JP5924192B2 - リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法 - Google Patents

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Description

本発明は、糖化に適した処理を施したリグノセルロースを含有するバイオマスをセルロース分解酵素やヘミセルロース分解酵素からなる酵素群により糖化処理する反応を含むリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法において、使用する酵素群を反応液から高回収率で回収して長期間にわたって循環利用することを可能とするリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法に関する。
糖化に適した処理を施したリグノセルロース原料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりガソリンの代替燃料となるアルコールや、プラスチック原料となるコハク酸や乳酸などの化成品原料を製造することができることから、循環型社会の形成に有益な技術である。
植物系バイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法は2つに大別できる。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
酸糖化法は酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、リグノセルロース系バイオマスを原料とする方法の場合は、澱粉や廃糖蜜などを原料とする方法に比べて糖収率が低いことに加えて、処理工程から排出される廃酸の処理設備や、酸による腐食に耐え得る大型の設備が必要となること等が製品コストの増大原因となっていて実用化の大きな障壁となっている。
一方、酵素糖化法は、近年酵素の価格が下がってきていることと技術の進歩から、後処理まで含めた全体のコストで酸糖化法のコストに近づいてきてはいるが、酵素糖化法の全体コストに占める割合が高い酵素の価格は依然として高いことから、酵素糖化法の実用化のためには酵素にかかる費用の一層の低減が重要である。
酵素糖化法のコストを下げる技術としては、セルロース繊維への酵素のアクセスを容易にする前処理の方法の開発や、結晶性セルロースを効率よく糖化する方法の開発、更には酵素の効率的な回収、再利用方法の開発などが考えられる。
リグニンを除去していないリグノセルロース材料は、リグニンを除去したリグノセルロース材料と比べて酵素によって分解されにくく、糖化されずに樹脂、金属などの不純物と一緒に糖化液中に残渣として残る。一般に、この残渣はスクリーン、遠心分離等により分離し廃棄される。この残渣には酵素糖化法におけるコストの中で大きな比重を占めている酵素が多量に吸着されているため、反応液から分離した残渣をそのまま廃棄してしまうと高価な酵素も廃棄されてしまうという問題があった。
上記のような残渣中の酵素の回収手段として、残渣の洗浄が考えられる。しかし、酵素は、その分子内に有しているセルロースに特異的に吸着するセルロースバインディングドメイン(CBD)等によりセルロースと強固に結合しているため、単なる水洗浄ではセルロースに吸着した酵素を十分に回収することは困難であった。
そこで、酵素の回収率の改善を目的として界面活性剤を添加して処理する方法(特許文献1参照)などが提案されている。しかし、界面活性剤処理法でも、酵素の回収率が十分であるとはいえず、また、薬品添加による酵素の失活や、処理工程付加に伴うコストアップ及び後の発酵段階における微生物への悪影響などが懸念されることなどから実用的ではない。
糖液からの酵素の回収法としては、限外濾過を用いた方法(特許文献2参照)、糖液に再度セルロースを添加して酵素を吸着回収する方法(特許文献3参照)などが提案されている。しかし、限外濾過法は微少な不純物がろ過膜につまり十分な処理速度及び酵素回収率が得られない問題があるし、セルロース添加による回収法では十分な酵素回収が困難であった。
吸着した酵素を剥離させる工程を経ずに、酵素が吸着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する方法が提案されている(特許文献4)。この方法では、残渣の蓄積は避けられないので反応効率が低下することが懸念される。また、CBH(セロビオハイドラーゼ)等、CBDを有する酵素に関してはリグノセルロース残渣を次回分で再処理することで酵素の循環利用が可能であるが、ベータ−グルコシダーゼ等は上清中に遊離している場合もあるので、添加したセルラーゼの全てを循環利用することは困難である。
酵素のコストを下げる方法として、酵素を循環利用する方法が報告されている。Scott,C.D.らの方法(非特許文献1)によると、酵素を大量(濾紙分解活性で基質1gに対して80−160単位)に添加して古紙原料を酵素加水分解する主反応槽に、酵素加水分解液中の未反応古紙面から高剪断力で生成グルコースやセロビオース成分を除いて常に新しいセルロース繊維表面を露出させる高速遠心ポンプによる磨砕装置と、磨砕装置からの処理液から未反応原料と加水分解液を分離して未反応原料のみを主反応槽に循環する膜分離装置と、膜分離装置からの加水分解液から酵素と生成グルコース及びセロビオースを分離して酵素のみを主反応槽に循環する限外濾過装置とを有する循環ラインを設けた連続システムを想定してコストを予測している。このシステムにより、糖化率は25時間
で100%であり、酵素の残存率は24時間で95%以上であるとされている。また、酵素が残渣に吸着されて失われること、残渣の酵素の吸着機能はpHを5〜7に高めることで低下可能な場合があること、温度を5℃に下げることで低減できるという報告もあることが記載されている。
