が挙げられるが、それらに限定されない。具体例となる下等真核生物としては、
をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの様々な種も挙げられる。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる具体例としての原生動物属としては、ブラストクリチジア属（Ｂｌａｓｔｏｃｒｉｔｈｉｄｉａ）、クリチジア属（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ）、エンドトリパナム属（Ｅｎｄｏｔｒｙｐａｎｕｍ）、ヘルペトモナス属（Ｈｅｒｐｅｔｏｍｏｎａｓ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、レプトモナス属（Ｌｅｐｔｏｍｏｎａｓ）、フィトモナス属（Ｐｈｙｔｏｍｏｎａｓ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）（例えば、Ｔ．ブルセイ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉｉ）、Ｔ．ガンビエンス（Ｔ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、Ｔ．ローデシエンス（Ｔ．ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、およびＴ．クルジ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ））、ならびにウォレセイナ属（Ｗａｌｌａｃｅｉｎａ）が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書に記載する場合の遺伝子操作は、任意の数の遺伝子（例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）および／または本明細書中に列挙するいずれかの遺伝子の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、もしくは２０以上）の任意の組み合わせを発現させる（例えば、過剰発現させる）、それらに修飾を導入する、またはそれらを欠失させるために用いることができる。
一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＡＬＧ３（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０３４８８、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ｅ０３１９０ｇ）遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を欠失している。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＡＬＧ６（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０２９２２、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ｄ１７０２８ｇ）タンパク質を発現する（例えば、過剰発現する）。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＭＮＮ４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０３２１７、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ｄ２４１０１ｇ）を発現する。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＯＣＨ１および／もしくはＭＮＮ９遺伝子またはそれらの遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を欠失している。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を欠失していない。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、グルコシダーゼＩＩ、例えばＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのグルコシダーゼＩＩ、のアルファまたはベータサブユニット（またはアルファサブユニットとベータサブユニットの両方）を発現する。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ムタナーゼ、例えば、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼを発現する。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、これらの修飾の任意の組み合わせを有する場合がある。
例えば、一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＡＬＧ３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０３４８８、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ｅ０３１９０ｇによって例示されるＡＬＧ３遺伝子）遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠失している場合があり；ＡＬＧ６（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０２９２２、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ｄ１７０２８ｇによって例示されるようなＡＬＧ６）タンパク質を過剰発現する場合があり；グルコシダーゼＩＩ（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、または本明細書に記載する他の種のグルコシダーゼＩＩ）のアルファおよびベータサブユニットの一方または両方を過剰発現する場合がある；アルファ−１，２−マンノシダーゼを過剰発現する場合があり；ならびに次のもののうちの１つ以上（および任意の組み合わせ）を過剰発現する場合がある：グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、糖ヌクレオチド輸送体、糖−ヌクレオチド修飾酵素。一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を欠失していない。
一部の実施形態において、遺伝子修飾された細胞は、マンノシダーゼ活性（例えば、α−マンノシダーゼ活性）を含有する場合がある。前記マンノシダーゼ活性は、小胞体にターゲッティングすることができる。前記マンノシダーゼは、少なくとも７．５未満（例えば、少なくとも７．４未満、少なくとも７．３未満、少なくとも７．２未満、少なくとも７．１未満、少なくとも７．０未満、少なくとも６．９未満、少なくとも６．８未満、少なくとも６．７、少なくとも６．６未満、少なくとも６．５未満、少なくとも６．４、少なくとも６．３未満、少なくとも６．２未満、少なくとも６．１未満、少なくとも６．０未満、少なくとも５．９未満、少なくとも５．８未満、少なくとも５．７未満、少なくとも５．６未満、少なくとも５．５未満、少なくとも５．４未満、少なくとも５．３未満、少なくとも５．２未満、少なくとも５．１未満、少なくとも５．０未満、少なくとも４．９未満、少なくとも４．８未満、または少なくとも４．７未満）の最適なｐＨを有し得る。前記マンノシダーゼは、ＭＮＳ１であり得る。
例えば、遺伝子操作細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を欠失せず、マンノシダーゼ（例えば、アルファ−１，２−マンノシダーゼまたは本明細書に記載する任意の他のマンノシダーゼ）を過剰発現することができる。前記マンノシダーゼは、野生型形態のタンパク質である場合もあり、または突然変異形態、例えば、マンノシダーゼとＨＤＥＬ ＥＲ貯留アミノ酸配列を含有する融合タンパク質（実施例参照）である場合もある。（Ｎ−グリコシル化活性を有する任意のタンパク質を操作して、ＨＤＥＬ配列を含む融合タンパク質にすることができることは理解される）。
一部の実施形態において、前記遺伝子操作細胞は、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子のマンノシルリン酸化を促進することができる活性を含有する場合がある。例えば、前記遺伝子操作細胞に、Ｎ−グリカンのリン酸化を促進する活性をコードする核酸（例えば、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＰＮＯ１）を導入することができ、それらの細胞は、ターゲット分子のＮ−グリコシル化のリン酸化を増加させることができる。
一部の実施形態において、前記遺伝子修飾細胞は、前記改変Ｎ−グリコシル化分子からリン酸化をキャップするマンノース残基（例えば、マンノシダーゼ、例えばタチナタマメからのもの）を除去することができる活性を含有する場合がある。
一部の実施形態において、前記遺伝子修飾細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からグルコース残基を除去することができる。例えば、前記遺伝子修飾細胞は、α−１，３−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質、例えば、ムタナーゼ、またはグルコシダーゼＩＩ（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、もしくは本明細書に記載する任意の他の真菌種のグルコシダーゼＩＩ）のアルファおよびベータサブユニットの一方もしくは両方、を過剰発現することができる。
Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を、そのタンパク質が発現されることとなる細胞とは異なるタイプの（例えば、異なる種の）ものである細胞から得る実施形態では、対象となる特定の細胞における発現のために、そのタンパク質をコードする核酸のコドンを最適化することができる。例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉからのＮ−グリコシル化を有するタンパク質をコードする核酸のコドンをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどの酵母細胞における発現のために最適化することができる。そのようなコドン最適化は、対象となる細胞におけるタンパク質の発現を増加させるために有用であり得る。タンパク質をコードする核酸のコドンを最適化する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｇａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００４）２０（２）：４４３−４４８）、Ｋｏｔｕｌａら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．（１９９１）９，１３８６−１３８９）、およびＢｅｎｎｅｔｚｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７（６）：２０３６−３０３１）に記載されている。
哺乳動物の（例えば、ヒトの）グリコシル化経路の中間体であるＮ−グリカンを主として生産するように細胞を遺伝子操作することもできる。例えば、Ｎ−グリコシル化活性を有するヒトタンパク質をコードする１つ以上の核酸をその細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ヒトタンパク質をその細胞に導入し、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上の内因性酵母タンパク質を抑制する（例えば、欠失させるまたは突然変異させる）ことができる。真菌グリコシル化経路を「ヒト化する」ための技術は、例えば、Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（９）：５０２２−５０２７；Ｖｅｒｖｅｋｅｎら（２００４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．７０（５）：２６３９−２６４６；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（１１）：１４１０−１４１４に記載されており、これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
遺伝子操作が、例えば、タンパク質の発現または外因性タンパク質（突然変異形態の内因性タンパク質を含む）の発現の変化を含む場合、様々な技術を用いて、それらの遺伝子操作細胞がそのタンパク質を発現するかどうかを決定することができる。例えば、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはそのタンパク質自体の存在は、例えば、ノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲ分析またはウエスタンブロット分析をそれぞれ用いて検出することができる。Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の細胞内局在は、細胞分画および免疫蛍光法をはじめとする様々な技術を用いることによって分析することができる。
追加の遺伝子修飾およびそれらを本明細書に記載する任意の細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第７，０２９，８７２号；同第５，２７２，０７０号；および同第６，８０３，２２５号；ならびに米国特許出願公開第２００５０２６５９８８号、同第２００５００６４５３９号、同第２００５０１７０４５２号、および同第２００４００１８５８８号の開示から応用することができ、これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のインビボ生産を達成するために二形性酵母種において行われる操作工程は、他の酵母種において行われる操作工程とは異なるが、二形性酵母においてインビボで（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コアＮ−グリカン構造を有する）修飾糖タンパク質を生産するための遺伝子操作技術に、とりわけ米国特許第７，３２６，６８１号ならびに米国特許公開第２００４００１８５９０号、同第２００６００４０３５３号、および同第２００６０２８６６３７号に開示されている方法から常例的な実験によって応用できることは当業者には明らかであろう（これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により援用されている）。従って、それらの応用法を用いて、ヒト型ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカンで修飾された糖タンパク質の生産を達成することができる。これらの複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ残基で始まる、上に挙げたコアグリカンへの、２から５の枝を有することができ、それを、例えば、ガラクトース、フコース、およびシアル酸残基でさらに伸ばすことができる。
一部の実施形態では、標準的な技術を用いて、Ｎ−グリコシル化活性を有する突然変異タンパク質または野生型タンパク質を遺伝子操作細胞から単離することができる。例えば、遺伝子操作細胞における突然変異タンパク質または野生型タンパク質の発現後、そのタンパク質をその細胞自体からまたはその細胞を培養した培地から単離することができる。タンパク質を単離する方法は、当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、金属キレート化またはイムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈降法または分別可溶化が挙げられる。
一部の実施形態では、Ｎ−グリコシル化活性を有する単離されたタンパク質を凍結、凍結乾燥または不動化し、それらのタンパク質が活性を保持できる適切な条件下で保管することができる。
本開示は、本明細書に記載する任意の遺伝子操作細胞の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において用いる場合、遺伝子操作細胞の「実質的に純粋な培養物」は、その培養物中の生細胞の総数の約４０％未満（すなわち、約３５％未満；３０％未満；約２５％未満；約２０％未満；約１５％未満；約１０％未満；約５％未満；約２％未満；約１％未満；約０．５％未満；約０．２５％未満；約０．１％未満；約０．０１％未満；約０．００１％未満；約０．０００１％未満；またはさらにそれ以下）が、その遺伝子操作細胞以外の生細胞、例えば、細菌、真菌（酵母を含む）、マイコプラズマまたは原生動物細胞である、細胞の培養物である。この文脈での用語「約」は、その関連百分率が、指定百分率よりその指定百分率の１５％パーセント高いまたは低いことがあり得ることを意味する。従って、例えば、約２０％は、１７％から２３％であり得る。遺伝子操作細胞のそのような培養物は、細胞と増殖、保存または輸送培地とを含む。培地は、液体である場合もあり、半固体（例えば、ゼラチン状培地）である場合もあり、または凍結されている場合もある。前記培養物は、液体培地中もしくは半固体培地中／上で増殖している、または保存もしくは輸送培地（凍結保存または輸送培地を含む）中で保存もしくは輸送されている細胞を含む。前記培養物は、培養ベッセルまたは保管ベッセルもしくは基体（例えば、培養皿、フラスコまたは試験管、または保管バイアルもしくはチューブ）の中にある。
本明細書に記載する遺伝子操作細胞は、例えば、例えばグリセロールまたはスクロースなどの冷凍保護物質を含有する緩衝液中の、凍結細胞懸濁液として保管することもでき、凍結乾燥細胞として保管することもできる。あるいは、例えば、それらを、例えば流動層乾燥もしくは噴霧乾燥によってまたは任意の他の適する乾燥方法によって得られる、乾燥細胞調製品として、保管することができる。
改変Ｎ−グリコシル化分子を生産する方法
改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子を生産する方法を本明細書に記載する。これらの方法は、一般に、遺伝子操作細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓもしくは本明細書に記載する任意の他の関連二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、もしくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サルもしくはヒト））からの１つ以上のＮ−グリコシル化活性とターゲット分子を接触させる工程を含む。前記方法は、細胞ベースである場合もあり、または非細胞ベースである場合もある。
細胞ベースの方法は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を有するように遺伝子操作された細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、もしくは任意の他の関連二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞）に、その細胞においてＮ−グリコシル化を被るターゲット分子をコードする核酸を導入する工程を含むことがあり、この場合、前記細胞が、前記ターゲット分子を改変Ｎ−グリコシル化形態で生産する。前記ターゲット分子は、例えば、タンパク質、例えば、本明細書に記載するターゲットタンパク質のいずれかであり得る。ターゲットタンパク質が脂質である実施形態において、その核酸は、その脂質の合成を促進する１つ以上の酵素をコードするものであり得る。
細胞の遺伝子操作によって生ずる修飾のタイプを本明細書に記載する（添付の実施例および上の「遺伝子操作細胞」を参照のこと）。
核酸を導入するための方法は、当該技術分野において公知であり、また、添付の実施例および上で説明している。
遺伝子操作細胞へのターゲット分子（例えば、ターゲットタンパク質）の導入または発現は、その細胞の小胞体および／またはゴルジ装置によるターゲット分子の輸送を生じさせる結果となり、それによって改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子を生産することができる。
ターゲット分子の（例えば、遺伝子修飾細胞における）プロセッシング後、その改変されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子（例えば、ターゲットタンパク質）は、１つ以上のＮ−グリカン構造を含有し得る。例えば、前記改変形態のターゲット分子は、１つ以上の特異的Ｎ−グリカン構造、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩもしくはＶＩＩ；図４）、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＩ；図４）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＸＩＶ；図４）、Ｇｌｃ１Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩＩ；図４）、またはＧｌｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＸ；図４）（「Ｍａｎ」は、マンノースであり；「Ｇｌｃ」は、グルコースであり；および「ＧｌｃＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルグルコサミンである）を含有し得る。
前記遺伝子操作細胞から生産される改変されたＮ−グリコシル化を有するターゲット分子は、均一（すなわち、すべて、同じ特異的Ｎ−グリカン構造を含有する改変Ｎ−グリコシル化分子）である場合もあり、または実質的に均一である場合もある。「実質的に均一」とは、それらの改変ターゲット分子が、その遺伝子操作細胞によって生産される改変Ｎ−グリコシル化を有するターゲット分子の少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）であることを意味する。
