ES2316462T3 - Modificacion de glicosilacion de proteina en pichia pastoris. - Google Patents

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Abstract

Una cepa modificada por ingeniería genética de una levadura metilótrofa, en la que dicha cepa se transforma con un vector capaz de expresar una alfa-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma en dicha cepa, en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha alfa-1,2-manosidasa o dicha parte funcional y en la que el gen Och1 genómico en dicha cepa está alterado de tal forma que dicha cepa no es capaz de producir una proteína Och1 funcional.

Description

Modificación de glicosilación de proteína en Pichia pastoris.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos útiles para modificar genéticamente el proceso de glicosilación en cepas de levadura metilótrofas con el propósito de producir glucoproteínas con glicosilación reducida. La presente invención se refiere adicionalmente a cepas de levadura metilótrofas generadas usando los presentes métodos.
Antecedentes de la invención
Las levaduras metilótrofas incluyendo Pichia pastoris se han usado ampliamente para la producción de proteínas recombinantes de importancia comercial o médica. Sin embargo, la producción y las aplicaciones médicas de algunas glucoproteínas terapéuticas se puede ver obstaculizada por las diferencias en la biosíntesis de carbohidratos ligada a proteína entre estas levaduras y el organismo diana tal como un sujeto mamífero.
La N-glicosilación de proteínas se origina en el retículo endoplásmico (RE), en el que un oligosacárido ligado a N (Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2}) ensamblado en dolicol (un intermedio de vehículo de lípido) se transfiere al Asn apropiado de una proteína que se está generando. Esto es un acontecimiento común a todas las glucoproteínas ligadas a N eucariotas. Los tres restos de glucosa y un resto de manosa ligado a \alpha-1,2 específico se retiran por glucosidasas específicas y una \alpha-1,2-manosidasa en el RE, dando como resultado la estructura de oligosacárido central, Man_{8}GlcNAc_{2}. La proteína con esta estructura de azúcar central se transporta al aparato de Golgi donde el resto de azúcar se somete a diversas modificaciones. Hay diferencias significativas en las modificaciones de la cadena de azúcar en el aparato de Golgi entre levaduras y eucariotas superiores.
En células de mamífero, la modificación de la cadena de azúcar se produce por 3 rutas diferentes dependiendo del resto proteico al que se añade. Es decir, (1) la cadena de azúcar central no cambia; (2) la cadena de azúcar central se cambia añadiendo el resto N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAc-I-P) en UDP-N-acetil glucosamina (UDP-GlcNAc) a la posición 6 de manosa en la cadena de azúcar central, seguido de eliminación del resto de GlcNAc para formar una cadena de azúcar ácida en la glucoproteína; o (3) la cadena de azúcar central se convierte en primer lugar en Man_{5}GlcNAc_{2} eliminando 3 restos de manosa con manosidasa I; Man_{5}GlcNAc_{2} se modifica adicionalmente añadiendo GlcNAc y eliminando 2 restos de manosa más, seguido de adición secuencialmente de GlcNAc, galactosa (Gal), y ácido N-acetilneuramínico (también denominado ácido siálico (NeuNAc)) para formar diversas cadenas de azúcar híbridas o complejas (R. Kornfeld y S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664, 1985; Chiba et al J. Biol. Chem. 273: 26298-26304,1998).
En levadura, la modificación de la cadena de azúcar en el Golgi implica una serie de adiciones de restos de manosa por diferentes manosiltransferasas (glicosilación de "cadena externa"). La estructura de la glicosilación de cadena externa es específica de los organismos, típicamente con más de 50 restos de manosa en S. cerevisiae, y mucho más comúnmente con estructuras inferiores a Man_{14}GlcNAc_{2} en Pichia pastoris. Esta glicosilación de cadena externa específica de levadura del tipo alto en manosa también se denomina hiperglicosilación.
La hiperglicosilación a menudo es indeseada ya que conduce a heterogeneidad de un producto proteico recombinante tanto en la composición de carbohidratos como en el peso molecular, lo que puede complicar la purificación de la proteína. La actividad específica (unidades/peso) de enzimas hiperglicosiladas se puede disminuir por la parte aumentada de carbohidrato. Además, la glicosilación de cadena externa es fuertemente inmunógena, lo que es indeseable en una aplicación terapéutica. Además, el gran azúcar de cadena externa puede enmascarar los determinantes inmunógenos de una proteína terapéutica. Por ejemplo, la neuraminidasa (NA) del virus de la gripe expresada en P. pastoris se glicosila con N-glicanos que contienen hasta 30-40 restos de manosa. La NA hiperglicosilada tiene capacidad inmunógena reducida en ratones, ya que los bucles de superficie variables e inmunodominantes en la parte superior de la molécula de NA se enmascaran por los N-glicanos (Martinet et al. Eur J. Biochem.
247: 332-338, 1997).
Por lo tanto, es deseable modificar genéticamente las cepas de levadura metilótrofas en las que la glicosilación de proteínas se puede manipular y a partir de las cuales se pueden producir proteínas recombinantes que no se comprometerían en estructura o función por grandes cadenas laterales de N-glicano.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a métodos útiles para modificar genéticamente el proceso de glicosilación en cepas de levadura metilótrofas para producir glucoproteínas con glicosilación reducida. También se proporcionan cepas de levadura metilótrofas generadas usando los presentes métodos. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención puede usar vectores "knock-in" que son capaces de expresar en una cepa de levadura metilótrofa una o más proteínas cuyas actividades enzimáticas conducen a una disminución de glicosilación en glucoproteínas producida por la cepa de levadura metilótrofa.
Los vectores knock-in incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica una \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma y son capaces de expresar la \alpha-1,2-manosidasa o la parte funcional en una cepa de levadura metilótrofa. Una secuencia de nucleótidos preferida es una secuencia de nucleótidos que codifica la \alpha-1,2-manosidasa de una especie fúngica, y más preferiblemente, Trichoderma reesei. Preferiblemente, el vector de expresión de \alpha-1,2-manosidasa se modifica por ingeniería genética de tal forma que la \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma expresada por el vector incluye una señal de retención en RE. Una señal de retención en RE preferida es HDEL. La secuencia codificante de \alpha-1,2-manosidasa se puede ligar de forma funcional a un promotor constitutivo o inducible y una secuencia de terminación 3'. Los vectores pueden ser vectores integrativos o vectores replicativos. Los vectores de expresión de \alpha-1,2-manosidasa particularmente preferidos incluyen pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL y
pGAPZmMycManHDEL.
Los vectores knock-in pueden incluir una secuencia que codifica una glucosidasa II o una parte funcional de la misma y son capaces de expresar la glucosidasa II o la parte funcional en una cepa de levadura metilótrofa. Una secuencia de nucleótidos preferida es una secuencia de nucleótidos que codifica la glucosidasa II de una especie fúngica y, más preferiblemente, Saccharomyces cerevisiae. Preferiblemente, el vector de expresión de glucosidasa II se modifica por ingeniería genética de tal forma que la glucosidasa II o una parte funcional de la misma expresada por el vector incluye una señal de retención en RE. Una señal de retención en RE preferida es HDEL. La secuencia codificante de glucosidasa II se puede ligar de forma funcional a un promotor constitutivo o inducible y una secuencia de terminación 3'. Los vectores pueden ser vectores integrativos o vectores replicativos. Los vectores de expresión de glucosidasa II parti-
cularmente preferidos incluyen pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII,
pGAPADEglsII, pPICADEglsII, pAOX2ADEglsII, pYPTIADEglsII, pGAPZAglsIIHDEL y
pGAPADEglsIIHDEL.
Se pueden usar vectores de expresión que incluyen tanto una unidad de expresión de \alpha-1,2-manosidasa como una unidad de expresión de glucosidasa II.
La presente invención puede usar vectores "knock-out" que, cuando se introducen en una cepa de levadura metilótrofa, inactivan o alteran un gen facilitando de este modo la disminución de la glicosilación de glucoproteínas producidas en la cepa de levadura metilótrofa.
La presente invención puede usar un vector "knock-out" que, cuando se introduce en una cepa de levadura metilótrofa, inactiva o altera el gen Och1. Un vector knock-out de Ochl preferido es pBLURA5'PpOCH1.
La presente invención puede usar vectores que incluyen tanto una unidad knock-in como una unidad knock-out.
Además, cualquiera de los vectores knock-in o knock-out también puede incluir una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una proteína heteróloga de interés en una levadura metilótrofa.
Otra realización de la presente invención proporciona métodos para modificar la glicosilación en una levadura metilótrofa transformando la levadura con uno o más vectores.
Las cepas de una levadura metilótrofa que se pueden modificar usando los presentes métodos incluyen, pero sin limitación, cepas de levadura capaces de desarrollo sobre metanol tales como levaduras de los géneros Candida, Hansenula, Torulopsis y Pichia. Las levaduras metilótrofas preferidas son del género Pichia. Se prefieren especialmente cepas de Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851). GS190 (NRRL Y-18014), PPF1 (NRRL Y-18017), PPY120H, yGC4 y cepas obtenidas de las mismas. Las cepas de levadura metilótrofas que se pueden modificar usando los presentes métodos también incluyen las cepas de levadura metilótrofas que se han modificado por ingeniería genética para expresar una o más proteínas heterólogas de interés. La glicosilación en las proteínas heterólogas expresadas por estas cepas modificadas por ingeniería genética previamente se puede disminuir transformando tales cepas con uno o más de los vectores de la presente invención.
Las cepas de levadura metilótrofas que se modifican practicando los presentes métodos se proporcionan en otra realización de la presente invención.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a métodos para producir glucoproteínas con una glicosilación reducida.
De acuerdo con tales métodos, una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína se puede introducir en una cepa de levadura metilótrofa que se ha transformado previamente.
Alternativamente, se puede transformar una cepa de levadura metilótrofa que se ha modificado por ingeniería genética para expresar una glucoproteína.
Además, si una cepa de levadura metilótrofa no está transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoproteína de interés o cualquiera de los vectores, tal cepa de levadura se puede transformar, consecutivamente o simultáneamente, tanto con una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la glucoproteína como con uno o más vectores. Adicionalmente, una cepa de levadura metilótrofa se puede transformar con uno o más vectores knock-in y/o knock-out que también incluyen una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína en la cepa de levadura metilótrofa.
También se proporcionan kits que incluyen una o más cepas modificadas para producir glucoproteínas con glicosilación reducida.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra vectores que portan un casete de expresión de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcado con HDEL y describe el modo en el que estos vectores se construyeron de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Abreviaturas usadas a lo largo de esquemas de construcción: 5' AOX1 o AOX1 P: secuencia de promotor AOX1 de Pichia pastoris; Amp R: gen de resistencia a ampicilina; CoIE1: origen de replicación CoIE1; 3'AOX1: secuencias 3' del gen AOX1 de Pichia pastoris; HIS4: gen HIS4 de Pichia pastoris. AOX TT: secuencia de terminador de la transcripción del gen AOXI de Pichia pastoris; ORF: fase de lectura abierta; S: señal de secreción; P TEF1: la secuencia de promotor del gen de factor de elongación de transcripción 1 de Saccharomyces cerevisiae; P EM7: promotor EM7 procariota constitutivo sintético; Zeocina: gen de resistencia a Zeocina; CYC1 TT: extremo 3' del gen CYC1 de S. cerevisiae; GAP: secuencia de promotor del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Pichia pastoris; PpURA3: gen URA3 de Pichia pastoris. Como se puede observar en esta figura, la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei se ligó de forma funcional a la secuencia codificante para la secuencia señal de secreción de factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae y se ligó de forma funcional adicionalmente al extremo 3' de la secuencia codificante a la secuencia codificante para un péptido HDEL. Toda la construcción de fusión se ligó de forma funcional al promotor AOX1 de P. pastoris (en pPIC9MFManHDEL) o al promotor GAP de P. pastoris (en pGAPZMFManHDEL).
La Figura 2 ilustra vectores que portan un casete de expresión de \alpha-1,2-manosidasa IB de Mus musculus marcado con HDEL y describe el modo en el que estos vectores se construyeron de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Como se puede observar en esta figura, el dominio catalítico de la \alpha-1,2-manosidasa IB de Mus musculus se ligó de forma funcional a la secuencia codificante de la secuencia señal de secreción del factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae y se ligó de forma funcional adicionalmente al extremo 3' de la secuencia codificante a la secuencia codificante de un péptido HDEL. Toda la construcción de fusión se ligó de forma funcional al promotor AOX1 de P. pastoris (en pPIC9mManHDEL) o al promotor GAP de P. pastoris (en pGAPZmManHDEL). Además, se prepararon variantes del casete de expresión en las que la secuencia codificante de un marcador de epítopo cMyc se insertó entre la secuencia codificante de la secuencia señal de secreción de Factor de Acoplamiento \alpha de S. cerevisiae y la secuencia codificante del dominio catalítico de la \alpha-1,2-manosidasa IB de Mus musculus. Este casete de expresión también se ligó se forma funcional al promotor AOX1 de P. pastoris (en pPIC9mMycManHDEL) o al promotor GAP de P. pastoris (en pGAPZmMycManHDEL).