酵素を回収再利用する方法として、蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を5%の濃度で糖化槽に加え、2万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、8日間で2kgのシラカンバ材から単糖類を630g得ている方法も報告されており、この方法で酵素の使用量を20%節約できたとされている(非特許文献2)。
特開昭63-87994号公報 特開昭61-234790号公報 特開昭55-144885号公報 特開2010-98951号公報
Scott,C.D.,Rothrock,D.S.,Appl.Biochem.Biotechnol.,45/46,pp.641−653(1994) Ishihara,M.,etal.,Biotechnol. Bioeng.,37,948−954(1991)
リグノセルロースなどのバイオマスから糖類を製造する技術は、これまで化石資源に頼ってきた燃料やプラスチック原料を新たに供給し得る技術であり、特に循環型社会の構築に役立つ技術である。前述したように、これまで様々な技術が開発されてはいるものの、糖化に要する酵素のコストが高いことが主たる原因で経済性がないことが課題となっている。
前記したように、糖化に用いた酵素を回収し繰り返し使用することにより酵素の使用量を削減しようという試みが種々なされているが、糖化の際に生じる残渣に酵素が強く吸着しているため、回収率が下ってしまい、問題の解決には至っていない。このように、酵素糖化の際に生じる残渣に酵素が強度に吸着することが、酵素回収の際の最大の問題であり、これを解決できれば酵素のリサイクル性は向上し、コストを低下させ、酵素糖化処理法の経済性は大きく改善できる。それ故、本発明は、リグノセルロース材料の酵素糖化処理のために投入される酵素を無駄なく有効利用することができる方法を提供することを目的とするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、酵素糖化反応液中で、酵素がリグノセルロース原料や反応残渣等に酵素が吸着されることを抑制する手段を採択することが、酵素糖化反応後の反応液からの酵素の分離を容易ならしめると共に、廃棄処理される残渣と共に酵素が系外に排出されることを防止できる手段であるという発想に基づくものである。
(1)酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料を、該原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素生産微生物を含まないリグニン分解酵素をリグニン分解酵素活性で0.5〜300u(単位)添加して処理し、リグニン分解酵素で処理したリグノセルロース系原料を酵素糖化処理工程で酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から反応生成物と糖化酵素含有液を分離回収し、回収した糖化酵素含有液中の糖化酵素を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
(2)前記酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料が、リグノセルロース原料に対して化学的処理と機械的処理の両方の処理、あるいは化学的処理機械的処理のうちいずれか1つの処理が施されているリグノセルロース系原料であることを特徴とする(1)項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
(3)前記酵素糖化処理工程が、糖化酵素と糖類を発酵基質とする発酵微生物を併用してリグノセルロース系原料の酵素糖化処理と、生成糖類の発酵微生物による発酵処理とを併行して行って糖類と共に糖類の発酵生成物を生成する併行糖化発酵処理工程であることを特徴とする請求項1又は2に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
(4)酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料を、該原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素生産微生物を含まないリグニン分解酵素をリグニン分解酵素活性で0.5〜300u(単位)添加して処理し、該リグニン分解酵素で処理したリグノセルロース系原料を酵素糖化処理工程で酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から糖類含有液と糖化酵素含有液を分離して回収し、回収した糖化酵素含有液中の糖化酵素を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理による糖類の製造方法。
本発明により、リグノセルロース系原料の未反応分や反応残渣等への糖化酵素の吸着が抑えられて、酵素処理懸濁液からの糖化酵素の分離・回収が容易となる結果、酵素損失が極めて少ない経済性の高い連続的なリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法が提供される。
本発明のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法の一実施形態を示す工程図である。 本発明のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理工程を、酵素糖化処理と生成糖を原料とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程とした工程図である。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