遺伝子操作細胞が、Ｎ−グリカンのリン酸化を果たす１つ以上のＮ−グリコシル化活性を含む場合、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子は、リン酸化されたそのマンノシル残基を少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％）有することができる。
遺伝子操作細胞の任意の遺伝子修飾が、誘導性である、または誘導性キュー（例えば、化学的または物理的キュー）の存在について条件的である場合、その遺伝子操作細胞を、任意に、核酸の導入前、中、または後に誘導剤の存在下で培養することができる。例えば、ターゲットタンパク質をコードする核酸の導入後、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の発現を促進することができる化学的誘導剤にそれらの細胞を暴露することができる。多数の誘導キューによって、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質の条件付き発現が誘導される場合には、細胞を多数の誘導剤と接触させることがある。
１つ以上のＮ−グリコシル化活性によるプロセッシング後、改変されたターゲット分子を単離することができる。その改変ターゲット分子を酵母細胞内で維持し、細胞溶解によって遊離させることができ、またはその改変ターゲット分子を、その細胞からのその分子の分泌を命令する（その外因性核酸に元々ある、または発現ベクター内に操作された）コーディング配列により提供されるメカニズムによって、培養基に分泌させることができる。その細胞溶解産物または培養基中の改変ターゲット分子の存在を、その分子の存在を検出するための様々な標準的プロトコルによって検証することができる。例えば、改変ターゲット分子がタンパク質である場合、そのようなプロトコルとしては、その改変ターゲットタンパク質（もしくはそのターゲットタンパク質自体）に特異的な抗体を用いる免疫ブロット法もしくは放射性免疫沈降法、その改変ターゲットタンパク質（もしくはそのターゲットタンパク質自体）に特異的なリガンドの結合、またはその改変ターゲットタンパク質（もしくはそのターゲットタンパク質自体）の特異的酵素活性についての試験を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、それらの単離された改変ターゲット分子を凍結、凍結乾燥または固定化し、例えばそれらの改変ターゲット分子が生物活性を保持することができる適切な条件下で、保管することができる。
それらの改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子をインビボで（例えば、遺伝子操作細胞において）さらにプロセッシングすることができ、または遺伝子操作細胞もしくは細胞培地から単離後にインビトロでプロセッシングすることができる。このさらなるプロセッシングとしては、改変ターゲット分子の１つ以上のＮ−グリカン残基の修飾、または改変ターゲット分子へのそのＮ−グリカン残基以外に対する修飾を挙げることができる。その改変ターゲット分子の追加のプロセッシングとしては、ポリマーまたは担体などの異種部分の付加（共有結合的または非共有結合的連結）を挙げることができる。そのさらなるプロセッシングは、改変ターゲット分子の酵素的または化学的処理も含む場合がある。酵素的処理は、改変ターゲット分子と１つ以上のグリコシダーゼ（例えば、マンノシダーゼもしくはマンナナーゼ）、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはプロテアーゼとをその改変ターゲット分子の修飾を、誘導するために十分な時間、接触させることを含む場合がある。酵素的処理は、改変ターゲット分子と、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から１つ以上のグルコース残基を除去することができる酵素、例えば、マンノシダーゼ、またはグルコシダーゼＩＩのアルファおよびベータサブユニットの一方もしくは両方（しかし、これらに限定されない）とを接触させることを含む場合もある。化学的処理は、例えば、改変ターゲット分子とフッ化水素酸などの酸とを、その改変ターゲット分子の修飾を誘導するために十分な時間、接触させることを含む場合がある。一定条件下でのフッ化水素酸処理は、グリカンにホスホジエステラーゼ連結されるマンノース残基を特異的に除去するが、そのグリカン上にホスフェートを残す。改変ターゲット分子を、１つ以上のＮ−グリカンからのリン酸基の付加または除去により、さらにプロセッシングすることができる。例えば、改変ターゲット分子をマンノシルキナーゼまたはマンノシルホスファターゼと接触させることができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載する任意の改変ターゲット分子は、単離後、例えば酵素的または化学的手段を用いて、異種部分に付けることができる。「異種部分」は、その改変ターゲット分子に（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）連結される、その改変ターゲット分子上に元々存在する構成成分とは異なる、任意の構成成分を指す。異種部分としては、例えば、ポリマー、担体、アジュバント、免疫毒素、または検出可能（例えば、蛍光、発光、もしくは放射性）部分が挙げられる。一部の実施形態では、追加のＮ−グリカン部分をその改変ターゲット分子に追加することができる。
ターゲット分子を遺伝子操作細胞においてプロセッシングすることが、必要はないが、できることが理解される。例えば、本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態を有するターゲット分子を生産する無細胞法も特徴とし、この方法は、Ｎ−グリコシル化条件下でターゲット分子と、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を有するように遺伝子操作された細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、もしくは本明細書に記載する任意の他の関連二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、もしくはヒト））から調製した細胞溶解産物とを接触させる工程を含み、この場合、そのターゲット分子と細胞溶解産物の接触によって、改変されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子が生成される。
「Ｎ−グリコシル化条件」とは、（例えば、ターゲット分子と細胞溶解産物の）混合物を、（上で説明したような）改変Ｎ−グリコシル化を可能にする条件下でインキュベートすることを意味する。
その溶解産物中の１つ以上のＮ−グリコシル化活性の活性または完全性を保つ細胞溶解産物を得るために適する方法としては、その細胞溶解産物におけるＮ−グリコシル化活性を保つまたはその変化を最小にするヌクレアーゼ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤をはじめとする適切な緩衝剤および／または阻害剤の使用を挙げることができる。そのような阻害剤としては、例えば、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−四酢酸（ＥＧＴＡ）、プロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなど、ならびにホスファターゼ阻害剤、例えばホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどが挙げられる。阻害剤は、それらが、対象となるＮ−グリコシル化活性または活性に干渉しない、または最小限にしか悪影響を与えないように選択することができる。酵素的活性を含有する溶解産物を得るために適切な緩衝剤および条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｔｉｅｔｚ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄ．Ｂｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ａｓｈｗｏｏｄ，ｅｄｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９）に記載されている。
細胞溶解産物を、干渉物質の存在を除去するまたは最小にするように、適宜、さらに加工することができる。所望される場合には、細胞分画およびクロマトグラフ技術、例えば、イオン交換、疎水性および逆相、サイズ排除、アフィニティー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなど（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｂｕｒｔｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８１４：７１−８１（１９９８）参照）をはじめとする、当業者には周知の様々な方法によって、細胞溶解産物を分画することができる。
一部の実施形態において、全細胞小器官が無損傷および／または機能する状態のままである細胞溶解産物を調製することができる。例えば、溶解産物は、無損傷粗面小胞体、無損傷滑面小胞体、または無損傷ゴルジ装置のうちの１つ以上を含有し得る。無損傷細胞小器官を含有する溶解産物を調製するためおよびそれらの小器官の機能性について試験するための適切な方法は、例えば、Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２９−４３３３；Ｍｏｒｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（７）：４３２２−４３２８；Ｒｅｘａｃｈら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１４（２）：２１９−２２９；およびＰａｕｌｉｋら（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７（２）：２６５−２７３に記載されており、これらのそれぞれの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
本開示は、改変Ｎ−グリコシル化形態を有するターゲット分子を生産する方法も提供し、この方法は、ターゲット分子とＮ−グリコシル化活性を有する１つ以上の単離されたタンパク質とをＮ−グリコシル化条件下で接触させる工程を含み、この場合、ターゲット分子とＮ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質との接触は、改変されたＮ−グリコシル化形態のターゲット分子を生じさせ、ならびにＮ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質は、少なくとも１つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を有するように遺伝子操作された細胞（例えば、真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓもしくは本明細書に記載する任意の他の関連二相性酵母細胞）、植物細胞、または動物細胞（例えば、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、もしくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サルもしくはヒト））から調製される。
上に記載したような標準的な技術を用いて、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質を精製することができる。例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｐａｒｋ（２００２）３０（６）：７１６−７２０およびＦｕｊｉｔａ ａｎｄ Ｔａｋｅｇａｗａ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２（３）：６７８−６８２（これらの開示はそれら全体が参照により本明細書に援用されている）に記載されているように、ターゲット分子を、そのターゲット分子の修飾を誘導するために十分な時間、適する緩衝液中で１つ以上のタンパク質と接触させることができる。
一部の実施形態において、前記ターゲット分子は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つだけのタンパク質と接触させることができる。一部の実施形態において、前記ターゲット分子は、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つより多くのタンパク質と接触させることができる。前記ターゲット分子を１つより多くのタンパク質と同時に接触させる場合もあり、または逐次的に接触させる場合もある。ターゲット分子を、Ｎ−グリコシル化活性を有する１つより多くのタンパク質と逐次的に接触させる場合、１つ以上の工程の後、そのターゲット分子を精製することが、必要ではないが、できる。すなわち、ターゲット分子とタンパク質活性Ａと接触させ、その後、その分子をタンパク質活性Ｂに接触させる前に精製することができる等々。
無細胞法の一部の実施形態において、ターゲット分子を１つ以上のＮ−グリコシル化活性と接触させる前にそのターゲット分子を固相支持体に連結させると有利な場合がある。そのような連結によって、Ｎ−グリコシル化修飾後のより容易な精製が可能になる。適する固相支持体としては、マルチウエルアッセイプレート、粒子（例えば、磁性もしくはコード化粒子）、カラム、または膜が挙げられるが、これらに限定されない。
ターゲット分子のＮ−グリコシル化（例えば、改変Ｎ−グリコシル化）を検出するための方法としては、ＤＮＡシーケンサー援用（ＤＳＡ）、蛍光体援用炭水化物電気泳動法（ＦＡＣＥ）（添付の実施例において説明するとおり）、または表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）が挙げられる。例えば、分析にはＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用することができ、ＤＳＡ−ＦＡＣＥでは、例えば、糖タンパク質を変性させ、その後、例えば膜上に固定する。その後、適する還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールで、それらの糖タンパク質を還元することができる。ヨード酢酸などの酸を使用して、それらのタンパク質のスルフヒドリル基をカルボキシル化することができる。次に、Ｎ−グリコシダーゼＦなどの酵素を使用して、それらのＮ−グリカンをタンパク質から解離させることができる。還元的アミノ化によって、Ｎ−グリカンを任意に再構成および誘導体化することができる。その後、それらの誘導体化されたＮ−グリカンを濃縮することができる。Ｎ−グリカン分析に適する機器装備としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられる。データ分析は、例えば、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行うことができる。任意に、単離されたマンノタンパク質を１つ以上の酵素でさらに処理して、それらのＮ−グリカン状態を確認することができる。具体例としての酵素としては、例えば、添付の実施例に記載するような、α−マンノシダーゼまたはα−１，２−マンノシダーゼが挙げられる。追加のＮ−グリカン分析法としては、例えば、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相での高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、グリカンを標識しないときにはパルス電流検出を用いる、また、グリカンを適切に標識する場合にはＵＶ吸収または蛍光を用いる）が挙げられる。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１（４）：２７５−２８１およびＦｒｅｉｒｅら（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７（２）：５５９−５６４も参照のこと（これらのそれぞれの開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている）。
改変Ｎ−グリコシル化分子によって治療することができる疾患
本明細書に記載する単離された改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−グリコシル化タンパク質またはドリコール）は、１つ以上の改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変されたＮ−グリコシル化を有するタンパク質）の投与によって治療できる様々な疾患を治療するために、用いることができる。改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−糖タンパク質または改変Ｎ−グリコシル化ドリコール）の投与によって治療または予防することができる一部の特定の医学的状態の例を後続のセクションで概説する。
（ｉ）代謝異常
代謝異常は、個々のヒト（または動物）細胞内のエネルギーの生産に影響を及ぼすものである。大部分の代謝異常は遺伝性であるが、食事、毒物、感染などの結果として「後天的な」場合もあり得る。遺伝性代謝異常は、先天性代謝異常としても知られている。一般に、遺伝子代謝異常は、細胞の代謝プロセスの一部の工程に必要な酵素の欠失または不適当に構築される酵素を生じさせる遺伝的欠陥によって引き起こされる。代謝異常の最大のクラスには、炭水化物代謝異常、アミノ酸代謝異常、有機酸代謝異常（有機酸尿症）、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝異常、ポルフィリン代謝異常、プリンまたはピリミジン代謝異常、ステロイド代謝異常、ミトコンドリア機能障害、ペルオキシソーム機能障害、ならびにリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）がある。
本明細書に記載する１つ以上の改変Ｎ−グリコシル化分子（またはその医薬組成物）の投与によって治療することができる代謝異常の例としては、例えば、遺伝性ヘモクロマトーシス、目−皮膚白皮症、プロテインＣ欠乏症、Ｉ型遺伝性血管浮腫、先天性スクラーゼ−イソマルターゼ欠損症、クリグラー−ナジャーＩＩ型、ラロン症候群、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ、原発性甲状腺機能低下症、先天性ＱＴ延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、無β−リポタンパク血症、低血漿リポタンパク質Ａレベル、肝損傷を伴う遺伝性肺気腫、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、アルファ−１アンチキモトリプシン欠損症、腎性尿崩症、神経下垂体尿崩症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ペリツェウス−メルツバッハー病、フォン−ウィルブランド病ＩＩＡ型、複合第Ｖ／ＶＩＩＩ因子欠乏症、遅発性脊椎骨端異形成症、全脈絡膜萎縮、Ｉ細胞病、バッテン病、毛細血管拡張性運動失調症、ＡＤＰＫＤ−常染色体慢性嚢胞腎、微絨毛封入体病、結節性硬化症、Ｌｏｗｅの目脳腎症候群、筋萎縮性側索硬化症、骨髄異形成症候群、裸リンパ球症候群、タンジール病、家族性肝内胆汁うっ滞、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、スコット症候群、ヘルマンスキー−プドラック症候群１および２型、ツェルウェーガー症候群、近節短縮性点状軟骨形成異常、常染色体劣性原発性高シュウ酸尿症、Ｍｏｈｒ Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ症候群、球脊髄性筋萎縮症、原発性線毛運動不全症（カルタゲナー症候群）、巨人症および先端巨大症、乳汁漏出症、アジソン病、副腎性男性化、クッシング症候群、ケトアシドーシス、原発性および続発性アルドステロン症、ミラー−ディーカー症候群、滑脳症、運動ニューロン疾患、アッシャー症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、オピッツ症候群、ハンチントン病、遺伝性膵炎、抗リン脂質症候群、オーバーラップ結合組織疾患、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、ブルガダ症候群、フィンランド型先天性腎炎様症候群、デュービン−ジョンソン症候群、Ｘ連鎖低リン酸血症、ペンドレッド症候群、小児持続性高インスリン血症性低血糖、遺伝性球状赤血球症、無セルロプラスミン血症、小児型神経セロイドリポフスチン沈着症、偽性軟骨無形成症および多発性骨端、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、Ｘ連鎖シャルコー−マリー−ツース病、常染色体優性色素性網膜炎、ウォルコット−ラリソン症候群、クッシング症候群、肢帯型筋ジストロフィー、ムコ多糖症ＩＶ型、フィンランド型遺伝性家族性アミロイドーシス、アンダーソン病、肉腫、慢性骨髄単球性白血病、心筋症、顔面生殖器異形成、捻転症、ハンチントンおよび脊髄小脳失調症、遺伝性高ホモシステイン血症、多発性ニューロパチー、下位運動ニューロン疾患、色素性網膜炎、血清反応陰性多発性関節炎、間質性肺線維症、レイノー現象、ヴェグナー肉芽種症、タンパク尿、ＣＤＧ−Ｉａ、ＣＤＧ−Ｉｂ、ＣＤＧ−Ｉｃ、ＣＤＧ−Ｉｄ、ＣＤＧ−Ｉｅ、ＣＤＧ−Ｉｆ、ＣＤＧ−ＩＩａ、ＣＤＧ−ＩＩｂ、ＣＤＧ−ＩＩｃ、ＣＤＧ−ＩＩｄ、エーラース−ダンロス症候群、多発性外骨腫症、グリセリ症候群（１型もしくは２型）、またはＸ連鎖非特異的精神遅滞を挙げることができる。加えて、代謝異常としては、リソソーム貯蔵障害、例えば、ファブリ病、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、テイ−サックス病、サンドホス病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン−ピック病（Ａ、ＢおよびＣ型）、ハーラー病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー−ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド症、マンノシド症、シンドラー病、シアリドーシス１型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコ脂質症（ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型）、シスチン症、シアル酸貯蔵障害、マリネスコ−シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー−プドラック症候群、チェディアク−東症候群、ダノン病、またはゲレオフィジック異形成（しかし、これらに限定されない）も挙げることができる。
