JP5290957B2 - 免疫関連遺伝子の多型の検出用プローブおよびその用途 - Google Patents

免疫関連遺伝子の多型の検出用プローブおよびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、免疫に関連する遺伝子の多型を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。
多型の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出目的の領域をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）で増幅させ、その増幅産物の全配列を解析するDirect Sequencing法、（２）前記（１）と同様にＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素処理し、制限断片長の多型による変化を、サザンハイブリダイゼーションによりタイピングするＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法等があげられる。
しかしながら、前記（１）の方法は、例えば、ＰＣＲの後、シークエンスを行い、さらにシーケンサーで電気泳動等を行う必要がある。このため、検出に非常に手間や時間がかかる。また、ＰＣＲの後、得られた増幅産物を処理する必要があるため、その処理時にコンタミネーションが生じるおそれがある。前記（２）の方法も、ＰＣＲの後、得られた増幅産物を種々の制限酵素で処理し、解析する必要があり、手間がかかる。また、得られた増幅産物の制限酵素処理は、一旦、増幅産物を取り出して行う必要がある。このため、１回目の反応で得られた増幅産物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、前記（１）および（２）の方法では、点突然変異の検出を自動化し難いという問題があった。
このような問題から、近年、ＳＮＰの検出方法として、Ｔｍ（Melting Temperature）解析が注目されている。これは、まず、検出目的のＳＮＰを含む領域に相補的なプローブを用いて、被検核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、ハイブリッド形成体に加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、ＳＮＰを判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、検出対象部位の多型がＸまたはＹの場合、目的の多型（例えば、Ｙ）を含む核酸とそれに１００％相補的なプローブとのハイブリッド形成体について、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、被検核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が、前記評価基準値と同じであれば、被検核酸とプローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、被検核酸の検出対象部位が目的の多型（Ｙ）であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値よりも低ければ、被検核酸とプローブとはミスマッチである、すなわち、被検核酸の検出対象部が他方の多型（Ｘ）であると判断できる。このような方法であれば、例えば、前記プローブを添加したＰＣＲ反応液に温度処理を施し、シグナル測定を行うのみで、ＳＮＰを検出できるため、検出装置の自動化も可能である。
しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、以下のような課題がある。遺伝子の多型には、一般に、ホモ接合体（例えば、Ｘ／ＸまたはＹ／Ｙ）とヘテロ接合体（例えば、Ｘ／Ｙ）とが存在する。多型の検出においては、ホモ接合体（Ｘ／ＸまたはＹ／Ｙ）であるか、ヘテロ接合体（Ｘ／Ｙ）であるか、さらに、ホモ接合体の場合には、Ｘ／Ｘのホモ接合体とＹ／Ｙのホモ接合体のいずれであるかを判別することが重要である。しかしながら、ヘテロ接合体の場合、多型がＸである遺伝子と多型がＹである遺伝子とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の違いにすぎない。そうすると、一方の多型（例えば、Ｙ）を含む配列と完全にハイブリダイズ（パーフェクトマッチ）するプローブは、さらに、他方の多型（Ｘ）を含む配列にもハイブリダイズ（１塩基のミスマッチ）するという現象が起こる。このような場合、Ｔｍ解析により、シグナル強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、ミスマッチ配列を示す低温側のピークが、パーフェクトマッチ配列を示す高温側のピークの存在によって、検出し難くなるという問題がある。つまり、試料中にミスマッチ配列が存在する場合であっても、パーフェクトマッチ配列の存在によって、その判別が困難となり、検出感度の低下が生じるおそれがある。また、ホモ接合体についても、多型Ｘのホモ接合体（Ｘ／Ｘ）と、多型Ｙのホモ接合体（Ｙ／Ｙ）とでは、やはり一塩基の配列の違いにすぎない。このため、前述のように、パーフェクトマッチのピークとミスマッチのピークとが判別し難ければ、結果的に、前者（Ｘ／Ｘ）を示すピークであるか、後者（Ｙ／Ｙ）を示すピークであるかの判別が困難である。つまり、ホモ接合体であることは判断できても、多型の種類を決定し難い場合がある。
近年、ヒトが有する免疫機能を利用した抗体医薬が、医薬分野で注目されている。前記抗体医薬としては、例えば、悪性リンパ腫治療薬であるリツキサン（商品名；一般名リツキシマブ）や、乳がんの治療薬であるハーセプチン（商品名；一般名トラスツズマブ）等があげられる。しかしながら、ヒトの免疫力には個人差があり、これが前記抗体医薬の薬効に影響を与えていると考えられている。そして、薬効に影響を与える因子として、遺伝子の変異（例えば、ＳＮＰ）が報告されている。具体的には、免疫に関与する遺伝子である、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子（非特許文献１）の多型が報告されている。この遺伝子は、ＩｇＧのフラグメントＣレセプター（ＦｃＲｓ）の１種であるＦｃγＲIIIａをコードする。このため、治療に前記抗体医薬を用いる際は、例えば、このような遺伝子の多型（ＳＮＰ）を検出し、その結果を考慮して、抗体医薬の投与量や治療薬の変更等の治療方針を決定することが有用と考えられている。
Buillaume Cartron et al. BLOOD, 1 FEBRUARY 2002, VOLUME99, NUMBER3
このような理由から、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の多型の検出は、例えば、抗体医薬を用いる治療において非常に重要である。また、前述の問題は、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子だけでなく、その他の免疫関連遺伝子、例えば、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦα遺伝子およびＴＮＦβ遺伝子についても同様と考えられる。そこで、本発明は、免疫関連遺伝子について、一塩基のみが異なる多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な多型検出方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、下記（Ａ）〜（Ｈ）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ａ）配列番号１における１９３番目のグアニンを一塩基目として３’方向に向かって１３〜２１塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｂ）配列番号２における１９１番目のグアニンを一塩基目として３’方向に向かって１５〜２４塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｃ）配列番号３における３１１番目のグアニンを一塩基目として５’方向に向かって１６〜２１塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを５’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｄ）配列番号４における３９１番目のグアニンを一塩基目として３’方向に向かって１６〜２２塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｅ）配列番号５における４２６番目のグアニンを一塩基目として５’方向に向かって１５〜２４塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを５’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｆ）配列番号６における１６５番目のシトシンを一塩基目として３’方向に向かって１６〜２７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシンを５’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｇ）配列番号７における３９４番目のグアニンを一塩基目として３’方向に向かって１２〜１６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｈ）配列番号３００における３９３番目のグアニンを一塩基目として３’方向に向かって１５〜２２塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシンを３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明の多型検出用試薬は、免疫関連遺伝子の多型を検出するための試薬であって、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。
本発明の多型検出方法は、免疫関連遺伝子の多型の検出方法であって、下記（１）〜（３）工程を含むことを特徴とする。
（１）前記多型を検出する被検核酸と、本発明の多型検出用プローブとを含む反応系を準備する工程
（２）前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（３）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
本発明の多型検出用プローブによれば、免疫関連遺伝子であるＦＣＧＲ３Ａ遺伝子、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦα遺伝子およびＴＮＦβ遺伝子について、後述する所定の多型を、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別することができる。具体的には、免疫関連遺伝子の多型がヘテロ接合体（Ｘ／Ｙ）であっても、多型Ｘと多型Ｙとを判別して検出することが可能である。また、免疫関連遺伝子の多型がホモ接合体（Ｘ／ＸまたはＹ／Ｙ）の場合も、Ｘ／ＸであるかＹ／Ｙであるかを判別することが可能である。前述のように、Ｔｍ解析によるヘテロ接合体（Ｘ／Ｙ）の検出において、従来のプローブでは、前述のように、前記プローブが、一方の多型（Ｘ）を含む配列と、１塩基のみ異なる他方の多型（Ｙ）を含む配列の両方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において両者のシグナルピークが重なり、多型の判別が困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、両方の配列にハイブリダイズするものの、前記融解曲線において、両者のシグナルピークを十分に分離できる。このため、本発明によれば、一塩基のみが異なる多型を、簡便に判別して検出できる。また、本発明によれば、例えば、同一反応系に二種類以上のプローブを添加しても、各プローブが対応する免疫関連遺伝子の多型を、前記同一反応系において判別できる。このため、例えば、一つの被検試料について、一つの反応系を用いて、複数の多型を検出することができる。このように、本発明によれば、免疫関連遺伝子の多型を容易に優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を前述のような抗体医薬の投与による治療に反映することもできる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例３におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