<リグノセルロース系原料>
本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、切り株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられ、草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等が挙げられる。なお、本発明におけるリグノセルロース系原料としては、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ等も利用可能である。
前記木質系のリグノセルロース系原料の中でも、林地残材(樹皮、枝葉を含む)、樹皮が好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ(Eucalyptus)属又はアカシア(Acacia)属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。又、ヤナギ(Salix)属の林地残材も入手が可能であり原料として適している。
<機械的処理>
本発明では、前記リグノセルロース原料に機械的処理を施す。機械的処理としては、破砕、裁断、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の化学的処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー、ボールミル等を用いることができる。
前記機械的処理の前工程又は後工程として、異物(石、ゴミ、金属、プラステック等のリグノセルロース以外の異物)を除去するための洗浄工程や洗浄した原料に含まれる水を脱水するための脱水工程を導入することもできる。
原料を洗浄する方法としては、例えば、原料に洗浄水を供給して原料に混合されている異物を除く方法、あるいは、原料を水中に浸漬し異物を沈降させて取り除く方法等が挙げられる。また、メタルトラップ等の洗浄装置を用いて異物を原料から分離する方法が挙げられる。
原料に異物が含まれていると、破砕や磨砕等の機械的処理に要する消費電力が増加したり、機械的処理で用いるレファイナーのディスク(プレート)等の装置の部品を破損させる可能性がある。また、異物が原因となって配管が詰まる等の製造工程内でトラブルを起こす等の問題が発生するため、洗浄工程を導入することが望ましい。
<化学的処理>
前記、機械的処理を施したリグノセルロース原料を次に化学的処理する。化学的処理としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから選ばれる1種以上のアルカリ薬品、又は、亜硫酸ナトリウムと前記アルカリ薬品の中から選ばれる1種以上のアルカリ薬品を含有する溶液に浸漬する化学的処理を含む前処理である。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。
化学的処理は、前記機械的処理と組み合わせてそれらの前処理の後処理として行うことが好適である。
化学的処理で使用する薬品の添加量は、状況に応じて任意に調製可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面から、リグノセルロース系原料の絶乾100質量部に対して50質量部以下であることが望ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、処理時間20〜90分、処理温度80〜200℃が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は70分以下、処理温度は180℃以下であることが好ましい。
化学的処理として、リグノセルロース原料(乾燥重量)に対して10〜50質量%の亜硫酸ナトリウム及びpH調整剤として0.1〜5質量%のアルカリを添加することもできる。リグノセルロースに亜硫酸ナトリウムを前記の添加量で単独で添加して加熱処理すると、加水分解中に酢酸等の有機酸が生成するためpHの低下が起こり加水分解液が酸性となる。加水分解液が酸性の条件下で加水分解を継続すると加水分解で生成されたキシロースがフルフラールに変換するという問題が発生する。フルフラールは、エタノール発酵の阻害物質となるため可能な限り生成させないことが望ましい。また、発酵基質であるキシロースの収率が低下するため、結果としてエタノール生産効率が低下する。リグノセルロース原料に前記の添加量で亜硫酸ナトリウム及びpH調整剤としてアルカリを添加して加熱処理することにより、加水分解中のpHが中性〜弱アルカリ性に維持されるため、フルフラールの生成及びキシロースの収率低下を抑制することができる。
前記pH調整剤として用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられるが、これらの薬品に特に限定されない。
前記、リグノセルロース原料(乾燥重量)に対して10〜50質量%の亜硫酸ナトリウム及びpH調整剤として0.1〜5質量%のアルカリを添加して加熱処理を行う場合の加熱処理温度は、80〜200℃が好ましく、120〜180℃がさらに好ましい。また、加熱処理時間は、10〜300分で行うことができるが、30〜120分が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理温度は、180℃以下、処理時間は120分以下であることが好ましい。
前記化学的処理により得られたリグノセルロース原料を次工程で磨砕処理を施す前に化学的処理で使用した薬品を除去するためにリグノセルロース原料を洗浄してもよい。洗浄方法としては、例えば、リグノセルロース原料に洗浄水を添加しながら、洗浄ドレーナー、固液分離装置等で固形分と液体分に分離する方法が挙げられる。固液分離装置としては、スクリュープレス、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス、スクリーン等が挙げられる。