代謝異常の症状は非常に多く、多岐にわたり、それらとしては、例えば、貧血、疲労、簡単に挫傷すること、低血小板、肝臓肥大、脾臓肥大、骨格弱化、肺機能障害、感染（例えば、胸部感染または肺炎）、腎機能障害、進行性脳障害、発作、非常に濃い胎便、咳、喘鳴、唾液または粘液生産亢進、息切れ、腹痛、腸または消化管閉塞、生殖能問題、鼻内ポリープ、手の指／足の指の爪および皮膚の太鼓撥指形成、手または足の痛み、被角血管腫、発汗減少、角膜および水晶体混濁、白内障、僧帽弁逸脱および／または閉鎖不全、心拡大、温度不耐性、歩行困難、嚥下困難、進行性視力喪失、進行性聴力損失、低血圧症、巨大舌、反射消失、腰痛、睡眠時無呼吸、起坐呼吸、傾眠、脊柱前弯症または脊柱側弯症のうちの１つ以上を挙げることができる。欠損または不在タンパク質の様々な性質および結果として生ずる疾病の表現型（例えば、代謝異常の症状の呈示）に起因して、所与の疾患は、その特定の疾患に特有の症状のみを一般に呈するであろうことは理解される。例えば、ファブリ病を有する患者は、温度不耐性、角膜の旋回、疼痛、皮膚発疹、悪心または下痢など（しかし、これらに限定されない）の上述の症状の特定のサブセットを呈し得る。ゴーチェ症候群を有する患者には、脾腫、硬変症、痙攣、筋緊張亢進、無呼吸、骨粗しょう症、または皮膚変色が現れる場合がある。
本明細書に記載する１つ以上の改変Ｎ−グリコシル化分子の投与に加えて、代謝異常は、適当な栄養およびビタミン類（例えば、補因子療法）、理学療法、および疼痛薬物療法によっても治療することができる。
所与の代謝異常の具体的な性質に依存して、患者は、これらの症状を任意の年齢で呈し得る。多くの場合、症状は小児期にまたは成人期初期に現れる。例えば、ファブリ病の症状は、子供の頃に、例えば、１０または１１歳で現れる場合がある。
本明細書において用いる場合、（本明細書に記載するものなどの）「代謝異常を発現するリスクのある」被験体は、疾患を発現する素因、すなわち、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫまたはリポタンパク質リパーゼなどの酵素における突然変異の結果として代謝異常を発現する遺伝的素因、を有する被験体である。明らかに、「代謝異常を発現するリスクのある」被験体は、対象となる種の中のすべての被験体ではない。
「疾患を有することが疑われる」被験体は、疾患（例えば、代謝異常または本明細書に記載する任意の他の疾患）の１つ以上の症状、例えば、本明細書に記載するもののいずれかを有する被験体である。
（ｉｉ）癌
癌は、細胞の無制御な***、および浸潤による隣接組織への直接増殖、または転移による遠隔部位への内移植（この場合、癌細胞は、血流もしくはリンパ系によって輸送される）、いずれかによって拡大するこれらの能力を特徴とする疾病または疾患の１類である。癌は、すべての年齢の人々を襲うが、年齢と共にリスクが増す傾向がある。癌のタイプとしては、例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨の癌、血液学的癌、神経組織の癌、黒色腫、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、膣癌、または膀胱癌を挙げることができる。
本明細書において用いる場合、「癌を発現するリスクのある」被験体は、癌を発現する素因、すなわち、癌を発現する遺伝的素因、例えば、腫瘍抑制遺伝子の突然変異（例えば、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ＲＢもしくはＡＰＣにおける突然変異）を有する被験体、または癌を生じさせ得る条件に暴露された被験体である。従って、被験体は、その被験体が、突然変異誘発性または発癌性レベルの一定の化合物（例えば、タバコの煙の中の発癌性化合物、例えば、アクロレイン、砒素、ベンゼン、ベンズ｛ａ｝アントラセン、ベンゾ｛ａ｝ピレン、ポロニウム−２１０（ラドン）、ウレタンまたは塩化ビニル）に暴露されたときも、「癌を発現するリスクのある」被験体であり得る。さらに、被験体は、その被験体が、例えば、大量の線量の紫外線もしくはＸ線照射に暴露されたとき、または腫瘍原因／腫瘍関連ウイルス、例えば、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスもしくはヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルスに暴露された（例えば、感染した）とき、「癌を発現するリスクのある」場合がある。上で述べたことから、「癌を発現するリスクのある」被験体は、対象となる種の中のすべての被験体ではないことは明らかであろう。
「癌を有することが疑われる」被験体は、癌の１つ以上の症状を有する被験体である。癌の症状は当業者に周知であり、それらとしては、***のしこり、乳頭変化、胸部嚢胞、胸部疼痛、体重減少、衰弱、過労、摂食困難、食欲不振、慢性咳、息切れ悪化、血を伴う咳、尿中の血、糞便中の血、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部充満、鼓脹、腹膜腔内の流体、膣出血、便秘、腹部膨満、結腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、眩暈、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移、および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載する１つ以上の改変Ｎ−グリコシル化分子の投与に加えて、化学療法薬、電離放射線、免疫療法薬、または温熱療法薬によって癌を治療することもできる。化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド、ベラムピル（ｖｅｒａｍｐｉｌ）、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナム、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサートが挙げられる。
（ｉｉｉ）炎症性疾患
「炎症性疾患」は、本明細書において用いる場合、１つ以上の物質（例えば、被験体内で自然に発生しない物質）が、白血球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の作用によって、病的反応、例えば病的免疫反応、を不適切に誘発するプロセスを指す。それ故、炎症反応に関与するそのような細胞は、「炎症性細胞」と呼ばれる。不適切に誘発される炎症反応は、異物（例えば、抗原、ウイルス、細菌、真菌）が被験体内または上に存在しない場合のものであることもある。不適切に誘発される反応は、自己成分（例えば、自己抗原）が炎症性細胞のターゲットにされる場合（例えば、多発性硬化症などの自己免疫疾患）のものであることもある。不適切に誘発される反応は、大きさまたは継続期間が不適切である反応、例えば過敏症である場合もある。それ故、不適切にターゲットにされる反応は、微生物感染（例えば、ウイルス性、細菌性または真菌性）の存在に起因する場合がある。炎症性疾患（例えば、自己免疫疾患）のタイプとしては、変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、脊椎関節症、ＰＯＥＭＳ症候群、クローン病、多中心性キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、炎症性ニューロパチー、例えばギラン−バレー症候群、脈管炎、例えばウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、チャーグ−ストラウス症候群、または高安動脈炎を挙げることができるが、これらに限定されない。一定のタイプのアレルギー、例えば、鼻炎、副鼻腔炎、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、じんま疹（ｈｉｖｅｓ）、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー（例えば、ナッツアレルギー）、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン）、昆虫アレルギー（例えば、蜂刺されに対するアレルギー）、または肥満細胞症も炎症性疾患に含まれる。炎症性疾患としては、潰瘍性大腸炎および喘息も挙げることができる。
「炎症性疾患を発現するリスクのある」被験体は、１つ以上の炎症性疾患の家族歴（例えば、１つ以上の炎症性疾患の遺伝的素因）を有する被験体、または１つ以上の炎症誘発条件に暴露された被験体を指す。例えば、被験体は、ウイルスまたは細菌超抗原、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、連鎖球菌化膿性外毒素（ＳＰＥ）、黄色ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、連鎖球菌細胞***誘起外毒素（ＳＭＥ）および連鎖球菌超抗原（ＳＳＡ）（しかし、これらに限定されない）に暴露された場合がある。上で述べたことから、「炎症性疾患を発現するリスクのある」被験体は、対象となる種の中のすべての被験体でないことは明らかであろう。
「炎症性疾患を有することが疑われる」被験体は、炎症性疾患の１つ以上の症状が現れている被験体である。炎症性疾患の症状は当該技術分野において周知であり、それらとしては、発赤、腫脹（例えば、関節腫脹）、触ると温かい関節、関節痛、硬直、関節機能喪失、発熱、悪寒、疲労、エネルギー喪失、頭痛、食欲不振、筋肉硬直、不眠症、痒み、鼻詰まり、くしゃみ、咳、１つ以上の神経症状、例えば眩暈、発作または疼痛が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載する１つ以上の改変Ｎ−グリコシル化分子の投与に加えて、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生体応答修飾物質、またはコルチコステロイドによって炎症性疾患を治療することもできる。生体応答修飾物質としては、例えば、抗ＴＮＦ剤（例えば、可溶性ＴＮＦ受容体またはＴＮＦに特異的な抗体、例えばアデュリムマブ（ａｄｕｌｉｍｕｍａｂ）、インフリキシマブ、またはエタネルセプト）が挙げられる。
任意の改変Ｎ−グリコシル化分子（またはそれらの医薬組成物）を使用して本明細書に記載する任意の疾患を治療する（例えば、それらの１つ以上の症状を予防または改善する）ために適する方法を後続のセクションに示す。
医薬組成物および治療方法
改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子、例えばターゲットタンパク質）を、治療有効量の該分子ならびに１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体および／または希釈剤を含有する医薬組成物に組み込むことができる。許容される希釈剤、担体および賦形剤は、一般に、レシピエントの恒常性（例えば、電解質バランス）に悪影響を及ぼさない。許容される担体としては、生体適合性、不活性または生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖類または多糖類、ポリマー、粘度向上剤、保存薬などが挙げられる。１つの具体例としての担体は、生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０から７．４）である。もう１つの具体例としての担体は、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウムである。医薬組成物の調合および投与についてのさらなる詳細および技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）において見つけることができる。補助活性化合物も前記組成物に組み込むことができる。
改変Ｎ−グリコシル化分子を含有する医薬組成物の投与は、全身投与である場合もあり、または局所投与である場合もある。医薬組成物は、非経口投与および／または非経口投与でない投与に適するように調合することができる。具体的な投与様式としては、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、髄腔内、経口、直腸内、口腔内、局所、鼻、目、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、リンパ管、膣、および子宮内投与が挙げられる。
投与は、医薬組成物の定期的なボーラス注射による投与である場合もあり、あるいは外部にあるレザバー（例えば、ＩＶバッグ）または内部にあるレザバー（例えば、生腐食可能なインプラント、バイオ人工臓器、もしくは移植された改変Ｎ−グリコシル化分子生産細胞のコロニー）からの静脈内または腹腔内投与による連続または持続投与である場合もある。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号および同第５，８００，８２８号参照（それぞれ、それら全体が参照により本明細書に援用されている）。医薬組成物の投与は、適する送達手段、例えば、ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ，４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８（１９８４）参照（その全体が参照により本明細書に援用されている））；マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号参照（（その全体が参照により本明細書に援用されている））；持続放出ポリマーインプラント（例えば、Ｓａｂｅｌ，米国特許第４，８８３，６６６号参照（その全体が参照により本明細書に援用されている））；マクロカプセル化（例えば米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号ならびに公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ ９５／０５４５２（これらのそれぞれの開示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている））；皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは他の適する部位への注射；またはカプセル、液体、錠剤、ピルもしくは持続放出製剤での経口投与を用いて達成することができる。
非経口送達システムの例としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、ポンプ送達、カプセル封入細胞送達、リポソーム送達、針によって送達される注射、無針注射、ネブライザー、エーロゾル散布器、エレクトロポレーション、および経皮パッチが挙げられる。
非経口投与に適する製剤は、レシピエントの血液と好ましくは等張である、前記改変Ｎ−グリコシル化分子の滅菌水性調製品（例えば、生理食塩溶液）を適便に含有する。製剤を単位用量形で提供することもでき、または多回用量形で提供することもできる。
経口投与に適する製剤は、所定量の改変Ｎ−グリコシル化分子をそれぞれが含有する個別ユニット、例えば、カプセル、カシェ剤、錠剤もしくはロゼンジ；または水性液もしくは非水性液中の懸濁液、例えば、シロップ、エリキシル、エマルジョンまたは頓服水剤として提供することができる。
局所投与に適する改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子、例えばターゲットタンパク質）を、哺乳動物（例えば、ヒト患者）に、例えば、クリーム、スプレー剤、フォーム、ゲル、軟膏、膏薬、またはドライラブ（ｄｒｙ ｒｕｂ）として投与することができる。ドライラブは、投与部位で再び水和することができる。改変Ｎ−グリコシル化分子を包帯、ガーゼまたはパッチに直接しみ込ませる（例えば、浸漬し、乾燥させる）こともでき、その後、それを局所適用することができる。改変Ｎ−グリコシル化分子を局所投与のために包帯、ガーゼまたはパッチの中に半液体、ゲル化、または完全液体状態で維持することもできる（例えば、米国特許第４，３０７，７１７号参照（この内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている））。
治療有効量の医薬組成物を、その必要がある被験体に、当業者が確認できる投薬レジメンで投与することができる。例えば、組成物を、被験体に、例えば、１用量あたりその被験体の体重１ｋｇにつき０．０１μｇから１０，０００μｇの投薬量で全身投与することができる。もう１つの例での投薬量は、１用量あたりその被験体の体重１ｋｇにつき１μｇから１００μｇである。もう１つの例での投薬量は、１用量あたりその被験体の体重１ｋｇにつき１μｇから３０μｇ、例えば、１用量あたりその被験体の体重１ｋｇにつき３μｇから１０μｇである。
治療上の効能を最適にするために、改変Ｎ−グリコシル化分子を最初は異なる投薬レジメンで投与することができる。その単位用量およびレジメンは、例えば、哺乳動物の種、その免疫状態、その哺乳動物の体重を含む因子に依存する。一般に、臨床試験手順の一部として適切なスクリーニングアッセイを用いて組織内の改変Ｎ−グリコシル化分子のレベルをモニターして、例えば、所与の治療レジメンの効能を決定することができる。
改変Ｎ−グリコシル化分子についての投薬頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護士）の技能および臨床判断の範囲内である。一般に、投与レジメンは、最適な投与パラメーターを確立することができる臨床試験によって確立される。しかし、前記従事者は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別および医療状態に従ってそのような投与レジメンを変えることができる。その処置が予防的であるのか、治療的であるのかに依存して、投薬頻度を変えることができる。
そのような改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲット分子、例えばターゲットタンパク質）またはそれらの医薬組成物の毒性および治療上の効能は、公知の薬学的手順により、例えば、細胞培養物または実験動物において、決定することができる。これらの手順を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、用いることができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。毒性副作用を示す医薬組成物を使用できる場合、正常な細胞（例えば、ターゲットでない細胞）への潜在的損傷を最小にし、それによって副作用を減らすように作用を受ける組織の部位にそのような化合物をターゲッティングする送達システムを設計することに注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、適切な被験体（例えば、ヒト患者）において使用するための投薬量範囲を公式化する際に用いることができる。そのような医薬組成物の投薬量は、一般に、毒性を殆どまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。前記投薬量は、利用する剤形および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変わることがある。本明細書に記載するとおり（例えば、被験体における代謝異常を治療するために）使用される医薬組成物の場合、その治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量抑制を達成する医薬組成物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を、動物モデルにおいて公式化することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
本明細書において定義する場合、改変Ｎ−グリコシル化分子の「治療有効量」は、治療する被験体において医療上望ましい結果（例えば、代謝異常の１つ以上の症状の改善または癌細胞の増殖減少）を生じさせることができる分子の量である。改変Ｎ−グリコシル化分子の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、被験体またはサンプルの重量のキログラムあたりのその化合物のミリグラムまたはマイクログラム量（例えば、キログラムあたり約１マイクログラムからキログラムあたり約５００ミリグラム、キログラムあたり約１００マイクログラムからキログラムあたり約５ミリグラム、またはキログラムあたり約１マイクログラムからキログラムあたり約５０マイクログラム）を含む。
前記被験体は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト（例えば、ヒト患者）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒもしくはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、家畜タイプ（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジもしくはヤギ）、イヌ、ネコもしくはクジラであり得る。