本発明において、以下、検出目的の多型が発生する部位を「検出対象部位」といい、プローブがハイブリダイズ可能な配列であって前記検出対象部位を含む前記配列を「検出対象配列」という。前記検出対象配列の中でも、プローブとパーフェクトマッチする検出対象配列を「パーフェクトマッチ配列」、プローブとミスマッチする検出対象配列を「ミスマッチ配列」という。本発明において、パーフェクトマッチとは、前記検出対象部位の塩基が前記プローブにおける対応塩基と相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記プローブとが、完全に相補的であることを意味する。本発明において、ミスマッチとは、前記検出対象部位の塩基が前記プローブにおける対応塩基と非相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象部位と前記プローブとが、前記検出対象部位以外において完全に相補的であることを意味する。また、パーフェクトマッチ配列を有する核酸、ＤＮＡまたは遺伝子を、「パーフェクトマッチ核酸、パーフェクトマッチＤＮＡまたはパーフェクトマッチ遺伝子」といい、ミスマッチ配列を有する核酸、ＤＮＡまたは遺伝子を、「ミスマッチ核酸、ミスマッチＤＮＡまたはミスマッチ遺伝子」という。また、多型の検出が行われる核酸、ＤＮＡまたは遺伝子を「被検核酸、被検ＤＮＡまたは被検遺伝子」という。
＜プローブ＞
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、免疫関連遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記（Ａ）〜（Ｈ）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。なお、後述するように、本発明の多型検出プローブは、例えば、以下の各種オリゴヌクレオチド以外に、例えば、標識化物質等を有してもよい。
ＦＣＧＲ３Ａプローブ
下記（Ａ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＦＣＧＲ３Ａプローブ」という。
（Ａ）配列番号１における１９３番目のグアニン（ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１３〜２１塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＦＣＧＲ３Ａプローブは、配列番号１に示すＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の部分配列において、２０１番目の塩基（ｋ）の多型（ｇ／ｔ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｇ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ３９６９９１に登録されている。本発明において、以下、この多型を「ＦＣＧＲ３Ａ多型」という。
本発明のＦＣＧＲ３Ａプローブは、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子のセンス鎖（順鎖）に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ａ）において、配列番号１の２０１番目の塩基（ｋ）に対応する相補的な塩基は、ｍで表され、前記ｍは、アデニンまたはシトシンである。ｍがアデニンの場合、プローブは、多型（ｔ）とパーフェクトマッチし、ｍがシトシンの場合、プローブは、多型（ｇ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、ＦＣＧＲ３Ａ多型を検出できる。ｍは、好ましくは、アデニンである。
ＦＣＧＲ３Ａプローブの具体例を、下記表に示す。配列番号８〜１６で表されるプローブは、配列番号１における２０１番目（ｋ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｍが、配列番号１における２０１番目の塩基（ｋ）に対応する相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｍは、アデニン（ａ）およびシトシン（ｃ）のいずれでもよく、好ましくはアデニン（ａ）である。下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である（以下、同様）。前記Ｔｍ値は、例えば、前記ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method）によって決定することもできる。下記プローブの中でも、配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ａ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＦＣＧＲ３Ａプローブは、前記（Ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ａ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖（逆鎖）とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＦＣＧＲ２Ａプローブ
下記（Ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＦＣＧＲ２Ａ遺伝子の多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＦＣＧＲ２Ａプローブ」という。
（Ｂ）配列番号２における１９１番目のグアニン（ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１５〜２４塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＦＣＧＲ２Ａプローブは、配列番号２に示すＦＣＧＲ２Ａ遺伝子の部分配列において、２０１番目の塩基（ｙ）の多型（ｔ／ｃ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｔ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８０１２７４に登録されている。以下、この多型を「ＦＣＧＲ２Ａ多型」という。
本発明のＦＣＧＲ２Ａプローブは、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子のセンス鎖（順鎖）に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）において、配列番号２の２０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基は、ｒで表わされ、前記ｒは、アデニンまたはグアニンである。ｒがグアニンの場合、プローブは、多型（ｃ）とパーフェクトマッチし、ｒがアデニンの場合、プローブは、多型（ｔ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、ＦＣＧＲ２Ａ多型を検出できる。ｒは、好ましくは、アデニンである。
ＦＣＧＲ２Ａプローブの具体例を、下記表に示す。配列番号１７〜２６で表されるプローブは、配列番号２における２０１番目（ｙ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｒが、配列番号２における２０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｒは、アデニン（ａ）およびグアニン（ｇ）のいずれでもよく、好ましくはアデニン（ａ）である。下記プローブの中でも、配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｂ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＦＣＧＲ２Ａプローブは、前記（Ｂ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｂ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖（逆鎖）とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＩＬ−１０（−５９２）プローブ
下記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＩＬ−１０遺伝子の５９２番目の部位における多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＩＬ−１０（−５９２）プローブ」という。
（Ｃ）配列番号３における３１１番目のグアニン（Ｇ）を一塩基目として５’方向に向かって１６〜２１塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（Ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＩＬ−１０（−５９２）プローブは、配列番号３に示すＩＬ−１０遺伝子の部分配列において、３０１番目の塩基（ｍ）の多型（ａ／ｃ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｃ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８００８７２に登録されている。以下、この多型を「ＩＬ−１０（−５９２）多型」という。
本発明のＩＬ−１０（−５９２）プローブは、ＩＬ−１０遺伝子のセンス鎖に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｃ）において、配列番号３の３０１番目の塩基（ｍ）に対応する相補的な塩基は、ｋで表され、前記ｋは、チミンまたはグアニンである。ｋがチミンの場合、プローブは、多型（ａ）とパーフェクトマッチし、ｋがグアニンの場合、プローブは、多型（ｃ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、ＩＬ−１０（−５９２）多型を検出できる。ｋは、好ましくは、チミンである。
本発明のＩＬ−１０（−５９２）プローブの具体例を、下記表に示す。配列番号２７〜３２で表されるプローブは、配列番号３における３０１番目（ｍ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｋが、配列番号３における３０１番目の塩基（ｍ）に対応する相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｋは、チミン（ｔ）およびグアニン（ｇ）のいずれでもよく、好ましくはチミン（ｔ）である。下記プローブの中でも、配列番号３０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｃ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＩＬ−１０（−５９２）プローブは、前記（Ｃ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＩＬ−１０（−８１９）プローブ
