JP2018088883A - 上皮成長因子受容体遺伝子変異の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、EGFR遺伝子のexon20における変異の有無を明らかにすることは、がん疾患において、より効果的な治療法の選択などに極めて重用である。
ダイレクトシーケンス法は、PCRで増幅された領域全体の配列を観察できるが、癌組織のような正常細胞由来のDNAが混入する場合には、変異を検出するために最低、15〜20%以上の腫瘍由来のDNAが必要となり、解析に時間を要する。
また、PCR−RFLP法は、PCRで増幅したDNAを、制限酵素で切断し、電気泳動にかけるという手法のため、多くの処理ステップを要し手間がかかる。また、得られたPCR増幅産物を扱うため、増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
配列番号1に示される塩基配列の168番目の塩基を認識するように設計された核酸プローブであって、15〜25個のヌクレオチドからなり、かつ、配列番号10、11、12または13で示される塩基配列の中から選択する連続した15個以上の塩基配列を含むヌクレオチドである核酸プローブ。
[項2]
配列番号10、11、12または13で示される塩基配列からなる、項1に記載の核酸プローブ。
[項3]
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項1または項2に記載の核酸プローブ。
[項4]
以下の(p)〜(s)の工程を含む、EGFR遺伝子のexon20の変異を検出する方法。
(p)項1〜項3のいずれかに記載のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて複合体(ハイブリッド)を形成する工程。
(q)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
(r)前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を測定する工程。
(s)前記Tm値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるEGFR遺伝子のexon20の変異を検出する工程。
[項5]
さらに、以下の(o)の工程を含む、項4に記載の方法。
(o)前記(p)の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記(p)の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。
[項6]
項5の(o)に記載の核酸増幅工程で、以下の(a)および(b)の組合せからなるプライマーセットを用いて核酸を増幅する、項5に記載の方法。
(a)配列番号1で示される塩基配列の中から連続する16塩基以上32塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号3、4、5または6で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
(b)配列番号2で示される塩基配列の連続する16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号7、8または9で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、
[項7]
(a)のフォワードプライマーが、配列番号3、4、5または6で示される塩基配列からなり、および/または、(b)のリバースプライマーが、配列番号7、8または9で示される塩基配列からなる、項6に記載の方法。
[項8]
項1〜項3のいずれかに記載のプローブを含む、EGFR遺伝子のexon20の変異を検出するためのキット。
[項9]
さらに、項6に記載の(a)および(b)の組合せからなるプライマーセットを含む、項8に記載のキット。
本明細書において、「EGFR遺伝子の変異」とは、特に断りのない場合は前記exon20における変異を意味する。
また、配列番号2は配列番号1の相補的配列である。
本発明で用いられる核酸プローブは、EGFR遺伝子のexon20における変異の有無を検出するためのものであり、EGFR遺伝子、好ましくは後述の核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号1の共通配列の一部と同じ配列を有しており、配列番号2で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、アメリカ国立生物工学情報センター(NCBI)のウェブからアクセスできる相同性アルゴリズムBLASTにおいて、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値(%)を算出する。
本発明のEGFR遺伝子のexon20の変異の有無を判別する方法は、試料中のEGFR遺伝子のexon20における変異を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
(p)前記のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせて複合体(ハイブリッド)を形成する工程。
(q)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
(r)前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を測定する工程。
(s)前記Tm値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるEGFR遺伝子のexon20の変異を検出する工程。
該方法で用いられる核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
例えば、上記の方法において、さらに工程(s)のあとに以下の工程(t)を行うことができる。
(t)工程(s)で測定または検出されるデータを解析することでEGFR遺伝子の変異の有無を判別する工程