本明細書に記載する改変Ｎ−グリコシル化分子またはその医薬組成物は、別の治療、例えば代謝異常（例えば、リソソーム貯蔵障害）のための治療、との併用療法として被験体に施与することができる。例えば、前記併用療法は、被験体（例えば、ヒト患者）に対して、代謝異常（例えば、リソソーム貯蔵障害）を有する、またはそれを発現するリスクを有する（またはそれを有することが疑われる）被験体に治療的恩恵をもたらす１つ以上の追加の薬剤を投与することを含む場合がある。従って、前記化合物または医薬組成物と１つ以上の追加の薬剤を同時に投与する。あるいは、時宜を得て前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）を最初に投与し、そして次に時宜を得て前記１つ以上の追加の薬剤を投与してもよい。時宜を得て最初に前記１つ以上の追加の薬剤を投与し、そして次に時宜を得て前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）を投与してもよい。前記改変Ｎ−グリコシル化分子は、以前に施与したまたは現在施与している療法に取って代わることができ、またはそれらを増強することができる。例えば、本発明の改変Ｎ−グリコシル化分子で治療することにより、前記１つ以上の追加の薬剤の投与をやめること、または減少させること、例えば、より低レベルで投与することができる。以前の療法の施与を維持することもできる。場合によっては、その改変Ｎ−グリコシル化分子のレベル（例えば、投薬量またはスケジュール）が治療効果をもたらすために十分なレベルに達するまで、以前の療法を維持することができる。２つの療法を同時に施与することもできる。
以前の療法が特に毒性である場合（例えば、有意な副作用プロフィールを伴う代謝異常のための治療）、前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）の投与を用いて、その以前の療法の量を、毒性を伴わずに同じまたは改善された治療的恩恵をもたらすのに十分なレベルに相殺するおよび／または減少させることができる。
場合によっては、本発明の改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質、ドリコール、もしくはドリコール結合脂質）または医薬組成物を被験体に投与するとき、最初の療法を中止する。その被験体を第一の予備選択結果、例えば、本明細書に記載したもの（例えば、上記参照）のうちのいずれかなどの代謝異常の１つ以上の症状の改善、についてモニターすることができる。その第一の予備選択結果を観察する一部のケースでは、前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、改変Ｎ−グリコシル化タンパク質または改変Ｎ−グリコシル化ドリコール）での治療を減少させる、または中止する。その後、その改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）での治療を中止した後の第二の予備選択結果、例えば、代謝異常の症状の悪化、について、その被験体をモニターすることができる。第二の予備選択結果を観察するとき、その被験体への改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）の投与を復活もしくは増加させることができ、または第一の療法の施与を復活させる、または改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質、ドリコール、もしくはドリコール結合脂質）と第一の療法の両方、または前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質もしくはドリコール）の増大させた量と第一の治療レジメンを被験体に施与する。
前記改変Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質またはドリコール）を、疾病（例えば、代謝異常）の１つ以上の症状のための治療と共に施与することもできる。例えば、前記Ｎ−グリコシル化分子（例えば、タンパク質、ドリコールまたはドリコール結合脂質）を、例えば疼痛薬と（例えば、同時に、または上で説明した任意の併用レジメンにより）併用投与することができる。
一部の実施形態において、改変Ｎ−グリコシル化分子は、その改変グリコシル化がその分子の医療関連生成物を生成する能力を増すものである。例えば、改変Ｎ−グリコシル化分子は、治療用生成物（例えば、小分子または治療用ペプチド）を生成することができる酵素である場合があり、この酵素の活性は、グリコシル化によって増される、または最適化される。そのような生成物およびそれらの生成物を使用する方法は、本開示の範囲内である。
本明細書に記載するいずれの医薬組成物も、投与のための説示と一緒に、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
以下は、本発明の実施に関する実施例である。如何なる点においてもこれらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
（実施例１）プラスミド、プライマーおよび株
表１は、ベクター（例えば、発現ベクター）の構築の際に使用したプラスミドおよび本明細書に記載する実験において使用した欠失カセットのすべてのリストを含む。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＭＴＬＹ６０株をこれらの実験において用いた。
表２は、以下の実施例において使用したプライマー（それらのプライマー名）およびそれらのプライマーの用役のリストを含む。
（実施例２）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＯＣＨ１およびＭＮＮ９破壊
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＯＣＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＡＪ５６３９２０）とＭＮＮ９（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＡＦ４４１１２７）遺伝子の両方をノックアウトする戦略を、ＬＩＰ２遺伝子についてＦｉｃｋｅｒｓら（（２００３）Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（３）：７２７−３７）に記載されているように設定した。ＯＣＨ１遺伝子について準拠した遺伝子構築戦略を図５に示す。
ＯＣＨ１ ＫＯフラグメントを制限消化によっておよびＰＣＲによってプラスミドＹｌＯＣＨ１ ＰＵＴ ＴＯＰＯから単離し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０に形質転換した。２０のウラシル原栄養株を得、それを、プライマーＹｌｏｃｈ１ ｐｒｏｍ ｆｗ（配列番号１８）およびＹｌｏｃｈ１ ｔｅｒ ｒｅｖ（配列番号１９）を用いるゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）でのＰＣＲによってスクリーニングして、そのプラスミドのゲノムの組み込みを分析した。試験した２０のクローンのうちの２つに関して、適正なサイズ（すなわち、野生型における１８９４ｂｐに対して２６１８ｂｐ）のフラグメントを増幅した。その構築物のランダム組込みコピー、従って両方のフラグメントを含有する幾つかのクローンを増幅した。
ＵＲＡ３遺伝子を除去するために、Ｃｒｅリコンビナーゼについての発現カセットを含有するエピソームプラスミドｐＲＲＱ２で２つの陽性クローンを形質転換した。プライマーＹｌｏｃｈ１ ｐｒｏｍ ｆｗおよびＹｌｏｃｈ１ ｔｅｒ ｒｅｖ（上記参照）を用いるｇＤＮＡでのＰＣＲによって、ＵＲＡ３遺伝子の除去をスクリーニングした。これらの陽性クローンには、２３２８ｂｐフラグメント（ＵＲＡ３を含む）は不在であり、１０７５ｂｐの１０７５ｂｐ（ＵＲＡ３を含まない）フラグメントが存在した。
それらの２つの陽性クローンを用いてサザンブロット分析を行って、異所ＤＮＡ組込みが発生したかどうかを確認した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、アガロース−ゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース膜に移した。プラスミドＹｌＯＣＨ１ ＰＴ ＴＯＰＯからの５００ｂｐ ＳｐｅＩ／Ｉ−ＳｃｅＩフラグメントでその膜をプローブした。１４５６ｂｐのフラグメントがΔｏｃｈ１ ＰＵＴに存在し、これに対してΔｏｃｈ１ ＰＴには２０６６ｂｐのフラグメント、および野生型株には２８９３ｂｐのフラグメントが存在した。
ＭＮＮ９を不活性化するための構築戦略を設定した。それを図６に示す。
破壊フラグメントをＮｏｔＩ／ＰａｃＩ二重消化によってプラスミドＹｌＭＮＮ９ＰＵＴ ＴＯＰＯから切り取り、ＭＴＬＹ６０およびΔｏｃｈ１ ＰＴクローン９に形質転換した。幾つかのＵＲＡ３陽性クローンを両方の株について得、単一クローンを単離した後、ｇＤＮＡでのＰＣＲによってそれらを構築物の適正な組込みについてスクリーニングした。プライマーＹｌＭＮＮ９ Ｐ ｆｗおよびＹｌＭＮＮ９ Ｔ ｒｖ．（表２）を使用して、破壊株では２３４９ｂｐのフラグメントを増幅し、これに対して非形質転換体では、２０５６ｂｐのフラグメントを増幅した。
突然変異株によって合成されたＮ−グリカン構造を分析するために、マンノプロテインから得たグリカンを用いてＤＳＡ−ＦＡＣＥを行った（図７）。野生型（ＭＴＬＹ６０）株は、主コアタイプグリカン構造として、主としてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）および相当な量のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＩ；図４）を有し、後者は、Ｏｃｈ１ｐ活性の結果として追加のマンノースを十中八九ほとんど含有する。さらに、幾つかのより大きな構造を見ることができる。Δｏｃｈ１株は、主としてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ）および少しばかりのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＩ；図４）を有し、これらの両方が、α−１，２−マンノシダーゼ処理に感受性であり（示されているΔｏｃｈ１ α−１，２−ｍａｎ）、その結果、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ；図４）にトリミングされる。Δｍｎｎ９株は、Δｏｃｈ１株より多くのＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＩ；図４）を蓄積し、これは、Ｍｎｎ９ｐが、Ｏｃｈ１ｐ活性の結果として生ずるグリカン構造の伸長に関与することを示している。二重突然変異体Δｏｃｈ１Δｍｎｎ９は、Δｏｃｈ１株からのものに似ているグリコシル化表現型を示す。
（実施例３）ＭＮＳ１の突然変異誘発
ＭＮＳ１（ＥＲ α−１，２−マンノシダーゼ）は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングに関与し、また、中央アームのα−１，３−マンノースに連結されているα−１，２−マンノースをトリミングすることだけができるという意味で厳格な基質特異性を有する（図２）。ＭＮＳ１遺伝子を、その基質特異性をゴルジタイプα−１，２−マンノシダーゼのほうにシフトさせるように突然変異誘発できるかどうかを決定するために、幾つかのＥＲタイプマンノシダーゼの一次配列をゴルジタイプマンノシダーゼと比較した。これら２クラス間で異なる１つの領域を同定した。加えて、ゴルジタイプマンノシダーゼの触媒部位において酵母ＭＮＳ１となって晶出したオリゴ糖も分析して、糖とタンパク質の間で起こりうる相互作用を同定した。驚くべきことに、両方の方法を用いて同じ部位が同定された。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭＮＳ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：Ｚ４９６３１、ｓｇｄ：ＹＪＲ１３１Ｗ）を突然変異させて、その基質特異性を変更した。３つの突然変異バージョンを作製した：同じ領域に１つの突然変異を伴う２つ（Ｒ２７３ＬおよびＲ２７３Ｇ）および３つの突然変異を有する１つ（Ｒ２６９Ｓ／Ｓ２７２Ｇ／Ｒ２７３Ｌ）：
Ａ）Ｒ２７３Ｌ（アルギニン２７３をロイシンへ）
Ｂ）Ｒ２７３Ｇ（アルギニン２７３をグリシンへ）
Ｃ）Ｒ２６９Ｓ／Ｓ２７２Ｇ／Ｒ２７３Ｌ（アルギニン２６９をセリンへ／セリン２７２をグリシンへ／アルギニン２７３をロイシンへ）。
すべての突然変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）突然変異誘発キットを使用して行った。強力な構成的ＴＰＩ１プロモーターの制御下で３つの異なる突然変異遺伝子を発現するように構築物を作製した。野生型遺伝子をテンプレートとして使用することにより、オリゴヌクレオチド
を使用して、突然変異体Ｒ２７３Ｌを生成し、ならびにオリゴヌクレオチド
を使用して、突然変異体Ｒ２７３Ｇを得た。突然変異体Ｒ２７３ＬをテンプレートＤＮＡとして使用することにより、オリゴヌクレオチド
を使用して、突然変異体Ｒ２６９Ｓ／Ｓ２７２Ｇ／Ｒ２７３Ｌを得た。オリゴヌクレオチド
を使用するＰＣＲ反応によって、Ｅ−ｔａｇのコーディング配列をその突然変異体および野生型ＭＮＳ１オープンリーディングフレームの３’末端に付加させて、発現後にタンパク質を検出できるようにした。この構築戦略の外観を図８に提示する。
前記３つの構築物、ならびに（陰性対照として）非突然変異遺伝子を、ＸｂａＩでのプラスミドの消化後にＴＲＰ１を選択マーカーとして使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＸＷ２７（ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｌｙｓ２ ｏｃｈ１：：ＬＥＵ２ ｍｎｎ１：：ＵＲＡ３ ｍｎｎ６：：ＡＤＥ２）に形質転換して、その構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム内のＴＲＰ１遺伝子座に向けた。後述の株は、（その糖タンパク質を用いて）均一なＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を合成することができる。前記突然変異酵素が活性であれば、このＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ：図４）、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｖ；図４）および／またはＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩ；図４）にトリミングされるはずである。
トリプトファン原栄養株を単離し、液体ＳＤＣ−ｔｒｐ培地中で増殖させ、マンノプロテインを調製した。マンノプロテインから得たＮ−グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥによって分析した。図９からわかるように、Ｒ２７３ＧおよびＲ２６９Ｓ／Ｓ２７２Ｇ／Ｒ２７３Ｌ突然変異を含有する株から少量のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）が、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ：図４）、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｖ；図４）およびＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩ；図４）に転化された。他の突然変異体または野生型遺伝子の発現が改変Ｎ−グリコシル化表現型を生じさせる。すべての突然変異体が同等に十分に発現されるかどうかを評価するために、Ｅ−ｔａｇ（ＭＮＳ１タンパク質に付加された１３アミノ酸エピトープ）に特異的な抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った。すべての突然変異タンパク質、ならびに野生型ＭＮＳ１タンパク質が、同等に十分に発現された。
（実施例４）リン酸化増加
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＭＮＮ４の発現
Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のリン酸化を増加させるために、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＮＯ１の相同体）をＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて過剰発現させて、Ｎ−グリカンのコアタイプリン酸化を促進した。
プライマー
を使用して、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４（ＸＭ＿５０３２１７、ＹＡＬＩ０Ｄ２４１０１ｇ）遺伝子のコーディング配列を増幅した。このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、プラスミドに、ＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩ部位を用いてクローニングし、それによって、そのＯＲＦを、選択マーカーとしてのＵＲＡ３ｄ１遺伝子とランダム組込みを改善するためのゼータ配列とを含有するプラスミドｐＹｌＨＵＲＡ３のｈｐ４ｄプロモーターの制御下に置く（図１０）。
ＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１株における形質転換前に、ＭＮＮ４発現カセットを含有するプラスミドを、ＵＲＡ３遺伝座での組み込みのためにＥｃｏ４７ＩＩＩ、ＭＮＮ４遺伝子座での組み込みのためにＰｖｕＩ、またはランダム組込みのためにＲｓｒＩＩ／ＢｓｔＢＩ、いずれかで消化した。ＵＲＡ３およびＭＮＮ４遺伝子座にターゲッティングされた形質転換体を、ｈｐ４ｄプロモーター内のプライマーおよびＬＩＰ２ターミネーター内のプライマーを使用するＰＣＲによって分析した。その構築物のランダム組込みを伴う形質転換体をサザンブロット分析によって評価した。
マンノ−リン酸化が増加されたかどうかを評価するために、本発明者らは、ＹＰＤ培地中での４８時間の培養後、分泌された糖タンパク質から得たＮ−グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥキャピラリー電気泳動によって分析した（図１１）。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ）の量は、（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）と比較して）より早く移動する、ならびに１つ（Ｐ）（構造式ＸまたはＸＩ；図４）および２つ（ＰＰ）（構造式ＸＩＩ；図４）のリン酸残基をそれぞれ含有する可能性が高い、２つの構造に有利に劇的に減少した（図１１）。従って、ランダム組込み発現カセットは、ＵＲＡ３遺伝子座またはＭＮＮ４遺伝子座に組込まれたカセットより、この順で、良好に動作すると結論付けることができる。ＭＺ２が最高レベルのリン酸化を示した。
両方のピークがＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ；図４）ピークに由来すると仮定して、リン酸化グリカンに転化されたＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の量を定量した（表３）。
表３の説明：高さおよび面積は、電気泳動図から決定したピークの高さおよびピーク面積を指す。「シグナル％」は、Ｎ−グリカン混合物中のそれぞれのグリカンの割合を指す。アスタリスクによって識別される数値は、リン酸化Ｍａｎ８Ｇｎ２の割合（上）および非リン酸化Ｍａｎ８Ｇｎ２の割合（下）を示す。
これらの結果は、ＹｌＭＮＮ４遺伝子を過剰発現する株では、親Δｏｃｈ１中に存在するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（構造式Ｉ：図４）の８０％より多くがリン酸化されることを示していた。
（実施例５）小胞体における脂質結合オリゴ糖修飾によるグリコシル化の修飾
材料および方法
株、培養条件および試薬。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１またはＴＯＰ１０またはＤＨ５αを組換えプラスミドＤＮＡの増幅に使用し、使用するプラスミドに依存して１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンまたは５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補足したＬｕｉｒａ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地中、３７℃でサーモシェーカーにおいて増殖させた。
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０（ｕｒａ３ ｌｅｕ２）株を親株として使用した。すべての酵母菌株を２８℃のインキュベータで培養した。それらを、ＹＰＤ培地（２％デキストロース、２％バクトペプトンおよび１％酵母抽出物）または合成デキストロース完全（ＳＤＣ）培地（０．１７％ ＹＮＢ（アミノ酸なし、および硫酸アンモニウムなし）、１％グルコース、０．５％ ＮＨ４Ｃｌ、５０ｍＭ リン酸Ｋ／Ｎａバッファ ｐＨ６．８および０．０７７％ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ Ｉｎｃ，Ｍｏｒｇａｎ Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））を用いて増殖させた。Ｕｒａ＋およびＬｅｕ＋形質転換体の選択のために、それぞれ、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａまたはＣＳＭ−ｌｅｕを添加した。