La Figura 3 ilustra vectores que llevan una \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcada con MycHDEL y el modo en el que se obtuvieron estos vectores. De nuevo, la construcción de fusión resultante se ligó al promotor AOX1 de P. pastoris (en pPICZBMFManMycHDEL) o al promotor GAP de P. pastoris (en pGAPZMFManMycHDEL).
La Figura 4 demuestra la localización intracelular de la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcada con MycHDEL e indica la dirección a RE por análisis de inmunofluorescencia. Panel A transferencia de Western. Las cepas de levadura se cultivaron en cultivos YPG de 10 ml hasta una DO_{600} = 10, se diluyeron cinco veces y se cultivaron en YPM durante 48 h. Se analizó 1/50 del medio de cultivo y 1/65 de las células por SDS-PAGE y transferencia de Western con el anticuerpo anti-Myc monoclonal de ratón 9E10. La posición de las proteínas de marcador de peso molecular se indica con flechas. Carriles 1-5: lisados celulares. 1,2: transformantes pGAPZMFManMycHDEL. 3: PPY12OH no transformado (control negativo). 4,5: transformantes pPICZBMFManMycHDEL. Carriles 6-10: medio de cultivo. 6: PPY12OH no transformado (control negativo). 7,8: transformantes pGAPZMFManMycHDEL. 9,10: transformantes pPICZBMFManMycHDEL. Panel B Microscopía de inmunofluorescencia. 1: imagen de contraste de fases de una célula de P. pastoris (cepa PPY120H transformada con pGAPZMFManHDEL) a aumento 1000x. El núcleo es visible como una elipse en el cuadrante derecho inferior de la célula. 2: misma célula que en un 1, pero en modo de microscopía de fluorescencia para mostrar la localización de la proteína de T. reesei manosidasa-Myc-HDEL. La proteína se localiza principalmente en una distribución circular alrededor del núcleo (envuelta nuclear), lo que es típico de una distribución en estado de equilibrio en retículo endoplásmico. 3: imagen de contraste de fases de una célula de P. pastoris (cepa PPY120H transformada con pGAPZMFManHDEL) a aumento 1000x. 4: misma célula en microscopía de fluorescencia para mostrar la localización de la proteína de marcador de Golgi OCH1-HA en la cepa de P. pastoris PPY120H. La distribución similar a puntos a lo largo del citoplasma, con 3-4 puntos por célula es típica de la distribución de cis-Golgi en P. pastoris.
La Figura 5 ilustra la co-sedimentación de manosidasa-MycHDEL con Proteína Disulfuro Isomerasa en centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. El panel superior muestra la distribución a lo largo de las diferentes fracciones del gradiente de sacarosa de la proteína marcadora de Golgi OCH1-HA. El panel central muestra esta distribución de la proteína marcadora de retículo endoplásmico Proteína Disulfuro Isomerasa. Finalmente, el panel inferior muestra la distribución de la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcada con MycHDEL a lo largo de las mismas fracciones. Se concluye que la manosidasa-MycHDEL coincide prácticamente de forma exacta con la distribución del marcador de RE PDI y, por tanto, reside principalmente en el RE de las células de levadura de Pichia pastoris.
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La Figura 6 ilustra el análisis de N-glicano de trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi co-expresada con manosidasa-HDEL de Trichoderma reesei. Panel A: escala de referencia de tamaño de maltooligosacárido. Los tamaños de los glicanos se expresan en Unidades de Glucosa (GU) por comparación de su movilidad electroforética con la movilidad de estos malto-oligosacáridos. Panel B: N-glicanos obtenidos de trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi recombinante expresada en Pichia pastoris. El pico GU = 9,2 se corresponde a Man_{8}GlcNAc_{2}. Panel C: mismos analitos que panel 2, pero después de tratamiento durante noche con 3 U/ml de \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei recombinante purificada. Panel D: N-glicanos obtenidos de trans-sialidasa recombinante co-expresada en Pichia pastoris con manosidasa-HDEL de T. reesei (bajo el control de promotor GAP). El pico en GU = 7,6 se corresponde con el pico Man_{5}GlcNAc_{2} en el perfil de RNasa B (Panel F). Panel E: mismos analitos que panel D, pero después de tratamiento durante una noche con 3 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei recombinante purificada. Panel F: N-glicanos obtenidos de RNasa B bovina. Estos glicanos consisten en Man_{5}GlcNAc_{2} a Man_{8}GlcNAc_{2}. Se resuelven diferentes isómeros, representando el número de picos para Man_{7}GlcNAc_{2}.
La Figura 7 ilustra el procesamiento de N-glicanos de hemaglutinina de virus de la gripe por \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcada con HDEL y el dominio catalítico marcado con HDEL de \alpha-1,2-manosidasa lB murina. El oligosacárido de referencia Man_{5}GlcNAc_{2} se procesa con exploración 1850 en este análisis (no mostrado). Panel 1: escala de referencia de tamaño de maltooligosacárido. Panel 2: N-glicanos obtenidos de hemaglutinina de virus de la gripe recombinante expresada en Pichia pastoris. El pico en la exploración 2250 se corresponde a Man_{9}GlcNAc_{2}. Panel 3: N-glicanos obtenidos de hemaglutinina recombinante co-expresada en Pichia pastoris con manosidasa-HDEL de T. reesei (bajo el control del promotor GAP). El pico en la exploración 1950 se corresponde a Man_{6}GlcNAc_{2}. Panel 4: mismos analitos que para el panel 3, pero después del tratamiento durante una noche con 30 mU de \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei recombinante purificada. Panel 5: N-glicanos obtenidos de hemaglutinina recombinante co-expresada en Pichia pastoris con manosidasa IB-HDEL de ratón (bajo el control del promotor GAP). Panel 6: mismos analitos que para el panel 5, pero después del tratamiento durante una noche con 30 mU de \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei recombinante purificada.
La Figura 8 ilustra gráficamente el vector pBLURA5'PpOCH1 y el modo en el que se construyó.
La Figura 9 ilustra el esquema para alterar el gen OCH1 de Pichia pastoris por recombinación homóloga única usando pBLURA5'PpOCH1.
La Figura 10 ilustra el análisis de N-glicano de glucoproteína de pared celular del clon inactivado en Och1 y los tres clones obtenidos de este clon inactivado en Och1 mediante transformación con PGAPZMFMANHDEL. El panel 1 muestra el análisis de una mezcla de malto-oligosacáridos, cuyo grado de polimerización se da por los números en la parte superior de la figura. Este análisis sirve como una referencia de tamaño para los demás paneles. En el eje vertical de todos los paneles se da la intensidad máxima en unidades relativas de fluorescencia. Panel 2-6: análisis de los N-glicanos de glucoproteína de pared celular de las siguientes cepas: Panel 2, cepa yGC4 de P. pastoris no modificada por ingeniería genética; Panel 3, yGC4 transformado con pBLURA5'PpOch1; 4-6, tres clones de la cepa del Panel 3, transformada de forma suplementaria con pGAPZMFManHDEL. Panel 7: los N-glicanos obtenidos de la RNasaB bovina, que consisten en una mezcla de Man_{5-9}GlcNAc_{2}. Como se puede observar a partir de la comparación entre el panel 2 y 3 y la referencia al panel 7, la transformación con pBLURAS'PpOchl conduce a una abundancia fuertemente aumentada del sustrato de N-glicano Man_{8}GlcNAc_{2} (denominado pico 1 en el Panel 2) de OCH1p. El pico 2 representa el producto Man_{9}GlcNAc_{2} de OCH1p. Además, después de transformación suplementaria de pGAPZMFManHDEL, el glicano principal de las glucoproteínas de pared celular de tres clones independientes es el producto final de Man_{5}GlcNAc_{2} (pico 3 en el panel 4) de digestión con \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei del sustrato Man_{8}GlcNAc_{2}.
La Figura 11 ilustra el análisis de exactamente las mismas mezclas de glicano como en la Figura 10, pero después de una digestión in vitro con 3 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei, durante una noche en acetato sódico 20 mM pH = 5,0. La asignación de eje es igual que en la Figura 10. Se forma más Man_{5}GlcNAc_{2} en la cepa transformada con pBLURA5'PpOch1 (Panel 3) que en la cepa precursora (Panel 2). Los picos en todos los paneles antes de la exploración 3900 proceden de contaminantes y se deben ignorar en el análisis.
La Figura 12 ilustra el vector de expresión pGAPZAGLSl1 (SEC ID Nº: 18). P TEF1: promotor de gen de factor de elongación de la transcripción de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariota sintético. Zeocina: gen marcador de resistencia a zeocina. CYC1 TT: terminador de la transcripción de gen de citocromo C1 de S. cerevisiae. Co1 E1: origen de replicación bacteriano. GAP: promotor del gen GAP de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 13 ilustra el vector de expresión pAOX2ZAGLSII (SEC ID Nº: 16). P TEF1: promotor de gen de factor de elongación de la transcripción de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariota sintético. Zeocina: gen marcador de resistencia a zeocina. CYC1 TT: terminador de la transcripción de gen de citocromo C1 de S. cerevisiae. Co1 E1: origen de replicación bacteriano. AOX2 P: promotor del gen AOX2 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 14 ilustra el vector de expresión pPICZGLSII (SEC ID Nº: 20). P TEF1: promotor de gen de factor de elongación de la transcripción de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariota sintético. Zeocina: gen marcador de resistencia a zeocina. CYC1 TT: terminador de la transcripción de gen de citocromo C1 de S. cerevisiae. Co1 E1: origen de replicación. AOX1 P: promotor del gen AOX1 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 15 ilustra el vector de expresión pYPTIZAGLSlI ((SEC ID Nº: 22). P TEF1: promotor de gen de factor de elongación de la transcripción de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariota sintético. Zeocina: gen marcador de resistencia a zeocina. CYC1 TT: terminador de la transcripción de gen de citocromo C1 de S. cerevisiae. Co1 E1: origen de replicación. PYPT1: promotor del gen YPT1 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 16 ilustra el vector de expresión pGAPADE1glsII (SEC ID Nº: 19). Amp R: gen marcador de resistencia a ampicilina. ADE1: gen marcador de selección ADE1 de P. pastoris. GAP: promotor del gen GAP de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 17 ilustra el vector de expresión pAOX2ADE1glslI (SEC ID Nº: 17). Amp R: gen marcador de resistencia a ampicilina. ADE1: gen marcador de selección ADE1 de P. pastoris. AOX2 P: promotor del gen AOX2 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 18 ilustra el vector de expresión pPICADE1glsII (SEC ID Nº: 21). Amp R: gen marcador de resistencia a ampicilina. ADE1: gen marcador de selección ADE1 de P. pastoris. AOX1 P: promotor del gen AOX1 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de
P. pastoris.
La Figura 19 ilustra el vector de expresión pYPTIADE1glsII (SEC ID Nº: 23). Amp R: gen marcador de resistencia a ampicilina. ADE1: gen marcador de selección ADE1 de P. pastoris. P YPT1: promotor del gen YPT1 de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de
P. pastoris.
La Figura 20 ilustra el vector de expresión pGAPZAglsIIHDEL (SEC ID Nº: 24). Amp R: gen marcador de resistencia a ampicilina. ADE1: gen marcador de selección ADE1 de P. pastoris. GAP: promotor del gen GAP de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 21 ilustra el vector de expresión pGAPADE1glsIIHDEL (SEC ID Nº: 25). P TEF1: promotor de gen de factor de elongación de la transcripción de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariota sintético. Zeocina: gen marcador de resistencia a zeocina. CYC1 TT: terminador de la transcripción de gen de citocromo C1 de S. cerevisiae. Co1 E1: origen de replicación bacteriano. GAP: promotor del gen GAP de P. pastoris. GLS2: gen de glucosidasa II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador de la transcripción del gen AOX1 de P. pastoris.
La Figura 22 ilustra la prueba del ensayo de la actividad de GLSII usando una alfa-glucosidasa de levadura disponible en el mercado (Sigma: Cat. Nº G-5003). La mezcla de ensayo contiene un tampón fosfato-citrato pH 6,8, manosa, 2-desoxi-D-glucosa, el sustrato 4-metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranósido y alfa-glucosidasa de Sigma. 1: mezcla de ensayo iluminada con luz UV después de incubación durante una noche a 37ºC; 2 igual que 1, pero esta vez la mezcla de ensayo carece de la alfa-glucosidasa; 3: igual que 1, pero esta vez, la mezcla de ensayo carece del sustrato.
La Figura 23 ilustra los resultados de la actividad de GLSII expresada de forma recombinante de Pichia pastoris. Todas las mezclas de ensayo se incubaron durante una noche a 37ºC y después se iluminaron con luz UV. 1: ensayo con alfa-glucosidasa de levadura (Sigma: Cat. Nº G-5003); 2: ensayo con el medio purificado de la cepa 18 (PPY12-OH transformado con pGAPZA-GLSII); 3: ensayo con medio purificado de la cepa WT (de tipo silvestre) PPYI2-OH; 4: ensayo con el medio purificado de la cepa H3 (PPY12-OH transformado con pGAPZAglsIIHDEL).