(o)前記(p)の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記(p)の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。
本発明のEGFR遺伝子変異の検出方法において、EGFR遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、特に限定されないが、配列番号1に示すEGFR遺伝子の部分配列において、塩基番号168の変異を含む部分領域を核酸増幅するために用いられるものが好ましい。
そのようなものとして、例えばフォワードプライマーが以下の(A)からなり、リバースプライマーが以下の(B)からなるプライマーセットが挙げられる。
(A)配列番号1で示される塩基配列の連続する16塩基以上32塩基以下の塩基配列からなるプライマー
(B)配列番号2で示される塩基配列の連続する16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなるプライマー
(a)配列番号1で示される塩基配列の中から連続する16塩基以上32塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号3、4、5または6で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
(b)配列番号2で示される塩基配列の連続する16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号7、8または9で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
また、これらの生体試料から抽出された核酸を用いてもよい。
試料の採取方法、DNAやRNA等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
核酸増幅にPCR法を用いる場合、使用するDNAポリメラーゼは特に制限されないが、α型DNAポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
例えば、上記KOD DNA Polymerase以外に100塩基/秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するDNAポリメラーゼとして、「KOD FX(東洋紡製、商標)」、「KOD −Plus−(東洋紡製、商標)」、「KOD Dash(東洋紡製、商標)」、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ(タカラバイオ製、商標)なども利用できる。
なかでも、高い正確性とDNA合成活性とをあわせ持つKOD −Plus−が望ましい。
本発明のEGFR遺伝子変異検出方法においては、前記工程(o)によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その3’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
工程(q)(r)(s)において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
二本鎖DNAを含む溶液を加熱していくと、260nmにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖DNAにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖DNAに解離(DNAの融解)することが原因である。そして、全ての二本鎖DNAが解離して一本鎖DNAになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度(二本鎖DNAのみの吸光度)の約1.5倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
本発明のEGFR遺伝子変異を検出するためのキット(または組成物)は、前記核酸プローブを含み、前記EGFR遺伝子のexon20の変異検出方法に用いることが出来る。前記キットは、さらに前記核酸プライマーセットを含み、そのほかに、核酸増幅反応および/または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
(1)試料の調製
以下に示す試料1、試料2および試料3を調製した。
試料1:配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入された野生型plasmidを、10mMのTris−HCl(pH7.5)で50(コピー/μL)となるように調製したplasmid希釈液
試料2:配列番号1の塩基番号168のシトシンがチミンに変異した塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入された変異型plasmidを、10mMのTris−HCl(pH7.5)で50(コピー/μL)となるように調製したplasmid希釈液
試料3:前記の変異型plasmidと、前記の野生型plasmidを1:10の割合で混合し10mMのTris−HCl(pH7.5)で550(コピー/μL)となるように調製したplasmid希釈液
(2)核酸増幅および融解曲線解析
上記各試料(3μl)にそれぞれ下記試薬(7μl)を添加して10μlとした。これに対して下記の条件により核酸増幅および融解曲線解析を行ってEGFR遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製GENECUBE(登録商標)を使用した。
以下の試薬を含む溶液を調製した。
10μM オリゴヌクレオチドプライマー(塩基配列・本数等は具体例ごとに後述)0.4μL
100μM オリゴヌクレオチドプライマー(塩基配列・本数等は具体例ごとに後述)0.2μL
10μM オリゴヌクレオチドプローブ(塩基配列・本数・標識等は具体例ごとに後述)0.4μL
KOD Mix(ジーンキューブ(登録商標)テストベーシック、東洋紡製)3μL
PPD Mix(ジーンキューブ(登録商標)テストベーシック、東洋紡製)3μL
