JP5889103B2 - ストレプトコッカス抗原 - Google Patents
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Description
本発明は、抗原、エピトープ及びこのエピトープに向けられる抗体に係り、さらに詳細には、ストレプトコッカス感染の予防、診断又は治療に有用なストレプトコッカス・ニュモニエ病原のポリペプチド抗原に関する。
S.ニュモニエは、人、とりわけ乳児、高齢者及び免疫無防備状態人における病気の重要な物質である。それは、世界中で高い罹患率及び死亡率の菌血症/敗血症、肺炎、髄膜炎のような浸潤性の病気の患者から、頻繁に単離される細菌である。適切な抗生物質による治療によってさえ、未だに肺炎球菌感染の多くは死に至る。抗細菌薬の発展によって肺炎球菌性病気による全体的な死亡率は減少してきたが、抵抗性のある肺炎球菌生体の存在が今日の世界の主要な問題になってきた。有効な肺炎球菌ワクチンが、S.ニュモニエ病に関する罹患率及び死亡率に大きな影響力を与えることができた。このようなワクチンは、乳児及び幼児の中耳炎の阻止にも有用だろう。
PCT WO 00/39299は、ポリペプチド及びこれらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて述べている。PCT WO 00/39299は、BVH-3及びBVH-11と呼ばれるポリペプチドが、肺炎球菌による致命的な実験的感染を保護することを実証している。
従って、ストレプトコッカス感染の予防、診断及び/又は治療用の成分として使用可能なストレプトコッカス抗原について、満たされていない要望が残っている。
以下から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド;
(a)表A、B、D、E又はHから選択される第2ポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)表A、B、D、E又はHから選択される第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)表A、B、D、E又はHから選択されるアミノ配列を有するポリペプチド;又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド;
(d)表A、B、D、E又はHから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(e)表A、B、D、E又はHから選択される配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)表A、B、D、E又はHから選択されるポリペプチドのエピトープ保持部をコードするポリヌクレオチド;及び
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
BVH-3及びBVH-11ポリペプチドの部分は内部にあることが分かった。他の部分は、病気を引き起こす被包s.ニュモニエ菌株のような重要な菌株には存在しなかった。内部でない部分を含むポリペプチドがあると有利だろう。ポリペプチドの大部分が内部にあると、これら部分は細菌上で露出されない。しかし、これら部分は、組換えポリペプチド内で非常に免疫原性であり、かつ感染に対する保護を与えないだろう。ほとんどの菌株に存在する部分を含むポリペプチドがあっても有利だろう。
本発明は、特異的な免疫応答を得るため、望ましくない部分が欠失及び/又は修飾されているポリペプチドに関する。
本発明によって、保護ドメインを含むポリペプチド又はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
本発明の一局面により、以下から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドが提供される;
(a)表B、E又はHから選択される第2ポリペプチドと少なくとも70%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)表B、E又はHから選択される第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)表B、E又はHから選択されるアミノ配列を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド;
(d)表B、E又はHから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(e)表B、E又はHから選択される配列を有するポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を産生可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)表B、E又はHから選択されるポリペプチドのエピトープ保持部をコードするポリヌクレオチド;及び
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)又は(f)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
一局面によって、本発明は、表A、B、D、E、G若しくはHから選択される配列を含む第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表A、B、D、E、G若しくはHから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体に関する。
