MX2012011647A - Seleccion y uso de celulas huespedes para produccion de glicoproteinas. - Google Patents

Seleccion y uso de celulas huespedes para produccion de glicoproteinas.

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MX2012011647A
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glycoprotein
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MX2012011647A
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Brian E Collins
Jay Duffner
Victor Farutin
Naveen Bhatnagar
Lakshmanan Thiruneelakantapillai
Carlos J Bosques
Ganesh Venkataraman
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Momenta Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un método para realizar una glicoproteína que tiene una glicoestructura seleccionada.

Description

SELECCION Y USO DE CELULAS HUESPEDES PARA PRODUCCION DE GLICOPROTEINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención está dirigida a métodos de selección de células huéspedes para la producción de glicoproteínas, células huéspedes y otros métodos, células y glicoproteínas relacionadas .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un producto de glicoproteína típico difiere significativamente en términos de complejidad de un fármaco de molécula pequeña típico. Las estructuras de azúcar unidas al esqueleto del aminoácido de una glicoproteína pueden variar estructuralmente de muchas maneras, incluida la secuencia, la ramificación, el contenido de azúcar y la heterogeneidad. De esta forma, los productos de glicoproteínas pueden ser mezclas heterogéneas complejas de varias moléculas diversas estructuralmente que tienen en sí mismas estructuras de glicanos complejas. La glicosilación no solo aumenta la complejidad estructural de la molécula, sino que también afecta o condiciona varios de los atributos biológicos y clínicos de una glicoproteína.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La apariencia de las modificaciones post-translacionales , por ejemplo, glicoestructuras, complemento de glicano, componente de glicano, en las proteínas, es el Ref.:236024 resultado de una interacción extremadamente compleja de muchos factores . Los métodos descritos en la presente dependen, en parte, de análisis multi-observacionalés del carácter de las modificaciones post-translacionales, por ejemplo, glicoestructuras , complemento de glicano, componente de glicano, en las proteínas realizados a partir de las poblaciones celulares seleccionadas . Los métodos permiten realizar comparaciones de la capacidad de diferentes poblaciones celulares en términos de su capacidad para conferir modificaciones post-translacionales complicadas, por ejemplo, glicoestructuras, complemento de glicano, componente de glicano, en las proteínas que realizan. Los perfiles del atributo de calidad de la población celular proporcionan distinciones sorpresivamente importantes entre poblaciones celulares, incluso para líneas celulares muy similares. Por consiguiente, los métodos descritos en la presente pueden usarse para seleccionar una célula huésped apropiada para la producción de una glicoproteína objetivo (por ejemplo, la producción de un producto biosimilar o biogenérico de una glicoproteína terapéutica biológica comercializada) , por ejemplo, los métodos descritos en la presente pueden usarse para identificar y/o seleccionar una célula huésped para la producción de un producto biosimilar o biogenérico que coincida mejor con las propiedades de glicosilación de la célula huésped en la cual se produjo la glicoproteína biológica comercializada, por ejemplo, en casos donde la población de células huéspedes en la cual se produce la glicoproteina terapéutica biológica comercializada es desconocida por el fabricante del producto biosimilar o biogenérico. En aspectos, una población celular huésped apropiada para la producción de una glicoproteina objetivo se selecciona usando los métodos descritos en la presente.
En un aspecto, la invención presenta un método de modalidad de una glicoproteina que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) , o que proporciona o selecciona una población celular, por ejemplo, una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad una glicoproteina que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada). El método comprende: (a) adquirir, directa o indirectamente, la identidad de una población celular para la producción de la glicoproteina, en donde la identidad es adquirida o determinada por un método descrito en la presente, por ejemplo, mediante (i) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población celular, de un valor que se expresa en términos de una modificación post-translacional, siendo ese valor una función de una pluralidad de observaciones distintas (por ejemplo, el nivel de expresión de una pluralidad de genes diferentes o el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras , estructuras de glicano, componentes de glicano o combinaciones de éstos) para proporcionar un conjunto de valores para la primera población celular; (ii) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una segunda población celular, de un valor que se expresa en términos de una modificación post-translacional, siendo ese valor una función de una pluralidad de observaciones distintas (por ejemplo, el nivel de expresión de una pluralidad de genes diferentes o el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras, estructuras de glicano, componentes de glicano o combinaciones de éstos) para proporcionar un conjunto de valores para la segunda población celular; (iii) comparación de un valor para una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano o combinaciones de éstos) con el conjunto de valores para la primera población celular y con el conjunto de valores para la segunda población celular; y (iv) en respuesta a la comparación, selección de la primera o segunda población celular.
En una modalidad, el método es un método para proporcionar o seleccionar una población celular, por ejemplo, una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene una segunda modificación post-translacional (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) y el método comprende además (b) cultivar la población celular seleccionada.
En una modalidad, el método es un método de modalidad de una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) y el método comprende además (b) realizar una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) en la población celular seleccionada.
En una modalidad, el método puede comprender además modificar genéticamente la población celular identificada para expresar la glicoproteína, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población celular identificada antes de la etapa (b) .
En una modalidad, se adquiere un conjunto de valores para una pluralidad, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, de poblaciones celulares.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad es de la misma especie, tejido y tipo celular, a pesar de que en modalidades pueden diferir por mutaciones naturalmente adquiridas o intencionalmente inducidas.
En algunas modalidades, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad deriva de una línea celular diferente .
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad deriva de un clon celular único diferente de una línea celular específica.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad es una población celular íntimamente relacionada.
En una modalidad, cada población celular de las poblaciones celulares comparte una célula predecesora común en donde la célula predecesora no era parte de un organismo, por ejemplo, la célula predecesora era una célula cultivada o una célula fundadora de una línea celular. Típicamente, la célula predecesora común es una célula, por ejemplo, una célula cultivada, que se ha eliminado de un organismo multicelular, por ejemplo, un insecto o animal, por ejemplo, un mamífero o primate, excluyendo como célula predecesora común, células precursoras del animal o predecesoras del animal del cual la célula predecesora común se toma.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación intencionalmente inducida que inactiva un gen que codifica una proteína que sintetiza, une o modifica un glicano. En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares de la pluralidad deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación de inactivación intencionalmente inducida en un gen que codifica una proteína seleccionada de: una glicosiltransferasa (por ejemplo, MGAT1 (GlcNAc TI) , alfa manosidasa II, IIx, alfa manosidasa IB, alfa manosidasa IA, FucTl-9, glucosidasa (por ejemplo, GCS1, GAAB) , un precursor de biosíntesis o localización o tráfico, GNE (por ejemplo, glucosamina (UDP-N-acetil) -2-epimerasa/N-acetilmanosamina) , UDP fosfatasa del aparato de Golgi, transportador de UDP-GlcNAc, UAP-1 (UDP-N-acetilhexosamina pirofosforilasa) , PGM- 3-fosfoglucomutasa 3, NAGK-N-acetil-D-glucosamina cinasa, GNPNAT1 - glucosamina-fosfato N-acetiltransferasa 1, UGP-2 -UDP-glucosa pirofosforilasa 2, UGDH - UDP-glucosa 6- deshidrogenasa, GA1K-1 - Galactocinasa-1 , PGM-1 Fosfoglucomutasa-1 , GCK - glucocinasa) , un objetivo para alterar la localización o tráfico a través del RE y el aparato de Golgi, por ejemplo, una chaperona (BiP, SNARE, cpn, hsp) , EDEM (proteína tipo manosidasa de degradación del RE) , MANEA, receptor de mañosa. En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares de la pluralidad deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación de inactivación intencionalmente inducida que modula el nivel de un metabolito de glicano, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente .
En una modalidad, las poblaciones celulares no derivan de una línea celular Pro-5. En una modalidad, las poblaciones celulares no están modificadas (por ejemplo, no son mutagenizadas químicamente) para ser resistentes a una lectina.
En una modalidad, la modificación post-translacional seleccionada es un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado.
En una modalidad, la glicoproteína es un producto biológico terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, proteína de fusión del receptor Fe, hormona, citocina. En una modalidad, la glicoproteína es una versión biosimilar o biogenérica de un producto biológico terapéutico comercializado .
En una modalidad, las observaciones para cada población celular incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones de los niveles de expresión de genes. En una modalidad, las observaciones para cada población celular incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones relativas a los niveles de un metabolito de glicano .
En una modalidad, el método, por ejemplo, (i)-(iv) comprende : (i) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular (un perfil) que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post-translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para cada una de una pluralidad de poblaciones celulares, formando los perfiles adquiridos una pluralidad de perfiles distintos; (ii) adquirir la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano o una combinación de éstos) ,- (iü) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (ii) ; (iv) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando el perfil adquirido y la identidad adquirida en (ii) muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye el último) , seleccionar una de la pluralidad de poblaciones celulares para producción de la glicoproteína objeto; seleccionar o proporcionar la población celular para realizar la glicoproteína y/o realizar la glicoproteína que tiene la modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura) en la población celular seleccionada. En algunas modalidades, el método comprende además introducir un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población celular identificada.
En una modalidad, la identidad de la población celular se adquiere directamente .
En una modalidad, la identidad de la población celular se adquiere indirectamente .
En una modalidad, la dimensionalidad de una respuesta es menor que la dimensionalidad de las observaciones.
En una modalidad, el método comprende una manipulación que reduce la dimensionalidad de la respuesta, en comparación con el número de observaciones.
En una modalidad, la comparación se realiza con la respuesta', en donde la respuesta1 tiene al menos una dimensión menor que la respuesta.
En una modalidad, el método comprende una manipulación que reduce la dimensionalidad de una respuesta', en comparación con una respuesta.
En algunas modalidades, una observación subyacente se expresa en términos de estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano. La modalidad puede tener una o más de las siguientes propiedades : las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y una segunda observación y la primera observación es el nivel de una primera modificación post-translacional, por ejemplo, estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano y la segunda observación es el nivel de una segunda modificación post-translacional , por ejemplo, estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano; la comparación comprende comparar la modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, glicoestructura, con una representación dimensional de la pluralidad de perfiles en donde el eje en cada dimensión representa un aspecto diferente de glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, en donde el eje para una primera dimensión representa el nivel de glicano A y el eje para una segunda dimensión representa el nivel del glicano B.
En algunas modalidades, una observación subyacente no se expresa en términos de estructura de glicano y se expresa, por ejemplo, en términos del nivel de expresión de uno o más genes. En las modalidades, la operación no sólo da una respuesta sino que también ofrece una respuesta en términos de la estructura de glicano. La modalidad puede tener una o más de las siguientes propiedades: las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y segunda observación y al menos una de la primera y segunda observación no se expresa en términos de estructura post-translacional , por ejemplo, glicoestructura, pero se expresa en términos de un parámetro relacionado con la estructura post-translacional , por ejemplo, glicoestructura, y la operación proporciona una respuesta expresada en términos de estructura post-translacional , por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano; las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y segunda observación y la primera observación es el nivel de un primer metabolito y la segunda observación es el nivel de un segundo metabolito; la comparación comprende comparar la respuesta para la glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano seleccionado con una representación dimensional n de la pluralidad de distintos perfiles adquiridos en donde el eje en cada dimensión se correlaciona con un aspecto diferente de glicoestructura, complemento glicano o componente de glicano, por ejemplo, en donde el eje para una primera dimensión se correlaciona con el nivel de glicano A y el eje para una segunda dimensión se correlaciona con el nivel de glicano B.