(試料)
試料1、試料2、試料3のいずれか一つ(3μl)
94℃・2分
(以上1サイクル)
97℃・1秒
60℃・3秒
63℃・5秒
(以上50サイクル)
94℃・30秒
39℃・30秒
39℃〜75℃(0.09℃/秒で温度上昇)
(具体例1)図1は、フォワードプライマー(配列番号3)、リバースプライマー(配列番号8)および核酸プローブ(配列番号11、3’末端をBODIPY−FL標識)からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図1において、試料1の測定結果は野生型に由来する1つのシグナルのピークを示している。試料2の測定結果は変異型に由来する1つのシグナルのピークを示している。また、試料3の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する2つのシグナルのピークを示している。図1より、試料1〜3のいずれにおいてもEGFR遺伝子が検出されており、なおかつ変異の有無が判別できている。試料3は、変異型plasmidと野生型plasmidとを1:10の割合で混合したものであるが、本実施例は、変異型の割合が低くても、変異型のEGFR遺伝子を野生型と区別して検出できることを示している。
以上から、上記いずれの具体例の核酸プライマー・プローブの組み合わせでもEGFR遺伝子変異の有無を検出できており、本発明のEGFR遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはいずれもEGFR遺伝子変異の有無の検出に有効であることが示された。
(1)試料の調製
実施例1と同じ。
(2)核酸増幅および融解曲線解析
実施例1と同じ。ただし、用いた試薬、試料は下記のとおり。
以下の試薬を含む溶液を調製した。
100μM 核酸プライマー(塩基配列・本数等は具体例ごとに後述)0.2μl
10μM 核酸プライマー(塩基配列・本数等は具体例ごとに後述)0.4μl
10μM 核酸プローブ(塩基配列・本数・標識等は具体例ごとに後述)0.4μl
KOD Mix(ジーンキューブ(登録商標)テストベーシック、東洋紡製)3μl
PPD Mix(ジーンキューブ(登録商標)テストベーシック、東洋紡製)3μl
(試料)
試料1、試料2、試料3のいずれか一つ(3μl)
図3は、フォワードプライマー(配列番号4)、リバースプライマー(配列番号7)および核酸プローブ(配列番号14)からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図3において、試料1の測定結果は野生型に由来する1つのシグナルのピークを示している。試料2の測定結果は変異型に由来する1つのシグナルのピークを示している。一方、試料3の測定結果は野生型に由来するシグナルのピークを示しているものの、変異型に由来するシグナルのピークは示されていない。試料3は、変異型plasmidと野生型plasmidとを1:10の割合で混合したものであるが、本比較例は、変異型の割合が低い場合、変異型のEGFR遺伝子を検出できず野生型のみが検出されることを示している。
Claims (9)
- 配列番号1に示される塩基配列の168番目の塩基を認識するように設計された核酸プローブであって、15〜25個のヌクレオチドからなり、かつ、配列番号10、11、12または13で示される塩基配列の中から選択する連続した15個以上の塩基配列を含むヌクレオチドである核酸プローブ。
- 配列番号10、11、12または13で示される塩基配列からなる、請求項1に記載の核酸プローブ。
- 前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、請求項1または請求項2に記載の核酸プローブ。
- 以下の(p)〜(s)の工程を含む、EGFR遺伝子のexon20の変異を検出する方法。
(p)請求項1〜請求項3のいずれかに記載のプローブと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと前記一本鎖核酸とをハイブリダイズさせてハイブリッドを形成する工程。
(q)前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
(r)前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるTm値を測定する工程。
(s)前記Tm値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸におけるEGFR遺伝子のexon20の変異を検出する工程。 - さらに、以下の(o)の工程を含む、請求項4に記載の方法。
(o)前記(p)の工程においてハイブリッドを形成する前、または、前記(p)の工程においてハイブリッドを形成すると同時に、核酸を増幅する工程。 - 請求項5の(o)に記載の核酸増幅工程で、以下の(a)および(b)の組合せからなるプライマーセットを用いて核酸を増幅する、請求項5に記載の方法。
(a)配列番号1で示される塩基配列の中から連続する16塩基以上32塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号3、4、5または6で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるフォワードプライマー。
(b)配列番号2で示される塩基配列の連続する16塩基以上36塩基以下の塩基配列からなり、かつ、配列番号7、8または9で示される塩基配列の中から選択する連続した16個以上の塩基配列を含むヌクレオチドであるリバースプライマー、 - (a)のフォワードプライマーが、配列番号3、4、5または6で示される塩基配列からなり、および/または、(b)のリバースプライマーが、配列番号7、8または9で示される塩基配列からなる、請求項6に記載の方法。
- 請求項1〜請求項3のいずれかに記載のプローブを含む、EGFR遺伝子のexon20の変異を検出するためのキット。
- さらに、請求項6に記載の(a)および(b)の組合せからなるプライマーセットを含む、請求項8に記載のキット。
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