一局面によって、本発明は、表A、B、D、E、G若しくはHから選択される配列を含む第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表A、B、D、E、G若しくはHから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドに関する。
一局面によって、本発明は、表B、E若しくはHから選択される配列を含む第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表B、E若しくはHから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド又はその断片、類似体若しくは誘導体に関する。
一局面により、本発明は、表B、E若しくはHから選択される配列を含む第2ポリペプチドと少なくとも95%の同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
一局面により、本発明は、表B、E若しくはHから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドに関する。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは抗原性である。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは免疫原性である。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド又はキメラポリペプチドは個体内で免疫応答を誘発することができる。
一実施形態では、表A(BVH-3)又は表D(BVH-11)のポリペプチドは、少なくとも1つのエピトープ保持部を含む。
さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドの断片は、表C及びFで特定される1つ以上のエピトープ保持部を含む。断片は、表C及びFの少なくとも15相接アミノ酸のポリペプチドを含む。断片は、表C及びFの少なくとも20相接アミノ酸のポリペプチドを含む。
さらなる実施形態では、表A(BVH-3)のポリペプチドのエピトープ保持部は、表Cに列挙されている少なくとも1つのポリペプチドを含む。
さらなる実施形態では、表B(BVH-11)のポリペプチドのエピトープ保持部は、表Fに列挙されている少なくとも1つのポリペプチドを含む。
特に定義しない場合、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で言及するすべての公開公報、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が支配する。さらに、材料、方法及び実施例は説明のためだけであり、限定する意図ではない。
当業者には、本発明のタンパク質又はポリペプチドの類似体又は誘導体が、本発明の文脈における用途、すなわち抗原性/免疫原性物質としての用途を見出すことが分かるだろう。従って、例えば1つ以上の付加、欠失、置換等を含むタンパク質又はポリペプチドは本発明に包含される。さらに、あるアミノ酸を同様の“タイプ”の別のアミノ酸で置換することができる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸と置換することである。
これとは別のアプローチでは、類似体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドを効率的に標識化することによって、精製しやすい部分を取り込んだ融合タンパク質である。その“標識”を除去する必要があるか、又は融合タンパク質自体が有用な十分の抗原性を保持する場合もある。
本発明の断片は、1つ以上のこのようなエピトープ領域を含むか、又はこのよな領域に十分に類似し、その抗原性/免疫原性特性を保持すべきである。従って、本発明の断片については、それら断片が本明細書で述べるようなタンパク質若しくはポリペプチドの特定部分、類似体又は誘導体に100%同一でありうるので、同一性の程度はおそらく無関係である。この場合もやはり、重要な問題は、断片が抗原性/免疫原性特性を保持することである。
従って、類似体、誘導体及び断片について重要なことは、それらが誘導されるタンパク質又はポリペプチドと少なくとも同程度の抗原性/免疫原性を有することである。
該ポリペプチドの生物学的又は薬理学的特性を変える他の成分、すなわち半減期を増やすためのポリエチレングリコール(PEG);精製を容易にするためのリーダー又は分泌性アミノ酸配列;プレプロ−及びプロ−配列;及び(ポリ)サッカリドに融合しているポリペプチドも含まれる。
さらに、アミノ酸領域が多型性であることが分かっている場合、1つ以上の特定のアミノ酸を変えて、異なるストレプトコッカス菌株の異なるエピトープをより効率的に模倣することが望ましい。
該ポリペプチド断片、類似体及び誘導体のヘテロ及びホモポリペプチド多量体も熟考される。これらポリマー形態としては、例えば、アビジン/ビオチン、グルテルアルデヒド又はジメチルスーパーイミダートのような架橋剤で架橋されている1種以上のポリペプチドが挙げられる。このようなポリマー形態としては、組換えDNA技術で生成された多シストロンmRNAから生じる2種以上のタンデム又は反転相接配列を含有するポリペプチドが挙げられる。