Descripción detallada de la invención
Se ha establecido que la mayoría de los N-glicanos en las glucoproteínas que abandonan el retículo endoplásmico (RE) de Pichia tienen la estructura de oligosacárido central Man_{8}GlcNAc_{2}. Después de que las proteínas se transporten desde el RE al aparato de Golgi, se añaden restos de manosa adicionales a este resto de azúcar central mediante diferentes manosiltransferasas, dando como resultado glucoproteínas con grandes cadenas laterales de manosa. Tal hiperglicosilación de glucoproteínas recombinantes en muchos casos es indeseable. En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para modificar genéticamente cepas de levadura metilótrofas para producir glucoproteínas con glicosilación reducida. También se proporcionan cepas de levadura metilótrofas generadas que usan los presentes métodos.
La presente invención usa una secuencia que codifica una \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma, capaz de expresar la \alpha-1,2-manosidasa o la parte funcional en una cepa de levadura metilótrofa.
Una \alpha-1,2-manosidasa escinde los restos de manosa ligados a \alpha-1,2 en los extremos no reductores de
Man_{8}GlcNAc_{2}, y convierte este oligosacárido central en glucoproteínas en Man_{5}GlcNAc_{2}. In vitro, Man_{5}GlcNAc_{2} es un sustrato muy malo para cualquier manosiltransferasa de Golgi de Pichia, es decir, los restos de manosa no se pueden añadir a esta estructura de azúcar. Por otro lado, Man_{5}GlcNAc_{2} es el sustrato aceptor para la N-acetilglucosaminil-transferasa I de mamífero y es un intermedio para las cadenas de azúcar de tipo híbrido y complejo características de glucoproteínas de mamífero. Por tanto, mediante la introducción de una \alpha-1,2-manosidasa en levaduras metilótrofas tales como Pichia, se pueden producir glucoproteínas con contenido en manosa reducido.
La secuencia de nucleótidos que codifica una \alpha-1,2-manosidasa para el uso en la presente invención se pueden obtener de cualquier especie. Se han clonado varios genes de \alpha-1,2-manosidasa y están disponibles para los especialistas en la técnica, incluyendo genes de mamífero que codifican, por ejemplo, una \alpha-1,2-manosidasa murina (Herscovics et al. J. Biol. Chem. 269: 9864-9871,1994), una \alpha-1,2-manosidasa de conejo (Lal et al. J. Biol. Chem. 269: 9872-9881, 1994) o una \alpha-1,2-manosidasa humana (Tremblay et al. Glycobiology 8: 585-595, 1998), así como genes fúngicos que codifican, por ejemplo, un \alpha-1,2-manosidasa de Aspergillus (gen msdS), una \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei (Maras et al. J. Biotechnol. 77: 255-263, 2000), o una \alpha-1,2-manosidasa de Saccharomyces cerevisiae. El análisis de secuencia de proteína ha mostrado un alto grado de conservación entre las \alpha-1,2-manosidasas eucariotas identificadas hasta ahora.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos codifica una \alpha-1,2-manosidasa fúngica, más preferiblemente una \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei y más particularmente la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei descrita por Maras et al. J. Biotechnol. 77: 255-63 (2000).
La secuencia de nucleótidos también puede codificar solamente una parte funcional de una \alpha-1,2-manosidasa.
Por "parte funcional" se quiere decir un fragmento polipeptídico de una \alpha-1,2-manosidasa que sustancialmente conserva la actividad enzimática de la proteína de longitud completa. Con "sustancialmente" se quiere decir que se conserva al menos aproximadamente el 40% o, preferiblemente, al menos el 50% o más de la actividad enzimática de la \alpha-1,2-manosidasa de longitud completa. Por ejemplo, como se ilustra por la presente invención, el dominio catalítico de la \alpha-1,2-manosidasa IB murina constituye una "parte funcional" de la \alpha-1,2-manosidasa IB murina. Los especialistas en la técnica pueden identificar fácilmente y preparar partes funcionales de una \alpha-1,2-manosidasa usando una combinación de técnicas conocidas en la técnica. Las predicciones de las partes de una \alpha-1,2-manosidasa esenciales o suficientes para conferir la actividad enzimática se pueden preparar basándose en el análisis de la secuencia de proteína. La actividad de una parte de una \alpha-1,2-manosidasa de interés, expresada y purificada por un sistema de expresión apropiado, se puede verificar usando ensayos in vitro o in vivo que se describen más adelante en este documento.
En la presente invención, una \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma expresada en una cepa de levadura metilótrofa se dirige preferiblemente a un sitio en la ruta secretora donde Man_{8}GlcNAc_{2} (el sustrato de \alpha-1,2-manosidasa) ya se forma en una glucoproteína, pero no ha alcanzado una glicosiltransferasa de Golgi que prolonga la cadena de azúcar con restos de manosa adicionales.
En consecuencia, en una realización preferida de la invención, el vector de expresión de \alpha-1,2-manosidasa se modifica por ingeniería genética de tal forma que la \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma expresada por el vector incluye una señal de retención en RE.
"Una señal de retención en RE" se refiere a una secuencia de péptidos que dirige una proteína que tiene tal secuencia de péptidos para que sea transportada a y se retenga en el RE. Tales secuencias de retención en RE se encuentran a menudo en proteínas que residen y funciona en el RE.
En la técnica están disponibles múltiples selecciones de señales de retención en RE para los especialistas en la técnica, por ejemplo, los primeros 21 restos aminoacídicos de la proteína de RE de S. cerevisiae MNS1 (Martinet et al. Biotechnology Letters 20. 1171-1177, 1998). Una señal de retención en RE preferida es el péptido HDEL (SEC ID Nº: 1). La secuencia de péptido HDEL, encontrada en el extremo C de varias proteínas de levadura, actúa como una señal de retención/recuperación para el RE (Pelma EMBO J. 7: 913-918, 1988). Las proteínas con una secuencia de HDEL se unen por un receptor de unión a membrana (Erd2p) y después entran una ruta de transporte retrógrada para volver al RE desde el aparato de Golgi.
De acuerdo con la presente invención, una señal de retención en RE se puede poner en cualquier lugar en la secuencia de proteína de una \alpha-1,2-manosidasa, pero preferiblemente en el extremo C de la \alpha-1,2-manosidasa.
La \alpha-1,2-manosidasa se puede modificar adicionalmente, por ejemplo, mediante inserción de un marcador de epítopo para el que están disponibles anticuerpos, tales como marcadores Myc, HA, FLAG e His6 bien conocidos en la técnica. Una \alpha-1,2-manosidasa marcada con epítopos se puede purificar de forma conveniente o controlar tanto para la expresión como para la localización intracelular.
Una señal de retención en RE y un marcador de epítopo se pueden introducir de forma sencilla en una proteína de interés insertando secuencias de nucleótidos que codifican tal señal o marcador en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés usando cualquiera de las técnicas de biología molecular conocidas en la técnica.
En otra realización preferida, el vector incluye una secuencia que codifica una glucosidasa II o una parte funcional de la misma y que es capaz de expresar la glucosidasa II o la parte funcional en la cepa de levadura metilótrofa.
Se ha establecido que el oligosacárido ligado a N inicial (Glc_{3}Man_{9}GlcNAc_{2}), transferido en el RE sobre una proteína, se escinde en el RE por glucosidasas específicas para eliminar los restos de glucosa y por una manosidasa para eliminar una manosa ligada a \alpha-1,2 específica. Los presentes inventores han observado que algunas proteínas recombinantes expresadas en Pichia tienen restos de glucosa residuales sobre el resto de azúcar cuando tales proteínas abandonan el RE hacia el aparato de Golgi. Las moléculas de glucosa residuales presentes sobre la estructura de azúcar evitan la digestión completa del resto de azúcar por una \alpha-1,2-manosidasa y la introducción de una glucosidasa exógena puede facilitar la eliminación de estos restos de glucosa.
La secuencia de nucleótidos que codifica una glucosidasa II puede proceder de cualquier especie. Se han clonado genes de glucosidasa II de varias especies de mamífero incluyendo rata, ratón, cerdo y ser humano. La proteína de glucosidasa II de estas especies de mamífero consiste en una subunidad alfa y una beta. La subunidad alfa tiene aproximadamente 110 kDa y contiene la actividad catalítica de la enzima, mientras que la subunidad beta tiene una secuencia de retención en RE de HDEL C-terminal y se cree que es importante para la localización en RE de la enzima. El gen de glucosidasa II de S. cerevisiae también se ha clonado (ORF YBR229c, localizado en el cromosoma II). Este gen codifica una proteína de aproximadamente 110 kDa, que muestra un alto grado de homología con la subunidad alfa de mamífero.
Un gen de glucosidasa II preferido para el uso en los vectores es de una especie fúngica tal como Pichia pastoris y S. cerevisiae. Un ejemplo de un gen de glucosidasa II fúngico es el gen de subunidad alfa de glucosidasa II de S. cerevisiae.
La secuencia de nucleótidos también puede codificar solamente una parte funcional de una glucosidasa II. Con "parte funcional" se quiere decir un fragmento polipeptídico de una glucosidasa II que sustancialmente conserva la actividad enzimática de la proteína de longitud completa. Con "sustancialmente" se quiere decir que se conserva al menos aproximadamente el 40% o, preferiblemente, al menos el 50% o más de la actividad enzimática de la glucosidasa II de longitud completa. Se pueden identificar partes funcionales de una glucosidasa II y preparar por los especialistas en la técnica usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica.
En una realización preferida de la invención, la proteína glucosidasa II se modifica por ingeniería genética para incluir una señal de retención en RE de tal forma que la proteína expresada en una cepa de levadura metilótrofa se dirige al RE y se conserva en el mismo para la función. Las señales de retención en RE son como se han descrito anteriormente en este documento, por ejemplo, la secuencia de péptido HDEL.
La glucosidasa II se puede modificar adicionalmente, por ejemplo: mediante inserción de un marcador de epítopo para el que están disponibles anticuerpos, tales como marcadores Myc, HA, FLAG e His6, que se conocen bien en la técnica.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que se tiene que expresar (por ejemplo, una \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma; una glucosidasa II o una parte funcional de la misma) se pueden poner en una ligación funcional con un promotor y una secuencia de terminación 3'.
Los promotores apropiados para la expresión de una proteína en una levadura metilótrofa pueden incluir tanto promotores constitutivos como promotores inducibles. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Pichia pastoris ("el promotor GAP"). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, por ejemplo, el promotor de alcohol oxidasa I de Pichia pastoris ("el promotor AOXI") (Patente de Estados Unidos Nº 4.855.231), o el promotor de formaldehído deshidrogenasa de Pichia pastoris ("el promotor FLD") (Shen et al., Gene 216: 93-102, 1998).
Las secuencias de terminación 3' son secuencias 3' al codón de terminación de un gen estructural que funcionan estabilizando el producto de transcripción de ARNm del gen al que se liga de forma funcional la secuencia, tales como secuencias que suscitan poliadenilación. Las secuencias de terminación 3' se pueden obtener de Pichia o de otra levadura metilótrofa. Los ejemplos de secuencias de terminación 3' de Pichia pastoris útiles para la práctica de la presente invención incluyen secuencias de terminación del gen AOX1, del gen p40, del gen HIS4 y gen FLD1.
Los vectores contienen preferiblemente un gen marcador seleccionable. El marcador seleccionable puede ser cualquier gen que confiera un fenotipo seleccionable a una cepa de levadura metilótrofa y permite que se identifiquen células transformadas y se seleccionen de células no transformadas. El sistema de marcador seleccionable puede incluir una cepa de levadura metilótrofa mutante auxótrofa y un gen de tipo silvestre que complementa el defecto del hospedador. Los ejemplos de tales sistemas incluyen el gen HIS4 de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris que se pueden usar para complementar cepas de Pichia his4 o el gen ARG4 de S. cerevisiae o Pichia pastoris que se pueden usar para complementar mutantes arg de Pichia pastoris. Otros genes marcadores seleccionables que funcionan en Pichia pastoris incluyen el gen Zeo^{R}, el gen G418^{R} y similares.
Los vectores pueden incluir también una secuencia de replicación autónoma (ARS). Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.837.148 describe secuencias de replicación autónoma que proporcionan un medio adecuado para mantener plásmidos en Pichia pastoris.
Los vectores también pueden contener genes marcadores seleccionables que funcionan en bacterias, así como secuencias responsables de replicación y mantenimiento extracromosómico en bacterias. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables bacterianos incluyen genes de resistencia a ampicilina (Amp^{1}), de resistencia a tetraciclina (Tet), de resistencia a neomicina, de resistencia de higromicina y de resistencia a zeocina (Zeo^{R}).