El método requiere de etapas de "adquisición", por ejemplo, adquisición de un perfil o adquisición de la identidad de una modificación post-translacional seleccionada. La adquisición del método puede incluir uno de varios elementos.
En una modalidad adquirir un valor comprende someter una muestra a un proceso que resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo utilizado en el análisis. Los métodos comprenden métodos analíticos, por ejemplo, un método que incluye uno o más de los siguientes: separar una sustancia, por ejemplo, un analito o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo, una solución amortiguadora, disolvente o reactivo; o cambiar la estructura de un analito o un fragmento de otro derivado del mismo, por ejemplo, rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito o reactivo.
En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades donde el método incluye la producción de una glicoproteína, o el cultivo de una célula, la cosecha de una glicoproteína o la purificación de una glicoproteína, u otra etapa que resulta en una transformación de una entidad usada en el método, por ejemplo, una célula, glicoproteína o reactivo, pudiendo ser la etapa de adquisición una etapa posterior que puede proporcionarse sin la transformación, por ejemplo, por inspección, comparación o recepción de información de otra parte .
En una modalidad, adquirir un perfil comprende realizar un análisis químico o físico para determinar el perfil.
En una modalidad, adquirir un perfil comprende recibir información con respecto al perfil de otra parte.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende realizar un análisis químico o físico para determinar la identidad.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende seleccionar la identidad de una descripción de un fármaco, por ejemplo, de un prospecto.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende seleccionar la identidad de una lista o tabla.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende recibir información con respecto a la identidad de la modificación post-translacional de otra parte.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano .
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6, 6,1, 1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,4,0.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean de la estructura de glicano, complemento de glicano o componente de glicano. En una modalidad, una observación es el nivel de expresión génica.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de una glicosiltransferasa.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de un gen involucrado en una biosíntesis de glicano.
En una modalidad, una observación es el nivel de un metabolito .
En una modalidad, una observación es el nivel de UMP. En una modalidad, una observación es el nivel de GTP. En una modalidad, una observación es el nivel de UDP-Gal.
En una modalidad, una observación es el nivel de GDP- Fuc .
Como se describe en otra parte en la presente, los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones celulares, por ejemplo, cepas celulares diferentes de una línea celular parental o aislados de una cepa celular parenteral .
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO Kl.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO S.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células DG44.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células DHFR(-) .
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO GS.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, varios tipos de operación son adecuados para usar en los métodos .
En una modalidad, la operación es una combinación aritmética de una pluralidad de observaciones.
En una modalidad, la operación es un ajuste a un modelo de una pluralidad de observaciones.
En una modalidad, el modelo es un modelo lineal.
En una modalidad, la operación comprende relacionar, por ejemplo, asociar, correlacionar o igualar los valores para las observaciones derivadas de una fuente de información, por ejemplo, una lista, tabla o base de datos, por ejemplo, una base de datos disponible públicamente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, varios tipos de respuestas son adecuados para usar en los métodos .
En una modalidad, la respuesta es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes, por ejemplo, en donde: al menos uno de la pluralidad de genes codifica una proteína que forma la modificación post-translacional seleccionada; al menos uno de la pluralidad de genes codifica una proteína que reduce el nivel de la modificación post-translacional seleccionada; la respuesta es el producto de una operación en los niveles de ST3GAL3 y ST3GAL .
En otro aspecto, la invención presenta, un método para proporcionar o seleccionar una población celular de una pluralidad de aislados del mismo tipo de célula, por ejemplo, aislados de una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) . El método comprende: (a) adquirir la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) ,· (b) adquirir una evaluación, por ejemplo, mediante el uso del método descrito en la presente, la capacidad de cada una de la pluralidad de aislados de el tipo de célula para producir la modificación post-translacional seleccionada, (c) seleccionar un aislado de la pluralidad de aislados, (d) cultivar opcionalmente la población celular seleccionada; proporcionando así una población celular.
En una modalidad, el método también comprende (b) cultivar la población celular seleccionada.
En una modalidad, el método comprende además (b) realizar una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) en la población celular seleccionada.
En una modalidad, el método puede comprender además modificar genéticamente la población celular identificada para expresar la glicoproteína, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población celular identificada antes de la etapa (b) .
En una modalidad, se adquiere un conjunto de valores para una pluralidad, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, de poblaciones celulares.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad es de la misma especie, tejido y tipo celular, a pesar de que en modalidades pueden diferir por mutaciones naturalmente adquiridas o intencionalmente inducidas .
En algunas modalidades, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad deriva de una línea celular diferente, cepa celular diferente o clon diferente.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad deriva de un clon celular único diferente de una línea celular específica.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares en la pluralidad es una población celular íntimamente relacionada.
En una modalidad, cada población celular de las poblaciones celulares comparte una célula predecesora común en donde la célula predecesora no era parte de un organismo, por ejemplo, la célula predecesora era una célula cultivada o una célula fundadora de una línea celular. Típicamente, la célula predecesora común es una célula, por ejemplo, una célula cultivada, que se ha eliminado de un organismo multicelular, por ejemplo, un insecto o animal, por ejemplo, un mamífero o primate, excluyendo como célula predecesora común, células precursoras del animal o predecesoras del animal del cual la célula predecesora común se toma.
En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación intencionalmente inducida que inactiva un gen que codifica una proteína que sintetiza, une o modifica un glicano. En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares de la pluralidad deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación de inactivación intencionalmente inducida en un gen que codifica una proteína seleccionada de: una glicosiltransferasa (por ejemplo, MGAT1 (GlcNAc TI) , alfa manosidasa II, IIx, alfa manosidasa IB, alfa manosidasa IA, FucTl-9, glucosidasa (por ejemplo, GCS1, GANAB) , un precursor de biosíntesis o localización o tráfico, GNE (por ejemplo, glucosamina (UDP-N-acetil) -2-epimerasa/N-acetilmanosamina) , UDP fosfatasa del aparato de Golgi, transportador de UDP-GlcNAc, UAP-1 (UDP-N-acetilhexosamina pirofosforilasa) , PGM-3-fosfoglucomutasa 3, NAGK-N-acetil-D-glucosamina cinasa, GNPNATl - glucosamina-fosfato N-acetiltransferasa 1, UGP-2 -UDP-glucosa pirofosforilasa 2, UGDH - UDP-glucosa 6-deshidrogenasa, GA1K-1 - Galactocinasa-1 , PGM-1 Fosfoglucomutasa-1 , GCK - glucocinasa) , un objetivo para alterar la localización o tráfico a través del RE y el aparato de Golgi, por ejemplo, una chaperona (BiP, SNARE, cpn, hsp) , EDEM (proteína tipo manosidasa de degradación del RE) , MANEA, receptor de mañosa. En una modalidad, cada una de las poblaciones celulares de la pluralidad deriva de una célula predecesora común y ninguna de las poblaciones celulares de la pluralidad tiene una mutación de inactivación intencionalmente inducida que modula el nivel de un metabolito de glicano, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente.
En una modalidad, las poblaciones celulares no derivan de una línea celular Pro-5. En una modalidad, las poblaciones celulares no están modificadas (por ejemplo, no son mutagenizadas químicamente) para ser resistentes a una lectina.
En una modalidad, la modificación post-translacional seleccionada es un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado.
En una modalidad, la glicoproteína es un producto biológico terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, proteína de fusión del receptor Fe, hormona, citocina. En una modalidad, la glicoproteína es una versión biosimilar o biogenérica de un producto biológico terapéutico comercializado .
En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones celulares incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones de los niveles de expresión de genes. En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones celulares incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones relativas a los niveles de un metabolito de glicano.
En una modalidad, el método, por ejemplo, (i) - (iv) comprende : (i) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular (un perfil) que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post-translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para cada una de una pluralidad de poblaciones celulares, formando los perfiles adquiridos una pluralidad de perfiles distintos; (ii) adquirir la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano) ; (iii) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (ii) ; (iv) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando el perfil adquirido y la identidad adquirida en (ii) muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye el último) , seleccionar una de la pluralidad de poblaciones celulares para producción de la glicoproteína blanco; seleccionar o proporcionar la población celular para realizar la glicoproteína y/o realizar la glicoproteína que tiene la modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura) en la población celular seleccionada. En algunas modalidades, el método comprende además modificar genéticamente la población celular identificada para expresar la glicoproteína, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población celular identificada.
En una modalidad, la identidad de la población celular se adquiere directamente .
En una modalidad, la identidad de la población celular se adquiere indirectamente .
En una modalidad, la dimensionalidad de una respuesta es menos que la dimensionalidad de las observaciones.
En una modalidad, el método comprende una manipulación que reduce la dimensionalidad de la respuesta, en comparación con el número de observaciones.
En una modalidad, la comparación se realiza con la respuesta' , en donde la respuesta' tiene al menos una dimensión menor que la respuesta.
En una modalidad, el método comprende una manipulación que reduce la dimensionalidad de una respuesta', en comparación con una respuesta.
En algunas modalidades, una observación subyacente se expresa en términos de estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano. La modalidad puede tener una o más de las siguientes propiedades : las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y una segunda observación y la primera observación es el nivel de una primera modificación post-translacional , por ejemplo, estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano y la segunda observación es el nivel de una segunda modificación post-translacional, por ejemplo, estructura de glicano, glicoestructura, componente de glicano o complemento de glicano; la comparación comprende comparar la modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, glicoestructura, con una representación dimensional de la pluralidad de perfiles en donde el eje en cada dimensión representa un aspecto diferente de glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, en donde el eje para una primera dimensión representa el nivel de glicano A y el eje para una segunda dimensión representa el nivel del glicano B.
En algunas modalidades, una observación subyacente no se expresa en términos de estructura de glicano y se expresa, por ejemplo, en términos del nivel de expresión de uno o más genes. En las modalidades, la operación no sólo da una respuesta sino que también ofrece una respuesta en términos de la estructura de glicano. La modalidad puede tener una o más de las siguientes propiedades: las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y segunda observación y al menos una de la primera y segunda observación no se expresan en términos de estructura post-translacional , por ejemplo, glicoestructura, pero se expresan en términos de un parámetro relacionado con la estructura post-translacional, por ejemplo, glicoestructura, y la operación proporciona una respuesta expresada en términos de estructura post-translacional, por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano; las respuestas en el perfil adquirido se basan en una primera y segunda observación y la primera observación es el nivel de un primer metabolito y la segunda observación es el nivel de un segundo metabolito; la comparación comprende comparar la respuesta para la glicoestructura seleccionada, complemento de glicano o componente de glicano con una representación dimensional n de la pluralidad de distintos perfiles adquiridos en donde el eje en cada dimensión se correlaciona con un aspecto diferente de glicoestructura, complemento glicano o componente de glicano, por ejemplo, en donde el eje para una primera dimensión se correlaciona con el nivel de glicano A y el eje para una segunda dimensión se correlaciona con el nivel de glicano B.