抗原性ポリマー(すなわち合成多量体)の形成を達成するため、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライド等を有するポリペプチドを利用でき、該試薬はチオ基に特異的である。従って、異なるペプチドの2個のメルカプト基間の連結は単結合であるか、又は少なくとも2個、典型的には少なくとも4個で、16個以下であるが、通常約14個以下の炭素原子の連結基で構成される。
用語ワクチンは、抗体をも含む意である。本発明により、ストレプトコッカス感染及び/又はストレプトコッカス感染を媒介とする病気及び症状の治療又は予防のための、本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する1種以上の抗体の使用も提供される。
本出願で使用する場合、用語“個体”は哺乳類を包含する。さらなる実施形態では、哺乳類はヒトである。
ワクチン組成物は、好ましくは約0.001〜100μg/kg(抗原/体重)、さらに好ましくは0.01〜10μg/kg、最も好ましくは0.1〜1μg/kgの単位剤形で、約1〜6週間の免疫化間の間隔で1〜3回投与される。
ワクチン組成物は、好ましくは約0.1μg〜10mg、さらに好ましくは1μg〜1mg、最も好ましくは10〜100μgの単位剤形で、約1〜6週間の免疫化間の間隔で1〜3回投与される。
別の局面により、表B、E若しくはHから選択されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、又はその断片、類似体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、表A、B、D、E、G又はHに示されるものである。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、表B、E又はHに示されるものである。
当業者は、ハイブリダイゼーションに適したストリンジェント条件を容易に決めることができる(例えば、Sambrookら,(1989)分子クローニング: 実験室マニュアル,第2版, Cold Spring Harbor, N.Y.;分子生物学の最新プロトコル ,(1999) Ausubel F.M.ら編集, John Wiley & Sons, Inc., N.Y.参照)。
(a)ポリペプチドをコードするDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコードするDNA配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表A、B、D、E、G若しくはHから選択される配列又はその断片又は類似体を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
(a)ポリペプチドをコードするDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコードするDNA配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表B、E若しくはHから選択される配列又はその断片又は類似体を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
(a)ポリペプチドをコードするDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコードするDNA配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表A、B、D、E、G若しくはHから選択される配列又はその断片又は類似体を含むポリペプチド由来の少なくとも10個の相接アミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、ストリンジェント条件下で
(a)ポリペプチドをコードするDNA配列又は
(b)ポリペプチドをコードするDNA配列の補体
のどちらかにハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、
前記ポリペプチドが表B、E若しくはHから選択される配列又はその断片又は類似体を含むポリペプチド由来の少なくとも10個の相接アミノ酸残基を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
当業者には容易に分かるように、ポリヌクレオチドには、DNAとRNAの両者を包含する。
本発明は、本出願で述べるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをも包含する。
さらなる局面により、本発明のストレプトコッカスポリペプチドは、ストレプトコッカス感染、特にS.ニュモニエ感染のための診断試験に使用できる。いくつかの診断方法が可能であり、例えば生体試料中のストレプトコッカス生物体を検出する方法であり、以下の手順に従う:
a)患者から生体試料を得;
b)本発明のストレプトコッカスポリペプチドと反応性の抗体又はその断片を、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成し;かつ
c)ストレプトコッカスの存在を示、前記混合物内で特異的に結合される抗体又は断片を検出する。
a)患者から生体試料を得;
b)1種以上の本発明のストレプトコッカスポリペプチド又はその断片を、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成し;かつ
c)ストレプトコッカスに特異的な抗体の存在を示す、前記混合物内で特異的に結合される抗体又は断片を検出する。