La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína a expresar a una levadura metilótrofa se puede poner en un vector integrativo o un vector replicativo (tal como un plásmido un circular de replicación).
Los vectores integrativos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.882.279.
Los vectores integrativos incluyen generalmente una secuencia dispuesta en serie de al menos un primer fragmento de ADN insertable, un gen marcador seleccionable y un segundo fragmento de ADN insertable. El primer y el segundo fragmento de ADN insertable tienen cada uno aproximadamente 200 nucleótidos de longitud y tienen secuencias de nucleótidos que son homólogas a partes del ADN genómico de la especie que se tiene transformar. Una secuencia de nucleótidos que contiene un gen estructural de interés para la expresión se inserta en este vector entre el primer y el segundo fragmento de ADN insertable antes o después del gen marcador. Los vectores integrativos se pueden linealizar antes de la transformación de levadura para facilitar la integración de la secuencia de nucleótido de interés en el genoma de la célula hospedadora.
Los vectores replicativos e integrativos que portan cada una o ambas de una secuencia codificante de \alpha-1,2-manosidasa o una secuencia codificante de glucosidasa II se pueden construir mediante técnicas convencionales conocidas por el especialista en la técnica y se encuentran, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual o cualquiera de una miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles.
Los vectores preferidos que llevan una secuencia de expresión de \alpha-1,2-manosidasa incluyen
pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL,
pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL y pGAPZmMycManHDEL, que se describen adicional-
mente en los Ejemplos más adelante en este documento.
El vector preferido que lleva una secuencia de expresión de glucosidasa II incluye pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADE1glsII, pPICADE1glsII, pAOX2ADE1glsII,
pYPTIADE1DE1glsII, pGAPZAglsIIHDEL y pGAPADE1glsIIHDEL, que se describen
adicionalmente en los ejemplos más adelante en este documento.
La presente invención usa un vector "knock-out" que, cuando se introduce en una cepa de levadura metilótrofa, inactiva o altera el gen Och1.
El gen OCH1 de S. cerevisiae se ha clonado (Nakayama et al. EMBO J. 11: 2511-2519, 1992). Codifica una \alpha-1,6-manosiltransferasa unida a membrana, localizada en el complejo temprano de Golgi que es funcional en el inicio de una adición de cadena externa de \alpha-1,6-polimanosa al oligosacárido central ligado a N (Man_{5}GlcNAc_{2} y Man_{8}GlcNAc_{2}) (Makanashi-Shindo et al. J. Biol. Chem. 268: 26338-26345, 1993).
Se ha descrito una secuencia de Pichia en la Solicitud de Patente Japonesa Nº 07145005 que codifica una proteína altamente homóloga al OCH1 de S. cerevisiae. Para el propósito de la presente invención, esta secuencia se denomina en este documento "el gen OCH1 de Pichia". Los especialistas en la técnica pueden aislar los genes OCH1 de otras levaduras metilótrofas usando técnicas bien conocidas en la técnica.
De acuerdo con la presente invención, una alteración en el gen OCH1 de una levadura metilótrofa puede dar como resultado la producción de un producto de proteína inactiva o no producir ningún producto. La alteración puede adoptar la forma de una inserción de una secuencia de ADN heteróloga en la secuencia codificante y/o la deleción de alguna o todas las secuencias codificantes. Las alteraciones de genes se pueden generar mediante recombinación homóloga esencialmente como se describe por Rothstein (en Methods in Enzymology, Wu et al., eds., vol 101: 202-211, 1983).
Para alterar el gen Och1 mediante recombinación homóloga se puede construir un vector knock-out de Och1 de tal forma que incluya un gen marcador seleccionable. El gen marcador seleccionable está ligado de forma funcional, tanto en el extremo 5' como 3', a partes del gen Och1 de suficiente longitud para mediar en la recombinación homóloga. El marcador seleccionable puede ser uno de varios genes que complementan cada uno la auxotrofía de célula hospedadora o proporcionan resistencia a antibióticos, incluyendo genes URA3, LEU2 e HIS3. Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen CAT que confiere resistencia a cloranfenicol en células de levadura o el gen lacZ, que da como resultado colonias azules debido a la expresión de \beta-galactosidasa activa. Después se introducen fragmentos de ADN linealizados de un vector knock-out de Och1 en células de levadura metilótrofa hospedadoras usando métodos bien conocidos en la técnica. La integración de los fragmentos lineales en el genoma y la alteración del gen Och1 se puede determinar basándose en el marcador de selección y se pueden verificar mediante, por ejemplo, análisis de Transferencia de Southern.
Alternativamente se puede construir un vector knock-out en Och1 de tal forma que incluya una parte del gen Och1 que se tiene que alterar, parte que está desprovista de cualquier secuencia de promotor Och1 y codifica ningún fragmento o un fragmento inactivo de la proteína Och1. Con "un fragmento inactivo" se quiere decir un fragmento de la proteína Och1 que tiene, preferiblemente, menos de aproximadamente el 10% y mucho más preferiblemente aproximadamente el 0% de la actividad de la proteína Och1 de longitud completa. Tal parte del gen OCH1 se inserta en un vector de tal forma que ninguna secuencia promotora conocida está ligada de forma funcional a la secuencia de OCH1, pero de tal forma que un codón de terminación y una secuencia de terminación de la transcripción están ligados de forma funcional a la parte del gen Och1. Este vector se puede linealizar posteriormente en la parte de la secuencia de OCH1 e introducir por transformación en una cepa de levadura metilótrofa usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Mediante recombinación homóloga única, este vector linealizado se integra después en el gen OCH1. Se producen dos secuencias de Och1 en el cromosoma como resultado de la recombinación homóloga única. La primera secuencia de Och I es la parte del gen Och1 del vector, que ahora está bajo el control del promotor de OCH1 de la levadura metilótrofa del hospedador, todavía no puede producir una proteína OCH1 activa ya que tal secuencia Och1 no codifica ningún fragmento o codifica un fragmento inactivo de la proteína OCH1, como se ha descrito anteriormente en este documento. La segunda secuencia Och1 es una secuencia codificante OCH1 completa, pero no está ligada de forma funcional a ninguna secuencia promotora conocida, y por tanto, no se espera que se forme ningún mensajero activo para la síntesis de una proteína OCH1 activa. Preferiblemente, se introduce una mutación inactivante en la secuencia de OCH1, en el extremo 5' del sitio de linealización al vector y el extremo 3' del codón de inicio de la traducción de OCH1. Con "mutación de inactivación" se quiere decir una mutación que introduce un codón de terminación, una mutación de desplazamiento de fase o cualquier otra mutación que provoque una alteración de la fase de lectura. Tal mutación se puede introducir en una secuencia Och1 usando cualquiera de los métodos de mutagénesis dirigida conocidos en la técnica. Tal mutación de inactivación garantiza que no se pueda formar ninguna proteína OCH1 funcional incluso si existe alguna secuencia de promotor 5' a la secuencia Och1 en el vector knock-out.
Un vector knock-out de Och1 preferido es pBLURA5'PpOCH1.
Si se desea, cualquiera o ambas de una secuencia de expresión de manosidasa y una secuencia de expresión de glucosidasa se pueden llevar sobre el mismo plásmido usado para alterar el gen OCH1 para crear un vector "knock-in y knock-out".
Adicionalmente, cualquiera de los vectores que se han descrito anteriormente puede incluir además una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína de interés en una cepa de levadura metilótrofa.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para modificar cepas de levadura metilótrofas para disminuir la glicosilación en proteínas producidas por las cepas de levadura metilótrofas. De acuerdo con los presentes métodos, las cepas de levadura metilótrofas se modifican transformando las mismas en cepas de levadura con vectores como se ha descrito anteriormente en este documento y se define en las reivindicaciones.
Las cepas de levadura metilótrofas que se pueden modificar usando los presentes métodos incluyen, pero sin limitación, levadura capaz de desarrollo sobre metanol tales como levaduras de los géneros Candida, Hansenula, Torulopsis y Pichia. Se puede encontrar una lista de especies que son ilustrativas de esta clase de levaduras en C. Anthony (1982). The Biochemistry of Methylotrophs, 269. Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia anomola, Hansenula polymorpha y Candida boidinii son ejemplos de levaduras metilótrofas útiles en la práctica de la presente invención. Las levaduras metilótrofas preferidas son del género Pichia. Se prefieren especialmente cepas de Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851); GS190 (NRRL Y-18014) descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 4.818.700: PPF1 (NRRL Y-18017) descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 4.812.405; PPY120H e yGC4; así como cepas obtenidas de las mismas.
Las cepas de levadura metilótrofa que se pueden modificar usando los presentes métodos también incluyen las cepas de levadura metilótrofas que se han modificado por ingeniería genética para expresar una o más glucoproteínas heterólogas de interés. La glicosilación en las glucoproteínas heterólogas expresadas por estas cepas modificadas por ingeniería genética previamente se puede disminuir transformando tales cepas.
Los vectores se pueden introducir en las células de una cepa de levadura metilótrofa usando métodos conocidos tales como la técnica de esferoplasto, descrita por Cregg et al. 1985, o el sistema de transformación de levadura con cloruro de litio de célula completa, Ito et al. Agric. Biol. Chem. 48: 341, modificado para el uso en Pichia como se describe en el documento EP 312.934. Otros métodos publicados útiles para la transformación de los plásmidos o vectores lineales incluyen la Patente de Estados Unidos Nº 4.929.555; Hinnen et al. Proc. Nat. Acad Sci. USA 75: 1929 (1978); Ito et al. J. Bacterial. 153: 163 (1983); la Patente de Estados Unidos Nº 4.879.231; Sreekrishna et al. Gene 59: 115 (1987). También se pueden usar electroporación y procedimientos de transformación de célula completa con PEG1000. Creeg y Russel Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Capítulo 3, Humana Press, Totowa, N. J., págs. 27-39 (1998).
Se pueden seleccionar células de levadura transformadas usando técnicas apropiadas incluyendo, pero sin limitación, cultivar células auxótrofas después de la transformación en ausencia del producto bioquímico requerido (debido a la auxotrofía de la célula), selección y detección de un nuevo fenotipo o cultivar en presencia de un antibiótico que es tóxico para la levadura en ausencia de un gen de resistencia contenido en los transformantes. Los transformantes también se pueden seleccionar y/o verificar mediante la integración del casete de expresión en el genoma, que se puede evaluar mediante, por ejemplo, Transferencia de Southern o análisis por PCR.
La expresión de una \alpha-1,2-manosidasa introducida en una cepa de levadura metilótrofa se puede verificar a nivel de ARNm, por ejemplo, mediante análisis de transferencia de Northern, y a nivel proteico, por ejemplo, mediante análisis de transferencia de Western. La localización intracelular de la proteína se puede analizar usando una diversidad de técnicas, incluyendo fraccionamiento celular y experimentos de inmunofluorescencia. Se puede determinar una localización en RE de una \alpha-1,2-manosidasa mediante co-sedimentación de esta enzima con una proteína residente en RE conocida (por ejemplo, Proteína Disulfuro Isomerasa) en un experimento de fraccionamiento subcelular. También se puede determinar una localización en RE mediante un patrón de tinción por inmunofluorescencia característico de proteínas residentes en RE, típicamente un patrón de tinción perinuclear.
Para confirmar que una \alpha-1,2-manosidasa o un parte funcional de la misma expresada en una cepa de levadura metilótrofa tiene la actividad de recorte de manosa esperada se pueden emplear ensayos tanto in vitro como in vivo. Típicamente, un ensayo in vitro implica la digestión de un sustrato sintetizado in vitro, por ejemplo, Man_{8}GlcNAc_{2}, con la enzima expresada y purificada a partir de una cepa de levadura metilótrofa y evaluar la capacidad de tal enzima de recortar Man_{8}GlcNAc_{2} a, por ejemplo, Man_{5}GlcNAc_{2}. En ensayos in vivo, la \alpha-1,2-manosidasa o una parte de la misma se co-expresa en una levadura metilótrofa con una glucoproteína que se conoce que se glicosila con N-glicanos que llevan restos de manosa ligados a \alpha-1,2 terminales en tal levadura. La actividad enzimática de una \alpha-1,2-manosidasa de este tipo o una parte de la misma se puede medir basándose en la disminución del número de restos de manosa ligados a \alpha-1,2 en las estructuras de los N-glicanos de la glucoproteína. Tanto en ensayos in vitro como in vivo, la composición de un grupo carbohidrato se puede determinar usando técnicas que se conocen bien en la técnica y se ilustran en los Ejemplos más adelante en este documento.