標準的遺伝子技術。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換適格細胞を、Ｂｏｉｓｒａｍｅら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２０）：１１６６８−７５（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている）に記載されているとおりに調製した。出版物に掲載されているプロトコル（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｋｉｔカタログ番号ＭＰＹ８０２００；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、すべての酵母菌株からゲノムＤＮＡを単離した。このプロトコルは、６５℃での非酵素的細胞溶解、続いて、沈殿によるタンパク質の除去、そして核酸沈殿および再懸濁を含む。５μＬの１０×緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４および５００ｍＭ ＫＣｌ）、可変量のＭｇＣｌ２、２．５μＭ ｄＮＴＰ、５０ｎｇのテンプレート、５０ｐｍｏｌの適正なプライマーおよび２．５単位のＴａｑまたはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼいずれかを含有する５０μＬの最終量でＰＣＲ増幅を行った。用いたサイクリング条件は、次のとおりであった。９４℃で１０分間の変性、続いて、ホットスタート、そして３０サイクルの９４℃で４５秒間、適するアニーリング温度で４５秒間、および７２℃でｋｂあたり１分間の伸長、続いて、７２℃で１０分の伸長。ゲルから回収したＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ産物またはフラグメント）を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。ＤＮＡ塩基配列決定は、ＶＩＢ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ベルギーのアントワープ）によって行われた。
ベクター構築
（ｉ）ＡＬＧ３遺伝子のノックアウト（遺伝子置換）。ＡＬＧ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＸＭ＿５０３４８８、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ：ＹＡＬＩ０Ｅ０３１９０ｇ）のプロモーターフラグメント（Ｐ）を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）を使用し、
をフォワードおよびリバースプライマーとしてそれぞれ用いるＰＣＲによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０株のゲノムＤＮＡから増幅した。オーバーハンギングＡヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（カナダ、オントリオのＦｅｒｍｅｎｔａｓ）で除去した。そのＡＬＧ３遺伝子のターミネーターフラグメント（Ｔ）を、プルーフリーディングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用し、
をフォワードおよびリバースプライマーとしてそれぞれ用いるＰＣＲによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０株のゲノムＤＮＡから増幅した。ＩＳｃｅＩ制限部位を含有するプライマー配列のオーバーラップのため、Ｐ−フォワードプライマーおよびＴ−リバースプライマーでのＰＣＲによって両方のフラグメントを連結させることができた。その後、これらのコ・アプリコンをｐＣＲ−２．１ ＴＯＰＯ ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター内にサブクローニングし、そのコ・アンプリコン配列の正しさを塩基配列決定によって確認した。その後、ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ部位を用いてそのコ・アンプリコンを中間ベクターにクローニングした。
（ｉｉ）ＡＬＧ６遺伝子の過剰発現。ＡＬＧ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５０２９２２、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ：ＹＡＬＩ０Ｄ１７０２８ｇ）のターミネーター（４１５ｂｐ下流）と共にＡＬＧ６ ＯＲＦ（１７２５ｂｐ）を、プルーフリーディングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用し、
をフォワードおよびリバースプライマーとしてそれぞれ用いるＰＣＲによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０株のゲノムＤＮＡからクローニングした。その配列をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そのＡＬＧ６ ＯＲＦ配列の正しさを塩基配列決定によって確認した（上記のとおり）。次に、ｈｐ４ｄプロモーターを含有するベクター（ｐＹＬＨｍＡ）内にＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩによってそのＡＬＧ６ ＯＲＦをクローニングし、その後、ＡＬＧ３のターミネーターフラグメント中に存在する固有制限部位ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって中間ベクター内にクローニングした。
（ｉｉｉ）選択マーカーカセット。宿主ゲノムＤＮＡから選択可能マーカーＵＲＡ３を除去するために、例えば、Ｆｉｃｋｅｒｓらによって記載されたような（（２００３）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５５（３）：７２７−７３７、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用されている）、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用した。プラスミドｐＲＲＱ２（ｈｐ４ｄ−ｃｒｅ、ＬＥＵ２）（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ（ＩＮＲＡ）からの寄贈品）からのＣｒｅリコンビナーゼの発現の際に、前記マーカーは、２つのｌｏｘ部位間での組換えによって切除される。ＡＬＧ６過剰発現カセットを伴うおよび伴わない、両方の構築物において、ｌｏｘ部位に隣接するＵＲＡ３選択マーカーを、そのベクターのＰフラグメントとＴフラグメントの間に導入されたＩ−ＳｃｅＩ部位に挿入し、その結果、「ＰＵＴ」構築物を得た。
マンノプロテインの調製。２８℃のインキュベータ内で２５０ｒｐｍで回転する５０ｍＬファルコンチューブの中の１０ｍＬの標準ＹＰＤ培地において一晩、酵母菌株を増殖させた。その後、それらの細胞を４℃で４０００ｒｐｍでの遠心によってペレット化した。上清を除去し、それらの細胞を、先ず、２ｍＬの０．９％ ＮａＣｌ溶液で洗浄し、その後、２ｍＬの水で２回洗浄し、その後、微小遠心管内の１．５ｍＬの０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）に再懸濁させた。９０分間、１２１℃のオートクレーブで処理した後、それらの管をボルテックスにかけ、細胞破壊片を遠心によってペレット化した。上清を回収し、４℃の４容量のメタノールを用いて一晩、回転運動させながらマンノプロテインを沈殿させた。その後、そのアルコールで沈殿させた材料を遠心することによって沈殿物を得た。そのペレットを乾燥させ、５０μＬの水に溶解した。
糖分析。Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔら（２００１；上記）が記載したようにＡＢＩ３１３０ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡシーケンサ援用（ＤＳＡ）、蛍光体援用炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）を行った。簡単に言うと、１時間、５０℃のＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）および３．２Ｍ ＥＤＴＡ）中で糖タンパク質を変性させ、その後、１５μＬ ＲＣＭを含有するＩＰプレートの事前湿潤ＰＶＤＦ膜に固定化する。その膜の事前湿潤を３００μＬのＭｅＯＨで行い、３００μＬの水および５０μＬのＲＣＭで３回洗浄し、その後、真空除去した。それらの糖タンパク質を１時間、５０μＬの０．１Ｍジチオトレイトールで還元し、３００μＬの水で３回洗浄した。５０μＬの０．１Ｍヨード酢酸との暗所での３０分のインキュベーションを用いてそのＳＨ基をカルボキシメチル化し、３００μＬの水で３回洗浄した。その後、それらのプレートを１００μＬの１％ポリビニルピロリドン３６０と共に１時間インキュベートして、その膜上の占有されていない結合部位を飽和し、その後、再び３００μＬの水で３回洗浄した。次に、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．３）中のペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）ｘ Ｕでの３時間の処理によってＮ−グリカンを遊離させた。Ｎ−グリカンを回復し、蛍光体８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）を用いて還元アミノ化によって誘導体化した。これは、１．２Ｍクエン酸中の２０ｍＭのＡＰＴＳとＤＭＳＯ中の１ＭのＮａＣＮＢＨ３の１：１混合物１μＬとの３７℃での一晩（ＯＮ）のインキュベーションおよび４μＬの水の添加によるクエンチで達成した。過剰な標識をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０樹脂でのサイズ分画によって除去した。その後、残存する標識Ｎ−グリカンを蒸発によって濃縮した。ＲＮＡｓｅ ＢのＮ−グリカンおよびオリゴマルトースラダーをサイズマーカーとして含めた。Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータ分析を行った。標識された糖に対するグリコシダーゼ消化をＯＮ、３７℃で１００ｍＭ ＮＨ４ＡＣ（ｐＨ５）中で行った。追加のタチナタマメ（ＪＢ）マンノシダーゼをＯＮ消化後に添加し、さらに２４時間、３７℃で放置した。
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＡＬＧ３遺伝子の破壊
ＡＬＧ３遺伝子を破壊するために、ＡＬＧ３のプロモーターおよびターミネーターの部分を含み、且つ、ＵＲＡ３選択マーカーカセットを有するベクターを生成し、それをｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴと呼んだ。ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ部位を組込んで、そのベクターを線形化し、それによってＥ．ｃｏｌｉ関連ＤＮＡエレメントを除去した。プロモーターおよびターミネーター部位での二重相同組換えを用いて、ＡＬＧ３をＵＲＡ３選択可能マーカーで置換し、その結果、ａｌｇ３：：ＵＲＡ３突然変異株を得た。利用したノックアウト戦略は、Ｆｉｃｋｅｒｓら（２００３；上記）によって記載されており、効率的なマーカーレスキューを助長するＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用する。ゲノムＡＬＧ３コンティーグにおける組込みの際に、Ａｌｇ３ｐのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を失うはずである。これを、幾つかの形質転換体のマンノプロテインのグリコシル化パターンを分析することによって、モニターした。マンノプロテインから得たＮ−グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥ（キャピラリー電気泳動）によって分析し、エキソグリコシダーゼの選択で処理して、それらの構造を明らかにした。２４のうちの７つの形質転換体がグリコシル化プロフィールの変化を生じた（それらのうちの３つを図１３に示す）。７つすべての形質転換体において、ゲノムへのノックアウトカセットの正しい組み込みをＰＣＲによって確認することができた。それらのプロフィールを分析することによって、３つの主グリカン構造を見つけた：（ｉ）ＲＮＡｓｅ ＢのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造（これは、構造式ＩＶである；図４）と同じサイズで生じるもの（構造式ＶＩＩ；図４）；（ｉｉ）１グルコース単位余分の距離にあるもの；および（ｉｉｉ）２グルコース単位余分の距離にあるもの（図１３）。これらの結果は、ＡＬＧ３がこれらの細胞において破壊されたことを示す。
α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＡｌｇ６ｐの過剰発現
第一のグルコシルトランスフェラーゼ、すなわちＡｌｇ６ｐ、についての構成的活性過剰発現カセットをａｌｇ３遺伝子置換ベクターに組み込む戦略を開発した。このベクターをｐＹＬａｌｇ３ＰＵＴ−ＡＬＧ６と呼んだ。このベクターのＮｏｔＩ／ＰａｃＩフラグメントをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０株に形質転換した。このようにして、ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でＡＬＧ３の破壊およびＡＬＧ６の過剰発現が達成される。ゲノムへの正しい組み込みを再びＰＣＲによって確認した。マンノプロテインから得たＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析は、形質転換体の半分、すなわち２４のうち１２、がＷＴ株と比較すると、グリコシル化パターンの変化を示した。ＡＬＧ６の過剰発現が軽度のクローン的変動をもたらした（図１３）。
Ｎ−グリカン構造の同定
上で説明した実験からのグリカン構造の性質をさらに解明するために、マンノプロテインから得たグリカンのインビトロ消化（上記のとおり）を、エキソグリコシダーゼの選択で行った。次の酵素を用いてマンノプロテイングリカンを分析した：α−１，２−マンノシダーゼ；α−マンノシダーゼ（ＪＢ）およびグルコシダーゼＩＩ。観察された３つのグリカン構造は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩ；図４）、ＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩＩ；図４）およびＧｌｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＸ；図４）であった（図１４）。これらの結果は、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｏｃｈ１ｐ）による高マンノース伸長が殆どまたは全くないことを示している。
ＡＬＧ６過剰発現がＮ−グリコシル化部位占有を促進するために必要であるかどうかを決定するために、３つの異なるＹａｒｒｏｗｉａ株：ＭＴＬＹ６０、ＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３およびＭＴＬＹ６０Δａｌｇ３ＡＬＧ６において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のリパーゼ２（ＬＩＰ２）を発現させた。ＴＥＦ構成的プロモーターの制御下にあるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２のための構築物をＩＮＲＡから得た。その発現カセットを上述の株に形質転換し、そのタンパク質の発現を、それらの形質転換細胞から調製した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付すことによって検証した（図２８）。Ｌｉｐ２ｐタンパク質は、２つのグリコシル化部位を有する。ａｌｇ３欠損（「ノックアウト」）酵母菌株から得たＬｉｐ２ｐタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３つの異なるバンドに分離し、そのゲルのクマシーブルー染色を用いてそれらを視覚化した（図２８）。そのゲル中の３つすべての形態のタンパク質が、異なるグリコシル化形態のＬｉｐ２ｐタンパク質であることを確認するために、ａｌｇ３欠損（「ノックアウト」）酵母菌株から得たＬｉｐ２ｐをＰＮＧａｓｅＦ（糖タンパク質からオリゴ糖残基を除去する酵素）での処理に付し、その後、上に記載したとおりＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。ＰＮＧａｓｅ ＦでのＬｉｐ２ｐタンパク質の処理は、クマシーブルー染色後にそのゲル上に単一のバンド（これは、非グリコシル化Ｌｉｐ２ｐと同じ分子量を有した）を生じさせる結果となり、前に観察された３つすべてのタンパク質が異なるグリコシル化形態の同じＬｉｐ２ｐ分子であることを示した。これは、ａｌｇ３ＡＬＧ６株から得たＬｉｐ２ｐについてもあてはまる。しかし、還元グリコシル化形態のタンパク質の量は、減少される。従って、ＡＬＧ６の過剰発現はＮ−グリコシル化部位占有を（少なくとも一部は）回復させることができ、これがａｌｇ３ノックアウト突然変異酵母菌株では減少されると結論付けることができる。
キャッピンググルコース構造の除去
次に、モノ−グリコシル化（構造式ＶＩＩＩ；図４）およびビ−グリコシル化（構造式ＩＸ；図４）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩ；図４）構造をインビボで除去するために、酵素グルコシダーゼＩＩのα−サブユニットを過剰発現するように細胞を遺伝子操作した。ＹａｒｒｏｗｉａのグルコシダーゼＩＩのαサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＸＭ＿５００５７４）およびグルコシダーゼＩＩＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのαサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＡＪ８６５３３３）を２つの戦略として独立してクローニングして、そのタンパク質を過剰発現させた。グルコシダーゼＩＩＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのαサブユニットを選択した。その天然基質がＧｌｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩＩ；図４）であるからである。両方の遺伝子を構成的ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローニングした。それらのプラスミドは、ＵＲＡ３マーカーを含有する。これらの構築物を、ａｌｇ３突然変異酵母菌株（ＡＬＧ６過剰発現を伴うものと伴わないものの両方）に形質転換した。
これらの構築物を含有する培養細胞から得た分泌タンパク質からオリゴ糖を調製し、それらのオリゴ糖のプロフィールをＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析によって決定した。すべての形質転換体から同じＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィールが得られた。それぞれのグルコシダーゼＩＩαの２つの異なるクローンを図２９に示す。これらの結果から、Ｙａｒｒｏｗｉａまたはトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）グルコシダーゼＩＩ αサブユニットのいずれの過剰発現も、モノ−グリコシル化（構造式ＶＩＩＩ；図４）およびビ−グリコシル化（構造式ＩＸ；図４）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＶＩＩ；図４）構造の量に対して小さな影響しか及ぼさないと結論付けた。
ＨＤＥＬ配列でタグ付けしたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉのグルコシダーゼＩＩ α−サブユニットの発現
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からのグルコース残基のインビボでの除去に対するＹａｒｒｏｗｉａまたはトリパノソーマグルコシダーゼＩＩ αサブユニットの発現の効果を改善するために、分子生物学技術を用いて、ＨＤＥＬタグをコードする核酸を、２つのＧｌｓＩＩ α酵素のそれぞれをコードする核酸の３’末端にインフレームで付加させた。このＨＤＥＬタグは、ゴルジからＥＲへの取り戻しメカニズムとして役立てるつもりであった。ｈｐ４ｄプロモーターの制御下にある、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙ．ｌ．）とＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｔ．ｂ．）両方からのＨＤＥＬタグ付きグルコシダーゼＩＩ配列をコードするプラスミドを、ＡＬＧ６遺伝子の過剰発現を伴うおよび伴わないａｌｇ３ ＫＯ株に形質転換した。図３０においてわかるように、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａグルコシダーゼＩＩ αサブユニットの過剰発現は、グルコシル化構造の量に対して小さな影響しか及ぼさなかった。対照的に、余分なＨＤＥＬタグを有するＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉαサブユニットのα−グルコシダーゼＩＩの過剰発現は、モノ−グルコースピークを縮小させることとなった（図３１参照）。
ムタナーゼでのグリコシル化グリカンの処理