当業者は、この診断試験がエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ又はラテックス凝集アッセイのような免疫学的試験を含むいくつかの形態を取り、基本的に該ポリペプチドに特異的な抗体が生物体内に存在するかどうかを決定することを認識している。
a)患者から生体試料を得る工程;
b)本発明のポリペプチド又はその断片をコードするDNA配列を有する1種以上のDNAプローブを、前記生体試料と共にインキュベートして混合物を生成する工程;及び
c)ストレプトコッカス細菌の存在を示す、前記混合物内で特異的に結合されるDNAプローブを検出する工程。
プローブは、従来法によって合成でき、固相上に固定化するか、又は検出可能な標識で標識化できる。この出願で好ましいDNAプローブは、本発明のストレプトコッカス・ニュモニエポリペプチドの少なくとも約6個の相接ヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである。
a)本発明のポリペプチド又はその断片と反応性の抗体を、検出可能な標識で標識化する工程;
b)この標識化抗体又は標識化断片を患者に投与する工程;及び
c)ストレプトコッカスの存在を示す、前記患者内で特異的に結合される標識化抗体又は標識化断片を検出する工程。
以下は、本出願で開示する配列をまとめた参照表である。
この実施例は、ここで使用する細菌株、プラスミド、PCRプライマー、組換えタンパク質及びハイブリドーマ抗体について述べる。
S.ニュモニエ SP64(血清型6)及びSP63(血清型9)の臨床用単離物は、Laboratoire de la Sante Publique du Quebec, Sainte-Anne-de-Bellevueによって提供され;Rx1株、2型株D39及び3型株WU2の非被包誘導体は、アラバマ大学, バーミンガムからDavid.E.Bribesによって提供され、3型臨床用単離物P4241はCentre de Recherche en Infectiologie du Centre Hospitalier de lUniversite Laval, Sainte-Foyから提供された。大腸菌株DH5α (Gibco BRL, Gaithesburg, MD); AD494 (λDE3) (Novagen, Madison, WI)及びBL21 (λDE3) (Novagen)並びにプラスミド超リンカーpSL301ベクター(Invitrogen, San Diego, CA);pCMV-GHベクター(テキサス州ダラスのテキサス大学生化学部のStephen A. Johnston博士から贈呈);pET32及びpET21 (Novagen)及びpURV22.HIS発現ベクター(図30)をこの研究で使用した。pURV22.HISベクターは、機能性PRプロモーターが欠失されているバクテリオファージλ cI857温度感受性リプレッサー遺伝子のカセットを含有する。プロモーターλPLの制御下、30〜37℃から37〜42℃の範囲で昇温することでcI857リプレッサーを不活性化すると該遺伝子が誘発される。組換えプラスミドの生成に用いるPCRプライマーは、5'末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、それによって増殖幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性クローニングが可能になる。下表1に、使用するPCRオリゴヌクレオチドプライマーがリストされている。BVH-3、BVH-11及びBVH-11-2遺伝子産物をコード化する遺伝子配列の配置は、図25、図26及び図27にそれぞれまとめられている。
組換えpSL301及び組換えpCMV-GHプラスミドをpET発現ベクター中のインフレームクローニング用の制限酵素で消化した。pETベクターを使用する場合、クローンを全長又は不完全BVH-3、BVH-11又はBVH-11-2分子の発現のために大腸菌BL21(λDE3)又はAD494(λDE3)中に導入する前に、まず大腸菌DH5α内に固定した。
結果として生じた各プラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。組換えタンパク質は、チオレドキシン及びHis-tag(pET32発現系)とのN末端融合;His-tag(pET21発現系)とのC末端融合;又はHis-tag(pURV22.HIS発現系)とのN末端融合として発現した。発現組換えタンパク質は、超音波処理IPTG-(pET系)又はHis-Bind金属キレーション樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を用いる熱-(pURV22.HIS)誘発大腸菌の遠心分離後に得られる上清フラクションから精製した。S.ニュモニエSP64から産生された遺伝産物は、表2にリストされる。BVH-3-Sp63タンパク質(配列番号:10のアミノ酸残基21〜840)をコードする遺伝子断片は、PCR-プライマーセットOCRR479-OCRR480及びクローニングベクターpSL301を用いてS.ニュモニエSP63から生成した。BVH-3-Sp63分子発現用pET32ベクター内におけるインフレームクローニングのため組換えpSL301-BVH-3Sp63が消化された。
w/o ss:シグナル配列なし。BVH-3、BVH-11及びBVH-11-2タンパク質配列の解析は、推定疎水性リーダー配列の存在を示唆した。
* キメラについてコードされるアミノ酸は遺伝子産物として発現され、加えられた付加非必須アミノ酸残基Mはメチオニン、Kはリジン、Lはロイシン、Gはグリシン及びPはプロリンである。