El método requiere las etapas de "adquisición", por ejemplo, adquisición de un perfil o adquisición de la identidad de una modificación post-translacional seleccionada. La adquisición del método puede incluir uno de varios elementos .
En una modalidad adquirir un valor comprende someter una muestra a un proceso que resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo utilizado en el análisis. Los métodos comprenden métodos analíticos, por ejemplo, un método que incluye uno o más de los siguientes: separar una sustancia, por ejemplo, un analito o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito o fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo, una solución amortiguadora, disolvente o reactivo; o cambiar la estructura de un analito o un fragmento de otro derivado del mismo, por ejemplo, rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito o reactivo.
En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades donde el método incluye la producción de una glicoproteína, o el cultivo de una célula, la cosecha de una glicoproteína o la purificación de una glicoproteína, u otra etapa que resulta en una transformación de una entidad usada en el método, por ejemplo, una célula, glicoproteína o reactivo, pudiendo ser la etapa de adquisición una etapa posterior que puede proporcionarse sin la transformación, por ejemplo, por inspección, comparación o recepción de información de otra parte.
En una modalidad, adquirir un perfil comprende realizar un análisis químico o físico para determinar el perfil.
En una modalidad, adquirir un perfil comprende recibir información con respecto al perfil de otra parte.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende realizar un análisis químico o físico para determinar la identidad.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende seleccionar la identidad de una descripción de un fármaco, por ejemplo, de un prospecto .
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende seleccionar la identidad de una lista o tabla.
En una modalidad, adquirir la identidad de una modificación post-translacional comprende recibir información con respecto a la identidad de la modificación post-translacional de otra parte.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano .
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,4,0.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean de la estructura de glicano, complemento de glicano o componente de glicano. En una modalidad, una observación es el nivel de expresión génica.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de una glicosiltransferasa .
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de un gen involucrado en una biosíntesis de glicano .
En una modalidad, una observación es el nivel de un metabolito.
En una modalidad, una observación es el nivel de UMP. En una modalidad, una observación es el nivel de GTP. En una modalidad, una observación es el nivel de UDP- Gal.
En una modalidad, una observación es el nivel de GDP- Fuc .
Como se describe en otra parte en la presente, los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones celulares, por ejemplo, cepas celulares diferentes de una linea celular parental o aislados diferentes de una cepa celular parenteral.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO Kl.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO S .
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células DG44.
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células DHFR(-) .
En una modalidad, una de las poblaciones celulares de la pluralidad de poblaciones celulares es una línea de células CHO GS.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, varios tipos de operación son adecuados para usar en los métodos .
En una modalidad, la operación es una combinación aritmética de una pluralidad de observaciones .
En una modalidad, la operación es un ajuste a un modelo de una pluralidad de observaciones.
En una modalidad, el modelo es un modelo lineal. En una modalidad, la operación comprende relacionar, por ejemplo, asociar, correlacionar o igualar los valores para las observaciones derivadas de una fuente de información, por ejemplo, una lista, tabla o base de datos, por ejemplo, una base de datos disponible públicamente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, varios tipos de respuestas son adecuados para usar en los métodos .
En una modalidad, la respuesta es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes, por ejemplo, en donde: al menos una de la pluralidad de genes codifica una proteína que forma la modificación post-translacional seleccionada; al menos uno de la pluralidad de genes codifica una proteína que reduce el nivel de la modificación post-translacional seleccionada; la respuesta es el producto de una operación en los niveles de ST3GAL3 y ST3GAL4.
En otro aspecto, la invención presenta un método de selección o evaluación de una célula, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada. El método comprende : (a) adquirir, directa o indirectamente, la identidad de una población celular para la producción de la glicoproteína, en donde la identidad adquirida es determinada mediante (i) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población celular, de un valor que se expresa en términos de una modificación post-translacional, siendo ese valor una función de una pluralidad de observaciones distintas (por ejemplo, el nivel de expresión de una pluralidad de genes diferentes o el nivel de expresión de una pluralidad de glicoestructura diferente, complemento de glicano o componente de glicano) para proporcionar un conjunto de valores para la primera población celular; (ii) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una segunda población celular, de un valor que se expresa en términos de una modificación post-translacional, siendo ese valor una función de una pluralidad de observaciones distintas para proporcionar un conjunto de valores para la segunda población celular; (iii) comparación de un valor para una modificación post-translacional (por ejemplo, una glicoestructura, un complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) con el conjunto de valores para la primera población celular y con el conjunto de valores para la segunda población celular; y (iv) en respuesta a la comparación, selección de la primera o segunda población celular; o seleccionar de esa forma o evaluar la célula, en donde : (1) la etapa (i y/o ii) comprende cultivar una población celular, realizar un análisis químico o físico para proporcionar una respuesta, por ejemplo, análisis químico o físico para proporcionar una observación.
En una modalidad, el método, por ejemplo, (i) - (iv) comprende : (i) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post-translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para cada una de una pluralidad de poblaciones celulares, formando los perfiles adquiridos una pluralidad de perfiles distintos; (ii) adquirir la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano) ; (iii) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (b) ; (iv) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando el perfil adquirido y la identidad adquirida en (b) muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye el último) , seleccionar una de la pluralidad de poblaciones celulares para producción de la glicoproteína objeto, para seleccionar de esa forma o evaluar la célula, en donde : la etapa (i) comprende cultivar una población celular, realizar un análisis químico o físico para proporcionar una respuesta, por ejemplo, una análisis químico o físico para proporcionar una observación; la etapa (ii) comprende realizar una análisis químico o físico para proporcionar la identidad; la etapa (iii) comprende proporcionar una representación del perfil como un espacio n-dimensional y comparar la identidad con el espacio; u opcionalmente, el método comprende además cultivar la célula seleccionada.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada, por ejemplo, el nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente o un metabolito, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones celulares, por ejemplo, una población de células CHO u otra población celular descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente son adecuados varios tipos de operación para utilizar en los métodos, por ejemplo, operaciones descritas en la presente, por ejemplo, una combinación aritmética o modelo lineal.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente varios tipos de respuestas son adecuados para utilizar en los métodos, por ejemplo, una respuesta descrita en la presente, por ejemplo, una respuesta que es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes .
Como se describe en otra parte en la presente, los tipos de respuestas y/u observaciones pueden ser el nivel de expresión de un gen o genes descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención presenta un método para proporcionar una población de células, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada. El método comprende : (a) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post-translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para cada una de una pluralidad de poblaciones celulares, formando los perfiles adquiridos una pluralidad de perfiles distintos; (ii) adquirir la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) ; (c) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (b) ; (d) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando el perfil adquirido y la identidad adquirida en (b) muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye el último) , seleccionar una de la pluralidad de poblaciones celulares para producción de la glicoproteína objeto; y (e) cultivar la población celular seleccionada para proporcionar la población.
Como se describe en otra parte en la presente, un método puede requerir una o más etapas de "adquisición", por ejemplo, adquisición de un perfil o adquisición de la identidad de una modificación post-translacional seleccionada. En una modalidad adquirir un valor comprende someter una muestra a un proceso que resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo utilizado en el análisis, por ejemplo, un análisis descrito en la presente. En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades donde el método incluye la producción de una glicoproteína, o el cultivo de una célula, la cosecha de una glicoproteína o la purificación de una glicoproteína u otra etapa que resulta en una transformación de una entidad usada en el método, por ejemplo, una célula, glicoproteína o reactivo, pudiendo ser la etapa de adquisición una etapa posterior que puede proporcionarse sin la transformación, por ejemplo, por inspección, comparación o recepción de información de otra parte.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de glicoestructura, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean estructura de glicano, por ejemplo, el nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente o un metabolito, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente .
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones celulares, por ejemplo, una población de células CHO u otra población celular descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de operación para utilizar en los métodos, por ejemplo, operaciones descritas en la presente, por ejemplo, una combinación aritmética o modelo lineal .
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de respuestas para utilizar en los métodos, por ejemplo, una respuesta descrita en la presente, por ejemplo, una respuesta que es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes .
Como se describe en otra parte en la presente, los tipos de respuestas y/u observaciones pueden ser el nivel de expresión de -un gen o genes descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención presenta un método para monitorear un proceso de producción para realizar una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada. El método comprende: (a) adquirir, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población celular, un valor que se expresa en términos de una modificación post-translacional, siendo ese valor una función de una pluralidad de observaciones distintas (por ejemplo, el nivel de expresión de una pluralidad de genes diferentes o el nivel de expresión de una pluralidad de glicoestructura diferente, complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) para proporcionar un conjunto de valores para la primera población celular; (b) comparar un valor para una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, un complemento de glicano o componente de glicano, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) con el conjunto de valores para la primera población celular; y (c) si la comparación muestra una primera relación preseleccionada con el conjunto de valores, por ejemplo, el conjunto de valores incluye la identidad, buscar una primera opción, por ejemplo, continuar con el cultivo; y si la comparación muestra una segunda relación preseleccionada con el conjunto de valores, por ejemplo, el conjunto de valores no incluye la identidad, buscar una segunda opción, por ejemplo, cesar las condiciones de cultivo actuales o cultivar bajo un nuevo conjunto de condiciones.
En una modalidad, el método comprende: (a) adquirir un perfil del atributo de calidad de población celular que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post-translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para una alícuota de células de producción; (b) comparar la identidad de una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, glicoestructura) con el perfil; (c) si la comparación muestra una primera relación preseleccionada con el perfil, por ejemplo, el perfil incluye la identidad, buscar una primera opción, por ejemplo, continuar con el cultivo; y si la comparación muestra una segunda relación preseleccionada con el perfil, por ejemplo, el perfil no incluye la identidad, buscar una segunda opción, por ejemplo, cesar las condiciones de cultivo actuales o cultivar bajo un nuevo conjunto de condiciones.
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano y/o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y si el perfil incluye la identidad del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado continuar el cultivo de las células CHO, por ejemplo, para producir una glicoproteína biogenérica o biosimilar de la glicoproteína terapéutica biológica.
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano y/o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y si el perfil no incluye la identidad del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado buscar una segunda opción, por ejemplo, seleccionar una población de células CHO diferente que tiene un perfil que incluye el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado, por ejemplo, para producir una glicoproteína biogenérica o biosimilar de la glicoproteína terapéutica biológica.
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano y/o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y si el perfil incluye la identidad del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado continuar el cultivo de las células CHO, por ejemplo, para producir la glicoproteína terapéutica biológica .
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano y/o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y si el perfil no incluye la identidad del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado buscar una segunda opción, por ejemplo, cesar las condiciones de cultivo actuales o cultivar bajo un nuevo conjunto de condiciones, por ejemplo, condiciones que resultan en un perfil que incluye la identidad del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado, para producir la glicoproteína terapéutica biológica.