上で説明した結果は、モノ−グリコシル化形態のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を減少させる１つの具体例としての手段を明示している。糖タンパク質からのビ−グリコシル化形態のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を減少させるために、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼを１つの可能性の有る解決策として調査した。酵素調製物をＮｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２３４；デンマークのＢａｇｓｖａｅｒｄ）から得、インビトロでオリゴ糖を消化するために使用した。すなわち、ａｌｇ３ＡＬＧ６株から得たオリゴ糖（グリカン：Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ 、ＧｌｃＭａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ 、およびＧｌｃ ２ Ｍａｎ ５ ＧｌｃＮＡｃ ２ ）に、異なる濃度でムタナーゼを添加した。図３２のＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィールに示されているように、オリゴ糖において観察されるビ−グルコースピークが効果的に縮小された。
次に、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍのムタナーゼをインビボで過剰発現させた。ＨＤＥＬ−配列を含有するムタナーゼを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして合成した。その成熟タンパク質を、ＴＥＦ１プロモーターの制御下でＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列と共にインフレームでクローニングした（図３３）。この構築物をａｌｇ３突然変異酵母菌株（ＡＬＧ６過剰発現を伴うものと伴わないものの両方）に形質転換する。その構築物を含有する培養細胞からオリゴ糖を調製し、それらのオリゴ糖のプロフィールをＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析によって決定する。このＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィールは、それらのオリゴ糖において観察されるビ−グルコースピークの縮小を示すであろうと予想される。これらの結果から、ムタナーゼのインビボでの過剰発現は、そのムタナーゼを過剰発現していない細胞と比較して、オリゴ糖において観察されるビ−グルコースピークを縮小させることに対して有効であると結論付けられるだろう。
Ｙｌ ＧｌｓＩＩ α−およびβサブユニットの共発現
グルコシダーゼＩＩのα−およびβ−サブユニットがヘテロダイマー複合体を形成し、その結果、そのβ−サブユニットが、その複合体のＥＲへの取り戻しに責任を負い、基質認識にも関与し、これに対してそのα−サブユニットが触媒活性を含有することは公知である。グルコシダーゼＩＩのα−サブユニットだけの過剰発現は、ビ−グルコースオリゴ糖構造に対して及す影響が小さかったので、α−およびβ−サブユニットを共発現させた。
ＰＣＲを用いて、ＭＴＬＹ６０株から単離したゲノムＤＮＡからβ−サブユニットのオープンリーディングフレーム（ＹＡＬＩ０Ｂ０３６５２ｇ）を増幅させ、ＴＥＦ１およびｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローニングした。選択マーカーとしてＬＥＵ２を有し、且つ、ＴＥＦ１およびｈｐ４ｄプロモーターの制御下にあるグルコシダーゼＩＩ β−サブユニットを有する構築物を作製した。これらを、ＡＬＧ６過剰発現を伴うおよび伴わないａｌｇ３ノックアウト株に形質転換し、ＨＤＥＬ配列タグを有するおよび有さないＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａグルコシダーゼＩＩαサブユニットを過剰発現させた。それらの細胞から分泌されたタンパク質からＮ−グリカンを調製した。それらのＮ−グリカンのＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィールを図３３および３４に示す（ａｌｇ３ノックアウトとＡＬＧ６の過剰発現）。これらのプロフィールから、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからのグルコシダーゼＩＩのβサブユニットの過剰発現は、グリコシル化糖のトリミングに対してポジティブな影響を及ぼしたと結論付けることができる。一般に、グルコシダーゼＩＩのβサブユニットの効力は、ＴＥＦ１プロモーターのもとで発現されたときに改善された。それらのグリコシル化構造は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａグルコシダーゼＩＩαサブユニットがＨＤＥＬタグを含有するとき、さらにいっそう減少された（図３３および３４）。
ＡＬＧ６過剰発現を伴わないａｌｇ３欠損細胞については、グルコシル化構造の減少に関して類似した結果が異なる細胞集団それぞれについて観察された（図３５）。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＧｌｓＩＩ ａおよびｂサブユニットの発現
ａｌｇ３欠損バックグランドにおいて発生するグルコース保有構造からグルコース残基を除去するために、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ成熟（シグナルペプチド欠失）グルコシダーゼＩＩ αおよびβを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして合成した（α−サブユニット（配列番号７；図３６Ａ−３６Ｂ）β−サブユニット：（配列番号８；図３７））。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（Ａｎ）グルコシダーゼαサブユニットを構成的ＴＥＦ１およびｈｐ４ｄプロモーターの制御下でクローニングし、これは、選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を有した。それらの発現カセット（ＴＥＦ１およびｈｐ４ｄの制御下のＯＲＦ）をＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ａｌｇ３ＡＬＧ６株に形質転換した。形質転換体候補をＹＰＤにおいて増殖させ、分泌されたタンパク質からのグリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥによって分析した。２つのグルコシル化構造が形質転換株では非形質転換体（ａｌｇ３ＡＬＧ６）と比較してあまり豊富でないことを図３８から推定することができる。
グリコシル化グリカン構造をさらに減少させるために、ＴＥＦ１プロモーターまたはｈｐ４ｄプロモーターの制御下にあるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコシダーゼＩＩのベータサブユニットと選択マーカーとしてのＬＥＵ２を有する構築物を作製する。この構築物を、ＡｎグルコシダーゼＩＩ α−サブユニットを発現するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ａｌｇ３ＡＬＧ６株に形質転換する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコシダーゼＩＩのβ−サブユニットの発現は、そのＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるグルコシル化構造を減少させる結果になると予想される。
（実施例６）ＨＡＣ１イントロンの同定ならびにＨＡＣ１遺伝子のクローニングおよび単離
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＡＣ１スプライス部位。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＨＡＣ１のイントロン領域と真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｓｅｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓにおけるＨＡＣ１のイントロン領域の間の配列相同性に基づいて、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＡＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＸＭ＿５００８１１、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ：Ｙａｌｉ０Ｂ１２７１６ｇ）の可能性の有るスプライス部位を同定した。その５’および３’スプライス部位は、特徴的なループ構造内に局在すると予測され、そのイントロンは２９ｂｐ長であると算出された。
そのスプライス部位の周囲でプライマーを開発して、イントロンを同定した。遺伝子特異的プライマーを用いて、ＵＰＲ（小胞体ストレス反応）誘導（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）中での増殖による）および非誘導培養物（陰性対照）からの単離されたｍＲＮＡから、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、プライマーＨＡＣ１ＦＷ０６−００３およびＨＡＣ１Ｒｖ０６−００１を使用して、その第一鎖に関するＰＣＲを行った。増幅産物を１．５％アガロースゲルで分析した。
非誘導細胞については＋／−４００ｂｐのフラグメントが増幅されると予想され；誘導細胞については２９ｂｐ小さいフラグメントが増幅されると予想された。非誘導細胞およびＵＰＲ誘導細胞から、適正なサイズのフラグメントを得た。ＵＰＲ誘導培養物については、２つ以上の増幅産物が得られた。中間のフラグメントは非誘導培地について得られたバンドと同じサイズであり、これをスプライスされていないＨＡＣ１であると解釈した。より下位の、最も顕著なバンドをそのゲルから精製し、シーケンスベクターにクローニングした。その構築物の塩基配列を決定した後、配列アラインメントを行ってスプライス部位を同定した（図１５）。その配列アラインメントから、スプライス部位が、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＨＡＣ１配列と真菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＨＡＣ１配列の比較から予測された位置にあることがわかる。このスプライス部位は２９ｂｐ長である。
その活性完全長ＨＡＣ１配列を単離するために、発現ベクターへのクローニングに適する制限部位を有するようにプライマーを操作した。プライマー配列は、次のとおりであった：Ｈａｃ１ｙｌＲｖ０７−０１８：
１０ｍＬ培養物の酵母細胞を５ｍＭのＤＴＴの存在下で１．５時間インキュベートして、ＵＰＲ反応を誘発した。インキュベーション後、ＲＮＡをそのＤＴＴ処理細胞から単離し、その単離されたＲＮＡから逆転写酵素を用いて第一鎖ｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、上記プライマーを使用してＰＣＲを行った。そのスプライスされたＨＡＣ１を含有するＰＣＲ増幅配列を、標準的な分子生物学技術を用いてｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯクローングベクターに挿入し、塩基配列を決定した。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＡＣ１スプライス部位。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＡＣ１遺伝子のイントロン領域の配列相同性に基づき、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＡＣ１遺伝子における可能性の有るスプライス部位を同定した（図１６）。その５’および３’スプライス部位は、特徴的なループ構造内に局在すると予測され、そのイントロンは３２２ｂｐの長さであると算出された。
その予測スプライス部位の周囲でプライマー（ＨＡＣ１Ｆｗ０６−００４およびＨＡＣ１Ｒｖ０６−００５）を開発して、イントロンを同定した（表４参照）。そのイントロンを除去すると２５７ヌクレオチドのフラグメントが増幅されると予想され、イントロンが依然として存在すると５７９ｂｐフラグメントが増幅されると予測された。ＵＰＲ誘導および非誘導培養物からの単離されたｍＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。このＵＰＲは、指数増殖細胞の１０ｍＬ培養物に５ｍＭのＤＴＴを添加することによって誘導した。それらの細胞をＤＴＴの存在下で１．５時間培養した。その増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分析した。およそ２５７ｂｐのフラグメントを非誘導細胞と誘導細胞の両方からのｃＤＮＡから得た。
スプライスされていないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＡＣ１遺伝子の長さを検証するために、プライマーＨＡＣ１−ＫａｒｌおよびＨＡＣ１Ｒｖ０６−００５を使用してゲノムＤＮＡでのＰＣＲを行った。得られたフラグメントの長さを、誘導細胞培養物からのｃＤＮＡから得たＰＣＲ産物の長さと比較した。そのゲノムＤＮＡからの増幅フラグメントは、同じプライマーを使用してそのｃＤＮＡから得たアンプリコンより約３００ｂｐ長く、これは、そのイントロンがゲノムＤＮＡ配列中に存在し、スプライスされたｍＲＮＡが不在であることを示す。
２５７ｂｐのｃＤＮＡフラグメントをそのゲルから単離し、シーケンシングベクター内にクローニングした。そのフラグメントの塩基配列を決定し、アラインメントを行ってスプライス部位を同定した（図１７）。スプライスされたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＨＡＣ１遺伝子を単離しクローニングするために、発現ベクターへのクローニングのための制限酵素部位を伴うＰＣＲプライマーを開発した（ＨＡＣ１−ＫａｒｌおよびＨＡＣ１Ｒｖ０６−００９）。５ｍＭのＤＴＴで１．５時間、１０ｍＬの培養物をＵＰＲ誘導した。単離されたＲＮＡから逆転写酵素を使用して第一鎖ｃＤＮＡを調製し、その後、上記プライマーを使用してそのｃＤＮＡテンプレートＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。スプライスされたＨＡＣ１を単離し、塩基配列決定のためにｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯクローニングベクター内にクローニングした。スプライスされた遺伝子もメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下で発現ベクターｐＢＬＨＩＳ ＩＸ内にクローニングして、ベクターｐＢＬＨＩＳ ＩＸ ｐｐＨＡＣ１スプライス型を得た。そのＨＡＣ１遺伝子の発現ベクターへの正しい挿入を、ＰＣＲおよび制限酵素分析を用いて確認した。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、スプライシングにより、スプライスされていないｍＲＮＡ内のＣ末端の１０アミノ酸のコーディング配列が、１８アミノ酸のコーディング配列で置換される。一致して、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓでは、スプライシングにより、スプライスされていないＨＡＣ１内のＣ末端の４５アミノ酸のコーディング配列もまた１８アミノ酸のコーディング配列（これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列からのものと相同である）によって置換されることを明らかにした（図１８）。
（実施例７）スプライスされたＨＡＣ１遺伝子のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの形質転換および誘導
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞（ＭＴＬＹ６０株）を、ｈｐ４ｄプロモーターの発現制御下にあるスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡと選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子とを含有するベクター「ＰＹＨＭＡＸＨＡＣ１ｙｌスプライス型」（上記）を用いて形質転換した。酵母ゲノムへのこのベクターの組み込みをＰＣＲを用いて検証した。そのＰＹＨＭＡＸＨＡＣ１ｙｌスプライス型で形質転換されたＭＴＬＹ６０株をＹＰＧ中の２ｍＬの培養物で、２８℃で２４時間増殖させた。それらの培養細胞をＹＮＢで２回洗浄し、ＯＤ６００ ０．６に希釈し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）で緩衝したＹＴＧ中で２４時間増殖させた。その後、それらの細胞をＯＤ６００ ０．２に希釈し、さらに３世代増殖させて、中間指数期でそれらの細胞を回収した。そのペレットに、１ｍＬのＲＮＡｐｕｒｅ（商標）溶液を１ｇのガラスビーズと共にそれらの細胞に添加した。激しく振盪することによって細胞を破壊した。１５０μＬのクロロホルムの添加によってそれらの破壊細胞からＲＮＡを抽出し、イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させた。抽出されたＲＮＡをＤＮＡｓｅででも処理して、一切の共沈ＤＮＡ不純物を除去した。
ｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（カリフォルニア州、ハーキュリーズのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、２０μＬ総容量反応で８００ｎｇのＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを調製した。２０ｎｇ ＲＮＡ当量を実時間ＰＣＲ分析に用いて、それらの細胞中のＨＡＣ１ ｍＲＮＡの量を決定した。実時間ＰＣＲは、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（蛍光性）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を検出試薬として使用して実行した。それらの細胞中のＨＡＣ１ ｍＲＮＡの量を検出するためのプライマーを設計することに加えて、実時間ＰＣＲのための対照としてＡＣＴ１遺伝子（ハウスホールド遺伝子）およびＫＡＲ２遺伝子（ＵＰＲ反応性遺伝子）の量を定量するためのプライマーも設計した。それらの細胞中のそれぞれの遺伝子のｍＲＮＡの相対量を、発現対照としてＡｃｔｉｎ（ハウスキーピング遺伝子）を使用して比較閾サイクル値から算出した。それらの細胞によるＵＰＲ反応の誘導を、ＵＰＲの発現を測定することによって確認した。ＨＡＣ１ばかりでなくＫＡＲ２の発現レベルは、野生型株ＭＴＬＹ６０と比較して、構成的プロモーターの制御下でＨＡＣ１を発現する株におけるほうが高い（図３９）。
（実施例８）スプライスされたＨＡＣ１遺伝子のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓへの形質転換および誘導
培地：以下の実験のために３タイプの培地を用いた：ＢＭＹ（酵母用緩衝培地：１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ：６．０）／アミノ酸を伴わない１．３４％ ＹＮＢ／１％酵母抽出物／２％ペプトン）；ＢＧＭＹ（酵母用緩衝グリセロール−複合培地：１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ：６．０）／アミノ酸を伴わない１．３４％ ＹＮＢ／１％酵母抽出物／２％ペプトン／１％グリセロール）；およびＢＭＭＹ（酵母用緩衝メタノール−複合培地：１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ：６．０）／アミノ酸を伴わない１．３４％ ＹＮＢ／１％酵母抽出物／２％ペプトン／０．５％グリセロール）。
Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１７１０−０１）からのエレクトロポレーションプロトコルに従って、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換した。ベクターｐＢＬＨＩＳ ＩＸ ｐｐＨＡＣ１スプライス型をＨＩＳ４遺伝子内で線形化して、その構築物を組み込みのためのＨＩＳ４遺伝子座にターゲッティングした。１０マイクログラムのＤＮＡを酵母細胞に形質転換した。その構築物の正しい組み込みを、単一コロニーの単離後のゲノムＤＮＡでのＰＣＲ（プライマーＨＡＣ１−ＫａｒｌおよびＨＡＣ１Ｒｖ０６−００５）を用いて検証した。形質転換細胞から得たＤＮＡから９１５ｋｂおよび１２３７ｋｂのフラグメントが増幅され、これに対して非形質転換体（その構築物が組み込まれていない細胞）では１２３７ｋｂのフラグメントが増幅された。プラスミドの組み込みについて陽性であると同定されたクローンを誘導前に２４時間、１０ｍＬのＢＭＧＹ培地中で増殖させた。細胞をＢＭＹで１回洗浄した。誘導培養物にＢＭＹを添加した一方で、非誘導培養物にはＢＭＧＹを添加した。１２時間ごとに、誘導培養物に０．５％メタノール（最終濃度）を供給した。２４時間、誘導を行い、その後、細胞を遠心によって回収した。ＲＮＡを調製するために、細胞を１ｍＬのＲＮＡｐｕｒｅ（商標）（ニューヨーク州、ナッシュビルのＧｅｎｈａｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および１ｇのガラスビーズと併せ、激しく振盪させることによって溶解した。１５０μＬのクロロホルムの添加によってＲＮＡを抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。抽出し、沈殿させたＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから入手したＲＮＡｓｅ不含ＤＮＡｓｅ（Ｃａｔ Ｎｏ．７９２５４）でＤＮＡｓｅ処理した。４００ｎｇの全ＲＮＡを、ｏｌｉｇｏｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０６４−０１４）を使用する逆転写酵素反応に付した。２０ｎｇ ＲＮＡ当量を実時間ＰＣＲ反応に用いた。プライマー配列は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって設計した（配列についてはプライマー表を参照のこと）。ＳＹＢＲグリーン蛍光試薬（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を利用する実時間ＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄからのｉＣｙｃｌｅｒマシーンで実行した。ハウスキーピング遺伝子アクチンを対照として用いて比較閾サイクル値からｍＲＮＡの相対量を算出した。ＵＰＲの定量は、ＵＰＲ−ターゲット遺伝子ＫＡＲ２の発現分析によって行う。メタノールで誘導した同じクローンと比較して誘導しなかったクローンを比較すると、ＫＡＲ２の３から７倍高い発現が達成された（図１９）。