メスのBALB/cマウス(Charles River, St-Constant, Quebec, Canada)を、S.ニュモニエ株SP64由来のBVH-3M(チオレドキシン-His・Tag-BVH-3M融合タンパク質/pET32系)、BVH-11M(チオレドキシン-His・Tag-BVH-11M融合タンパク質/pET32系)、BVH-11-2M(チオレドキシン-His・Tag-BVH-11-2M融合タンパク質/pET32系)、BVH-11B(チオレドキシン-His・Tag-BVH-11B融合タンパク質/pET32系)、BVH-3M(His・Tag-BVH-3融合タンパク質/pURV22.HIS系)又はNEW1(NEW1-His・Tag融合タンパク質/pET21系)遺伝子産物で免疫化して、それぞれMabシリーズH3-、H11-、H112-、H11B-、H3V-、及びHN1-を得た。ハイブリドーマの培養上清は、まず、Hamelら(前出)に記載されている手順に従い、精製組換えBVH-3、BVH-11及び/又はBVH-11-2タンパク質又は熱殺S.ニュモニエ細胞の懸濁液の製剤を塗布したプレートを用いて酵素結合イムノアッセイ(ELISA)によってスクリーニングした。さらに特徴づけするために選択したMab-分泌ハイブリドーマは、以下の実施例2から表3及び表4にリストされている。Mab免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは、商業的に入手可能な試薬(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)を用いてELISAによって決定した。
操作してキメラ遺伝子内に包含されるべき遺伝子断片を増幅したオリゴヌクレオチド対を用い、遺伝子の3'末端に対応するBVH-3及びBVH-11遺伝子断片をPCRで増幅した。用いたプライマーは5'末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、その結果として増幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった(表1及び表2)。PCR-増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、線状プラスミドpET21又はpSL301ベクターに結合した。結果のプラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。PCR産物を含有する組換えpET21プラスミドを、第2DNA断片のインフレームクローニング及びキメラ肺炎球菌タンパク質分子をコードするキメラ遺伝子産生のための制限酵素による消化で線状にした。PCR産物を含有する組換えpSL301プラスミドを、DNA挿入断片を得るための制限酵素で消化した。生成した挿入DNA断片を精製し、所定のキメラ遺伝子に対応する挿入断片をキメラ遺伝子の産生用pET21ベクターに結合した。表2にリストされている組換えキメラポリペプチドは、His-tagとのC末端融合としてだった。His-Bind金属キレーション樹脂(QIAgen, Chatsworth, CA)を用いて超音波処理IPTG-誘発大腸菌培養の遠心分離から得た上清フラクションから発現組換えタンパク質を精製した。
この実施例は、Mabs及び実施例1で述べた組換え不完全タンパク質を用いた、標的エピトープを保有するペプチドドメインの同定について述べる。
Mabsによって認識されるエピトープを特徴づけるため、不完全なBVH-3、BVH-11又はBVH-11-2遺伝子産物に対してELISAで試験した。不完全遺伝子産物は、S.ニュモニエSP63株から産生されたBVH-3-Sp63を除き、S.ニュモニエSP64株から産生された。ポジティブ対照として、各抗体の反応性を全長BVH-3、BVH-11又はBVH-11-2組換えタンパク質で調べた。数ケースでは、SDS-PAGE及びニトロセルロース紙上の移動による遺伝子産物の分離後ウェスタンイムノブロット法によってMab反応性を評価した。観察された反応性は、以下の表3及び表4に示される。
表4のデータから分かるように、BVH-11-及び/又はBVH-11-2と反応性であり、かつBVH-3分子を認識しないMabsは、そのBVH-11A及びNEW10組換えタンパク質との反応性に応じて3グループに分割できる。いくつかのMabsはBVH-11A又はNEW10組換えタンパク質のどちらかと排他的に反応するが、他のMabsはBVH-11AとNEW10組換えタンパク質の両方と反応性だった。
この実施例は、エピトープのマッピング用のBVH-3及びBVH-11-2遺伝子ライブラリーの構成について述べる。
BVH-3及びBVH-11-2遺伝子ライブラリーは、それぞれヌクレオチド1837〜4909(配列番号:2)にわたるBVH-3遺伝子配列又はヌクレオチド172〜2630にわたるBVH-11-2遺伝子配列(配列番号:5)を含有する組換えpCMV-GH及びPSL301プラスミドDNAと、Novatope(登録商標)ライブラリー構成及びスクリーニングシステム(Novagen)を用いて構築した。BVH-3又はBVH-11-2遺伝子断片を含有する組換えプラスミドは、QIAgenキット(Chatsworth,CA)を用いて精製し、それぞれ制限酵素BglII及びXbaIで消化した。生成したBglII-XbaI DNA断片はQIAgen製のQIAquickゲル抽出キットを用いて精製し、ランダム切断DNAの生成のためDnase Iで消化した。