La actividad enzimática de una glucosidasa II o una parte funcional de la misma expresada en una cepa de levadura metilótrofa transformada se puede evaluar usando una diversidad de ensayos. Por ejemplo, células de levadura metilótrofas transformadas con una secuencia que codifica una glucosidasa II o una parte de la misma se pueden ajustar para desarrollarse sobre medio sólido que contiene un sustrato de la glucosidasa, por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indol-\alpha-D-glucopiranósido o 4-MU-\alpha-D-Glc. Cuando la enzima se expresa por la Pichia y se secreta por vía extracelular, la enzima actúa sobre el sustrato, dando lugar a señales detectables alrededor de las colonias tal como color azul y brillo fluorescente. Alternativamente, se puede recoger medio de cultivo líquido que contiene las moléculas de proteína expresada e incubar en tubos de ensayos con un sustrato, por ejemplo, p-nitrofenil-\alpha-D-glucopiranósido. La actividad enzimática se puede determinar midiendo el producto específico liberado. Además, se pueden emplear ensayos in vivo, en los que una glucosidasa II se co-expresa en levadura con una glucoproteína que se conoce que se N-glicosila con restos de glucosa, por ejemplo, neuraminidasa del virus de la gripe. La actividad enzimática de la glucosidasa II se puede medir basándose en la reducción del contenido de glucosa en la cadena o las cadenas de azúcar de la glucoproteína.
En la presente invención, una cepa de levadura metilótrofa se puede transformar con un vector knock-out de Och1. Como resultado de la transformación e integración del vector, se altera el gen Och1 genómico en las cepas de
levadura.
En la presente invención se transforma una cepa de levadura metilótrofa por transformaciones en serie, consecutivas, es decir, introduciendo un vector cada vez o, alternativamente, mediante co-transformación, es decir, introduciendo los vectores simultáneamente.
Las cepas de levadura metilótrofas modificadas que se han descrito anteriormente en este documento se pueden modificar adicionalmente si desea. Por ejemplo, se puede realizar alteración adicional de genes que codifican cualquier otra manosiltransferasa de Pichia. También se pueden introducir genes que codifican enzimas de mamífero para producir glucoproteínas que tengan N-glicanos de tipo híbrido o complejo, si se desea.
Se debe entender que determinados aspectos de la presente invención, especialmente la introducción de una actividad \alpha-1,2-manosidasa expresada intracelularmente, también son útiles para obtener una glicosilación disminuida de los glicanos ligados a O en glucoproteínas producidas en una levadura metilótrofa, ya que se conoce en la técnica que estos glicanos ligados a O consisten principalmente en restos de manosa ligados a \alpha-1,2. Otros glicanos ligados a O como se usan en este documento se refieren a estructuras de carbohidratos ligados a restos de serina o treonina de glucoproteínas.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para producir una glucoproteína con glicosilación reducida en una levadura metilótrofa, especialmente una glucoproteína heteróloga a la levadura metilótrofa.
"Una glucoproteína" como se usa en este documento se refiere a una proteína que, en levaduras metilótrofas, está glicosilada en uno o más restos de asparagina o en uno más restos de serina o treonina o tanto en restos de asparagina como de serina o treonina.
La expresión "glicosilación disminuida" se refiere a un tamaño reducido del resto de carbohidrato en la glucoproteína, particularmente con menos restos de manosa, cuando la glucoproteína se expresa en una cepa de levadura metilótrofa que se ha modificado de acuerdo con la presente invención, en comparación con una cepa de tipo silvestre, no modificada, de la levadura metilótrofa.
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De acuerdo con la presente invención se puede conseguir la producción de una glucoproteína de interés con glicosilación disminuida de varios modos. Se puede introducir una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína en una cepa de levadura metilótrofa que se ha modificado previamente de acuerdo con la presente invención, es decir, una cepa transformada con uno o más vectores y capaz de producir glucoproteínas con glicosilación reducida. Alternativamente, una cepa de levadura metilótrofa que ya se ha modificado por ingeniería genética para expresar una glucoproteína se puede transformar con uno o más de los vectores. De otro modo, si una cepa de levadura metilótrofa no expresa una glucoproteína de interés, ni la cepa se transforma con ninguno de los vectores, tal cepa de levadura se puede transformar, consecutivamente o simultáneamente, tanto con una secuencia de nucleótidos capaz de expresar después glucoproteína como con uno o más vectores. Adicionalmente, una cepa de levadura metilótrofa se puede transformar con uno o más vectores knock-in y/o knock-out que también incluyen una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína en la cepa de levadura metilótrofa.
La secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína en la levadura metilótrofa se puede preparar para incluir, de 5' a 3', un promotor, una secuencia que codifica la glucoproteína y una secuencia de terminación 3'. Los promotores y las secuencias de terminación 3' que son adecuados para la expresión de una glucoproteína pueden incluir cualquiera de los promotores y las secuencias de terminación 3' que se han descrito anteriormente en este documento.
La secuencia de nucleótidos para la expresión de una glucoproteína puede incluir secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias señal que codifican péptidos de tránsito cuando se desea la secreción de un producto proteico. Tales secuencias se conocen ampliamente, están fácilmente disponibles e incluyen prepro de factor de acoplamiento alfa (\alphamf) de Saccharomyces cerevisiae, secuencia señal de ácido fosfatasa (PHO1) de Pichia pastoris y similares.
La secuencia de nucleótidos para la expresión de una glucoproteína se puede poner en un vector replicativo o un vector integrativo. La selección y construcción de tales vectores son como se ha descrito anteriormente en este documento.
La secuencia de nucleótidos capaz de expresar una glucoproteína se puede llevar en el mismo plásmido replicativo que una unidad de expresión de \alpha-1,2-manosidasa o glucosidasa II de plásmido. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia codificante de glucoproteína se lleva en un plásmido separado o se integra en el genoma del hospedador.
Las glucoproteínas producidas se pueden purificar mediante métodos convencionales. Los protocolos de purificación se pueden determinar mediante la naturaleza de la proteína específica a purificar. Tal determinación está dentro del nivel normal de la especialidad de la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo celular se separa de las células y la proteína secretada por las células se puede aislar del medio por técnicas de aislamiento rutinarias tales como precipitación, inmunoadsorción, fraccionamiento o una diversidad de métodos cromatográficos.
Las glucoproteínas que se pueden producir mediante los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, \alpha-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, invertasa de S. cerevisiae, trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi, proteína de envuelta de VIH, hemaglutinina A de virus de la gripe, neuraminidasa del virus de la gripe, glucoproteína de herpes virus de tipo 1 bovino, angiostatina humana, receptor CTLA-4 de B7-1, B7-2 y de B-7 humano, factor tisular humano, factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas), activador de plasminógeno tisular, inhibidor I de activador de plasminógeno, uroquinasa, proteínas lisosómicas humanas tales como \alpha-galactosidasa, plasminógeno, trombina, factor XIII e inmunoglobulinas. Para glucoproteínas útiles adicionales que se pueden expresar en las cepas de Pichia modificadas por ingeniería genética de la presente invención véase Bretthauer y Castellino, Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 193-200 (1999) y Kukuruzinska et al. Ann Rev. Biochem. 56: 914-44 (1984).
Otro aspecto más de la presente invención proporciona kits que contienen una cepa de levadura metilótrofa que se ha transformado de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1 Introducción de \alpha-1,2-Manosidasa en el Borde RE-Golgi 1.1 Plásmidos
1
2 
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El gen de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei se ha aislado y descrito por Maras et al. (J. Biotechnol 77: 255-263, 2000). La secuencia de este gen está disponible en Genbank de NCBI con el número de entrada AF212153. Se generó un fragmento de construcción mediante PCR usando el plásmido pPIC9MFmanase (igual que el pPP1MFmds1 descrito por Maras et al. (2000)) como el molde y usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos: 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' (SEC ID Nº: 2) y 5'-AGTCTAGATTACAACTCGTCGTGAG
CAAGGTGGCCGCCCCGTCG-3' (SEC ID Nº: 3). El producto resultante contenía el extremo 3' del promotor AOXI de Pichia pastoris, la secuencia señal de prepro del factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae, la fase de lectura abierta de la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei clonada en fase con la secuencia señal, la secuencia codificante para HDEL, un codón de terminación y un sitio de restricción XbaI. Este fragmento se digirió con EcoRI y XbaI, eliminando las secuencias 5' hasta la ORF de manosidasa y después se clonó en el vector pGAPZ\alphaA (Invitrogen, Baarn, Países Bajos) que se había digerido con EcoRI y XbaI, restaurando de este modo la fusión con la secuencia señal de factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae. El plásmido resultante se denominó pGAPZMFManHDEL y se ilustra gráficamente en la Figura 1. La secuencia ORF de la fusión MFManHDEL en pGAPZMFManHDEL se indica en la
SEC ID Nº: 14.
Para introducir la secuencia codificante para un marcador c-Myc entre el dominio catalítico y la señal de HDEL, el extremo 3' de la ORF de la \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei se amplificó por PCR usando un cebador con sentido 5'-CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC-3' (SEC ID Nº: 4) (que contiene un sitio de restricción SphI) y un cebador antisentido GTATCTAGATTACAACTCGTCGTGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAGCAAGGTGGCC
GCCCCGTCGTGATGATGAA (SEC ID Nº: 5) (que contiene las secuencias codificantes para el marcador c-Myc y la señal de HDEL, seguido de un codón de terminación y un sitio de restricción XbaI). El producto de PCR resultante de digirió con SphI y XbaI, se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se insertó en pGAPZMFManHDEL que se había cortado con las mismas enzimas de restricción, dando como resultado el plásmido pGAPZMFManMycHDEL. Para poner la ORF de pGAPZMFManMycHDEL bajo el control del promotor AOXI inducible, toda la ORF se liberó de pGAPZMFManMycHDEL con BstBI y XbaI y se clonó en pPICZB (Invitrogen, Baarn, Países Bajos) dando como resultado pPICZBMFManMycHDEL.
La clonación del dominio catalítico de manosidasa IB de ratón con adición concomitante de la secuencia codificante para un marcador HDEL C-terminal se realizó mediante PCR en una genoteca de ADNc de ratón (ARNm aislado de la línea celular L929 inducida con cicloheximida y Factor de Necrosis Tumoral de ratón. La longitud promedia del inserto de la genoteca de ADNc fue de 2000 pb). Los cebadores oligonucleotídicos de PCR usados fueron: 5'AACTC
GAGATGGACTCTTCAAAACACAAACGC3' (SEC ID Nº: 6) y 5'TTGCGGCCGCTTACAACTCGTCGTGTCG
GACAGCAGGATTACCTGA3' (SEC ID Nº: 7). El producto contenía un sitio XhoI 5' y la secuencia codificante para el sitio de HDEL C-terminal, seguido de un codón de terminación y un sitio NotI en el extremo 3'. El producto se clonó en pGAPZ\alphaA mediante los sitios XhoI/NotI en el producto de PCR y el vector, dando como resultado una fusión en fase del dominio catalítico de manosidasa de ratón con la secuencia señal de factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae. La secuencia de toda la fase de lectura abierta generada se indica en la SEC ID Nº: 15.
1.2 Transformación de Levadura e Integración Genómica TABLA 2
3
Todas las transformaciones de Pichia pastoris se realizaron con electroporación de acuerdo con las instrucciones de Invitrogen. Los transformantes de vectores que llevan el gen de resistencia a Zeocina se seleccionaron en YPD que contenía 100 \mug/ml de Zeocina (Invitrogen, Baarn, Países Bajos) y sorbitol 1 M. La selección de los transformantes de derivados de pPIC9 se realizó en medio mínimo que carecía de histidina y que contenía sorbitol 1 M. La integración genómica de los casetes de expresión se verificó usando PCR en ADN genómico purificado de las cepas de Pichia usando el método de Minipreparación de Levadura (Nucleon). En todos los casos que se referían a las fusiones génicas de Trichoderma reesei, los cebadores usados fueron el cebador con sentido 5'-CCATTGAGGACG
CATGCCGCCGCC-3' (SEC ID Nº: 8), que hibridó con la mitad 3' de la ORF de manosidasa, y el cebador antisentido 3' AOX 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCCT-3' (SEC ID Nº: 9), que hibridó con el terminador de la transcripción AOXI que estaba presente en todas las construcciones de expresión. Para el control de la integración genómica de los transgenes de manosidasa de ratón se realizó PCR usando el cebador con sentido 5'GAP 5'GTCCCTATTTCAAT
CAATTGAA3' (SEC ID Nº: 10, hibridación con el promotor GAP o 5'AOXI 5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3' (SEC ID Nº: 11), hibridando con el promotor AOXI) y el cebador antisentido 3'AOXI (anteriormente). Para las construcciones de expresión que contenían una unidad de expresión de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei marcada con Myc, se obtuvo evidencia adicional de integración genómica usando Transferencia de Southern con toda la ORF de MFManMycHDEL (marcada con ^{32}P usando HighPrime, Boehringer Mannheim) como una sonda.
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1.3 Expresión de \alpha-1,2-manosidasa
La expresión de una \alpha-1,2-Manosidasa en cepas GS115 que expresan hemaglutinina de virus de la gripe se verificó por Transferencia de Northern cualitativa. La expresión de una \alpha-1,2-Manosidasa en cepas PPY120H se verificó por transferencia de Western anti-Myc.