２つの追加のクローン６およびクローン８からのＨＡＣ１ ｍＲＮＡの相対量を定量的ＰＣＲによって決定し、Ｋａｒ２のｍＲＮＡの相対量と比較した。ＨＡＣ１の強い誘導が両方のクローンにおいて観察された。ＫＡＲ２ ｍＲＮＡの相対量は、ＨＡＣ１ ｍＲＮＡの相対量と相関するようであった。ＨＡＣ１の発現レベルが高いほど高いＫＡＲ２の発現量がもたらされる（図２０）。
蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）を用いてメタノール誘導培養物の細胞死の調査を行い、非誘導細胞の細胞死と比較した。分析１回につき１万個の細胞を測定した。１２、３６および４８時間の誘導後に、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞を分析した。細胞死は観察されなかった。ＧｌｙｃｏＳｗｉｔｃｈＭ５（ＧＳＭ５）株は、主コアタイプグリカン構造として主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造式ＩＶ；図４）を有する。Ｈａｃ１ｐ誘導がＮ−グリカン構造に対して影響を及ぼすかどうかを確認するために、１ｍＬの培養基のＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を行った。スプライスされたＨａｃ１ｐの４８時間の誘導後に得られるグリカンプロフィールは、親ＧＳＭ５株のプロフィールに類似している。
Ｈａｃ１ｐの誘導がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの増殖を損なわせるかどうかを確認するために増殖曲線を作成した。空ベクター形質転換株と比較してＨａｃ１ｐ誘導株の増殖欠陥は見られなかった（図２２）。
（実施例９）ＹｌＭＮＮ６の発現
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＭＮＮ６は、ホスホマンノース残基をＮ−グリカンに転移させる。従って、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるＹｌＭＮＮ６の過剰発現は、リン酸化増加をもたらすことができる。さらに、ＹｌＭＮＮ４およびＹｌＭＮＮ６の過剰発現によって、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのリン酸化に対する追加効果を得ることができる。ＹｌＭＮＮ６コーディング領域（Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＸＭ＿４９９８１１、Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ Ｒｅｆ：ＹＡＬＩ０Ａ０６５８９ｇ）を、ＰＣＲプライマー
を使用してそのゲノムからＰＣＲ増幅し、ｈｐ４ｄプロモーターの制御下での発現のためにｐＹＨｍＡＸ発現ベクター内にクローニングした（図２１）。ランダム組込みを向上させるためにゼータ配列を使用してそのプラスミドをＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０に形質転換させた。ウラシルを伴わない培地で増殖させた細胞クローンから分泌された糖タンパク質を回収し、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて、それらの糖タンパク質を合成したグリカンの組成を分析した。しかし、リン酸化増加は観察されなかった（図２２）。
（実施例１０）Ｈａｃ１ｐ発現の影響
異種タンパク質の分泌に対するＨａｃ１ｐ過剰発現の評価
ヒグロマイシン耐性マーカーと、誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡとを含有するベクター（ｐＰＩＣｈｙｇｐｐＨＡＣ１スプライス型）またはヒグロマイシン耐性マーカーと、構成的ＧＡＰプロモーターの制御下にあるスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡとを含有するベクター（ｐＧＡＰｈｙｇＨＡＣ１ｐｐスプライス型）を、誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下でｍＩＬ−１０タンパク質を発現するＧＳ１１５株に形質転換した。Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１７１０−０１、カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのエレクトロポレーションプロトコルに従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換した。それらのベクターを前記ＡＯＸ１またはＧＡＰプロモーター内で線形化して、Ｈａｃ１ｐ遺伝子の組み込みをそれぞれそのＡＯＸ１またはＧＡＰ遺伝子座にターゲッティングした。そのプラスミドの宿主ゲノムへの組み込みをＰＣＲを用いて確認した。
陽性同定クローンからの前培養物（５ｍＬ）を２４時間、ＹＰＤ中で増殖させた。それらの培養物中の細胞の６００ｎｍの波長での濃度（ＯＤ）（ＯＤ６００）を測定し、培養物を、２４ウエルプレートのそれぞれのウエルの２ｍＬのＢＭＧＹ培地中、１のＯＤ６００に希釈した。４８時間、ＢＭＧＹ中で培養物を増殖させ、ＢＭＹで２回洗浄し、その後、ＢＭＭＹ中で２４時間誘導した。８から１２時間ごとに、１％メタノール（最終濃度）を含有する培地を培養物に再供給した。誘導後、細胞の上清を回収し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を使用して、１ｍＬの上清からタンパク質を沈殿させた。その沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
そのＳＤＳ−ＰＡＧＥから、少なくとも１つのタンパク質−ｍＩＬ−１０−の発現に関するクローン的変動を異なるクローン間で観察した。例えば、Ｈａｃ１ｐタンパク質を（ＧＡＰプロモーターの制御下で）構成的に発現するクローンについては、発現レベルの改善が観察されず、これに対してＨａｃ１ｐを誘導（ＡＯＸ１プロモーター）により発現するクローンについては、より高いｍＩＬ−１０タンパク質発現レベルを示す２つのクローンを同定することができた（図４０および図４１）。それらのクローンのそれぞれによるｍＩＬ−１０の発現を、参照ＧＳ１１５ ｍＩＬ−１０発現株が生じさせるｍＩＬ−１０の発現と比較した。
これらのクローンについて新たな誘導を行った。２４時間増殖させた前培養物をバッフル付きフラスコ内で２０ｍＬ ＢＭＧＹ中、ＯＤ １に希釈した。細胞をＢＭＧＹ中で４８時間増殖させ、２回洗浄し、その後、ＢＭＭＹで誘導した。１％メタノールを含有する培地を８〜１２時間ごとに培養物に再供給した。誘導後、細胞の上清を回収し、ＴＣＡを使用して１ｍＬの上清からタンパク質を沈殿させた。その沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す前に、すべてのグリコシル化を除去する（またはしない）ようにそのタンパク質をＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した（図４１）。Ｈａｃ１ｐ発現株の上清からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質は、７５ｋＤａの顕著なバンドを含んでいた。これは、参照株中には存在しない。このバンドは、質量分析により、最も顕著なＵＰＲターゲット遺伝子であるＫａｒ２ｐであると同定された。サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いて、Ｈａｃ１ｐおよびｍＩＬ−１０タンパク質の同時誘導性発現が、ｍＩＬ−１０タンパク質の２倍高い発現をもたらすことができることを証明することができた（クローン１、図４１）。ＣＢＡは、ｅｎｄｏＨ処理ｍＩＬ−１０タンパク質を用いて行った。
異種タンパク質の表面発現に関するＨａｃ１ｐ過剰発現の評価
ヒグロマイシン耐性マーカーと誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡとを含有するベクター（ｐＰＩＣｈｙｇｐｐＨＡＣ１スプライス型）またはヒグロマイシン耐性マーカーと構成的ＧＡＰプロモーターの制御下にあるスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡとを含有するベクター（ｐＧＡＰｈｙｇＨＡＣ１ｐｐスプライス型）を、成熟ヒトインターフェロン−ベータ／アルファ−アグルチニン融合タンパク質、成熟マウスインターフェロンガンマ／アルファ−アグルチニン融合タンパク質、成熟ヒトエリスロポエチン／アルファ−アグルチニン融合タンパク質、またはアルファ−アグルチニンとマウストロンボモジュリンのレクチン様ドメインとの融合タンパク質（これらのそれぞれが、誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にある）を発現するＧｌｙｃｏｓｗｉｔｃｈＭａｎ５株に形質転換した。Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１７１０−０１）からのエレクトロポレーションプロトコルに従って、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換した。それらのベクターを前記ＡＯＸ１またはＧＡＰプロモーター内で線形化して、組み込みのためにＨａｃ１ｐ遺伝子をそれぞれそのＡＯＸ１またはＧＡＰ遺伝子座にターゲッティングした。そのプラスミドの宿主ゲノムへの組み込みをＰＣＲを用いて確認した。
陽性同定クローンからの前培養物（５ｍＬ）を２４時間、ＹＰＤ中で増殖させた。そのＯＤ６００を測定し、培養物を、２４ウエルプレートのそれぞれのウエル内の２ｍＬのＢＭＧＹ中、１のＯＤ６００に希釈した。２４時間、ＢＭＧＹ中で培養物を増殖させ、脱イオン水で２回洗浄し、その後、ＢＭＭＹ中で２４時間（１％メタノールを含有する培養基を使用して）誘導した。ＶＨＨコーディング配列にＣ末端融合するＶ５−エピトープに特異的な抗体での間接免疫染色によって表面発現を立証した。誘導後、０．１％ウシ血清アルブミンを補足した１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中の１０７個の細胞を１μＬ／ｍＬの抗Ｖ５抗体（１μｇ／μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、１μＬ／ｍＬのＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／μＬ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した後、それらの細胞をフローサイトメトリーによって分析した（表５）。
ＭＦＩ＝フローサイトメトリー分析によって得られた平均蛍光強度
Ｈａｃ１ｐタンパク質を構成的に発現する株については、表面タンパク質のみを発現する参照株と比較して、４つすべてのタンパク質について表面発現レベルの改善をまったく観察することができないか、また、該発現レベルのはるかに小さな差しか観察することができなかった。ヒトインターフェロンベータを発現する細胞において、表面発現レベルの有意な減少が観察された。誘導性Ｈａｃ１ｐを過剰発現する株（表５）については、次のことを観察することができた：１）ヒトインターフェロン−ガンマ表面発現株では、ヒトインターフェロン−ベータａ−アグルチニン融合体のみを発現する参照株と比較して、表面発現レベルが１．８分の１になったことを観察することができ；２）ヒトエリスロポエチンａ−アグルチニン融合タンパク質を表面発現する株については、前記参照株と比較して、表面発現レベルが１．３分の１になったことを観察することができ；３）ヒトインターフェロン−ベータを表面発現する株では、前記参照株と比較して、表面発現の差を観察することができず；および４）マウストロンボモジュリンレクチン様ドメインを表面発現する株では、前記参照株と比較して、表面発現レベルが１．９倍になったことを観察することができた。
リン脂質合成に対するＨａｃ１ｐの過剰発現の影響
（スプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡから生産される）Ｈａｃ１ｐ産物の過剰発現が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける脂質代謝に影響を及ぼすかどうかを決定するために、上で説明したスプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡで細胞を形質転換し、それらの細胞における脂質代謝に対するＨａｃ１ｐの影響を電子顕微鏡分析によって決定した。細胞をＢＭＧＹで４８時間増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＢＭＭＹでさらに４８時間増殖させた。次に、８から１２時間ごとに１％メタノールを含有する培地でそれらの細胞を培養した。その後、Ｂａｈａｒａｅｅｎの方法（Ｂａｈａｒａｅｅｎら（２００４）Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ）による電子顕微鏡検査のためにそれらの細胞を調製した。簡単に言うと、グルタルアルデヒド（３％）とパラ−ホルムアルデヒド（ｐＨ７．２の０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウム中で緩衝された１．５％）とを含有する第一固定液を氷上で２時間、それらの細胞と接触させる。その後、それらの細胞を２０分間、０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウムで３回洗浄した。洗浄後、それらの細胞を６％過マンガン酸カリウム溶液と１時間、室温で接触させ、その後、２０分間、０．０５Ｍのカコジル酸ナトリウムで３回洗浄した。実験結果を図５４に提示する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける（スプライスされたＨＡＣ１ ｃＤＮＡから生産される）Ｈａｃ１ｐ産物の過剰発現は、図５４に示す電子顕微鏡写真（ＥＭ）において見ることができるような離散した積層膜領域の形成をもたらす。これらの結果は、脂質代謝に関与する遺伝子のその転写活性化経由でのＨａｃ１ｐの過剰発現が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける脂質代謝に対して強い影響を確かに及ぼすことを明示している。
（実施例１１）ＭａｎＨＤＥＬの発現
Δｏｃｈ１株によって発現される糖タンパク質に結合するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の場合、α−１，２−マンノシダーゼを発現して、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へと切断することができる（すなわち、ゴルジ型α−１，２−マンノシダーゼ活性）。このマンノシダーゼは、分泌系にターゲッティングされるはずである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｒｅｐｒｏ接合因子に融合しており、ＨＤＥＬ配列でタグ付けされたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号：ＡＦ２１２１５３）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおいてばかりでなくＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてもインビボでＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２をＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へとトリミングすることができる。構成的ｈｐ４ｄプロモーターの制御下でＹ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａにおいてＭＦＭａｎＨＤＥＬ（ＨＤＥＬ配列でタグ付けしたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼに融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅα−接合因子ｐｒｅｐｒｏ）を過剰発現する発現構築物を作製した（図２３）。制限酵素ＮｏｔＩでのプラスミドｐＹＨｍＡＸＭａｎＨＤＥＬの消化、それに続くアガロースゲル電気泳動を用いる所望のフラグメントの単離後、その発現カセットをそれらの細胞に形質転換した。
それらの形質転換細胞からのマンノプロテインから得たグリカンを、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いて分析した。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２のほんの少しの割合しかＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転化されなかった（図２４）。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への不完全な転化は、最適でない分泌シグナルに起因した。従って、そのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ分泌シグナルを、十分に発現されるＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＬＩＰ２から得た分泌シグナル（ＬＩＰ２ｐｒｅ）で置換した。このＬＩＰ２ｐｒｅ配列を、合成オリゴヌクレオチドＬＩＰ２ｐｒｅ ｆｗ ＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣ（配列番号６６）およびＬｉｐ２ｐｒｅｐｒｏ ｒｖ ＧＴＡＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号６７）をハイブリダイズすることによって作製し、そのＤＮＡをｐＹＬＨｍＡベクター（ＢａｍＨＩ／ＡｖｒＩＩ部位）にクローニングして、以下の構築物を得た：ｐＹＬＨＵｄＬ２ｐｒｅ。そのＭａｎＨＤＥＬコーディング配列を、オリゴヌクレオチドＭａｎＨＤＥＬ Ｅｃｏ４７ＩＩＩｆｗ（ＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＣ（配列番号６８））およびＭａｎＨＤＥＬ ＡｖｒＩＩ ｒｖ（ＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号６９））を使用してｐＧＡＰＺＭＦＭａｎＨＤＥＬからＰＣＲ増幅し、ｐＹＬＨＵｄＬ２ｐｒｅ内にクローニングした。この構築戦略を図２５に示す。そのプラスミドのＮｏｔＩでの消化および適正なフラグメントの単離（上記参照）後、（構成的プロモーターｈｐ４ｄの制御下にあるＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬを伴う）その発現カセットをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Δｏｃｈ１株に形質転換した。分泌されたタンパク質から得たグリカンをＤＳＡ ＦＡＣＥによって分析した。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２への多少の転化が発生したが、その反応は不完全であった（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ばかりでなく中間産物Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２も存在した；図２６）。
Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングをさらに改善するために、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼのコドンをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでの発現のために最適化し（配列番号９；図４２）、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列に融合させた。この融合構築物は、４つの異なるプロモーター：（ｉ）ｈｐ４ｄ、（ｉｉ）ＧＡＰ（配列番号１０；図４３）、（ｉｉｉ）ＰＯＸ２、および（ｉｖ）ＴＥＦ１の制御下で発現させた。最終発現プラスミドをｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（配列番号１１；図４４Ａ−Ｃ）ｐＹＬＧＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（配列番号１２；図４５Ａ−）ｐＹＬＰＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（配列番号１３；図４６Ａ−Ｃ）ｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ（配列番号１４；図４７Ａ−Ｃ）と名づけた。ＮｏｔＩでのプラスミドの切断、そしてＭａｎＨＤＥＬ発現カセットを含有するフラグメントの単離後、４つすべてのプラスミドをＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＴＬＹ６０ Δｏｃｈ１株（実施例２に記載）に形質転換した。ｈｐ４ｄ、ＧＡＰおよびＴＥＦプロモーターの制御下にあるＭａｎＨＤＥＬを有する形質転換株（プラスミドｐＹＬＨＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ、ｐＹＬＧＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬおよびｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ）をＹＰＤ中で増殖させた。