Como se describe en otra parte en la presente, un método puede requerir una o más etapas de "adquisición", por ejemplo, adquisición de un perfil o adquisición de la identidad de una modificación post-translacional seleccionada. En una modalidad, adquirir un valor comprende someter una muestra a un proceso que resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo utilizado en el análisis, por ejemplo, un análisis descrito en la presente. En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades donde el método incluye la producción de una glicoproteína, o el cultivo de una célula, la cosecha de una glicoproteína o la purificación de una glicoproteína u otra etapa que resulta en una transformación de una entidad usada en el método, por ejemplo, una célula, glicoproteína o reactivo, pudiendo ser la etapa de adquisición una etapa posterior que puede proporcionarse sin la transformación, por ejemplo, por inspección, comparación o recepción de información de otra parte .
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean estructura de glicano, por ejemplo, el nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente o un metabolito, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente .
Como se describe en otra parte en la presente, los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones diferentes, por ejemplo, una población de células CHO u otras descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de operación para utilizar en los métodos, por ejemplo, las operaciones descritas en la presente, por ejemplo, una combinación aritmética o modelo lineal .
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de respuestas para utilizar en los métodos, por ejemplo, una respuesta descrita en la presente, por ejemplo, una respuesta que es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes .
Como se describe en otra parte en la presente, los tipos de respuestas y/u observaciones pueden ser el nivel de expresión de un gen o genes descritos en la presente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método de selección de una glicoproteína para fabricación en una población celular. El método comprende: (a) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una glicoestructura y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para una población celular; (b) adquirir las identidades de una pluralidad de glicoestructuras; (c) comparar el perfil adquirido con las identidades adquiridas en (b) ; (d) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando las identidades adquiridas en (b) y el perfil adquirido muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye el último) , seleccionar una de la pluralidad de glicoestructuras para producción en la población celular; y (e) realizar una glicoproteína que tiene la glicoestructura seleccionada en la población celular.
Como se describe en otra parte en la presente, un método puede requerir una o más etapas de "adquisición", por ejemplo, adquisición de un perfil o adquisición de la identidad de una modificación post-translacional seleccionada. En una modalidad adquirir un valor comprende someter una muestra a un proceso que resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo utilizado en el análisis, por ejemplo, un análisis descrito en la presente. En otras modalidades, por ejemplo, en modalidades donde el método incluye la producción de una glicoproteína, o el cultivo de una célula, la cosecha de una glicoproteína o la purificación de una glicoproteína, u otra etapa que resulta en una transformación de una entidad usada en el método, por ejemplo, una célula, glicoproteína o reactivo, pudiendo ser la etapa de adquisición una etapa posterior que puede proporcionarse sin la transformación, por ejemplo, por inspección, comparación o recepción de información de otra parte .
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos que no sean estructura de glicano, por ejemplo, el nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente o un metabolito, por ejemplo, un metabolito descrito en la presente .
Como se describe en otra parte en la presente, los métodos descritos en la presente pueden usarse con un intervalo de poblaciones diferentes, por ejemplo, una población de células CHO u otras descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de operación para utilizar en los métodos, por ejemplo, operaciones descritas en la presente, por ejemplo, una combinación aritmética o modelo lineal.
Como se describe en otra parte en los métodos descritos en la presente, son adecuados varios tipos de respuestas para utilizar en los métodos, por ejemplo, una respuesta descrita en la presente, por ejemplo, una respuesta que es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes .
Como se describe en otra parte en la presente, los tipos de respuestas y/u observaciones pueden ser el nivel de expresión de un gen o genes descritos en la presente.
En un aspecto, la descripción presenta una base de datos, que comprende una pluralidad de registros para aislados de una población celular de una población celular preseleccionada, por ejemplo, células CHO, en donde cada registro comprende un identificador para un aislado único (en oposición a otros en la pluralidad) de el tipo celular preseleccionado y un identificador para un perfil del atributo de la calidad de la población celular para el aislado, y en donde el perfil del atributo de calidad de la población celular para cada entrada es único (en oposición a otros en la pluralidad) para el aislado.
En una modalidad, un tipo celular preseleccionado es CHO u otra población celular descrita en la presente.
Una base de datos que comprende una pluralidad de registros, correspondiendo cada registro de la pluralidad a un aislado de una población celular de una población celular preseleccionada, por ejemplo, células CHO, en donde la pluralidad de registros comprende: un primer registro que comprende un identificador para un primer aislado del tipo celular preseleccionado y un identificador para un primer perfil del atributo de calidad de la población celular para el primer aislado, un segundo registro que comprende un identificador para un segundo aislado del tipo celular preseleccionado y un identificador para un segundo perfil del atributo de calidad de la población celular único para el segundo aislado, en donde el perfil del atributo de calidad de la población celular en cada uno de los registros de la pluralidad de registros es distinto para cada aislado en la pluralidad es diferente del perfil del atributo de calidad de la población celular para cada uno de los otros aislados en la pluralidad.
En una modalidad, la base de datos comprende registros para al menos 5, 10 o 20 aislados.
En un aspecto, la invención presenta un método de modalidad de una glicoproteína que tiene un componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado, o que proporciona o selecciona una población de células CHO de una pluralidad de poblaciones de CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene un componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado. El método comprende : (a) adquirir, directa o indirectamente, la identidad de una población de células CHO para la producción de la glicoproteína, en donde la identidad es adquirida o determinada por un método descrito en la presente, por ejemplo, mediante (i) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población de células CHO, por ejemplo, una población de células CHO descrita en la presente, de un valor que se expresa en términos de componente de glicano y/o complemento de glicano, siendo el valor una función de una pluralidad de observaciones distintas que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de genes y el nivel de expresión de una pluralidad de glicoestructuras diferentes, estructuras de glicano, componentes de glicano, complemento de glicano o combinaciones de éstos, para proporcionar un conjunto de valores para la primera población de células CHO; (ii) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una segunda población de células CHO, por ejemplo, una población de células CHO descrita en la presente, de un valor que se expresa en términos de componente de glicano y/o complemento de glicano, siendo el valor una función de una pluralidad de observaciones distintas que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de genes y/o metabolitos y el nivel de expresión de una pluralidad de glicoestructuras diferentes, estructuras de glicano, componentes de glicano, complemento de glicano o combinaciones de éstos, para proporcionar un conjunto de valores para la segunda población de células CHO, en donde la segunda población de células CHO difiere de la primera población de células CHO, por ejemplo, por una mutación naturalmente adquirida o intencionalmente inducida; (iii) comparación de un valor para un componente de glicano o complemento de glicano seleccionado con el conjunto de valores para la primera población de células CHO y con el conjunto de valores para la segunda población de células CHO; (iv) en respuesta a la comparación, selección de la primera o segunda población de células CHO.
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y la población de células CHO seleccionada tiene un conjunto de valores que indica que produce una glicoproteína que tiene el componente de glicano y/o complemento de glicano de la glicoproteína terapéutica biológica comercializada.
En una modalidad, la glicoproteína es un anticuerpo terapéutico, proteína de fusión del receptor Fe, hormona, citocina. En una modalidad, la glicoproteína es una versión biosimilar o biogenérica de un producto biológico terapéutico comercializado .
En una modalidad, el método es un método para proporcionar o seleccionar una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada (por ejemplo, una glicoestructura, complemento de glicano, componente de glicano seleccionados, por ejemplo, con una estructura de glicano seleccionada) y el método comprende además (b) cultivar la población de células CHO seleccionada.
En una modalidad, el método es un método de modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado, y el método comprende además (b) realizar una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado en la población de células CHO seleccionada.
En una modalidad, el método puede comprender además modificar genéticamente la población de células CHO identificada para expresar la glicoproteína, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población de células CHO identificada antes de la etapa (b) .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO Kl .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO S.
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células DG44.
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células DHFR(-) .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO GS .
En una modalidad, se adquiere un conjunto de valores para una pluralidad, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, de poblaciones de células CHO. En una modalidad, un conjunto de valores se adquiere para una pluralidad de poblaciones de células CHO que incluyen una línea de células CHO Kl, una línea de células CHO S, una línea de células DG44 y una línea de células DHFR ( - ) .
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos del nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente, o un metabolito descrito en la presente.
En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones de células CHO incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones de los niveles de expresión de genes. En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones celulares incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones relativas a los niveles de un metabolito de glicano.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1, 0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,4,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de una glicosiltransferasa .
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de un gen involucrado en una biosíntesis de glicano.
En una modalidad, una observación es el nivel de un metabolito .
En una modalidad, una observación es el nivel de UMP. En una modalidad, una observación es el nivel de GTP. En una modalidad, una observación es el nivel de UDP- Gal .
En una modalidad, una observación es el nivel de GDP- Fuc .
En un aspecto, la invención presenta un método de modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado, o que proporciona o selecciona una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteina que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado. El método comprende: (i) adquirir un perfil del atributo de calidad de población celular (un perfil) , que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de una modificación post- translacional y es el producto de una operación por una pluralidad de observaciones, para cada una de una pluralidad de poblaciones de células CHO, formando los perfiles adquiridos una pluralidad de perfiles distintos; (ii) adquirir la identidad del complemento de glicano y/o componente de glicano; (üi) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (ii) ; (iv) en respuesta a la comparación (por ejemplo, cuando el perfil adquirido y la identidad adquirida del componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado muestran una relación preseleccionada entre sí, por ejemplo, el primero incluye al último) , seleccionar una de la pluralidad de poblaciones de células CHO para producción de la glicoproteína objeto; seleccionar o proporcionar la población de células CHO para realizar la glicoproteína y/o realizar la glicoproteína que tiene el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado en la población de células CHO seleccionada. En algunas modalidades, el método comprende además introducir un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población de células CHO .
En una modalidad, el componente de glicano y/o complemento de glicano seleccionado es un componente de glicano o complemento de glicano de una glicoproteína terapéutica biológica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica biológica comercializada, y la población de células CHO seleccionada tiene un conjunto de valores que indica que produce una glicoproteína que tiene el componente de glicano y/o complemento de glicano de la glicoproteína terapéutica biológica comercializada.
En una modalidad, la glicoproteína es un anticuerpo terapéutico, proteína de fusión del receptor Fe, hormona, citocina. En una modalidad, la glicoproteína es una versión biosimilar o biogenérica de un producto biológico terapéutico comercializado .
En una modalidad, el método es un método para proporcionar o seleccionar una población de células CHO, por ejemplo, para usar en la modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado y el método comprende además cultivar la población de células CHO.
En una modalidad, el método es un método de modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado, y el método comprende además realizar una glicoproteína que tiene un complemento de glicano y/o componente de glicano seleccionado en la población de células CHO seleccionada.
En una modalidad, el método puede comprender además modificar genéticamente la población de células CHO seleccionada para expresar la glicoproteína, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína en la población de células CHO identificada.
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO Kl .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO S.
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células DG4 .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células DHFR(-) .
En una modalidad, una de las poblaciones de células CHO de la pluralidad de poblaciones de células CHO es una línea de células CHO GS .
En una modalidad, se adquiere un conjunto de respuestas para una pluralidad, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, de poblaciones de células CHO. En una modalidad, un conjunto de respuestas se adquiere para una pluralidad de poblaciones de células CHO que incluyen una línea de células CHO Kl, una línea de células CHO S, una línea de células DG44 y una línea de células DHFR(-) .
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos de estructura de glicano, por ejemplo, una estructura de glicano descrita en la presente.