Transferencia de Northern Cualitativa - Se purifico ARN total de cepas de Pichia y el producto se determinó espectrofotométricamente. Se realizó transferencia de Northern de acuerdo con procedimientos convencionales y se realizó una estimación de la cantidad de ARN cargado usando tinción con azul de metileno de la transferencia, visualizando las bandas de ARNr. La transferencia se sondó con un fragmento de ClaI/NarI de la manosidasa, marcado con ^{32}P usando HighPrime (Boehringer Mannheim).
SDS-PAGE y Transferencia de Western - Se prepararon lisados de las células de levaduras totales lavando las células dos veces con PBS, seguido de ebullición en 1 volumen de tampón de carga Laemmli concentrado 2x durante 5 minutos. El lisado se centrifugó brevemente en una microcentrífuga antes de cargar el gel y solamente se cargó el sobrenadante. Para el análisis de proteínas secretadas al medio de crecimiento, las proteínas se precipitaron de 200 \mul de este medio usando desoxicolato/ácido tricloroacético de acuerdo con procedimientos convencionales. El sedimento se re-disolvió en tampón de carga Laemmli concentrado 2x y las soluciones se corrigieron en cuanto al pH usando Tris. Se realizó SDS-PAGE seguido de electrotransferencia semiseca a membranas de nitrocelulosa. Para la Transferencia de Western se usaron los monoclonales de ratón anti-Myc 9E10 y anti-HA (Boehringer Mannheim) a una concentración de 1 \mug/ml, y se usó el antisuero anti-PDI de conejo (Stressgen) con una dilución de 1/500. Los anticuerpos secundarios eran IgG anti-ratón de cabra conjugadas con fosfatasa alcalina para los monoclonales e IgG de cabra anti-conejo para peroxidasa para el policlonal (anticuerpos secundarios de Sigma). Se realizó la detección usando el sistema NBT/BCIP para fosfatasa alcalina y el sustrato Renaissance (NENBiosciences) para peroxidasa. La representación del resultado de la última transferencia se realizó en un dispositivo de formación de imágenes Lumilager (Boehringer Mannheim).
Los resultados mostrados en la Figura 4 indicaron que la gran mayoría de la proteína marcada con HDEL se retuvo intracelularmente, tanto cuando se expresó por el promotor GAP constitutivo fuerte como cuando se expresó por el promotor AOXI inducible fuerte.
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1.4 Localización de \alpha-1,2-Manosidasa
Centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa isopícnico - Para determinar la localización de la manosidasa marcada con HDEL se realizó fraccionamiento subcelular usando células que expresan HDEL-Myc-manosidasa por el promotor GAP constitutivo fuerte.
En resumen, se lisaron 0,5 g de células de levadura de peso húmedo usando 4 x 1 minuto de agitación vorticial con 4,5 g de perlas de vidrio en 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 que contiene sorbitol 0,6 M, \beta-mercaptoetanol 10 mM y MgCl_{2} 5 mM). Entre periodos de agitación vorticial, la mezcla se puso sobre hielo durante 5 min. El sobrenadante se recogió y las perlas de vidrio se lavaron una vez con tampón de lisis y el sobrenadante de esta etapa de lavado se añadió al primer sobrenadante. Este lisado se sometió a un procedimiento de centrifugación diferencial. El sedimento P10000 se solubilizó en 0,5 ml de una solución de sacarosa al 60% en tampón de lisis. Esta solución se puso en el fondo de un tubo de ultracentrífuga Ultraclear (Beckman) de 14 x 89 mm. Posteriormente, se superpusieron cuidadosamente 1,5 ml de cada una de las soluciones de sacarosa al 55, 50, 45, 42,5, 40 y 37,5%. El tubo se llenó hasta el borde con sacarosa al 35%. Se realizó centrifugación en gradiente de sacarosa isopícnico durante 14 h a 180.000 g en un rotor SW 41 Beckman en una ultracentrífuga preparadora Beckman Modelo L8-70. Después de la finalización se recogieron fracciones de 1 ml de la parte superior y se dializaron parcialmente del exceso de sacarosa, se evaporaron hasta sequedad en una centrífuga al vacío. Después de re-disolver el sedimento en tampón Laemmli, las muestras se sometieron a SDS-PAGE por triplicado y las transferencias de Western se trataron con anti-HA, anti-Myc o anti-PDI ("PDI" para Proteína Disulfuro Isomerasa), respectivamente.
Los resultados ilustran la co-sedimentación prácticamente exacta de la proteína MFManMycHDEL con la proteína marcadora Proteína Disulfuro Isomerasa (que también se dirige con una secuencia señal de HDEL) (Figura 5). En el mismo ensayo, el OCH1 marcado con HA se distribuyó a lo largo de todo el gradiente, teniendo la mayor abundancia en fracciones una densidad inferior a la de las fracciones que contenían la manosidasa y la PDI. Este resultado indicó que la manosidasa se dirigió a la ubicación esperada (el límite RE-Golgi) mediante la adición de una señal de HDEL. Por el contrario, la manosidasa sin HDEL, expresada por el promotor de alcohol oxidasa I inducible (que tenía una fuerza comparable con el promotor GAP), se secretó a un alto nivel de aproximadamente 20 mg/l.
Microscopía de inmunofluorescencia - Para confirmar la dirección correcta de la manosidasa-Myc-HDEL se realizó un experimento de microscopía de inmunofluorescencia.
En resumen, se cultivaron cultivos de levadura hasta una DO_{600} en YPD (para pGAPZMFManMycHDEL) o en YMP después de una fase de cultivo en YPG-glicerol para pPICZBMFManMycHDEL. Se añadió formaldehído a los cultivos de levadura hasta una concentración final del 4% y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se sedimentaron y resuspendieron en tampón fosfato potásico 50 mM pH 6,5 que contenía MgCl_{2} 1 mM y formaldehído al 4% y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la sedimentación, las células se re-suspendieron hasta una DO_{600} = 10 en tampón fosfato potásico 100 mM pH 7,5 que contenía MgCl_{2} 1 mM y combinación de inhibidor de proteasa Complete^{TM} sin EDTA (Boehringer Mannheim). A 100 \mul de suspensión celular se añadieron 0,6 \mul de \beta-mercaptoetanol y 20 \mul de 20.000 U/ml de Zimolasa 100T (ICN) seguido de una incubación durante 25 minutos con agitación cuidadosa. Las células se lavaron dos veces en el tampón de incubación y se añadieron a cubreobjetos recubiertos con poli-lisina (estos se preparan usando anillos adhesivos que se usan normalmente para reforzar perforaciones en papel). El exceso de líquido se transfirió con un hisopo de algodón y las células se dejaron secar a 20ºC. Después del bloqueo se realizan etapas de incubación con anticuerpo y lavado en PBS que contiene albúmina sérica bovina al 0,05%. Los anticuerpos primarios se usan a 2 \mug/\mul y se usaron anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos (Molecular probes) a 5 \mug/\mul. El núcleo se tiñó con el ácido nucleico HOECHST 33258. Después de la fijación y permeabilización de pared celular se comprobó la integridad de la morfología de la célula de levadura en microscopía de contraste de fases y después de la inmunotinción, los portaobjetos se examinaron en un microscopio de fluorescencia Axiophot de Zeiss equipado con una cámara digital Kodak. La imágenes se procesaron usando software Macprobe 4.0 y se prepararon con Corel Photopaint 9.0.
La proteína marcadora de Golgi OCH1-HA dio el patrón de tinción de Golgi típico descrito en la bibliografía (tinción similar a motas). La tinción con el anticuerpo anti-Myc monoclonal 9E10, que reconoce manosidasa-Myc-HDEL, dio un patrón de tinción perinuclear con cierta tinción dispar en el citoplasma, altamente indicativa de una dirección a RE (Figura 4).
Basándose en los anteriores experimentos, se concluye que la manosidasa-Myc-HDEL de Trichoderma reesei se dirigió al límite RE-Golgi.
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Ejemplo 2 Co-expresión de Manosidasa-HDEL con Glucoproteínas Recombinantes Co-expresión de Manosidasa-HDEL con la trans-Sialidasa de Trypanosoma cruzi
La clonación de un gen de trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi que codifica un miembro activo de trans-sialidasa sin el dominio de repetición C-terminal se ha descrito por Laroy et al. (Protein Expression and Purification 20: 389, 2000), que se incorpora en este documento como referencia. La secuencia de este gen de trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi está disponible por Genbank del NCBI con el Nº de Entrada AJ276679. Para la expresión en P. pastoris, todo el gen se clonó en pHILD2 (Invitrogen, San Diego, CA), creando pHILD2-TS. Para permitir la mejor secreción se creó pPIC9-TS en el que la trans-sialidasa se ligó a la señal de secreción prepro del factor de acoplamiento \alpha de levadura. Los plásmidos pPIC9-TSE y pCAGGS-prepro-TSE se crearon cuando se añadió el marcador de epítopo E al extremo C de la trans-sialidasa para permitir detección y purificación sencilla. Se ha descrito la construcción de pHILD2-TS, pPIC9-TSE y pCAGGS-prepro-TSE por Laroy et al. (2000), incorporado en este documento como referencia. Los vectores usados en la construcción se hicieron disponibles a través de http://www.belspo.be/bccm/lmbp.htm#main para pCAGGS (Nº LMBP 2453), Invitrogen, San Diego, CA para pHILD2 y pPIC9 y Pharmacia Biotech para 
\hbox{pCANTAB-5E.}
El plásmido pPIC9-TSE se linealizó con SstI y se introdujo por transformación en la cepa GS 115 (his4) de P. pastoris mediante electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Uno de los transformantes se transformó adicionalmente con el plásmido pGAPZMFManHDEL, estableciendo una cepa que co-expresa Manosidasa-HDEL y la trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi.
La fermentación y purificación de proteína fue de acuerdo con los procedimientos descritos por Laroy et al. (2000).
La trans-sialidasa purificada se sometió a análisis de carbohidratos de acuerdo con Callewaert et al., Glycobiology 11, 4, 275-281, 2001. En resumen, las glucoproteínas se unieron a la membrana de PVDF en los pocillos de una placa de 96 pocillos, se redujeron, alquilaron y sometieron a desglicosilación por péptido-N-glicosidasa F. Los glicanos se derivatizaron con ácido 8-amino-1,3,6-pirenotrisulfónico por aminación reductora. Posteriormente, el exceso de marcador libre se eliminó usando columnas spin llenas de Sephadex G10 y los glicanos se analizaron por electroforesis sobre un gel de secuenciación de 36 cm en un secuenciador de ADN ABI 377A y se detectaron usando láser de argón incorporado. Los productos de digestión con 3 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de T. reesei (descrito por Maras et al., J. Biotechnol. 77, 255-63, 2000) también se realizaron en acetato sódico 20 mM pH = 5,0. Los glicanos obtenidos de 1 \mug de las glucoproteínas recombinantes purificadas se usaron como el sustrato. 1U de la \alpha-1,2-manosidasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 \mumol de manosa de manano de levadura de panadero por minuto a 37ºC y
pH = 5,0.
Como se puede observar en la Figura 6, panel B, el N-glicano principal de trans-sialidasa era Man_{8}GlcNAc_{2} (compárese con el panel F, que representa un análisis de los N-glicanos de RNAsaB bovina. El penúltimo pico en este perfil es Man_{8}GlcNAc_{2}, el primer pico es Man_{5}GlcNAc_{2}). In vitro, este glicano se podía digerir hasta Man_{5}GlcNAc_{2} con \alpha-1,2-manosidasa (Figura 6, panel C). En el perfil de N-glicano de trans-sialidasa co-expresada con manosidasa-HDEL, el pico principal se correspondía a Man_{5}GlcNAc_{2} (Figura 6, panel D).
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Co-expresión de Manosidasa-HDEL con la hemaglutinina de virus de la gripe A
Se conoce que la hemaglutinina de virus de la gripe A se glicosila en Pichia pastoris con N-glicanos de alto contenido en manosa que contienen 9-12 restos de manosa (Saelens et al. Eur. J. Biochem. 260: 166-175, 1999). El efecto de una manosidasa co-expresada en los N-glicanos de la hemaglutinina se evaluó en un método de perfilado de N-glicano descrito más adelante. Además, para comparar la eficacia de la enzima de Trichoderma (que tiene una temperatura óptima de 60ºC) con una manosidasa de mamífero que tiene una temperatura óptima de 37ºC, el dominio catalítico de la manosidasa IB de ratón se clonó de una genoteca de ADNc de ratón y se marcó con una señal HDEL por amplificación por PCR. Esta ORF se clonó después de la secuencia señal prepo del factor de acoplamiento \alpha de S. cerevisiae bajo el control del promotor GAP. La expresión de los transgenes de manosidasa-HDEL al nivel de ARNm se confirmó por transferencia de Northern cualitativa.