本発明では、前記化学処理により得られたリグノセルロース原料をレファイナーのディスク(プレート)のクリアランスを0.1〜2.0mmの範囲で磨砕することが好ましく0.1〜1.0mmの範囲で磨砕処理することがさらに好ましい。使用するレファイナーとしては、シングルディスクレファイナー、ダブルディスクレファイナー等を使用することができ相対するディスクのクリアランスを0.1〜2.0mmの範囲に設定できるレファイナーであれば特に制限なく使用することができる。ディスクのクリアランスが2.0mmを超えると糖化または併行糖化発酵で得られる糖収率が添加するため好ましくない。一方、ディスクのクリアランスが0.1mmより低いとレファイナーで磨砕処理した後の加水分解物(固形分)の収率が低下するため好ましくない。また、ディスクのクリアランスが0.1mmより低いとレファイナーの運転に要する電気消費量が増大するため好ましくない。
前記の磨砕処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶液と固形分に固液分離し、固形分を糖化または併行糖化発酵の原料として用いる。固液分離する方法としては、例えば、スクリュープレス、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いて水溶液と固形分に分離することができ、水溶液と固形分に分離することができる装置であれば制限なく使用することができる。
本発明では、前記の前処理を施したリグノセルロース系原料をリグニン分解酵素で処理する。リグノセルロース系原料に対するリグニン分解酵素の添加量は、原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素の酵素活性で0.5〜300u(単位)添加することが好ましく、0.5〜100u(単位)がさらに好ましい。酵素活性は、0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50ul、酵素液345ul、10mM過酸化水素5ul、1mM MnSO100ulを十分混合して反応させ、反応の結果生成するMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を測定する。酵素活性の単位は、1分間にMn(III)マロン酸複合体1umol増加させる活性を1ユニットと定義する。
原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素の酵素活性で0.5〜300u(単位)添加しリグニン分解酵素で原料を処理するとリグニンがスルホン化されて電荷を持つことにより、後の糖化又は糖化発酵工程で用いるセルラーゼの原料への吸着が抑制される。糖化又は糖化発酵工程で原料へのセルラーゼの吸着が抑制されるため、結果としてエタノール製造工程内において、酵素(セルラーゼ)回収率が高まりセルラーゼを含有する反応液を工程内で循環させることにより長期間、セルラーゼを再利用することができる。
用いるリグニン分解酵素としては、微生物により生産されるリグニン分解酵素、リグニン分解酵素を含有する微生物の培養液、市販のリグニン分解酵素等が挙げられる。前記微生物としては、カワラタケ、アラゲカワラタケ等の白色腐朽菌等が挙げられ、リグニン分解酵素を生産することができる微生物であれば特に制限なく用いることができる。リグニン分解酵素としては、フェノールオキシダーゼ(ラッカーゼ等)、パーオキシダーゼ(マンガンパーオキシダーゼ等を含む)等が挙げられる。
リグニン分解酵素で処理した後の原料(原料懸濁液)はリグニン分解酵素を除去するために洗浄水で洗浄することが好ましい。用いる洗浄水としては、水が好ましいが、糖化又は糖化発酵へ影響を及ぼさない洗浄水であれば特に制限なく用いることができる。洗浄後、原料を固液分離より原料(固形分)と濾液(液体分)に分離することが好ましい。固液分離の方法としては、原料(固形分)を分離できる固液分離装置であれば特に限定なく用いることができる。固液分離装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。処理効率を向上させるために、固液分離装置に振動装置をつけて振動を加えてもよい。
前記の固液分離で分離した原料(固形分)は、糖化工程あるいは糖化発酵工程へ移送し糖化発酵の原料として用いる。
前記の糖化工程あるいは糖化発酵工程で用いる原料は、糖化または併行糖化発酵を行う前に殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なpHに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化及び/又は糖化発酵工程に適したpHに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やpHを調整してから原料を送り出すことで、好適pH、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。
<糖化工程>
図1に示すように、リグニン分解酵素処理されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、糖化工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素(セルラーゼ、ヘミセルラーゼ)により糖化(セルロース→グルコース、ヘミセルロース→グルコース、キシロース)される。
<併行糖化発酵工程>