下記（Ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＩＬ−１０遺伝子の８１９番目の部位における多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＩＬ−１０（−８１９）プローブ」という。
（Ｄ）配列番号４における３９１番目のグアニン（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１６〜２２塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＩＬ−１０（−８１９）プローブは、配列番号４に示すＩＬ−１０遺伝子の部分配列において、４０１番目の塩基（ｙ）の多型（ｃ／ｔ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｃ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８００８７１に登録されている。以下、この多型を「ＩＬ−１０（−８１９）多型」という。
本発明のＩＬ−１０（−８１９）プローブは、ＩＬ−１０遺伝子のセンス鎖に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｄ）において、配列番号４の４０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基は、ｒで表され、前記ｒは、グアニンまたはアデニンである。ｒがグアニンの場合、プローブは、多型（ｃ）とパーフェクトマッチし、ｒがアデニンの場合、プローブは、多型（ｔ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、多型を検出できる。ｒは、好ましくは、グアニンである。
本発明のＩＬ−１０（−８１９）プローブの具体例を、下記表に示す。配列番号３３〜３９で表されるプローブは、配列番号４における４０１番目（ｙ）を含む領域に相補的な配列からなり、前記ｒが、配列番号４における４０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｒは、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）のいずれでもよく、好ましくはグアニン（ｇ）である。下記プローブの中でも、配列番号３６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｄ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＩＬ−１０（−８１９）プローブは、前記（Ｄ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｄ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＩＬ−１０（−１０８２）プローブ
下記（Ｅ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＩＬ−１０遺伝子の１０８２番目の部位における多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＩＬ−１０（−１０８２）プローブ」という。
（Ｅ）配列番号５における４２６番目のグアニン（Ｇ）を一塩基目として５’方向に向かって１５〜２４塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（Ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＩＬ−１０（−１０８２）プローブは、配列番号５に示すＩＬ−１０遺伝子の部分配列において、４１４番目の塩基（ｒ）の多型（ａ／ｇ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ａ”）を検出するためのプライマーである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８００８９６に登録されている。以下、この多型を「ＩＬ−１０（−１０８２）多型」という。
本発明のＩＬ−１０（−１０８２）プローブは、ＩＬ−１０遺伝子のセンス鎖に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｅ）において、配列番号５の４１４番目の塩基（ｒ）に相補的な塩基は、ｙで表され、前記ｙは、チミンまたはシトシンである。ｙがチミンの場合、プローブは、多型（ａ）とパーフェクトマッチし、ｙがシトシンの場合、プローブは、多型（ｇ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、多型を検出できる。ｙは、好ましくは、シトシンである。
本発明のＩＬ−１０（−１０８２）プローブの具体例を、下記表に示す。配列番号４０〜４９で表されるプローブは、配列番号５における４１４番目（ｒ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｙが、配列番号５における４１４番目の塩基（ｒ）に相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｙは、チミン（ｔ）およびシトシン（ｃ）のいずれでもよく、好ましくはシトシン（ｃ）である。下記プローブの中でも、配列番号４７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｅ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＩＬ−１０（−１０８２）プローブは、前記（Ｅ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｅ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＩＬ−１０（−３５７５）プローブ
下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＩＬ−１０遺伝子の３５７５番目の部位における多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＩＬ−１０（−３５７５）プローブ」という。
（Ｆ）配列番号６における１６５番目のシトシン（Ｃ）を一塩基目として３’方向に向かって１６〜２７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（Ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＩＬ−１０（−３５７５）プローブは、配列番号６に示すＩＬ−１０遺伝子の部分配列において、１７９番目の塩基（ｗ）の多型（ａ／ｔ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｔ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８００８９０に登録されている。以下、この多型を「ＩＬ−１０（−３５７５）多型」という。
本発明のＩＬ−１０（−３５７５）プローブは、ＩＬ−１０遺伝子のアンチセンス鎖に相補的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｆ）において、配列番号６の１７９番目の塩基（ｗ）に対応する塩基は、ｗで表され、前記ｗは、チミンまたはアデニンである。ｗがチミンの場合、プローブは、アンチセンス鎖の多型（ａ）とパーフェクトマッチし、ｗがアデニンの場合、プローブは、アンチセンス鎖の多型（ｔ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、多型を検出できる。ｗは、好ましくは、チミンである。
本発明のＩＬ−１０（−３５７５）プローブの具体例を、下記表に示す。配列番号５０〜６１で表されるプローブは、配列番号６における１７９番目（ｗ）を含む領域と同じ配列からなり、塩基ｗが、配列番号６における１７９番目の塩基（ｗ）に対応する塩基である。以下に示す配列において、塩基ｗは、チミン（ｔ）およびアデニン（ａ）のいずれでもよく、好ましくはチミン（ｔ）である。下記プローブの中でも、配列番号５７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＩＬ−１０（−３５７５）プローブは、前記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｆ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。
ＴＮＦα（−３０８）プローブ
下記（Ｇ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＴＮＦα遺伝子の多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＴＮＦα（−３０８）プローブまたはＴＮＦαプローブ」という。
（Ｇ）配列番号７における３９４番目のグアニン（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１２〜１６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＴＮＦαプローブは、配列番号７に示すＴＮＦα遺伝子の部分配列において、４０１番目の塩基（ｒ）の多型（ａ／ｇ；Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ａｌｌｅｌｅ“ｇ”）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ１８００６２９に登録されている。以下、この多型を「ＴＮＦα（−３０８）多型またはＴＮＦα多型」という。
本発明のＴＮＦαプローブは、ＴＮＦα遺伝子のセンス鎖に相補的であり、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖における多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｇ）において、配列番号７の４０１番目の塩基（ｒ）に相補的な塩基は、ｙで表され、前記ｙは、チミンまたはシトシンである。ｙがチミンの場合、プローブは、多型（ａ）とパーフェクトマッチし、ｙがシトシンの場合、プローブは、多型（ｇ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、多型を検出できる。ｙは、好ましくは、シトシンである。
本発明のＴＮＦαプローブの具体例を、下記表に示す。配列番号６２〜６６で表されるプローブは、配列番号７における４０１番目（ｒ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｙが、配列番号７における４０１番目の塩基（ｒ）に相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｙは、チミン（ｔ）およびシトシン（ｃ）のいずれでもよく、好ましくはシトシン（ｃ）である。下記プローブの中でも、配列番号６４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｇ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＴＮＦαプローブは、前記（Ｇ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｇ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
ＴＮＦβプローブ
下記（Ｈ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、免疫関連遺伝子であるＴＮＦβ遺伝子の多型を検出するためのプローブである。以下、このプローブを「ＴＮＦβ（＋２５２）プローブまたはＴＮＦβプローブ」という。