La hemaglutinina se expresó y purificó de una cepa de control que no expresa manosidasa y de una cepa que co-expresa la manosidasa HDEL de Trichoderma reesei o la manosidasa IB-HDEL de ratón de acuerdo con el procedimiento descrito por Kulakosky et al. Glycobiology 8: 741-745 (1998). La hemaglutinina purificada se sometió a digestión con PNGasa F como se describe por Saelens et al. Eur. J. Biochem. 260: 166-175, 1999. Las proteínas y los glicanos se precipitaron con tres volúmenes de acetona enfriada con hielo y los glicanos se extrajeron del sedimento con metanol al 60%. Después de la evaporación al vacío, los glicanos se marcaron con ácido 8-amino-1,3,6-pirenotrisulfónico añadiendo 1 \mul de una mezcla 1:1 de APTS 20 mM en ácido cítrico 1,2 M y N_{a}CNBH_{3} 1 M en DMSO e incubando durante 16 h a 37ºC en el fondo de un tubo de PCR de 250 \mul. La reacción se detuvo por la adición de 10 \mul de agua desionizada y la mezcla se cargó sobre un lecho de Sephadex G10 de 1,2 cm cargado hasta sequedad en una columna microspin mediante centrifugación en un rotor de cubeta oscilante, que se proporciona para una superficie de resina plana. Después de la carga se añadieron cuidadosamente 50 \mul de agua desionizada al lecho de resina y la columna spin se centrifugó brevemente durante 5 segundos a 750 g en una centrífuga de sobremesa. Este proceso de elución se repitió dos veces y todos los eluatos se agruparon y evaporaron hasta sequedad en una centrífuga de vacío Speedvac (Savant). Los glicanos marcados se reconstituyeron en 1,5 \mul de gel de tampón de carga que contenía formamida al 50% y 0,5 \mul de Genescan 500^{TM}, marcado con rodamina (Perkin Elmer Bioscience), que sirve como patrón de referencia interno. Esta mezcla se cargó sobre un gel de secuenciación de ADN que contenía el 10% de una mezcla 19:1 de acrilamida : bisacrilamida (Biorad, Hercules, CA, EEUU) y se preparó el tampón de secuenciación de ADN convencional (Tris 89 mM, borato 89 mM, EDTA 2,2 mM). La polimerización del gel se catalizó por la adición de 200 \mul de solución de persulfato de amonio al 10% en agua y 20 \mul de TEMED. El gel tenía la longitud de pocillo a lectura de 36 cm convencional y se procesó en un aparato de secuenciación de ADN modelo 373A de Applied Biosystems. El pre-procesamiento del gel se realizó a 1000 V durante 15 min y después de la carga, el gel se sometió a electroforesis durante 8 horas a 1250 V sin calentamiento. Esta metodología da un límite de detección de 10 fmol por pico. Los datos se analizaron con el software Genescan 3.0.
Como se muestra en la Figura 7, la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei proporcionó la reducción más completa del número de \alpha-1,2-manosas presentes en los N-glicanos. El procesamiento de N-glicano por manosidasa IB-HDEL de ratón era menos eficaz que por la \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei.
A pesar de la eliminación eficaz de \alpha-1,2-manosas de los N-glicanos de hemaglutinina, no se obtuvo Man_{5}GlcNAc_{2}. Incluso después de la digestión de los N-glicanos con 3 mU de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei purificada, solamente se obtuvo Man_{6}GlcNAc_{2} como la cadena de azúcar más pequeña. Estos resultados indican que los restos remanentes posiblemente eran manosas ligadas a \alpha-1,6, que se originan por las actividades enzimáticas de \alpha-1,6-manosiltransferasa de OCH1 de inicio. Se observó que OCH1 se localiza en una parte muy temprana del aparato de Golgi y podría actuar sobre los N-glicanos de hemaglutinina antes de la digestión completa del precursor Man_{8}GlcNAC_{2} a Man_{5}GlcNAc_{2} por las manosidasas-HDEL. Por tanto, para proteínas cuyos glicanos se modifican de forma eficaz por la \alpha-1,6-manosiltransferasa, es deseable una inactivación del gen OCH1 que codifica la transferasa para obtener proteínas con Man_{5}GlcNAc_{2}.
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Ejemplo 3 Inactivación del Gen Och1 de Pichia
Se encontró una secuencia de Pichia pastoris en el GenBank con el Nº de Entrada E12456 y se describió en la Solicitud de Patente Japonesa Nº 07145005, incorporada en este documento como referencia. Esta secuencia muestra todas las características típicas de una \alpha-1,6-manosiltransferasa y es muy homóloga con OCH1 de S. cerevisiae, denominándose, por tanto, en este documento el gen Och1 de Pichia pastoris.
En primer lugar se clonó por PCR la ORF completa del gen Och1 de Pichia pastoris en pUC18 para obtener el plásmido pUC18pOch1. pUC18pOch1 se cortó con HindIII, se unió por extremos romos con polimerasa T4, después se cortó con XbaI, liberando un fragmento que contenía la parte 5' del gen Och1 de Pichia pastoris. Este fragmento se ligó en el vector pBLURA IX (disponible en el Keck Graduate Institute, Dr. James Cregg, http://www.kgi.ed/html/noncore/faculty/cregg/cregg.htm), que se había cortado con EcoRI, se ligó por extremos romos con polimerasa T4 y después se cortó con NheI. Esta ligación generó pBLURA5'PpPCH1, como se muestra en la Figura 8.
La alteración de este gen OCH1 de Pichia en el genoma de Pichia se consiguió por recombinación homóloga única usando pBLURA5'PpOCH1, como se ilustra en la Figura 9. Como resultado de la recombinación homóloga única, el gen Och1 del cromosoma de Pichia se sustituyó por dos secuencias Och1: una consistía solamente aproximadamente en el primer tercio de la ORF de Och1 completa, la otra tenía una ORF de Och1 completa sin ningún promotor de Och1. La recombinación homóloga única se consiguió del siguiente modo. Las células de la cepa de Pichia yGC4 se transformaron por electroporación con pBLURA5'PpOCH1 que se había linealizado con el cortador único BstBI. Se obtuvieron aproximadamente 500 transformantes en medio mínimo que contenía sorbitol 1 M, biotina, arginina, adenina e histidina e incubación a 27ºC. Treinta y dos de estos transformantes se seleccionaron y re-seleccionaron en las mismas condiciones. Doce clones se analizaron adicionalmente para integración genómica correcta del casete mediante PCR. Siete de los doce clones protótrofos de URA contenían el casete en el locus correcto.
\newpage
Uno de los clones inactivados en Och1 también se transformó adicionalmente con pGAPZMFManHDEL para producir "supertransformantes". Tanto el clon inactivado en Och1 como los tres supertransformantes que también expresan ManHDEL se evaluaron en análisis de glicano de pared celular del siguiente modo. Las células de levadura se cultivaron en 10 ml de YPD hasta una DO_{600} = 2 y se prepararon manoproteínas sometiendo a autoclave las células de levadura en tampón citrato sódico 20 mM pH 7 durante 90 min a 120ºC y recuperación del sobrenadante después de la centrifugación. Se precipitaron las proteínas a partir de este sobrenadante con tres volúmenes de metanol frío. La preparación de proteína obtenida de este modo se usó para análisis de N-glicano usando DSA-FACE como se describe por Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11, 275-281. Como se muestra en la Figura 10, había una cantidad aumentada de Man_{8}GlcNAc_{2} glicano en el clon inactivado en Och1 en comparación con la cepa precursora yGC4, indicativa de una actividad reducida de la enzima Och1. En los tres supertransformantes que también expresaron la \alpha-1,2-manosidasa marcada con HDEL se observó la producción de Man_{5}GlcNAc_{2}. Además, después de la digestión de las mismas mezclas de glicano con 3 mU/ml de \alpha-1,2-manosidasa de Trichoderma reesei recombinante purificada se formó más Man_{5}GlcNAc_{2} en la cepa transformada con pBLURA5'PpOCH1 que en la cepa precursora (Figura 11, compárense panel 2 y 3).
Estos resultados confirmaron que la ausencia de una producción de Man_{5} glicanos en proteínas producidas recombinantemente tales como hemaglutinina por células que expresan \alpha-1,2-manosidasa se debía a la actividad de la proteína Och1. Estos resultados indican adicionalmente que la producción de glucoproteínas con Man_{5} glicanos se podría facilitar por la inactivación del gen Och1.
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Ejemplo 4 Expresión de Glucosidasa II en Pichia pastoris 4.1 Amplificación de la ORF de subunidad alfa de GLSII de S. cerevisiae
Se preparó ADN genómico a partir de la cepa de S. cerevisiae INVS (\alpha, leu2-3 112 his3\Delta1, trpl-289, ura3-52) usando el kit Nucleon (Amersham). Se realizó una reacción de PCR de tipo touch-down usando este ADN genómico como molde y la LA TaKaRa polimerasa (ImTec Diagnostics). La secuencia de los cebadores de PCR se basó en la secuencia conocida de la ORF de GLSII de S. cerevisiae:
100 
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4.2 Clonación de la ORF de glucosidasa II de S. cerevisiae en vectores de expresión de Pichia pastoris
Construcción de los vectores de expresión de glucosidasa II - El fragmento de PCR se digirió con XhoI/ApaI y se ligó en el vector pGAPZA (Invitrogen), poniendo de este modo la ORF bajo el control transcripcional del promotor GAP. Usando esta estrategia, el marcador myc y el His6 se pusieron en fase con el extremo C de Glucosidasa II, creando pGAPZAGLSII. La ORF completa de pGAPZAGLSII se secuenció después para garantizar que no se generaran mutaciones en la reacción de PCR. La secuencia del vector pGAPZAGLSII se indicó en la SEC ID Nº: 18. La ORF de GLSII del vector pGAPZAGLSII se clonó en el vector pPICZA (Invitrogen) para crear pPICZAGLSII, poniendo de este modo la ORF bajo el control transcripcional del promotor AOXI. La ORF de GLSII del vector pGAPZAGLSII se clonó en el vector pAOX2ZA, poniendo de este modo la ORF bajo el control transcripcional del promotor AOX2. Este vector se creó sustituyendo el sitio de multi clonación del vector pAOX2ZB por el sitio de multi clonación de pPICZA. Se generó el vector pAOX2ZB sustituyendo el promotor AOX1 de pPICZB por la región promotora AOX2 del gen AOX2 (Martinet et al., Biotechnology Letters 21). La región del promotor AOX2 se generó mediante PCR en ADN genómico de Pichia con el cebador con sentido 5'GACGAGATCTTTTTTTCAGACCATATGACCGG 3' (SEC ID Nº: 26) y el cebador antisentido 5'GCGGAATTCTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGT3' (SEC ID Nº: 27). La ORF de GLSII del vector pGAPZGLSII se clonó en el vector pYPT1ZA para crear pYPTIZAGLSII, poniendo de este modo la ORF bajo el control transcripcional del promotor YPT1. Se creó el vector pYPTZA sustituyendo el promotor AOX1 de pPICZA por el promotor YPT1 presente en el plásmido pIB3 (Nº de Entrada a GenBank AF027960) (Sears et al., Yeast 14, págs. 783-790, 1998). Todas las construcciones contienen el gen de resistencia a pleomicina. Los vectores de expresión finales resultantes (pGAPZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pPICZAGLSII y pYPT1ZAGLSII) se ilustran en las Figuras 12-15.
\newpage
Se construyeron de vectores de expresión similares, que llevaban el marcador de resistencia a Ampicilina y el marcador de selección ADE1 de Pichia. En principio, el casete de expresión de resistencia a Zeocina de los plásmidos pAOX2ZAGLSII, pGAPZAGLSII y pYPT1ZAGLSII se sustituyó por el casete ADE1 de Pichia y Ampicilina del vector pBLADE IX (Cregg, J. M.) para dar como resultado los vectores pAOX2ADE1glsII, pGAPADE1glsII y pYPT1ADE1glsII. Se obtuvo el vector pPICADE1glsII insertando la fase de lectura abierta de glucosidasa II en el sitio de clonación múltiple del vector pBLADE IX (Cregg, J. M.) Los vectores de expresión finales resultantes (pGAPADE1glsII, pAOX2ADE1glsII, pPICADE1glsII y pYPT1ADE1glsII) se ilustran en las Figuras 16-20.
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Adición del marcador de retención en RE HDEL a los vectores de expresión de Glucosidasa II
Se usaron los siguientes cebadores para generar un fragmento de PCR que contiene HDEL:
101
Se realizó PCR en pGAPZAGLSII con Taq pol. a 60ºC. El fragmento de PCR de 225 pb se cortó con SalI/SplI y se ligó en el vector pGAPZAGLSII abierto con SalI/SplI, creando el plásmido pGAPZAglsIIHDEL. La secuencia del plásmido pGAPZAglsIIHDEL se indica en la SEC ID Nº: 24. La estrategia de construcción y los vectores de expresión finales resultantes (pGAPZAglsIIHDEL y pGAPADE1glsIIHDEL) se ilustran en las Figuras 20-21.
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4.3. Transformación de cepa de Pichia pastoris
La transformación se realizó usando las técnicas de electroporación convencionales, como se describe por Invitrogen. Las células de la cepa de Pichia pastoris PPY12-OH se transformaron con pGAPZGLSII que se había cortado con el cortador único AvrII. Los transformantes se seleccionaron basándose en su resistencia a zeocina.