形質転換株の分泌タンパク質から得たグリカンをＤＳＡ ＦＡＣＥによって分析した。結果を図４８に提示する。あるいは、形質転換体（ｐＹＬＰＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬプラスミドが組み込まれた形質転換体を含む）を、オレイン酸を含有する培地（タンパク質生産条件）で増殖させ、グリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥによって分析した。ベクターのうちの１つ、ｐＹＬＴＵＸｄＬ２ｐｒｅＭａｎＨＤＥＬ、についてのデータを図４９に提示する。このデータから結論付けることができることとして、４８時間の培養により、ほぼすべてのグリカンがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に転化される。
（実施例１２）ＰＯＸ２プロモーター制御遺伝子発現のための培養条件
新しいプレートの単一コロニーから培養を開始し、２５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内の５０ｍＬ管の中の２８℃の１０ｍＬ ＹＰＤにおいて一晩増殖させた。次に、２２ｍＬの生産培地（２．５ｍＬのオレイン酸エマルジョンを含む）が入っている２５０ｍＬ振盪フラスコにその前培養物を０．２の最終ＯＤ６００で接種した。この培養物を２５０ｒｐｍのオービタルシェーカーの中で２８℃でインキュベートした。その培養物のサンプルを、９６時間培養を通して様々な時点で採取した。
オレイン酸エマルジョン（２０％）は、次のような方法で作製した：
滅菌５０ｍＬベッセルに、
２０ｍＬの滅菌水；
５ｍＬのオレイン酸；および
１２５μＬのＴｗｅｅｎ ４０
を添加する。
７５Ｈｚで１分間、超音波処理を行って、エマルジョンを形成させる。
生産培地は、以下のものから成った：
１％酵母抽出物；
２％トリプトン；
１％グルコース；および
５０ｍＭ ホスフェート ｐＨ６．８。
（実施例１３）ヒトグルコセレブロシダーゼの発現
ヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＬＣＭ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０４０６１）を、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａでの発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして化学合成した（配列番号１５、図５０）。
成熟タンパク質についてのコーディング配列を、ＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列のコーディング配列に融合させた。この融合構築物をオレイン酸誘導性ＰＯＸ２プロモーターの制御下でクローニングした。結果として生じたプラスミドをｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅＧＬＣＭ（＝ｐＲＡＮ２１）と名づけた。形質転換前に、そのプラスミドをＮｏｔＩで消化し、発現カセットを含有するフラグメントを単離し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０、ＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１（上の実施例２に記載）、およびＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１ＭａｎＨＤＥＬ（実施例１１に記載）に形質転換した。これらの３つの株から得た形質転換体を、実施例１２において記載したとおり増殖させた。上に記載したとおりその上清からタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そしてラットモノクローナル抗グルコセレブロシダーゼ抗体（Ａｌｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら（２００４）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２３（６）：１０３０−６）を使用して免疫ブロットした。具体例としての免疫ブロット分析を図５１に示す。ｏｃｈ１破壊株ではスミアリングが発生せず（レーン１、２および３）、これに対してＷＴ細胞ではタンパク質の異質性がスミアとして見られる（レーン４および６）ことが図５１からわかる。ＭａｎＨＤＥＬを発現する酵母の株から得たタンパク質では、タンパク質のスミアリングが観察されなかった。これらの結果は、遺伝子操作したＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞ＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１およびＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１ＭａｎＨＤＥＬを使用すると、ターゲットタンパク質のより均一な集団を得ることができることを明示している。
（実施例１４）ヒトエリスロポエチンの発現：
ヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０１５８８）をコードするｃＤＮＡを化学合成し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のためにコドンを最適化した（配列番号１６；図５２）。その成熟タンパク質についてのｃＤＮＡコーディング配列をＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列のコーディング配列に融合させた。この融合構築物を、オレイン酸誘導性ＰＯＸ２プロモーターの制御下でクローニングした。結果として生じたプラスミドをｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅｈｕＥＰＯと名づけた。形質転換前に、そのプラスミドをＮｏｔＩで切断し、発現カセットを含有するフラグメントを単離し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１（実施例２に記載）に形質転換した。形質転換体候補を、実施例１２に記載したとおり増殖させ、分泌されたタンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手したモノクローナルマウス抗ヒトＥｐｏ抗体（クローンＡＥ７Ａ５）を使用するウエスタンブロットによって分析した。それらの細胞から得たＥＰＯ産物は、非常に均一なグリコシル化を示した。
（実施例１５）ヒトα−ガラクトシダーゼＡの発現：
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡＬ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ ｎｒ：Ｐ０６２８０）をコードするｃＤＮＡを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現用のコドン最適化ｃＤＮＡとして化学合成した（配列番号１７；図５３）。
その成熟タンパク質についてのｃＤＮＡコーディング配列をＬＩＰ２ ｐｒｅシグナル配列のコーディング配列に融合させた。この融合構築物を、オレイン酸誘導性ＰＯＸ２プロモーターの制御下でクローニングした。結果として得られたプラスミドをｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅａＧａｌａｓｅと名づけた。形質転換前に、そのプラスミドをＮｏｔＩで切断し、発現カセットを含有するフラグメントを単離し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＭＴＬＹ６０およびＭＴＬＹ６０Δｏｃｈ１ＭＮＮ４（実施例４に記載）に形質転換した。これら２つの株において得た形質転換体を、実施例１２に記載したとおり増殖させた。形質転換体から得た細胞外タンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、免疫ブロットによって分析した。α−ガラクトシダーゼＡに特異的な２つの抗体（Ａｂｃａｍから入手したニワトリポリクローナル抗体（ａｂ２８９６２）およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−２５８２３））を使用して、それらの発現されたヒトα−ガラクトシダーゼＡタンパク質を検出した。
（実施例１６）ＷＴ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるマンノシダーゼの発現
マンノシダーゼＨＤＥＬのみの（すなわち、機能性ＯＣＨ１遺伝子を含有する細胞における）発現が、真菌細胞によって発現されるタンパク質のより均一なグリコシル化をもたらすことができるかどうかを決定するために、マンノシダーゼＨＤＥＬをコードする核酸を含有する発現カセット（実施例１１参照）を野生型Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ｐｏ１ｄ細胞に形質転換した。それらの細胞から得た分泌タンパク質から得られたグリカンをＤＳＡ−ＦＡＣＥによって分析した（図５５）。分析したグリカンは、主として、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２および少ない部分であるＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２から成った。これらの結果は、ＯＣＨ１遺伝子の破壊が一切ない、マンノシダーゼＨＤＥＬのみの発現が、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによって発現されるタンパク質のより均一なグリコシル化をもたらすことを明示している。
他の実施形態
本発明を「発明を実施するための形態」に関連して説明したが、上述の説明は、本発明を例証するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点および変形は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (21)

  1. 改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法であって、該方法は、
    少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を提供すること；および
    ターゲットタンパク質をコードする核酸を該細胞に導入すること
    を含み、該細胞が該ターゲットタンパク質を改変Ｎ−グリコシル化形態で生産し、該ターゲットタンパク質がヒトタンパク質であり、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性の一方がＯＣＨ１活性の欠損を含み、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性のもう一方が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含み、ここで、該Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、該ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドであり、そして、該マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドがＭＮＮ４である、方法。
  2. 前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ターゲットタンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合タンパク質である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
  4. 前記融合タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、成長因子、サイトカインまたはケモカインと抗体またはその抗原結合フラグメントとの融合体である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ターゲットタンパク質が、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）に関連したタンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ターゲットタンパク質が、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−ヘキソサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−マンノシダーゼ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−Ｄ−グルコロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ−Ｌ−マンノシダーゼ、アルファ−ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンＫ、およびリポタンパク質リパーゼからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記改変Ｎ−グリコシル化形態が、１つ以上のＮ−グリカン構造を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質が、均一である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記改変Ｎ−グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも２０％である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記改変Ｎ−グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも３０％である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記改変Ｎ−グリコシル化を含有する改変ターゲット分子の割合が、少なくとも４０％である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、前記細胞内の外因性核酸によってコードされたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記方法において、糖タンパク質のマンノシル残基の少なくとも３０％が、リン酸化される、請求項１または１２に記載の方法。
  14. 前記糖タンパク質のインビトロまたはインビボでの追加のプロセッシングをさらに含む、請求項１、１２または１３に記載の方法。
  15. 前記追加のプロセッシングが、
    前記修飾糖タンパク質への異種部分の付加；
    前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の酵素的または化学的処理；
    マンノシダーゼ、マンナナーゼ、ホスホジエステラーゼ、グルコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼでの前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理；
    フッ化水素酸での前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質の処理；または
    前記改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質のリン酸化
    を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記異種部分が、ポリマーまたは担体である、請求項１５に記載の方法。
  17. 少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作された、単離されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞であって、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性の一方がＯＣＨ１活性の欠損を含み、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性のもう一方が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含み、ここで、該Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドであり、該マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドがＭＮＮ４であり、そして、該細胞が改変Ｎ−グリコシル化形態のヒトタンパク質の生産に使用される、細胞。
  18. 前記Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、ヒトタンパク質である、請求項１７に記載の単離された細胞。
  19. 少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から調製された細胞溶解産物とターゲットタンパク質を接触させることを含む、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法であって、該細胞溶解産物とターゲットタンパク質の接触が、結果として、改変されたＮ−グリコシル化形態の該ターゲットタンパク質を生じさせ、該ターゲットタンパク質がヒトタンパク質であり、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性の一方がＯＣＨ１活性の欠損を含み、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性のもう一方が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含み、ここで、該Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、該ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドであり、該マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドがＭＮＮ４である、方法。
  20. Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲットタンパク質を接触させることを含む、改変Ｎ−グリコシル化形態のターゲットタンパク質を生産する方法であって、該Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質が、少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞から得られ、および該Ｎ−グリコシル化活性を有する１つ以上のタンパク質とターゲット分子の接触が、結果として、改変されたＮ−グリコシル化形態の該ターゲットタンパク質を生じさせ、該ターゲットタンパク質がヒトタンパク質であり、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性の一方がＯＣＨ１活性の欠損を含み、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性のもう一方が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含み、ここで、該Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、該ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドであり、該マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドがＭＮＮ４である、方法。
  21. Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を含む細胞の培養物であって、該細胞は少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性を含むように遺伝子操作され、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性の一方がＯＣＨ１活性の欠損を含み、該少なくとも２つの修飾Ｎ−グリコシル化活性のもう一方が、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の発現を含み、ここで、該Ｎ−グリコシル化活性を有する発現されるタンパク質が、ターゲットタンパク質のマンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドであり、該マンノシルリン酸化を促進することができるポリペプチドがＭＮＮ４であり、そして、該細胞が改変Ｎ−グリコシル化形態のヒトタンパク質の生産に使用され、該培養物中の生細胞の総数の４０％未満が、遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞以外の生細胞である、培養物。
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