（Ｈ）配列番号３００における３９３番目のグアニン（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１５〜２２塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニンに相補的なシトシン（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
本発明のＴＮＦβプライマーは、配列番号３００に示すＴＮＦβ遺伝子の部分配列において、４０１番目の塩基（ｙ）の多型（ｔ／ｃ）を検出するためのプローブである。この多型は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ｒｓ９０９２５３に登録されている。以下、この多型を「ＴＮＦβ（＋２５２）多型またはＴＮＦβ多型」という。
本発明のＴＮＦβプローブは、ＴＮＦβ遺伝子のセンス鎖に相補的であって、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、センス鎖の多型を検出できる。前記オリゴヌクレオチド（Ｈ）において、配列番号３００の４０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基は、ｒで表され、前記ｒは、アデニンまたはグアニンである。ｒがグアニンの場合、プローブは、多型（ｃ）とパーフェクトマッチし、ｒがアデニンの場合、プローブは、多型（ｔ）とパーフェクトマッチする。したがって、パーフェクトマッチか否かによって、多型を検出できる。ｒは、好ましくは、グアニンである。
ＴＮＦβプローブの具体例を、下記表に示す。配列番号３０１〜３０８で表されるプローブは、配列番号３００における４０１番目（ｙ）を含む領域に相補的な配列からなり、塩基ｒが、配列番号３００における４０１番目の塩基（ｙ）に対応する相補的な塩基である。以下に示す各配列において、塩基ｒは、アデニン（ａ）およびグアニン（ｇ）のいずれでもよく、好ましくはグアニン（ｇ）である。下記プローブの中でも、配列番号３０６または配列番号３０７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｈ１）が好ましい。
Figure 0005290957
また、本発明のＴＮＦβプローブは、また、前記（Ｈ）のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｈ’）からなるプローブであってもよい。これによれば、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、アンチセンス鎖における多型を検出できる。
本発明のプローブは、前述の各オリゴヌクレオチドにおいて、検出対象部位に対応する塩基部位以外で、１個または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、検出対象配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなるプローブを含む。
本発明のプローブは、前述のオリゴヌクレオチドに標識化物質が結合した標識化プローブであることが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。
前記標識化物質は、制限されないが、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon）を利用したプローブは、蛍光消光プローブと呼ばれる。前記標識化プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、より好ましくは、３’末端および５’末端のうち、塩基がシトシンであるヌクレオチド末端が標識化されていることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出対象配列において、前記標識化プローブの末端塩基のシトシンと対をなす塩基、もしくは、前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニンとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出対象配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシンが、前記検出対象配列におけるグアニンに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ベクトンディッキンソン社製）等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズとその解離を容易に確認できる。
また、本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、被検核酸は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製でき、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系中に共存させることができる。このような場合、前記プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、例えば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
本発明のプローブは、それぞれ、各種免疫関連遺伝子における多型の検出に使用できる。また、多型の検出の際には、本発明のプローブのうち一種類を用いて、一種類の多型のみを検出してもよいし、二種類以上のプローブを用いて、二種類以上の多型を検出してもよい。本発明のプローブを二種類以上使用する場合、例えば、同一の反応系に共存させて、前記同一反応系を用いて二種類以上の多型を検出することができる。この場合は、各プローブを、異なる検出条件の蛍光色素で標識化することが好ましい。
なお、本発明のプローブを用いた多型の検出において、検出方法は何ら制限されず、検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。本発明のプローブを適用する方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型の検出方法について、以下に説明する。
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、免疫関連遺伝子の多型の検出方法であって、下記（１）〜（３）工程を含むことを特徴とする。なお、本発明の多型検出方法は、本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（１）前記多型を検出する被検核酸と、本発明の多型検出用プローブとを含む反応系を準備する工程
（２）前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（３）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
本発明の多型検出方法において使用する本発明のプローブは、前述のように、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。前者の場合、一つの反応系において、所望の一種類の多型を検出でき、後者の場合、二種類以上の本発明のプローブを反応系に添加することで、一つの反応系において、各プローブに対応する所望の二種類以上の多型をそれぞれ検出できる。一つの反応系で二種類以上の多型を検出する場合、本発明のプローブの組み合わせは特に制限されないが、例えば、以下のような組み合わせがあげられる。
（１）ＦＣＧＲ３ＡプローブとＩＬ−１０（−８１９）プローブとの組み合わせ、好ましくは、配列番号１４の配列を含むプローブと配列番号３６の配列を含むプローブとの組み合わせ
（２）ＦＣＧＲ２ＡプローブとＩＬ−１０（−５９２）プローブとＴＮＦα（−３０８）プローブとの組み合わせ、好ましくは、配列番号２３の配列を含むプローブと配列番号３０の配列を含むプローブと配列番号６４の配列を含むプローブ
（３）ＩＬ−１０（−１０８２）プローブとＩＬ−１０（−３５７５）プローブとの組み合わせ、好ましくは、配列番号４７の配列を含むプローブと配列番号５７の配列を含むプライマーとの組み合わせ
（４）ＩＬ−１０（−５９２）プローブとＩＬ−１０（−１０８２）プローブとの組み合わせ、好ましくは、配列番号３０の配列を含むプローブと配列番号４７の配列を含むプローブとの組み合わせ
一つの反応系に二種類以上のプローブを添加する場合、各プローブは、それぞれ異なる検出条件の標識化物質で標識化されていることが好ましい。これによって、検出条件を変えるのみで、同じ反応系を用いて、二種類以上の多型を簡便に検出できる。
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、後述するように、前記（２）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、本発明のプローブとのハイブリダイズが可能となる。
本発明において、前記被検核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれる核酸でもよいし、検出精度を向上できることから、前記核酸を鋳型核酸として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物であってもよい。前記増幅産物は、例えば、生体試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよいし、生体試料中のトータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡから逆転写−ＰＣＲにより合成したｃＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。
前記被検核酸が前記増幅産物の場合、前記（１）工程において、例えば、予め調製した増幅産物を用いて、本発明のプローブと前記増幅産物とを含む反応系を準備してもよいし、本発明のプローブの存在下、鋳型核酸から核酸増幅法により目的の増幅産物を増幅させ、前記プローブと増幅産物とを含む反応系を準備してもよい。
後者の場合、前記（１）工程は、下記（１ａ）工程を含むことが好ましい。
（１ａ）前記プローブを含む反応系において、核酸増幅法により、鋳型核酸から前記被検核酸となる増幅産物を生成する工程
前記核酸増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription−mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等があげられるが、中でもＰＣＲ法が好ましい。
前記（１ａ）工程においては、前記免疫関連遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅するためのプライマーを使用することが好ましい。プライマーの配列は、特に制限されず、検出対象部位を含む検出対象配列を増幅できればよく、例えば、検出対象配列やその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜３０ｍｅｒがあげられる。前述のように、二種類以上の多型を検出する場合は、各多型についての検出対象配列を増幅するためのプライマーを、それぞれ併用してもよい。また、同一反応系にこれらのプライマーを共存させることで、二種類以上の検出対象配列を同時に増幅することができる。
前記プライマーとしては、例えば、遺伝子のセンス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。以下に、プライマーセットの一例を示すが、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
ＦＣＧＲ３Ａプライマーセット（ａ）
ＦＣＧＲ３Ａ多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット（ａ）があげられる。