Análisis genómico de los transformantes - Se preparó ADN genómico a partir de algunos transformantes de Pichia resistentes a zeocina. Se realizó una reacción de PCR en el ADN genómico para determinar si el gen de glucosidasa II se había integrado o no en el genoma de levadura. Se realizó PCR usando ADN polimerasa Taq (Boehinger) (MgCl_{2} 2,5 mM, 55ºC para hibridación). Los cebadores eran iguales que los que se usaron para la amplificación de la ORF en el ADN genómico de S. cerevisiae. Se confirmaron los transformantes pGAPZAGLSII por la presencia de un producto de PCR específico indicativo de la ORF de glucosidasa II.
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4.4 Expresión y secreción de la subunidad alfa de glucosidasa II de S. cerevisiae en Pichia pastoris
Análisis a nivel transcripcional - Se preparó ARN a partir de los transformantes que tenían una puntuación positiva después del análisis genómico. Se preparó ARN usando fenol ácido. Para cada muestra se cargaron 15 \mug de ARN en un gel de agarosa con formaldehído. Después de la electroforesis, se transfirió el ARN a una membrana Hybond N. La membrana se hibridó usando una sonda radiactiva, que consistía en un fragmento específico de glucosidasa II de 344 pb, que se correspondía a la región 3' de la ORF de glucosidasa II. No se detectaron señales con cepas de control no transformadas, mientras que se observaron señales claras con los transformantes.
Análisis a nivel proteico usando un ensayo de membrana doble - Se puso una membrana de nitrocelulosa sobre un medio de dextrosa tamponado (BMDY). Sobre la parte superior de esta membrana de nitrocelulosa se puso una membrana de acetato de celulosa. Los transformantes de Pichia de pGAPZAGLSII se sembraron en estrías sobre el acetato de celulosa y se cultivaron durante unos pocos días. Las células de levadura permanecieron sobre el acetato de celulosa, mientras que las proteínas secretadas atravesaron esta membrana. De este modo, la proteína secretada se capturó sobre la membrana de nitrocelulosa. Después de unos pocos días se retiró, el acetato de celulosa, que contenía las colonias de levadura. La membrana de nitrocelulosa se analizó para la presencia de glucosidasa II usando un anticuerpo anti-myc. La mayoría de los transformantes dieron una señal clara en comparación con una señal débil, difícilmente visible con la cepa WT, no transformada.
Expresión extracelular - Los transformantes PPY12-OH de la construcción pGAPZAGLSII(mychis6) (cepas 12, 14 y 18) y los transformantes de la construcción pGAPZAGLSII(myc)HDEL (cepas H1, H2 y H3) se cultivaron durante 2 días en 2 x 10 ml de medio BMDY. Estos 6 transformantes anteriormente tuvieron una puntuación positiva tanto a nivel genómico (PCR en ADNg) como a nivel de ARN (transferencia de Northern). El medio de cultivo se recogió por centrifugación y se concentró con columnas Vivaspin hasta aproximadamente 1 ml. Las proteínas de este concentrado se precipitaron con TCA, se resuspendieron en tampón Laemmli y se cargaron para análisis de SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La transferencia se incubó durante una noche con Ab anti-myc. El Ab secundario se unió a peroxidasa. Usando el kit de detección de luminiscencia Renaissance (NEN) y una película fotosensible (Kodak) se observó una fuerte banda aproximadamente a 110 kDa para los transformantes 12, 14 y 18, indicando que se expresó y secretó GLSII por estos transformantes. No se obtuvo ninguna señal para los transformantes H1-3, lo que indica que el marcador HDEL, que se añadió al extremo C a la ORF de GLSII, dio como resultado una localización en RE de la proteína, evitando que se secretara GLSII al medio de cultivo.
Expresión intracelular - Los 6 transformantes y la cepa WT se cultivaron durante 2 días en 500 ml de BMDY. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron, resuspendieron en un volumen mínimo (Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 5%) y se rompieron usando perlas de vidrio. Los restos celulares se eliminaron mediante varias etapas de centrifugación (centrifugación a baja velocidad (2000-3000 g)). Se obtuvieron membranas del sobrenadante por ultracentrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en tampón Laemmli y se cargaron para el análisis SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La expresión de GLSII intracelular se comprobó usando Ab anti-myc y Ab secundario conjugado con peroxidasa. Después de la detección de luminiscencia se observó una banda aproximadamente a 100 kDa con los transformantes GLSIIHDEL (H1 y H3, señal débil para H2), pero no con las cepas de expresión de WT y GLSII. Estos resultados indican claramente la presencia intracelular de GLSII recombinante cuando se expresa con marcador HDEL C-terminal. No se detectó GLSII intracelularmente cuando no estaba presente este marcador.
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4.5 Ensayos de purificación y actividad de la subunidad alfa de glucosidasa II recombinante
Se ajustó un ensayo de GLSII del siguiente modo y se ensayó usando alfa-glucosidasa de levadura disponible en el mercado (Sigma) como un control positivo.
Composición: 70 \mul de tampón de fosfato-citrato 80 mM pH 6,8, 7 \mul de manosa 250 mM, 3,5 \mul de 2-desoxi-D-glucosa 250 mM, 0,8 \mul de 4-MeUmbeliferil-alfa-D-glucopiranósido (1 \muM). Se realizaron tres ensayos: uno con 1 unidad de enzima comercial, uno sin la enzima y uno con la enzima pero sin el sustrato. La mezcla de ensayo se incubó durante una noche a 30ºC. Cuando se iluminó con UV, solamente la mezcla de reacción tanto con la enzima como con el sustrato mostró fluorescencia (Figura 22). Esto indica que el ensayo era muy específico para detectar la actividad de la alfa-glucosidasa.
Se cultivaron la cepa 18 y la cepa H3 de PPY12-OH de WT durante 2 días en 2 x 10 ml de medio de cultivo. Las células se sedimentaron por centrifugación y el medio se ajustó hasta NaCl 300 mM e imidazol 10 mM y se concentró con columnas Vivaspin hasta 0,5-1 ml. Se cargó medio sobre una columna spin Ni-NTA (Qiagen) y la purificación se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se eluyó proteína de la columna en 2 x 100 \mul de tampón de elución (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM pH 8,0). Para cada eluato se ensayaron 20 \mul para su actividad de glucosidasa II. Se usaron 0,33 unidades de la enzima comercial diluida en 20 \mul del tampón de elución como un control positivo. Se observó fluorescencia con el control positivo y el eluato de la cepa 18, la cepa que secretó la enzima al medio de cultivo. Estos resultados indican que la subunidad alfa de GLSII de S. cerevisiae recombinante, secretada por Pichia pastoris, era una enzima funcionalmente activa. La actividad no se observó en la cepa WT (no transformada), ni en la cepa H3 ya que la GLSII se expresó intracelularmente (Figura 23). Estos resultados también indican que la subunidad beta no es necesaria para la funcionalidad de la parte alfa de la proteína.
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Ejemplo 5 Creación de Cepas de Pichia que Expresan tanto Glucosidasa II como Manosidasa
La cepa GS 115 se transformó con pGAPZGLSII y pGAPZglsIIHDEL. Los transformantes se seleccionaron en YPDSzeo.
La cepa yGC4 se transformó con las siguientes construcciones, respectivamente:
(1)
pGAPADEglsII y pGAPADEglsIIHDEL, selección sobre medio de sorbitol sintético sin adenina;
(2)
pGAPZMFManHDEL; selección en YPDSzeo; y
(3)
pGAPZMFManHDEL/pGAPADEglsIIHDEL: selección en medio de sorbitol sintético sin adenina y con zeocina.
La cepa yGC4 con OCH1 knock-in y que expresa MFmanosidaseHDEL se transformó con pGAPADEglsII y pGAPADEglsIIHDEL. La selección de los transformantes se realizó en medio de sorbitol sintético sin adenina y uracilo.
Se obtuvieron colonias para todas las transformaciones. Se obtuvieron transformantes con el vector o los vectores de expresión integrados en el genoma, determinados por PCR. Se observó la expresión de GLSII de algunos de estos transformantes.
SEC ID Nº: 1
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HDEL (péptido)
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SEC ID Nº: 2
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5 
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SEC ID Nº: 3
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6 
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SEC ID Nº: 4
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7 
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SEC ID Nº: 5
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8 
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SEC ID Nº: 6
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9 
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SEC ID Nº: 7
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10 
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SEC ID Nº: 8
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11 
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SEC ID Nº: 9
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12 
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SEC ID Nº: 10
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13 
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SEC ID Nº: 11
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14 
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SEC ID Nº: 12
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15 
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SEC ID Nº: 13
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16 
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SEC ID Nº: 14
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La secuencia de ORF de la fusión MFManHDEL en pGAPZMFManHDEL:
17 
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SEC ID Nº: 15
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La secuencia de ORF de la fusión MFmManHDEL en pGAPZMFmManHDEL:
18 
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SEC ID Nº: 16 pAOX2ZAGLSII
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19
20
21 
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SEC ID Nº: 17 pAOX2ADE1glsII
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22
23
24
25 
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SEC ID Nº: 18 pGAPZAGLSII
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26
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28 
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SEC ID Nº: 19 pGAPADE1glsII
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29
30
31
32 
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SEC ID Nº: 20 pPICZAGLSII
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35 
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SEC ID Nº: 21 pPICADE1glsII
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36
37
38
39 
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SEC ID Nº: 22 pYPT1ZAGLSII
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40
41
42 
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SEC ID Nº: 23 pYPT1ADE1glsII
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43
44
45
46 
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SEC ID Nº: 24 pGAPZAglsIIHDEL
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48
49
50 
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SEC ID Nº: 25 pGAPADE1glsIIHDEL
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SEC ID Nº: 26
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SEC ID Nº: 27
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SEC ID Nº: 28
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SEC ID Nº: 29
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Claims (21)

1. Una cepa modificada por ingeniería genética de una levadura metilótrofa, en la que dicha cepa se transforma con un vector capaz de expresar una \alpha-1,2-manosidasa o una parte funcional de la misma en dicha cepa, en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha \alpha-1,2-manosidasa o dicha parte funcional y en la que el gen Och1 genómico en dicha cepa está alterado de tal forma que dicha cepa no es capaz de producir una proteína Och1 funcional.
2. La cepa de la reivindicación 1, en la que dicha \alpha-1,2-manosidasa es de una especie fúngica.
3. La cepa de la reivindicación 2, en la que dicha especie fúngica es Trichoderma reesei.
4. La cepa de la reivindicación 1, en la que dicha \alpha-1,2-manosidasa es de una especie de mamífero.
5. La cepa de la reivindicación 4, en la que dicha \alpha-1,2-manosidasa es \alpha-1,2-manosidasa IA o IB murina.
6. La cepa de la reivindicación 1, en la que dicha \alpha-1,2-manosidasa o dicha parte funcional se marca con una señal de retención en RE.
7. La cepa de la reivindicación 6, en la que dicha señal de retención en RE comprende el péptido HDEL.
8. La cepa de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica dicha \alpha-1,2-manosidasa o dicha parte funcional se liga de forma funcional a un promotor y a una secuencia de terminación 3'.
9. La cepa de la reivindicación 8, en la que dicho promotor es el promotor de un gen seleccionado del grupo que consiste en AOXI, AOXII, GAP y FLD.
10. La cepa de la reivindicación 1, transformada adicionalmente con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glucosidasa II o una parte funcional de la misma.
11. La cepa de la reivindicación 10, en la que dicha glucosidasa II es de una especie fúngica.
12. La cepa de la reivindicación 11, en la que dicha especie fúngica es Saccharomyces cerevisiae.
13. La cepa de la reivindicación 10, en la que dicha glucosidasa II es de una especie de mamífero.
14. La cepa de la reivindicación 10, en la que dicha glucosidasa II o dicha parte funcional se marca con una señal de retención en RE.
15. La cepa de la reivindicación 14, en la que dicha señal de retención en RE comprende el péptido HDEL.
16. La cepa de la reivindicación 10, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica dicha glucosidasa II o dicha parte funcional se liga de forma funcional a un promotor y a una secuencia de terminación 3'.
17. La cepa de la reivindicación 16, en la que dicho promotor es el promotor de un gen seleccionado del grupo que consiste en AOXI, AOXII, GAP y FLD.
18. La cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, transformada adicionalmente con una secuencia de ácido nucleico que codifica y es capaz de expresar una glucoproteína heteróloga.
19. Uso de una cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 para disminuir la glicosilación en proteínas producidas por levadura metilótrofa.
20. Un método para producir una glucoproteína con glicosilación disminuida en una levadura metilótrofa, que comprende transformar células de una cepa de levadura metilótrofa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y con una secuencia de nucleótidos capaz de expresar dicha glucoproteína en dicha levadura y producir dicha glucoproteína por las células transformadas.
21. Un kit que comprende una cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
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