Como se describe en otra parte en la presente, una observación puede expresarse en términos del nivel de expresión génica, por ejemplo, un gen descrito en la presente, o un metabolito descrito en la presente.
En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones de células CHO incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones de los niveles de expresión de genes. En una modalidad, las observaciones para cada una de las poblaciones de células CHO incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más observaciones relativas a los niveles de un metabolito de glicano.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,4,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 4,5,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5 , 5,1,0 , 0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,0,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 5,6,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,6,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,1,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,2,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,3,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de 6,7,1,4,0.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de una glicosiltransferasa.
En una modalidad, una observación es el nivel de expresión de un gen involucrado en una biosintesis de glicano.
En una modalidad, una observación es el nivel de un metabolito .
En una modalidad, una observación es el nivel de UMP. En una modalidad, una observación es el nivel de GTP. En una modalidad, una observación es el nivel de UDP-Gal.
En una modalidad, una observación es el nivel de GDP- Fuc .
Como se describe en otra parte en la presente, son adecuados varios tipos de observaciones para usar en los métodos, por ejemplo, operaciones descritas en la presente, por ejemplo, una combinación aritmética o modelo lineal.
Como se describe en otra parte en la presente, son adecuados varios tipos de respuestas para usar en los métodos, por ejemplo, una respuesta descrita en la presente, por ejemplo, una respuesta que es el producto de una operación en el nivel de expresión de una pluralidad de genes .
Como se describe en otra parte en la presente, los tipos de respuestas y/u observaciones pueden ser el nivel de expresión de un gen o genes descritos en la presente.
Los títulos y literales y numerales, por ejemplo, (a), (b) , (i), etc., se presentan meramente para facilitar la lectura de la descripción y las reivindicaciones. El uso de títulos y literales y numerales en la descripción o reivindicaciones no requiere que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o numérico o en el orden en el cual se presentan.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones .
Los figuras se describen primero brevemente: BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS la Fig. 1 es un cromatograma ilustrativo de glicanos de la glicoproteína aislada que se liberó, etiquetó y analizó por LC y LC/MS; la Fig. 2 es una representación de datos de LC ilustrativos de la distribución del producto de clones de CHO; la Fig. 3 es una gráfica de análisis de PCA para los perfiles del atributo de calidad de la población celular (PACPC) para cada uno de los tipos celulares CHO Kl, CHO S, CHO DG44 y DHfr(-) . la Fig. 4 es una representación de los niveles de expresión; la Fig. 5 es una representación de los niveles de expresión; la Fig. 6 es un modelo lineal que utiliza la expresión de ST3GAL3 para computar el nivel de glicano 5,6,1,2,0 producido; las Figs. 7A-7B son una representación de la distribución de transcriptos relacionados con la glicosilación en los clones (cada punto) de cada fondo de línea celular agrupado para cada transcripto; las Figs. 8A-8D son una representación del análisis de PCA de transcriptos de genes glicorrelacionados derivados de cada uno de los clones de los fondos de las líneas celulares de CHO, círculos CH0K1, triángulos CHOS, más DG44; las Figs . 9A-9D son una representación de las incógnitas superimpuestas en los perfiles del atributo de calidad de la población celular para cada uno de los cuatro tipos celulares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Tal como se utiliza en la presente, "adquirir un valor" se refiere a cualquier proceso que resulte en posesión del valor. En una modalidad el valor es "adquirido directamente" mediante la modalidad de uno o más pasos de transformación física, por ejemplo, en una muestra, por ejemplo, una muestra de glicoproteína, un extracto de célula, o una muestra de células, por ejemplo, una línea celular. De este modo, el proceso resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia, por ejemplo, un reactivo analítico o un dispositivo usado en el proceso. Los métodos, a modo de ejemplo, comprenden: métodos analíticos; métodos preparatorios; y manipulación de células, por ejemplo, la extracción o purificación de componentes, por ejemplo, ácido nucleico, por ejemplo, ARNm o ADN, o proteína, de una célula, o de células cultivadas. En estos métodos se incluye típicamente uno o más de los siguientes: separar una sustancia, por ejemplo, un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar una sustancia, por ejemplo, un analito, o un fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo una solución amortiguadora, un solvente o un reactivo; o cambiar la estructura de un analito, o un fragmento de otro derivado del mismo, por ejemplo, mediante la ruptura o la formación de un enlace químico covalente o no covalente, entre un primer y segundo átomo de la sustancia, por ejemplo, un analito. El valor también puede ser "adquirido indirectamente" . La adquisición indirecta comprende recibir el valor, por ejemplo, de otra parte, por ejemplo una parte que adquirió el valor directamente. Típicamente, incluso en modalidades caracterizadas por una adquisición indirecta, alguna de las partes ha sometido una muestra a un proceso como los que se describen previamente, lo cual resulta en un cambio físico en la muestra u otra sustancia. En una modalidad 'una parte que practica el método de evaluación le ordena a otra parte desempeñar el proceso, y por ejemplo, una parte que practica el método recibe el valor. En una modalidad un valor puede ser la expresión de si una célula o una línea celular posee una característica o no o en qué medida, por ejemplo, una característica relacionada con la estructura de un glicano, por ejemplo el nivel de un transcripto, la capacidad de crear una glicoproteína que tiene una estructura de glicano preseleccionada, un nivel preseleccionado de una estructura de glicano, una proporción preseleccionada de una primera a una segunda estructura de glicano, o una estructura de glicano preseleccionada en una ubicación preseleccionada.
Un "perfil del atributo de calidad de la población celular" (PACPC) comprende un conjunto de respuestas para una población celular. Un conjunto comprende al menos dos respuestas. Típicamente un conjunto comprende una respuesta para una primera célula, por ejemplo, un primer aislado o alícuota de una población celular, y una respuesta para- una segunda célula, por ejemplo, un segundo aislado o alícuota de la población celular. Una respuesta, la cual se expresa en términos de una modificación post-translacional , por ejemplo, una estructura de glicano, es el producto de la operación en una pluralidad de observaciones (por ejemplo, medidas o características determinadas) . Una operación relaciona las observaciones con una modificación post-translacional, por ejemplo, una estructura de glicano. En una modalidad las observaciones están expresadas en términos de una modificación post-translacional, por ejemplo, una estructura de glicano. En una modalidad la observación no está expresada en términos de una modificación post-translacional, por ejemplo, una estructura de glicano, por ejemplo, están expresadas en términos de una expresión génica, y la operación también las convierte en unidades de una modificación post- ranslacional , por ejemplo, una estructura de glicano. Ejemplos de operaciones incluyen una correlación de una o más observaciones con una modificación post-translacional, por ejemplo una estructura de glicano, por ejemplo mediante el uso de una tabla de consulta o una herramienta equivalente; el uso de las observaciones como entradas en el modelo, por ejemplo, un modelo lineal, el cual relaciona las observaciones con modificaciones post-translacionales, por ejemplo, una estructura de glicano; o, por ejemplo, cuando las observaciones son en sí expresadas en términos de una modificación post-translacional , por ejemplo, una estructura de glicano, combinación, por ejemplo, mediante la adición, de observaciones. La observación puede obtenerse por análisis de los componentes principales. El conjunto de respuestas que comprenden un perfil del atributo de calidad de la población celular, si se considera como continuo, puede ser visualizado/analizado como si definiera un espacio discreto ocupado por la población celular. Por ejemplo, el conjunto de respuestas puede describirse en n dimensiones y ocupar un espacio de n dimensiones, por ejemplo, si se describen en 3 dimensiones el conjunto define un espacio tridimensional .
En una "pluralidad de distintos perfiles del atributo de calidad de la población celular" , tal como se utiliza en la presente, cada perfil del atributo de calidad de la población celular en la pluralidad es distinto de cada PACPC en la pluralidad, por ejemplo, al menos una respuesta de un primer perfil difiere de al menos una respuesta de un segundo perfil.
En una modalidad una respuesta es una indicación directa del estado de una modificación post-translacional, por ejemplo, una glicoestructura, por ejemplo, la presencia o nivel de una glicoestructura, una célula con un nivel x de glicano x y un nivel y de glicano y. Una modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, una glicoestructura, por ejemplo, una glicoestructura presente en una proteína de referencia, es una modificación post-translacional, por ejemplo, una glicoestructura, la cual se incluirá en una proteína. Si el conjunto de respuestas incluye la modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, una glicoestructura, o para decirlo de otra manera, si la glicoestructura seleccionada entra dentro del perfil del atributo de calidad de la población celular, entonces la población celular puede seleccionarse para la producción de una glicoproteína que tiene la modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, una glicoestructura. La comparación de la modificación post-translacional, por ejemplo, una glicoestructura, con un perfil del atributo de calidad de la pluralidad de la población celular permite para la selección de una población celular para optimizar la producción de una proteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada, por ejemplo, una glicoestructura .
Un "aislado distinto" tal como se utiliza en la presente, se refiere a una relación entre una primera célula o grupo de células y una segunda célula o grupo de células. Los aislados distintos tienen un predecesor celular común pero donde las células fundadoras de cada aislado distinto están separadas por lo menos por 1, 10, 20, 50, 100, 500, 1.000, 5.000 o 10.000 ciclos de divisiones celulares. Para ilustrar, una célula parental se divide para formar dos células Fl, cada célula Fl se divide para formar dos células F2, cada célula F2 se divide para formar dos células F3. Existen tres ciclos de división celular entre la célula parental y la célula F3. Típicamente, el predecesor celular común es una célula, por ejemplo, una célula cultivada, que ha sido retirada de un organismo multicelular, por ejemplo, un insecto o un animal, por ejemplo, un mamífero o un primate, excluyendo como predecesores celulares comunes a las células precursoras de animales o predecesores del animal de donde se tomó el predecesor celular común.
Una "observación" , tal como se utiliza en la presente, es un valor para el parámetro, por ejemplo, una medida, un valor determinado u observado para un parámetro, relacionado con una propiedad de una célula.
Las "poblaciones celulares estrechamente relacionadas", tal como se utiliza en la presente, se refiere a poblaciones celulares que tienen una o más, y en modalidades dos o más, o la totalidad, de las siguientes propiedades: son de la misma especie; son del mismo tipo de tejido; son del mismo tipo de célula, por ejemplo, son células estromales; tienen el mismo estado de transformación (por ejemplo, ambas están transformadas y muestran crecimiento esencialmente inmortal en cultivo o ambas son incapaces de crecimiento inmortalizado, o ambas tienen tasas de crecimiento que se encuentran dentro de 2X entre sí en un medio seleccionado) . En modalidades, sus células fundadoras se separaron unas de otras por menos de 1.000 y, en modalidades, por menos de 500 o 100 ciclos de división celular.
Una "glicoestructura" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más elementos del complemento de glicano de una glicoproteína o a una estructura de glicano seleccionada. Puede referirse, por ejemplo, a un solo monosacárido, a un solo componente de glicano (por ejemplo, la presencia de estructuras de alto contenido en mañosa) , o al complemento entero de glicano de una glicoproteína, o a una estructura de glicano en particular, por ejemplo, a un componente de glicano de alta mañosa.