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における１７３番目のシトシン（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２７〜４６塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における３０７番目のアデニン（ａ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜２９塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記３０７番目のアデニン（ａ）に相補的なチミン（ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号７７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９７の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＦＣＧＲ２Ａプライマーセット（ｂ）
ＦＣＧＲ２Ａ多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット（ｂ）があげられる。
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット
（Ｆ２） 配列番号２の塩基配列における１８９番目のグアニン（ｇ）を一塩基目として５’方向に向かって２３〜３８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２） 配列番号２の塩基配列における２０６番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって３１〜４８塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレ−オチドであって、前記２０６番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号１３２の配列からなるＦ２プライマーと、配列番号１１４の塩基配列からなるＲ２プライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−５９２）プライマーセット（ｃ）
ＩＬ−１０（−５９２）多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ３）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット（ｃ）があげられる。
（Ｆ３）配列番号３の塩基配列における２９１番目のシトシン（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２３〜４１塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ３） 配列番号３の塩基配列における３１１番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって２７〜４１塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記３１１番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号１４８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６７の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−８１９）プライマーセット（ｄ）
ＩＬ−１０（−８１９）多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ４）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ４）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット（ｄ）があげられる。
（Ｆ４）配列番号４の塩基配列における３５１番目のグアニン（ｇ）を一塩基目として５’方向に向かって２４〜３９塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ４）配列番号４の塩基配列における４２０番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって２９〜４６塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記４２０番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号１８２の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１９８の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−１０８２）用プライマーセット（ｅ）
ＩＬ−１０（−１０８２）多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ５）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ５）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセット（ｅ）があげられる。
（Ｆ５）配列番号５の塩基配列における３２９番目のシトシン（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２２〜３２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ５）配列番号５の塩基配列における４４７番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜３９塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記４４７番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２１３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２７の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−３５７５）用プライマーセット（ｆ）
ＩＬ−１０（−３５７５）多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ６）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ６）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセットがあげられる。
（Ｆ６）配列番号６の塩基配列における１３９番目のシトシン（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって２５〜４２塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ６）配列番号６の塩基配列における２２３番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３３塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記２２３番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２４４の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６０の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＴＮＦαプライマーセット（ｇ）
ＴＮＦα多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ７）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ７）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセットがあげられる。
（Ｆ７）配列番号７の塩基配列における３８６番目のグアニン（ｇ）を一塩基目として５’方向に向かって２６〜４１塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ７）配列番号７の塩基配列における４１８番目のシトシン（ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２４〜４０塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記４１８番目のシトシン（ｃ）に相補的なグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２７７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２９３の塩基配列からなるリバースとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
ＴＮＦβプライマーセット（ｈ）
ＴＮＦβ多型の検出において、プライマーセットとしては、例えば、下記（Ｆ８）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ８）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含むプライマーセットがあげられる。
（Ｆ８）配列番号３００の塩基配列における３５０番目のシトシン（ｃ）を一塩基目として５’方向に向かって１８〜３７塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ８）配列番号３００の塩基配列における４４３番目のグアニン（ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって１７〜３７塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであって、前記４４３番目のグアニン（ｇ）に相補的なシトシン（ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
以下に、フォワードプライマーとリバースプライマーの具体例を示すが、本発明はこれには限定されない。また、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号３３７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３１２の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
Figure 0005290957
前記（１）工程において、前記被検核酸に対する本発明のプローブの添加割合（モル比）は、特に制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。この際、前記被検核酸とは、例えば、パーフェクトマッチ配列を有するパーフェクトマッチ核酸とミスマッチ配列を有するミスマッチ核酸との合計でもよいし、パーフェクトマッチ配列を含む増幅産物とミスマッチ配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、被検核酸におけるパーフェクトマッチＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、パーフェクトマッチ核酸（パーフェクトマッチ配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
本発明の多型検出方法を適用する試料としては、特に制限されないが、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例としては、例えば、白血球細胞等の血球、全血、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