図2に示すように、酵素糖化反応に適した前処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、さらに酵母等の微生物と混合されて併行糖化発酵工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素により糖化され、生成された糖が酵母によりエタノールに発酵される。
糖化工程又は併行糖化発酵工程で用いるリグノセルロース系原料の懸濁濃度は、1〜30質量%であることが好ましい。1質量%未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、30質量%を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。
併行糖化発酵で使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。
各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。
市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ(Trichoderma)属、アクレモニウム(Acremonium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ファネロケエテ(Phanerochaete)属、トラメテス(Trametes)属、フーミコラ(Humicola)属、バチルス(Bacillus)属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンT2(エイチピィアイ社製)、メイセラーゼ(明治製菓社製)、ノボザイム188(ノボザイム社製)、マルティフェクトCX10L(ジェネンコア社製)、GC220(ジェネンコア社製)等が挙げられる。
原料固形分100質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、0.5〜100質量部が好ましく、1〜50質量部が特に好ましい。
糖化工程または併行糖化発酵工程でのpHは3.5〜10.0の範囲に維持することが好ましく、4.0〜7.5の範囲に維持することがより好ましい。
糖化工程または併行糖化発酵工程の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、25〜50℃が好ましく、30〜40℃がさらに好ましい。反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は10〜240時間、さらに好ましくは15〜160時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、10〜150時間、さらに好ましくは15〜100時間である。
発酵用に用いられる微生物として、糖類(六炭糖、五炭糖)を発酵できる発酵微生物を用いる。発酵微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、キャンディダ・シハタエ(Candida shihatae)、パチソレン・タノフィルス(Pachysolen tannophilus)、イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)等の酵母やザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)等の細菌が挙げられる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物(酵母、細菌等)を用いることもできる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物を特に制限なく用いることができる。
微生物は固定化しておいても良い。微生物を固定化しておくと、次工程で微生物を分離して再回収するという工程を省くことができるため、少なくとも回収工程に要する負担を軽減することができ、微生物のロスが軽減できるというメリットがある。また、凝集性の
糖化工程または併行糖化発酵工程を出た培養液は、固液分離工程へ移送され、液体分(濾液)と固形分(残渣)に分離される。固液分離を行う装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。
回収された固形分(残渣)は糖化工程または併行糖化発酵工程へ移送し糖化発酵の原料として用いることもできる。
固液分離工程で分離された液体分(濾液)は蒸留工程へ移送される。
<蒸留工程>
蒸留工程では、減圧蒸留装置により発酵生成物としてエタノールが蒸留分離される。減圧下では低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
蒸留温度は25〜60℃が好ましい。25℃未満であると、生成物の蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、60℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪くなる。
蒸留後の蒸留残渣留分中に残る発酵生成物濃度は0.1質量%以下であることが好ましい。このような濃度にすることによって、後段の固液分離工程において固形物とともに排出される発酵生成物量を低減することができ、収率を向上させることができる。
<遠心分離工程>