El "complemento de glicano", tal como se utiliza en la presente, se refiere a todos los componentes de glicano de una glicoproteína. En el caso de una proteína que tiene un solo sitio de glicosilación, el componente de glicano unido a la misma forma el complemento de glicano. En el caso de una proteína que tiene más de un sitio de glicosilación, el complemento de glicano se crea de componentes de glicano unidos a todos los sitios. Un "componente del complemento de glicano" se refiere a un subconjunto de componentes de glicano que forman el complemento de glicano, por ejemplo, uno o más componentes de glicano unidos a su respectivo sitio o sitios de glicosilación. El complemento de glicano puede consistir en el porcentaje de todos los componentes de glicano de todas las glicoproteínas en la mezcla. El componente de glicano puede también consistir en todos los componentes de glicano asociados con una glicoforma en una mezcla de glicoproteína.
El "componente de glicano" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un resto de azúcar, por ejemplo, un monosacárido, oligosacárido o polisacárido (por ejemplo, un disacárido, un trisacárido, un tetrasacárido, etc.) unido a una proteína en un sitio. En modalidades, la unión es covalente y el componente de glicano está enlazado mediante N u O a la proteína. Los componentes de glicano pueden ser cadenas de monosacáridos unidas entre sí por medio de enlaces glicosídicos . Los componentes de glicano pueden ser lineales o ramificados.
Una "estructura de glicano" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a la estructura de un complemento de glicano, un componente de un complemento de glicano o un componente de glicano. Los elementos de una estructura de glicano incluyen uno o más de los siguientes: la presencia, ausencia o nivel de glicosilación en uno p más sitios, por ejemplo, uno o más sitios por glicosilación enlazada a N o enlazada a O; enlace mediante N u 0; longitud (número de restos monosacáridos) ; colocación o ubicación de un monosacárido, por ejemplo, un resto galactosilo, dentro de una cadena; contenido de sacárido (por ejemplo, las cantidades o proporciones de componentes monosacáridos en un glicano en particular) ; secuencia de sacáridos (por ejemplo, el orden de subunidades de monosacáridos en un resto glicano) ; la presencia, ausencia o cantidad de una subunidad de sacáridos terminal o penúltima; el número, colocación y tipo (por ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de estructuras de GlcNAc o de mañosa bisectadas) de puntos de ramificación; la presencia, ausencia o nivel de una estructura compleja, por ejemplo, una estructura biantenaria, una estructura triantenaria, una estructura tetrantenaria, etc.; la presencia, ausencia o nivel de una alta mañosa o una estructura híbrida; la relación entre restos monosacáridos (por ejemplo, enlaces entre restos monosacáridos, isómeros y puntos de ramificación) ; la presencia, ausencia, posición o número de un monosacárido seleccionado, por ejemplo, un resto galactosilo un resto fucosilo, un resto GlcNAc o un resto manosilo; la presencia, ausencia, posición o número de una estructura seleccionada, por ejemplo, una estructura mono-galactosilada, digalactosilada o poligalactosilada . Otros ejemplos no taxativos incluyen cualquier otra estructura que se encuentre en glicoproteínas naturales; y heterogeneidad u homogeneidad en uno o más sitios (por ejemplo, diversidad a través de toda la proteína, por ejemplo, el grado de ocupación de los sitios de glicosilación potenciales de una proteína (por ejemplo, el grado de ocupación del mismo sitio de glicosilación potencial entre dos o más de las estructuras centrales de la proteína particular en una pluralidad de moléculas y el grado de ocupación de un sitio de glicosilación potencial en una estructura central de la proteína con relación a diferentes sitios de glicosilación potenciales en la misma estructura central de la proteína) .
Una estructura de glicano puede describirse en términos de una comparación de la presencia, ausencia o cantidad de una primera estructura de glicano con una segunda estructura de glicano. Por ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de ácido siálico con relación a la presencia, ausencia o cantidad de fucosa. En otros ejemplos, la presencia, ausencia o cantidad de ácido siálico tal como el ácido N-acetilneuramínico puede compararse, por ejemplo con la presencia, ausencia o cantidad de un derivado de ácido siálico tal como un ácido N-glicolilneuramínico.
Las estructuras de glicano pueden describirse, identificarse o someterse a ensayos de varias maneras . Una estructura de glicano puede describirse, por ejemplo, en términos estructurales definidos, por ejemplo, por el nombre químico, o por una propiedad funcional o física, por ejemplo, por peso molecular o por un parámetro relacionado con la purificación o separación, por ejemplo, el tiempo de retención de un pico en una columna u otro dispositivo de separación. En modalidades una estructura de glicano puede ser, a modo de ejemplo, un pico u otra fracción (que representa una o más especies) de estructuras de glicanos derivadas de una glicoproteína, por ejemplo de una digestión enzimática .
Un "monosacárido" tal como se utiliza en la presente se refiere a la unidad básica de un componente de glicano y en modalidades, un resto que es transferido por una glicosiltransferasa a un sustrato. Un "monosacárido" , tal como se utiliza en la presente, incluye monosacáridos naturales y no naturales. Ejemplos de restos monosacáridos incluyen glucosa (Glc) , N-acetilglucosamina (GlcNAc) , mañosa (Man) , N-acetilmanosamina (ManNAc) , galactosa (Gal) , N-acetilgalactosamina (GalNAc) , fucosa (Fue) , ácido siálico (NeuAc) y ribosa, así como derivados y análogos de los mismos. Se conocen derivados de distintos monosacáridos. Por ejemplo, el ácido siálico abarca por encima de treinta derivados con ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilneuramínico que forman las estructuras del núcleo. Los ejemplos de análogos de ácido siálico incluyen aquellos que imitan funcionalmente al ácido siálico, pero no son reconocidos por sialilasas de células huéspedes endógenas. Otros ejemplos de análogos de monosacáridos incluyen, a modo no taxativo, N- levulinoilmanosamina (ManLev) , Neu5Aco¡-metilglicósido, NeuSAcp-metilglicósido, Neu5Aca-bencilglicósido, NeuSAc -bencilglicósido, éster metílico de Neu5Aca-metilglicósido, éster Neu5Ac -metílico, ácido 9-0-Acetil-N-acetilneuramínico, ácido 9-O-Lactil-N-acetilneuramínico, N-azidoacetilmanosamina y variaciones 0-acetiladas de la misma y Neu5Aca-etil tioglucósido.
"Alta mañosa" tal como se utiliza en la presente se refiere a una o múltiples estructuras de N-glicano que incluyen HM3, HM4, HM5, HM6 , HM7 , HM8 y HM9 que contienen 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de mañosa respectivamente.
Células y líneas celulares Los métodos que se describen en la presente utilizan células para producir glicoproteínas que tienen modificaciones post- translacionales seleccionadas (por ejemplo glicoestructuras) . Ejemplos de células y líneas de células útiles en éstos y otros métodos descritos en la presente siguen a continuación.
La célula útil en los métodos descritos en la presente puede ser eucariota o procariota, siempre que la célula proporcione o haya agregado a la misma las enzimas apropiadas para activar y adjuntar (o remover) sacáridos presentes en la célula o sacáridos presentes en el medio de cultivo celular o alimentados a las células. Ejemplos de células eucariotas incluyen células de levadura, insecto, hongo, planta y animales, especialmente células de mamíferos. Las células adecuadas de mamíferos incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o inmortal normal o anormal, incluidas: línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionario humano (293) (Graham et al., J. Gen. Virol . 36:59 (1977)); células de riñón de un hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); Ovario de Hámster Chino (CHO) , por ejemplo, DG44, DUKX-V11, GS-CHO (ATCC CCL 61, CRL 9096, CRL 1793 y CRL 9618) ; células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243 251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL 1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A; ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); células de melanoma de ratón (NSO) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI (Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44 46 (1982)); células de riñon canino (MDCK) (ATCC CCL 34 y CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), células WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, Md.), células MCF-7, células MDA-MB-438, células U87, células A127, células HL60, células A549, células SP10, células DOX, células SHSY5Y, células Jurkat, células BCP-1, células GH3 , células 9L, células MC3T3, células C3H-10T1/2, células NIH-3T3, células C6/36, líneas celulares linfoblásticas humanas (por ejemplo GEX) y células PER-Ce* . El uso de cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se discute generalmente en Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH Publishers, N.Y, N.Y., 1987).
Ejemplos de células de plantas incluyen, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, semilla de colza, maíz, trigo, arroz, tabaco, etc.) (Staub, et al. 2000 Nature Biotechnology 1 (3): 333-338 and McGarvey, P. B . , et al . 1995 Bio-Technology 13(13): 1484-1487; Bardor, M . , et al . 1999 Trends in Plant Science 4(9): 376-380). Ejemplos de células de insectos incluyen, por ejemplo, Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc. Ejemplos de células de bacterias incluyen Escherichia coli. También pueden seleccionarse diferentes levaduras y hongos tales como Pichiapastoris, Pichia methanolica , Hansenula polymorpha, y Saccharomyces cerevisiae.
Medios de cultivo y procesamiento Los métodos descritos en la presente pueden incluir determinar y/o seleccionar componentes de medios o condiciones de cultivo las cuales resultan en la producción de una glicoestructura deseada. Los parámetros de cultivo que pueden determinarse incluyen componentes de medios, pH, condiciones de alimentación, osmolaridad, niveles de dióxido de carbono, tasa de agitación, temperatura, densidad celular, densidad de siembra celular, tiempo transcurrido y tasa de aspersión.
Los cambios en los parámetros de producción tales como la velocidad de agitación de un cultivo celular, la temperatura a la que se cultivan las células, los componentes en el medio de cultivo, los tiempos en los cuales inician y terminan los cultivos, variaciones en el tiempo transcurrido en el suministro de nutrientes pueden resultar en variaciones en las propiedades de un glicano del producto de glicoproteína producido. De este modo, los métodos descritos en la presente pueden incluir uno o más de: aumento o disminución de la velocidad a la cual se agitan las células, aumento o disminución de la temperatura a la que se cultivan las células, adición o eliminación de componentes de medios y alteración de tiempos a los cuales los cultivos se inician o terminan.
Seleccionar secuencialmente parámetros de producción o una combinación de los mismos, tal como se utiliza en la presente, significa que se selecciona un primer parámetro (o una combinación) y luego se selecciona un segundo parámetro (o combinación), por ejemplo, en base a una restricción impuesta por la selección del primer parámetro de producción.
Medios Los métodos descritos en la presente pueden incluir determinar y/o seleccionar un componente de medios y/o la concentración de un componente de medios que tiene una correlación positiva con una glicoestructura deseada. Un componente de medios puede ser agregado o administrado en el transcurso de la producción de glicoproteína o cuando se produce un cambio en el medio, lo cual depende de las condiciones de cultivo. Los componentes de medios incluyen componentes agregados directamente a los cultivos, así como componentes que son productos derivados de cultivo celular.
Los componentes de medios incluyen, por ejemplo, una solución amortiguadora, contenido de aminoácidos, contenido de vitaminas, contenido de sales, contenido de minerales, contenido de sueros, contenido de fuentes de carbono, contenido de lípidos, contenido de ácido nucleico, contenido de hormonas, contenido de elementos traza, contenidos de amoniaco, contenido de co-factores, contenidos de indicador, contenido de moléculas pequeñas, contenido de hidrolizados y contenido de modulador de enzimas .