Ｔｍ値について説明する。二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ）に解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖核酸になると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、プローブに付加した標識化物質のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識化物質によるシグナルを、シグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。
次に、本発明の多型検出方法について、被検核酸が核酸増幅物であり、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、本発明のプローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。具体例としては、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識化プローブを添加して、反応液を調製する。前述のように、添加する標識化プローブは、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。前記標識化プローブとしては、例えば、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。前記ＱＰｒｏｂｅとは、一般に、プローブ末端のシトシンを蛍光色素で標識化したプローブであり、これが検出対象配列にハイブリダイズすることで、前記蛍光色素と検出対象配列のグアニンとが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。標識化プローブの塩基配列は、前述の通りであって、検出目的の多型に応じて、適宜選択すればよい。
前記標識化プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する核酸増幅反応の後、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、核酸増幅反応の前に添加してもよい。このようにＰＣＲ等の核酸増幅反応前に前記標識化プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、プローブの３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
前記標識化プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の核酸増幅用反応液、従来公知のものがあげられる。
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識化プローブの存在下、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の多型が発生する検出対象部位を含む配列を増幅させる。以下、核酸増幅法としてＰＣＲを例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
具体的には、前記ゲノムＤＮＡと前記標識化プローブとを含む前記反応液について、ＰＣＲを行う。この反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できるが、例えば、前記ゲノムＤＮＡおよび前記標識化プローブの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ等のｄＮＴＰ、緩衝液、各種触媒、プライマー等があげられる。
次に、得られた増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
前記二本鎖ＤＮＡの解離は、例えば、加熱により行うことができる。この解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。このハイブリダイズ工程における温度条件は、特に制限されないが、前記標識化プローブのＴｍ値よりも低い温度であることが好ましく、例えば、４０〜５０℃である。また、前記温度での処理時間は、特に制限されないが、例えば、１〜６００秒である。
ハイブリダイズ工程において、前記反応液の各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌであり、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前述のＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物（前記一本鎖ＤＮＡ）と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液を加熱することで、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、末端のシトシンが標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
二種類以上の標識化プローブを用いて、二種類以上の多型を検出する際には、各標識化プローブの標識化物質に応じた条件で、各標識化プローブに基づくシグナル変動を測定すればよい。
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、例えば、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、変化量を（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い点をＴｍ値として決定できる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
そして、これらのＴｍ値から、目的の検出対象部位における多型（遺伝子型）を決定する。Ｔｍ解析において、例えば、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、目的の検出対象部位における多型を決定することができる。例えば、目的の検出対象部位における多型がＸまたはＹの場合、検出対象部位がＸである検出対象配列に完全に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれな、検出対象部位の塩基はＸと判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ、または、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値よりも低い値であれば、検出対象部位の塩基はＹと判断できる。
また、本発明においては、前述のように、前記反応液の温度を上昇させ、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合について説明する。一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、免疫関連遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬であって、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。なお、本発明の多型検出用試薬は、例えば、免疫関連遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
本発明の多型検出用試薬において、本発明の多型検出用プローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。プローブが二種類以上の場合、その組み合わせは、特に制限されないが、例えば、前述のような組み合わせがあげられる。また、二種類以上のプローブは、例えば、別個の容器に収容されてもよいが、前述のように同一反応系での多型の検出が可能であることから、混合された状態で同じ容器に収容でされてもよい。また、二種類以上のプローブを含む場合、各プローブは、別個の標識化物質で標識化されていることが好ましい。このように標識化物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記標識化物質としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
前述のように、免疫関連遺伝子である、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦα遺伝子およびＴＮＦβ遺伝子には、それぞれ、例えば、商品名リツキサン等の悪性リンパ腫治療薬、商品名ハーセプチン等の乳がん治療薬（例えば、商品名ハーセプチン）のような抗体医薬の薬効に関与している多型の存在が報告されている。そして、本発明のプローブによれば、これらの多型をそれぞれ検出することができる。また、これらの多型について、例えば、いずれか一種類のみに変異型が検出される場合もあるが、複数種類に変異型が検出される場合もある。本発明において検出目的としている各多型は、それぞれ前記抗体医薬の薬効と関係を示すが、それぞれに特有の特徴を示すと考えられる。このため、例えば、複数の多型を検出し、それらの結果を総合的に判断することで、より良い診断や治療が可能になる。したがって、本発明の多型検出試薬またはプローブキットにおいて、本発明のプローブを二種類以上含有させることによって、診断や治療等のための多型検出をより簡便に行うことができる。
本発明の検出用試薬は、さらに、免疫関連遺伝子における検出目的部位を含む領域を増幅するためのプライマーやプライマーセットを含んでもよい。プライマーセットとしては、例えば、使用する本発明のプローブの種類に応じて、前述のようなものがあげられる。具体的には、ＦＣＧＲ３ＡプローブとＦＣＧＲ３Ａプライマーセット、ＦＣＧＲ２ＡプローブとＦＣＧＲ２Ａプライマーセット、ＩＬ−１０（−５９２）プローブとＩＬ−１０（−５９２）プライマーセット、ＩＬ−１０（−８１９）プローブとＩＬ−１０（−８１９）プライマーセット、ＩＬ−１０（−１０８２）プローブとＩＬ−１０（−１０８２）プライマーセット、ＩＬ−１０（−３５７５）プローブとＩＬ−１０（−３５７５）プライマーセット、ＴＮＦαプローブとＴＮＦαプライマーセット、ＴＮＦβプローブとＴＮＦβプライマーセットを、それぞれ組み合わせて含むことが好ましい。
本発明のプローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、前述のような例があげられる。また、プライマーまたはプライマーセットの組み合わせについても、本発明のプローブの組み合わせに応じて決定できる。
本発明の検出用試薬は、この他にも、例えば、核酸増幅反応に必要な成分を含んでもよい。具体例としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ等のｄＮＴＰ、緩衝液、各種触媒等があげられる。また、本発明の検出用試薬は、検出試薬キットでもよく、さらに、使用説明書を含んでもよい。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。なお、％は、ｗ／ｖ％を示す。
［実施例１］
ＦＣＧＲ３Ａ多型およびＩＬ−１０（−８１９）多型の検出
本発明のプローブを使用して、Ｔｍ解析により、ＦＣＧＲ３Ａ多型およびＩＬ−１０（−８１９）多型を検出した。
ＦＣＧＲ３Ａ多型およびＩＬ−１０（−８１９）多型が既知である３名の健常者から、ＥＤＴＡ採血菅により血液を採取した（サンプル１〜サンプル３）。各サンプルのＦＣＧＲ３Ａ多型およびＩＬ−１０（−８１９）多型は、それぞれ以下の通りである。
ＦＣＧＲ３Ａ多型 ＩＬ−１０（−８１９）多型
サンプル１ Ｔ／Ｔ Ｃ／Ｃ
サンプル２ Ｇ／Ｔ Ｔ／Ｃ
サンプル３ Ｔ／Ｔ Ｔ／Ｔ