蒸留残液は、遠心分離工程へ移送され残留している残渣を遠心分離によって除去した後、液体留分は併行糖化発酵工程に循環されるか又は二次併行糖化発酵工程(前記、一次併行糖化発酵工程とは異なる第2の併行糖化発酵工程)へ移送される。二次併行糖化発酵工程では、新しいリグノセルロース原料を添加して糖化発酵させることもできるし、キシロース等の五炭糖の発酵を目的とした発酵を行うことができる。遠心分離後の液体留分には酵素が含まれており、併行糖化発酵工程または二次併行糖化発酵工程で再利用される。一方、遠心分離後の残渣には、酵素、リグニン、酵母が含まれている。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。また、酵母を残渣から分離して、糖化発酵工程で再利用することもできる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
[実施例1]
[リグニン分解酵素の調製]
培地(グルコース3質量%、ペプトン1質量%、KHPO 0.15質量%、MgSO・7HO 0.05質量%、塩酸チアミン 0.0002質量%、CuSO・5HO 0.0016質量%、pH5.0)5Lを培養槽(10L)内で滅菌した。前記培地にアラゲカワラタケ(コリオラス・ヒルスタス:Coriolus hirsutus IFO4917)を接種し28℃、攪拌速度150rpm、通気量5L/分の条件で8日間培養した。
培養後、培養液を濾布で濾過し除菌し粗酵素液(濾液)を得た。この粗酵素液を10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で緩衝化したDEAEトヨパール(陰イオン交換樹脂)を充填したカラム(直径5cm x 長さ20cm)に通液し、酵素を樹脂に吸着させた。樹脂を10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、30質量%硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)をカラムに通液し樹脂に吸着している酵素を溶出させてリグニン分解活性を有する画分(粗酵素液A)を得た。前記粗酵素液Aに硫酸アンモニウムを添加し粗酵素液A含まれる硫酸アンモニウムの最終濃度が50質量%になるように調製後、4℃で2時間放置した。50質量%硫酸アンモニウムを含む粗酵素液Aを遠心分離(10000 rpm、20分)し、沈殿(不純蛋白質)を除去した。前記粗酵素液Aにさらに硫酸アンモニウムを添加し粗酵素液A含まれる硫酸アンモニウムの最終濃度が70質量%になるように調製後、4℃で2時間放置した。70質量%硫酸アンモニウムを含む粗酵素液Aを遠心分離(10000 rpm、20分)し、沈殿(活性画分)を回収した。沈殿を少量の蒸留水に溶解後、蒸留水2Lに対して24時間透析した。透析中、前記蒸留水を5回交換した。透析後、活性画分を限外濾過(Amicon社、PM―10)で濃縮し、リグニン分解酵素溶液を得た。酵素溶液に含まれるリグニン分解酵素の酵素活性を下記の方法で測定した。
<リグニン分解酵素活性の測定>
酵素活性は0.5Mマロン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)50ul、酵素液345ul、10mM過酸化水素5ul、1mM MnSO100ulを十分混合し、反応の結果生じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn(III)マロン酸複合体を酵素活性が、培養開始6日目で6umol/ml/minで認められた。ここで酵素活性単位は1分間にMn(III)マロン酸複合体1umol増加させる活性を1ユニットとした。
[前処理]
チップ状のユーカリ・グロブラスの林地残材(樹皮70%、枝葉30%)を20mmの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機(西邦機工社製、SC−15)で破砕し原料として用いた。
上記原料1kg(絶乾重量)に対して97%亜硫酸ナトリウム50g及び水酸化ナトリウム1gを添加後、水を添加し水溶液の容量を10Lに調製した。前記原料懸濁液を混合後、170℃で1時間加熱した。加熱処理後の原料懸濁液をレファイナー(熊谷理器工業製、KRK高濃度ディスクレファイナー)でディスクのクリアランスを1.0mmに設定し磨砕した。次に20メッシュ(847um)のスクリーンを用いて磨砕処理後の原料懸濁液を固液分離(脱水)することにより溶液の電気伝導度が30uS/cmになるまで水で洗浄し、固形分Aを得た。
[リグニン分解酵素処理]
前記で得られた固形分A(乾燥重量)1gに対して0.1u(0.1単位)のリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。反応後、反応液に含まれる原料(固形分)を水で洗浄後、20メッシュ(847um)のスクリーンを用いて固液分離(脱水)し、固形分Bを得た。
[酵素(セルラーゼ)吸着抑制試験]
基質原料を最終濃度5質量%、CSL(コーンスティープリカー)を最終濃度1質量%、硫酸アンモニウムを最終濃度0.5質量%、となるように調製した水溶液にセルラーゼ10ml(商品名、GC220:ジェネンコア社製)を添加した。30℃、120rpmの攪拌下で糖化反応を行い、24時間後の反応液1mlを回収し、10,000rpmで5分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
酵素回収で最も重要とされるベータ−グルコシダーゼの活性を指標にして回収率を算出した。活性測定は以下に示す方法で行った。結果を表1に示す。
(ベータ−グルコシダーゼ活性)
ネータ−グルコシダーゼ活性の測定は、1.25mM 4−Methyl−umberiferyl−glucosideを含む125mM酢酸緩衝液(pH5.0)16ulに、酵素液4ul加え、37℃、10分間反応を行った後、500mM glycine−NaOH緩衝液(pH10.0)100ulを添加して反応を停止させ、350nmの励起光での460nmの蛍光強度を測定することで行った。酵素回収率は以下の計算式から求めた。
酵素回収率(%)=(上清の酵素活性/添加した酵素活性)x 100