Parámetros fisicoquímicos Los métodos descritos en la presente pueden incluir seleccionar condiciones de cultivo que se correlacionan con una glicoestructura deseada. Tales condiciones pueden incluir temperatura, pH, osmolaridad, fuerza de corte o tasa de agitación, oxidación, tasa de euforbios, recipientes de crecimiento, flujo tangencial, DO, C02, nitrógeno, lote alimentado, reducción oxidativa, densidad celular y estrategia de alimentación. En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de parámetros fisicoquímicos que pueden seleccionarse.
Tabla 2 : Temperatura DO pH C02 Osmolaridad Nitrógeno Fuerza de corte o tasa de agitación Lote alimentado Oxidación Reducción oxidativa Tasa de euforbios Densidad celular Vasos de crecimiento Cultivo de perfusión Flujo tangencial Estrategia de alimentación Lote Por ejemplo, el parámetro de producción puede consistir en cultivar una célula en condiciones de pH ácido, neutro o básico. Las temperaturas pueden seleccionarse de 10 a 42 °C. Por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 28 a 36°C no altera significativamente la producción de galactosilación, fucosilación, producción de alto contenido en mañosa, producción híbrida o sialilación de glicoproteínas producidas por una célula (por ejemplo, una célula de CHO, por ejemplo una célula de CHO deficiente en dhfr) cultivadas a estas temperaturas. Además, cualquier método que reduzca la velocidad de la tasa de crecimiento de una célula también puede tener ese efecto. De este modo, pueden seleccionarse temperaturas en este intervalo o métodos que reduzcan la tasa de crecimiento cuando no se desea tener estos parámetros de producción que alteren la glicosíntesis .
En otras modalidades pueden seleccionarse los niveles de dióxido de carbono, lo cual resulta en una característica o características de glicano deseadas. Los niveles de C02 pueden ser de, por ejemplo, aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 13%, 15%, 17%, 20%, 23% y 25% (y intervalos intermedios) . En una modalidad, cuando se desea una disminución de la fucosilación, la célula puede ser cultivada en niveles de C02 de aproximadamente 11 a 25%, por ejemplo, aproximadamente 15%. Los niveles de C02 pueden ajustarse manualmente o pueden ser derivados de células .
Una amplia variedad de matraces, botellas, reactores y controladores permiten la producción y el aumento de sistemas de cultivo celular. El sistema puede elegirse en base, al menos en parte, a sus correlaciones con una propiedad o propiedades de glicano deseadas .
Las células pueden cultivarse, por ejemplo, como lote, lote alimentado, perfusión o cultivos continuos.
Los parámetros de producción que pueden seleccionarse incluyen, por ejemplo, agregar o eliminar el medio inclusive cuando (al principio, al medio o tarde durante el tiempo de cultivo) y cuán a menudo el medio es cosechado; aumentar o disminuir la velocidad a la cual se agitan los cultivos celulares; aumentar o disminuir la temperatura a la cual se cultivan las células; aumentar o disminuir el medio de modo de ajustar la densidad de cultivo; seleccionar un tiempo en el cual los cultivos celulares comienzan o terminan; y seleccionar un tiempo en el cual se cambian los parámetros de cultivo celular. Los parámetros pueden seleccionarse para cualquier lote, lote alimentado, perfusión y condiciones de cultivo continuas.
Glicoproteínas Las glicoproteínas objeto incluyen glicoproteínas naturales y no naturales. Las glicoproteínas representativas incluyen: anticuerpos, por ejemplo, IgG, IgM, anticuerpos humanos, humanizados, injertados y quiméricos, y fragmentos de los mismos; proteínas de fusión, por ejemplo, fusiones que incluyen dominios de anticuerpos humanos (u otros) , por ejemplo, Fe o dominios de región constante; factores de crecimiento; hormonas, interferones ; citocinas; receptores de citocina; componentes de sangre solubles, por ejemplo, albúmina, factores de coagulación, factores hematopoyéticos ; enzimas; y cualquier clase de proteína representada por una proteína enumerada en la Tabla 3. También están incluidos los fragmentos solubles o activos de cualquiera de las glicoproteínas o clases de glicoproteínas descritas en la presente .
Ejemplos de glicoproteínas que pueden obtenerse mediante los métodos descritos en la presente incluyen aquellas en la Tabla 3 a continuación: Tabla 3.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente pueden ser utilizados para crear glicoproteínas con un nivel seleccionado de alta mañosa, por ejemplo, un mayor nivel de alta mañosa, en comparación con una glicoproteina de referencia .
EJEMPLOS Ejemplo 1. Análisis de glicanos CTLA4 producidos en varios aislados y el uso datos de glicanos para distinguir células con diferentes fondos.
Cuatro fondos de líneas celulares de CHO se transíectaron con el gen que codifica CTLA4IgG. Estos grupos de células fueron entonces sometidos a selección y a selección clonal para generar 20 clones de cada uno de los cuatro fondos de líneas celulares. La CTLA4IgG producido de cada clon se aisló y purificó por cromatografía por afinidad de proteína A. Los glicanos de la glicoproteína aislada fueron entonces liberados, etiquetados y analizados por LC y LC/MS. En la Figura 1 se ilustra un cromatograma . Los datos ilustrativos de LC de la distribución del producto de cada uno de los clones se describe en la Figura 2.
Un análisis de los datos de glicano fue utilizado para distinguir las células de los cuatro fondos. Se determinaron los datos sobre varios aspectos de la estructura de glicano. En la Tabla 4 se proporcionan aspectos representativos de la estructura de glicano que pueden utilizarse en este abordaje. En esta tabla los glicanos están representados como la composición de HexNAc, Hex, Fue, NeuAc, NeuGc, la presencia de A, o B indica las especies isoméricas y la presencia de Ac indica un evento de acetilación.
Tabla 4 Los datos de glicano se sometieron entonces a un Análisis de los Componentes Principales (ACP) . El ACP proporcionó la representación gráfica que se muestra en la Figura 3. Aunque se representa más fácilmente como una imagen tridimensional rotatoria, el ángulo 86 fue elegido como imagen representativa del ACP debido a que ilustra mejor la distribución de los clones en 2 dimensiones. Sorprendentemente, este análisis proporciona una diferenciación sólida entre los miembros de este grupo de tipos de células relativamente similares. Sorprendentemente, el perfil del atributo de calidad de la población celular para cada uno de los tipos de célula, CHO Kl, CHO S, CHO DG44 y DHfr(-) no solamente son diferentes, sino que permiten una selección inequívoca de una línea celular que tiene una cualidad deseada, por ejemplo, como se muestra por la diferenciación a lo largo del eje X.
Ejemplo 2. Correlación de estructuras de glicano con los datos de expresión génica utilizando modelos lineales.
Cuatro líneas de células de ovario de hámster chino se transfectaron con un gen para producir la proteína CTLA4-Ig. Los clones de cada línea celular se obtuvieron mediante la dilución de clones; líneas celulares clónales se expandieron de modo de producir la proteína CTLA4-Ig para análisis de glicanos y ARN para análisis de la expresión génica. Se obtuvieron ARN y proteína CTLA4-Ig celulares de 20-24 clones de cada línea celular. El ARN mensajero (ARNm) se analizó por RT-PCR para medir los niveles de expresión de 28 genes relacionados con la glicosilación. Los niveles de expresión de genes relacionados con la glicosilación fueron normalizados por uno o más genes domésticos (por ejemplo, ß-actina o genes de proteínas ribosómicas) . Se obtuvieron niveles de expresión linealizada por una transformación exponencial del nivel de expresión normalizado del gen doméstico. Estos datos están ilustrados en la Figura 4. Los glicanos fueron obtenidos de la proteína CTLA4-Ig y analizados por varios métodos, incluidas LCMS/MS. Se calculó una composición porcentual para cada especie de glicano. Los datos representativos se muestran en la Figura 5.
Se utilizó un modelado lineal para descubrir relaciones entre estructuras de glicanos y expresiones génicas. El descubrimiento del modelo lineal se realizó con el entorno informático R utilizando el siguiente método. Para cada glicano medido el conjunto de datos se dividió en conjuntos de entrenamiento y de prueba utilizando un análisis de remuestreo con un método de estratificación para asegurar una representación igual de aislados de las cuatro líneas celulares. Los mejores coeficientes adecuados del modelo lineal para cada gen individual fueron computarizados y registrados para el conjunto de entrenamiento; se registró el error de ajuste del modelo. Se utilizaron niveles de expresión génica para calcular el nivel de glicano para muestras en el conjunto de prueba se registró el error de estimación. El modelo lineal con el mejor ajuste para el conjunto de entrenamiento se retuvo. Todos los modelos de dos genes fueron evaluados mediante la adición a su vez de cada gen remanente al mejor modelo de ajuste de un gen. Se retuvo el modelo de dos genes de mejor ajuste. Este proceso se repitió hasta que se generaron modelos de 10-15 genes. El proceso completo se repitió a partir de la generación de conjuntos de entrenamiento y de prueba por 20 iteraciones para cada glicano con el fin de medir la repetibilidad del descubrimiento de los modelos de mejor ajuste.
Posteriormente se llevó a cabo un análisis detallado del modelo. Los modelos que utilizan más de 5 genes se determinaron indeseables debido a las universalmente altas tasas de errores para conjuntos de prueba que indican datos sobreajustados . Para cada glicano, la frecuencia de ocurrencia se computó de un gen particular en las primeras cinco posiciones de las 20 series de descubrimientos de modelo. Los genes que aparecen más frecuentemente se seleccionaron para un análisis detallado del modelo en el cual 200 iteraciones de entrenamiento y tasas de error de conjuntos de pruebas se computarizaron usando análisis de remuestreo con estratificación con posterior cálculo del coeficiente para el modelo lineal de mejor ajuste utilizando los genes objetivo. Los errores se registraron para conjuntos de entrenamiento y prueba para cada iteración. Los modelos con errores de entrenamiento y prueba deseables fueron posteriormente comparados entre sí ajustando el modelo al conjunto de datos completos que llevan a cabo pruebas F de errores de modelos para justificar la selección de modelos más complejos en lugar de modelos simples .
En el ejemplo incluido aquí (ver Figura 6) , un modelo lineal que utiliza una expresión ST3GAL3 para computar el nivel de glicano G5.6.1.2.0 produjo un ajuste razonable al nivel de medida del glicano. Un modelo lineal con ST3GAL4 no produjo un modelo con un ajuste apropiado. Sin embargo la adición de ST3GAL4 al modelo ST3GAL3 produjo un modelo con un modelo de ajuste considerablemente mejor para los datos de acuerdo con pruebas F (p=0,0011) . El signo de los coeficientes para los dos genes indica que una mayor expresión de ST3GAL3 aumenta el nivel de G5.6.1.2.0 y una mayor expresión de ST3GAL4 disminuye el nivel de G5.6.1.2.0. Esta relación fue inesperada.
Tabla de Análisis de Varianza Modelo 1: G5.6.1.2.0 ~ ST3GAL3 Modelo 2: G5.6.1.2.0 - ST3GAL3 + ST3GAL4 Grad. lib. res. Grad. lib. SRC Suma de cuad. F Pr(>F) 1 29 30.5688 10 2 28 20.7739 1 9.7949 13.202 0.001112 ** 15 9 Ejemplo 3. Variabilidad y clasificación de líneas celulares .