前記各サンプル１０μＬを７０μＬの下記検体希釈液１と混合し、混合液１０μＬを、さらに、７０μＬの下記検体希釈液２と混合した。この混合液１７μＬを９５℃で１０分間加熱した後、下記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加してＰＣＲを行った。前記ＰＣＲは、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６２℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長５１５〜５５５ｎｍ、５８５〜７００ｎｍ）。
（検体希釈液１）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ） ＥＤＴＡ
０．０５％ ＮａＮ３
０．３％ ＳＤＳ
（検体希釈液２）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
０．０５％ ＮａＮ３
Figure 0005290957
ＦＣＧＲ３Ａプローブ（配列番号１４）
５’−tcccaaAaagccccc-(BODIPY FL)−３’
ＦＣＧＲ３Ａ Ｆプライマー（配列番号７７）
５’−tctgacttctacattccaaaagccacactcaaagac−３’
ＦＣＧＲ３Ａ Ｒプライマー（配列番号９７）
５’−ctcctcccaactcaacttcccagtgtgat−３’
ＩＬ−１０（−８１９）プローブ（配列番号３６）
５’−acagagatGttacatcacc-(TAMRA)−３’
ＩＬ−１０（−８１９） Ｆプライマー（配列番号１８２）
５’−tgctggagatggtgtacagtagggtgagg−３’
ＩＬ−１０（−８１９） Ｒプライマー（配列番号１９８）
５’−caccatgacccctaccgtctctattttatagtgagc−３’
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）はサンプル１、（Ｂ）はサンプル２、（Ｃ）はサンプル３の結果であり、上段はＦＣＧＲ３Ａ多型、下段はＩＬ−１０（−８１９）多型の結果を示す。
本実施例では、ＦＣＧＲ３Ａプローブとして、センス鎖のＦＣＧＲ３Ａ多型（ｔ）にパーフェクトマッチするプローブを使用し、ＩＬ−１０（−８１９）プローブとして、センス鎖のＩＬ−１０（−８１９）多型（ｃ）にパーフェクトマッチするプローブを使用した。その結果、ＦＣＧＲ３Ａ多型の検出では、図１の上段に示すように、ホモ接合体（Ｔ／Ｔ）のサンプル１および３は、パーフェクトマッチを示す５７．０℃のみにピークを示した。他方、ヘテロ接合体（Ｇ／Ｔ）のサンプル２は、パーフェクトマッチを示す５７．０℃と１塩基のミスマッチを示す４８．０℃とにピークを示した。また、ＩＬ−１０（−８１９）多型の検出では、図１の下段に示すように、ホモ接合体（Ｃ／Ｃ）のサンプル１は、パーフェクトマッチを示す５９．０℃のみにピークを示し、ホモ接合体（Ｔ／Ｔ）のサンプル３は、ミスマッチを示す５２．５℃のみにピークを示した。他方、ヘテロ接合体（Ｔ／Ｃ）のサンプル２は、パーフェクトマッチを示す５９．０℃と１塩基のミスマッチを示す５２．５℃とにピークを示した。この結果から、本発明のプローブによれば、検出対象配列とのハイブリダイゼーションがパーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを、十分に判断でき、且つ、二種類の多型を一つの反応系で判断できることがわかった。
［実施例２］
ＦＣＧＲ２Ａ多型、ＩＬ−１０（−５９２）多型およびＴＮＦα多型の検出
本発明のプローブを使用して、Ｔｍ解析により、ＦＣＧＲ２Ａ多型、ＩＬ−１０（−５９２）多型およびＴＮＦα（−３０８）多型を検出した。
ＦＣＧＲ２Ａ多型、ＩＬ−１０（−５９２）多型およびＴＮＦα（−３０８）多型が既知である１名の健常者から、ＥＤＴＡ採血菅により血液を採取した（サンプル１）。また、ＴＮＦα（−３０８）多型がホモ接合体（Ａ／Ａ）であるＴＮＦα遺伝子を有するプラスミドを準備した（サンプル２）。各サンプルのＦＣＧＲ２Ａ多型、ＩＬ−１０（−５９２）多型およびＴＮＦα（−３０８）多型は、以下の通りである。
ＦＣＧＲ２Ａ多型 ＩＬ−１０（−５９２）多型 ＴＮＦα多型
サンプル１ Ｃ／Ｔ Ｃ／Ａ Ｇ／Ｇ
サンプル２ − − Ａ／Ａ
１０μＬのサンプル１を７０μＬの前記検体希釈液１と混合し、混合液１０μＬを、さらに、７０μＬの前記検体希釈液２と混合した。この混合液１７μＬを９５℃で１０分間加熱した後、下記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加してＰＣＲを行った。他方、１μＬのサンプル２（３．５ｐｇ）を下記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加してＰＣＲを行った。前記ＰＣＲは、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６２℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長４５０〜４８０ｎｍ、５１５〜５５５ｎｍ、５８５〜７００ｎｍ）。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−５９２）プローブ（配列番号３０）
５’−(Pacific Blue)-cttcctacagTacaggcg-P−３’
ＩＬ−１０（−５９２）Ｆプライマー（配列番号１４８）
５’−ggtaaaggagcctggaacacatcctgtgac−３’
ＩＬ−１０（−５９２）Ｒプライマー（配列番号１６７）
５’−agcccttccattttactttccagagactggc−３’
ＦＣＧＲ２Ａプローブ（配列番号２３）
５’−ttctcccAtttggatccc-(BODIPY FL)−３’
ＦＣＧＲ２Ａ Ｆプライマー（配列番号１３２）
５’−ctgtggtttgcttgtgggatggagaagg−３’
ＦＣＧＲ２Ａ Ｒプライマー（配列番号３８）
５’−aggtcacattcttccagaatggaaaatcccagaaattc−３’
ＴＮＦα（−３０８）プローブ（配列番号６４）
５’−ccgtccCcatgccc-(TAMRA)−３’
ＴＮＦα（−３０８）Ｆプライマー（配列番号２７７）
５’−cctggtccccaaaagaaatggaggcaatagg−３’
ＴＮＦα（−３０８）Ｒプライマー（配列番号２９３）
５’−ccactgactgatttgtgtgtaggaccctgg−３’
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）はサンプル１、（Ｂ）はサンプル２の結果であり、上段はＩＬ−１０（−５９２）多型、中段はＦＣＧＲ２Ａ多型、下段はＴＮＦα（−３０８）多型の結果を示す。
本実施例では、ＩＬ−１０（−５９２）プローブとして、センス鎖ＩＬ−１０（−５９２）多型（ａ）にパーフェクトマッチするプローブを使用し、ＦＣＧＲ２Ａプローブとして、センス鎖ＦＣＧＲ２Ａ多型（ｔ）にパーフェクトマッチするプローブを使用し、ＴＮＦα（−３０８）プローブとして、センス鎖ＴＮＦα（−３０８）多型（ｇ）にパーフェクトマッチするプローブを使用した。その結果、ＩＬ−１０（−５９２）多型の検出では、図２の上段に示すように、ヘテロ接合体（Ｃ／Ａ）のサンプル１は、パーフェクトマッチを示す５８．０℃と１塩基のミスマッチを示す５０．０℃とにピークを示した。また、ＦＣＧＲ２Ａ多型の検出では、図２の中段に示すように、ヘテロ接合体（Ｃ／Ｔ）のサンプル１は、パーフェクトマッチを示す５７．０℃と１塩基のミスマッチを示す４８．０℃とにピークを示した。また、ＴＮＦα（−３０８）多型の検出では、図２の下段に示すように、ホモ接合体（Ｇ／Ｇ）のサンプル１は、パーフェクトマッチを示す６１．０℃のみにピークを示し、ホモ接合体（Ａ／Ａ）のサンプル２は、１塩基のミスマッチを示す４９．０℃のみにピークを示した。この結果から、本発明のプローブによれば、検出対象配列とのハイブリダイゼーションがパーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを、十分に判断でき、且つ、三種類の多型を一つの反応系で判断できることがわかった。
［実施例３］
ＩＬ−１０（−１０８２）多型およびＩＬ−１０（−３５７５）多型の検出
本発明のプローブを使用して、Ｔｍ解析により、ＩＬ−１０（−１０８２）多型およびＩＬ−１０（−３５７５）多型を検出した。
ＩＬ−１０（−１０８２）多型およびＩＬ−１０（−３５７５）多型が既知である１名の健常者から、ＥＤＴＡ採血菅により血液を採取した（サンプル１）。また、商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて、ＩＬ−１０（−１０８２）多型およびＩＬ−１０（−３５７５）多型が既知であるゲノムを精製し、１０倍希釈したものをサンプル２とした。また、ＩＬ−１０（−３５７５）多型がホモ接合体（Ａ／Ａ）である合成ＤＮＡを準備した（サンプル３）。各サンプルのＩＬ−１０（−１０８２）多型およびＩＬ−１０（−３５７５）多型は、それぞれ以下の通りである。
ＩＬ−１０
（−１０８２）多型 （−３５７５）多型
サンプル１ Ａ／Ａ Ｔ／Ｔ
サンプル２ Ａ／Ｇ Ｔ／Ｔ
サンプル３ − Ａ／Ａ
１０μＬのサンプル１を７０μＬの前記検体希釈液１と混合し、混合液１０μＬを、さらに、７０μＬの前記検体希釈液２と混合した。この混合液１７μＬを９５℃で１０分間加熱した後、下記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加してＰＣＲを行った。他方、１μＬのサンプル２または１μＬのサンプル３（３．５ｐｇ）を、それぞれ下記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加して、ＰＣＲを行った。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長５１５〜５５５ｎｍ、５８５〜７００ｎｍ）。
Figure 0005290957
ＩＬ−１０（−１０８２）プローブ（配列番号４７）
５’−(BODIPY FL)-ccctacttccccCtccc-P−３’
ＩＬ−１０（−１０８２）Ｆプライマー（配列番号２１３）
５’−ccgcaacccaactggctctccttac−３’
ＩＬ−１０（−１０８２）Ｒプライマー（配列番号２２７）
５’−ggattccatggaggctggataggaggtcc−３’
ＩＬ−１０（−３５７５）プローブ（配列番号５７）
５’−(TAMRA)-cccactggaaaaatTcattt-P−３’
ＩＬ−１０（−３５７５）Ｆプライマー（配列番号２４４）
５’−ggatggaagaagagaggtattccccttcccac−３’
ＩＬ−１０（−３５７５）Ｒプライマー（配列番号２６０）
５’−ccagtttgccctcaagcccagatgc−３’
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）はサンプル１、（Ｂ）はサンプル２、（Ｃ）はサンプル３の結果であり、上段は、ＩＬ−１０（−１０８２）多型、下段は、ＩＬ−１０（−３５７５）多型の結果を示す。
本実施例では、ＩＬ−１０（−１０８２）プローブとして、センス鎖のＩＬ−１０（−１０８２）多型（ｇ）にパーフェクトマッチするプローブを使用した。ＩＬ−１０（−３５７５）プローブとしては、アンチセンス鎖のＩＬ−１０（−３５７５）多型（ａ）にパーフェクトマッチするプローブを使用した。これは、センス鎖のＩＬ−１０（−３５７５）多型（ｔ）にパーフェクトマッチすることと同義である。その結果、ＩＬ−１０（−１０８２）多型の検出では、図３の上段に示すように、ホモ接合体（Ａ／Ａ）のサンプル１は、ミスマッチを示す４９．０℃のみにピークを示し、他方、ヘテロ接合体（Ａ／Ｇ）のサンプル２は、パーフェクトマッチを示す６０．０℃と１塩基のミスマッチを示す４９．０℃とにピークを示した。また、ＩＬ−１０（−３５７５）多型の検出では、図３の下段に示すように、ホモ接合体（Ｔ／Ｔ）のサンプル１および２は、パーフェクトマッチを示す５６．０℃のみにピークを示し、ホモ接合体（Ａ／Ａ）のサンプル３は、ミスマッチを示す４９．０℃のみにピークを示した。この結果から、本発明のプローブによれば、検出対象配列とのハイブリダイゼーションがパーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを十分に判断でき、且つ、二種類の多型を一つの反応系で判断できることがわかった。