[実施例2]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して0.5uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例3]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して1uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例4]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して2uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例5]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して10uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例6]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して30uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例7]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して50uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例7]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して100uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[実施例8]
実施例1において、固形分A(乾燥重量)1gに対して300uのリグニン分解酵素を添加し30℃で1h反応させた。それ以外の操作は全て実施例1と同様の操作で試験した。結果を表1に示す。
[比較例1]
実施例1において、リグニン分解酵素処理を行わない試験を比較例1とした。結果を表1に示す。
Figure 0005924192
表1に示すように、原料(基質)1gに対して0.5〜300uのリグニン分解酵素を添加した試験(実施例2〜9)では、原料(基質)1gに対して0.1uのリグニン分解酵素を添加した試験(実施例1)、リグニン分解酵素処理を行わない試験(比較例1)と比較し、ベータ―グルコシダーゼの回収率が高かった。
以上の結果から、原料(基質)1gに対するリグニン分解酵素の添加量が0.5〜300uでリグニン分解酵素処理を行うことにより、原料へのベータ―グルコシダーゼ(セルラーゼ)の吸着が抑制された結果、ベータ―グルコシダーゼの回収率を高めることが可能となる。
本発明により、リグノセルロース系原料の未反応成分や反応残渣等への糖化酵素の吸着が抑制されて、酵素糖化処理液からの酵素の分離が容易となる。酵素糖化処理工程内における糖化酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持されるため、リグノセルロース原料の酵素糖化処理による糖類やエタノール等を工業的に生産することが可能となる。

Claims (4)

  1. 酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料を、該原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素生産微生物を含まないリグニン分解酵素をリグニン分解酵素活性で0.5〜300u(単位)添加して処理し、リグニン分解酵素で処理したリグノセルロース系原料を酵素糖化処理工程で酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から反応生成物と糖化酵素含有液を分離回収し、回収した糖化酵素含有液中の糖化酵素を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  2. 前記酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料が、リグノセルロース原料に対して化学的処理と機械的処理の両方の処理、あるいは化学的処理機械的処理のうちいずれか1つの処理が施されているリグノセルロース系原料であることを特徴とする請求項1に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  3. 前記酵素糖化処理工程が、糖化酵素と糖類を発酵基質とする発酵微生物を併用してリグノセルロース系原料の酵素糖化処理と、生成糖類の発酵微生物による発酵処理とを併行して行って糖類と共に糖類の発酵生成物を生成する併行糖化発酵処理工程であることを特徴とする請求項1又は2に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  4. 酵素糖化反応に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料を、該原料(乾燥重量)1gに対して、リグニン分解酵素生産微生物を含まないリグニン分解酵素をリグニン分解酵素活性で0.5〜300u(単位)添加して処理し、該リグニン分解酵素で処理したリグノセルロース系原料を酵素糖化処理工程で酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から糖類含有液と糖化酵素含有液を分離して回収し、回収した糖化酵素含有液中の糖化酵素を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理による糖類の製造方法。
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