Cuatro líneas de células de ovarios de hámster chino se transfectaron con un gen para producir proteína CTLA4-Ig. Los clones de cada línea celular se obtuvieron mediante clonación por dilución; líneas celulares clónales se expandieron de modo de producir la proteína CTLA4-Ig para análisis de glicanos y ARN para análisis de expresión génica. Se obtuvieron ARN y proteína CTLA4-Ig celulares a partir de 20-24 clones de cada línea celular. El ARN mensajero (ARNm) se analizó por RT-PCR para medir los niveles de expresión de 28 genes relacionados con glicosilación. Los niveles de expresión de los genes relacionados con glicosilación se normalizaron por uno o más genes domésticos (es decir, ß-actina o genes de proteínas ribosómicas) . Se obtuvieron niveles de expresión linealizados por una transformación exponencial del nivel de expresión normalizado del gen doméstico .
Los perfiles de datos transcripcionales para una variedad de genes relacionados con la glicosilación están ilustrados en la Figura 7. La Figura 7 representa la distribución de transcriptos relacionados con la glicosilación en todos los clones (cada punto) de cada antecedente de línea celular (Azul, Rojo, Verde o Negro) agrupado para cada transcripción. Los genes seguidos fueron los siguientes: los transcriptos A1-A8, Bl-5, C5 , 6 son de glicosiltransferasas; B6-8, Cl-4, Dl-4, son de enzimas biosintéticas ; C7,8, D5,6, son transcriptos de normalización y CTLA4IgG. Los datos transcripcionales fueron luego sometidos a un Análisis de Componentes Principales (ACP) ciegos a las identificaciones de los fondos de las líneas celulares . Los tres primeros componentes principales fueron graficados en los ejes x, y y z. A los clones se les asignó luego un símbolo de acuerdo con su origen de línea celular como se ilustra en la Figura 8. Sorprendentemente, el perfil del atributo de calidad de la población celular para cada uno de los tipos de célula, CHO Kl, CHO S, CHO DG44 y DHfr(-) no solamente son diferentes, sino que permiten una selección inequívoca de una línea celular que tiene una cualidad deseada, por ejemplo, como se muestra en la Figura 8.
Luego se llevó a cabo un ensayo ciego en el cual el perfil transcripcional se midió para 21 aislados de células de origen desconocido. El origen de cada línea celular era desconocido para los investigadores. Sin embargo, conocían que poseían el potencial para ser derivados de cualquier línea de células CHO Kl, S, DG44 y DHfr(-) . Los datos de los aislados de origen desconocido fueron transformados en el sistema de coordenadas utilizado en el ACP de los datos originales y graficados junto con los datos originales. Ver Figura 9, la cual muestra los desconocidos superpuestos en los perfiles del atributo de calidad de la población celular para cada uno de los cuatro tipos de células derivados de orígenes conocidos. La identidad de cada línea celular fue prela por análisis discriminatorio lineal (APL) ; 20 de 21 clones fueron clasificados correctamente. Los perfiles del atributo de calidad de la población celular permitieron una correcta asignación de uno de los cuatro tipos de células a 20 de 21 aislados de células desconocidos.
Extensiones y alternativas Toda la bibliografía y el material similar citado en esta solicitud, incluidos, a modo no taxativo, las patentes, las solicitudes de patentes, los artículos, los libros, los tratados y las páginas web, independientemente del formato de la bibliografía o los materiales similares, se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. En caso de que una o más de las bibliografías o materiales similares incorporados difieran de esta solicitud o la contradigan, incluidos, a modo no taxativo, los términos definidos, los términos de uso, las técnicas descritas o similares, prevalecerá esta solicitud. Los títulos de secciones utilizados en la presente se incluyen únicamente con fines de organización y no deben interpretarse como una limitación al objeto descrito de ninguna manera. Si bien los métodos se han descrito junto con diferentes modalidades y ejemplos, no se pretende que los métodos se limiten a las modalidades o los ejemplos. Por el contrario, los métodos abarcan diferentes alternativas, modificaciones y equivalentes, tal como lo apreciarán los expertos en la técnica .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para realizar una glicoproteína que tiene un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado caracterizado porque comprende: (a) adquirir la identidad de una población celular para la producción de la glicoproteína, en donde la identidad es adquirida o determinada mediante (i) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población celular, de un valor que se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano, cuyo valor es una función de una pluralidad de distintas observaciones que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes genes y el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras , estructuras de glicano, componentes de glicano, o combinaciones de los mismos para proporcionar un conjunto de valores para la primera población celular; (ii) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una segunda población celular, de un valor que se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano, cuyo valor es una función de una pluralidad de distintas observaciones que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes genes y el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras , estructuras de glicano, componentes de glicano, o combinaciones de los mismos para proporcionar un conjunto de valores para la segunda población celular; (iii) comparación de un valor para un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado con un conjunto de valores de la primera población celular y con el conjunto de valores para la segunda población celular; y (iv) en respuesta a la comparación, selección de la primera o segunda población celular; y (b) cultivar la población celular seleccionada para realizar así la glicoproteína que tiene el complemento de glicano o componente de glicano seleccionado.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además aislar la glicoproteína del cultivo.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además purificar la glicoproteína.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: (i) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular (un perfil) que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano y es el producto de una operación en una pluralidad de observaciones, para cada pluralidad de las poblaciones celulares, los perfiles adquiridos forman una pluralidad de distintos perfiles; (ii) adquirir la identidad de un complemento de glicano o un componente de glicano seleccionado; (iii) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (ii) ; (iv) cuando el perfil adquirido incluye la identidad adquirida en (ii) , seleccionar una de las pluralidades de población celular para realizar la glicoproteína que tiene el complemento de glicano o componente de glicano seleccionado.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además introducir un ácido nucleico que codifica toda o parte de la glicoproteína dentro de la población celular identificada.
6. Un método para realizar una glicoproteína que tiene un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado, caracterizado porque comprende: (a) adquirir la identidad de una población de células CHO para la producción de la glicoproteína, en donde la identidad se adquiere o se determina por (i) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población de células CHO, de un valor que se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano, cuyo valor es una función de una pluralidad de distintas observaciones que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de genes o metabolitos y el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras , estructuras de glicano, componentes de glicano, o combinaciones de los mismos para proporcionar un conjunto de valores para la primera población de células CHO; (ii) adquisición, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una segunda población de células CHO, de un valor que se expresa en términos de un componente de glicano o un complemento de glicano, cuyo valor es una función de una pluralidad de distintas observaciones que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de genes o metabolitos y el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras, estructuras de glicano, componentes de glicano, complemento de glicano o combinaciones de los mismos para proporcionar un conjunto de valores para la segunda población de células CHO en donde la segunda población de células CHO digiere de la primera población de células CHO en una mutación adquirida naturalmente o inducida intencionalmente; (iii) comparación de un valor para un componente de glicano o complemento de glicano seleccionado con el conjunto de valores de la primera población de células CHO y con el conjunto de valores para la segunda población de células CHO; (iv) en respuesta a la comparación, selección de la primera o segunda población de células CHO; y (b) cultivar la población de células CHO seleccionada para realizar así la glicoproteína que tiene el componente de glicano o complemento de glicano seleccionado.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la observación es una o más del nivel de 4,4,1,0,0; el nivel de 4,4,1,1,0; el nivel de 4,5,1,0,0; el nivel de 4,5,1,1,0; el nivel de 4,5,1,2,0; el nivel de 5,5,1,0,0; el nivel de 5,6,1,0,0; el nivel de 5,6,1,1,0; el nivel de 5,6,1,2,0; el nivel de 5,6,1,3,0; el nivel de 6,6,1,1,0; el nivel de 6,6,1,2,0; el nivel de 6,7,1,1,0; el nivel de 6,7,1,2,0; el nivel de 6,7,1,3,0; el nivel de 6,7,1,4,0; el nivel de expresión de una glicosiltransferasa; el nivel de expresión de un gen que participa en la biosíntesis de glicano; el nivel de metabolitos; el nivel de U P; el nivel de GTP; el nivel de UDP-Gal; el nivel de GDP-Fuc .
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un conjunto de valores se adquiere por una pluralidad de poblaciones de células CHO que incluyen una línea de células CHO Kl, una línea de células CHO S, una línea de células DG44 y una línea de células DHFR(-) .
9. Un método para proporcionar o seleccionar una población celular de una pluralidad de aislados de una población celular para su utilización en la modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano o un componente de glicano seleccionado, caracterizado porque comprende : (a) adquirir la identidad de un complemento de glicano o un componente de glicano seleccionado; (b) adquirir una evaluación de la capacidad de cada una de las pluralidades de aislados de las poblaciones celulares para producir el complemento de glicano o componente de glicano, y (c) seleccionar un aislado de la pluralidad de aislados, para proporcionar así un aislado de una población celular para su utilización en la modalidad de una glicoproteína que tiene un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado .
10. Un método para monitorear un proceso de producción para realizar una glicoproteína que tiene una modificación post-translacional seleccionada, caracterizado porque comprende: (a) adquirir, para cada uno de una pluralidad de aislados o alícuotas de una primera población celular, un valor que se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano, cuyo valor es una función de una pluralidad de distintas observaciones que incluyen el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes genes y el nivel de expresión de una pluralidad de diferentes glicoestructuras, complemento de glicano o componente de glicano para proporcionar un conjunto de valores para la primera población celular; (b) identificar un complemento de glicano o componente de glicano seleccionado; (c) comparar un valor por el complemento de glicano o componente de glicano seleccionado, con el conjunto de valores de la primera población celular; y (d) si la comparación muestra que el conjunto de valores para la primera población celular incluye el valor para el complemento de glicano o componente de glicano seleccionado, buscar una primera opción, por ejemplo, continuar el cultivo; y si la comparación muestra que el grupo de valores no incluye el valor para el complemento de glicano o componente de glicano seleccionado, buscar una segunda opción, por ejemplo, cesar las condiciones de cultivo actual o cultivar bajo un conjunto nuevo de condiciones.
11. Un método para seleccionar una glicoproteína para manufacturar en una población celular, caracterizado porque comprende : (a) adquirir un perfil del atributo de calidad de la población celular, que comprende un conjunto de respuestas, en donde una respuesta se expresa en términos de un complemento de glicano o un componente de glicano y es el producto de una operación en una pluralidad de observaciones, para una población celular; (b) adquirir las identidades de una pluralidad de complemento de glicano o componente de glicano; (c) comparar el perfil adquirido con la identidad adquirida en (b) ; (d) cuando las identidades adquiridas en (b) incluyen el perfil adquirido, seleccionar una de la pluralidad de complemento de glicano o componente de glicano para la producción en la población celular; y (e) realizar una glicoproteína que tiene la glicoestructura seleccionada en la población celular.
12. Una base de datos que comprende una pluralidad de registros para aislados de una población celular de una población celular preseleccionada, caracterizada porque cada registro comprende un identificador para un asilado único de el tipo de célula preseleccionada y un identificador de un perfil del atributo de calidad de la población celular para el asilado, y en donde el perfil del atributo de calidad de la población celular para cada entrada es único en comparación con otros en la pluralidad para el aislado.
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