以上の結果から、本発明のプローブによれば、検出対象配列とのハイブリダイゼーションがパーフェクトマッチであるかミスマッチであるかを十分に判断できることがわかった。このため、本発明によれば、例えば、検出目的部位において、多型（Ｘ）であるか多型（Ｙ）であるかを精度よく判別できる。また、このようにパーフェクトマッチとミスマッチとを判断できることから、例えば、検出目的の多型がホモ接合体（Ｘ／ＸまたはＹ／Ｙ）であるかヘテロ接合体（Ｘ／Ｙ）であるか、さらには、Ｘ／Ｘのホモ接合体であるか、Ｙ／Ｙのホモ接合体であるかも判断することが可能である。また、１つの反応系において、二種類以上の多型を判断することも可能である。
以上のように、本発明によれば、免疫関連遺伝子であるＦＣＧＲ３Ａ遺伝子、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦα遺伝子およびＴＮＦβ遺伝子について、一塩基のみが異なる多型であっても判別することが可能である。このため、本発明のプローブを、例えば、Ｔｍ解析等に適用することによって、簡便な多型検出が可能になる。また、本発明によれば、一つの反応系に二種類以上のプローブを併存させても、それぞれが対応する遺伝子について多型を判別することができる。このため、一つの反応系を用いて複数の多型の検出を行うことができる。このように本発明によれば、免疫関連遺伝子の多型を容易に判別できるため、例えば、検出結果を前述のような抗体医薬の治療投与に反映することもできる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。

Claims (15)

  1. 免疫関連遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、
    前記免疫関連遺伝子が、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子であり、
    下記（Ａ）のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする多型検出用プローブ。
    （Ａ）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  2. 前記プローブが、前記オリゴヌクレオチドに標識化物質が結合した標識化プローブである、請求項１記載の多型検出用プローブ。
  3. 前記プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求項１または２記載の多型検出用プローブ。
  4. 前記プローブが、前記オリゴヌクレオチドに前記標識化物質として蛍光色素が結合した標識化プローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項１から３のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
  5. 前記プローブが、前記オリゴヌクレオチドにおけるシトシンを有する末端ヌクレオチド残基に前記標識化物質が結合した標識化プローブである、請求項１から４のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
  6. 免疫関連遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬であって、
    請求項１から５のいずれか一項に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする多型検出用試薬。
  7. さらに、下記（Ｂ）〜（Ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなる多型検出用プローブを含む、請求項６記載の多型検出用試薬。
    （Ｂ）配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｃ）配列番号３０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｄ）配列番号３６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｅ）配列番号４７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｆ）配列番号５７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｇ）配列番号６４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  8. 前記（Ａ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブ、および前記（Ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブを含む、請求項７記載の多型検出用試薬。
  9. さらに、前記免疫関連遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅するためのプライマーを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の多型検出用試薬。
  10. 前記プライマーが、下記プライマーセット（ａ）である、請求項９記載の多型検出用試薬。
    プライマーセット（ａ）
    配列番号７７の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号９７の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
  11. さらに、前記（Ｂ）〜（Ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプローブと、プライマーとを含み、
    前記プローブおよび前記プライマーの組み合わせが、前記オリゴヌクレオチド（Ｂ）からなるプローブおよび下記プライマーセット（ｂ）の組み合わせ、前記オリゴヌクレオチド（Ｃ）からなるプローブおよび下記プライマーセット（ｃ）の組み合わせ、前記オリゴヌクレオチド（Ｄ）からなるプローブおよび下記プライマーセット（ｄ）の組み合わせ、前記オリゴヌクレオチド（Ｅ）からなるプローブおよび下記プライマーセット（ｅ）の組み合わせ、前記オリゴヌクレオチド（Ｆ）からなるプローブおよび下記プライマーセット（ｆ）の組み合わせ、ならびに前記オリゴヌクレオチド（Ｇ）からなるプローブおよびプライマーセット（ｇ）の組み合わせからなる群から選択された少なくとも一つの組み合わせである、請求項６から１０のいずれか一項に記載の多型検出用試薬。
    プライマーセット（ｂ）
    配列番号１３２の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号１１４の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
    プライマーセット（ｃ）
    配列番号１４８の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号１６７の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
    プライマーセット（ｄ）
    配列番号１８２の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号１９８の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
    プライマーセット（ｅ）
    配列番号２１３の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号２２７の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
    プライマーセット（ｆ）
    配列番号２４４の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号２６０の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
    プライマーセット（ｇ）
    配列番号２７７の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号２９３の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
  12. 免疫関連遺伝子の多型の検出方法であって、前記免疫関連遺伝子が、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子であり、下記（１）〜（３）工程を含むことを特徴とする多型検出方法。
    （１）前記多型を検出する被検核酸と、請求項１から５のいずれか一項に記載の多型検出用プローブとを含む反応系を準備する工程
    （２）前記反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
    （３）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
  13. 前記（１）工程が、下記（１ａ）工程を含み、前記（１ａ）工程において、前記免疫関連遺伝子における検出目的の多型を含む配列を増幅するためのプライマーを使用する、請求項１２記載の多型検出方法。
    （１ａ）前記プローブを含む反応系において、核酸増幅法により、鋳型核酸から前記被検核酸となる増幅産物を生成する工程
  14. 前記プライマーが、下記プライマーセット（ａ）である、請求項１３記載の多型検出方法。
    プライマーセット（ａ）
    配列番号７７の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号９７の塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセット
  15. 前記免疫関連遺伝子が、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子と、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子、およびＴＮＦα遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの遺伝子であり、
    前記（１）工程において、前記多型検出用プローブと、下記（Ｂ）〜（Ｇ）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなる多型検出用プローブとを含む反応系を準備する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の多型検出方法。
    （Ｂ）配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｃ）配列番号３０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｄ）配列番号３６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｅ）配列番号４７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｆ）配列番号５７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｇ）配列番号６４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
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