50〜200塩基対のDNA断片を精製し、T4 DNA ポリメラーゼで処理して標的DNA末端に平滑化し、単一の3'dA残基を加え、製造業者によって示される手順に従って(Novatope(登録商標)システム, Novagen)pSCREEN-T-ベクター(Novagen)に結合した。それぞれBVH-3又はBVH-11-2遺伝子由来の小さいエピトープを発現する大腸菌クローンの遺伝子ライブラリーは、免疫プローブとしてMabsを用いる標準的なコロニーリフト法によってスクリーニングした。コロニースクリーニングは、非常に高いバックグラウンドをコロニーリフトに生じさせるMabsでは成功しなかった。さらに、エピトープ発現コロニーの検出に失敗したMabsもあった。反応性の欠如は、おそらく産生される組換えタンパク質の量が少ないこと、又は異なるタンパク質ドメインから成るコンホメーション依存性エピトープの認識によって説明できる。ポジティブクローンからのDNA挿入断片の配列決定によって標的エピトープをコードするセグメントの位置を決定した。データは表5に示される。組換えpSCREEN-Tベクター中へのDNA挿入によってコードされるポリペプチドを精製し、後述する実施例6で免疫原として使用することができる。
この実施例は、BVH-3、BVH-11及び/又はBVH-11-2と反応性の抗体を生産するための組換えタンパク質による動物の免疫化について述べる。
NZWウサギ(Charles River Laboratories, St-Constant, Quebec, Canada)を80μgのQuilAアジュバント(Cedarlane Laboratoratories Ltd, Hornby, Canada)の存在下50μg又は100μgの精製BVH-3M、L-BVH-3AD、NEW1、NEW13、又はL-BVH-11組換えタンパク質で、複数部位に皮下的に免疫化した。これらウサギを、3週間の間隔をおいて2回、同一抗原で追加免疫化し、各免疫化前及び最後の免疫化後6〜28日に血液試料を収集した。血清試料を免疫前、後1st、後2nd、又は後3rd注射と名付けた。免疫化に対するウサギの免疫応答は、塗布抗原として組換えBVH-3M(BVH-3M-His・Tag 融合タンパク質/pET21系)若しくはBVH-11M(BVH-11M-His・Tag融合タンパク質/pET21系)タンパク質又は熱殺S.ニュモニエRx-1細胞の懸濁液を用いてELISAによって評価した。ELISA力価は、吸収A410値がバックグラウンド値より0.1超える最高の血清希釈の逆数として定義した。下表6に示されるように、全動物で免疫化後BVH-3及び/又はBVH-11エピトープと反応性の抗体が誘発された。組換え又は肺炎球菌抗原と反応性の抗体は、免疫前血清には存在しなかった。組換え抗原の単一注射後、各ウサギの血清中で免疫化に対する免疫応答が検出できた。試験した各抗原による第2注射後の抗体応答は、抗体力価の大きな増加を特徴とした。興味深いことに、S.ニュモニエと反応性の抗体の良い力価、第3免疫化後に52,000の平均力価が得られ、従って天然の肺炎球菌エピトープが組換え大腸菌遺伝子産物上で発現されることを立証した。これらデータは、BVH-3、BVH-11及び/又はBVH-11-2遺伝子産物、及び肺炎球菌病の予防及び治療用ワクチンとしてそれぞれBVH-3、BVH-11及び/又はBVH-11-2遺伝子産物に対して産生される抗体の潜在的な用途を支持する。
この実施例は、BVH-3、BVH-11又はBVH-11-2遺伝子産物に対して産生される抗体の投与による致死実験的肺炎球菌感染に対する動物の保護について述べる。
Brodeurら(J Immunol Methods 71:265-272,1984)によって記載された方法に従い、Mab分泌ハイブリドーマ細胞で腹腔内に接種されたマウスの腹水から、高力価Mab製剤を得た。実施例4で述べたようにBVH-3Mで免疫化したウサギから血清試料を収集した。第3免疫化後に収集したウサギ血清及び腹水を、45〜50%飽和硫酸アンモニウムを用いる沈殿による抗体の精製に使用した。抗体製剤をリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解し、透析した。
0.1mlのウサギ抗体の腹腔内投与前後に、1000CFUのWU2 S.ニュモニエでCBA/Nマウスを感染させた。
S.ニュモニエWU2による静脈内誘発4時間前に全体で0.2mlの腹水をCBA/Nマウスに腹腔内注射した。
この実施例は、実施例1で述べたMabを用いた表面露出ペプチドドメインの局在化について述べる。
S.ニュモニエ3型株WU2は、0.5%酵母エキス(Difco Laboratories)で富化したTodd Hewitt (TH)ブロス(Difco Laboratories, Detroit MI)内、37℃で8%CO2雰囲気で成長させ、0.260のOD600を得た(〜108 CFU/ml)。この細菌懸濁液を1ml試料に等分し、S.ニュモニエ細胞を遠心分離でペレットにし、ハイブリドーマ培養上清内で再懸濁させた。この細菌緩衝液を2時間4℃でインキュベートした。
試料を遮断緩衝液[2%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS]内で2回洗浄してから、遮断緩衝液内で希釈された1mlのヤギフルオレッセイン(FITC)が接合した抗-マウスIgG+IgMを添加した。さらに室温での60分インキュベーション後、試料を遮断緩衝液内で2回洗浄し、PBS緩衝液中の0.25%ホルムアルデヒドで18〜24時間4℃で固定した。細胞をPBS緩衝液内で1回洗浄し、500μlのPBS緩衝液に再懸濁させた。フローサイトメトリー(Epics(登録商標) XL; Beckman Coulter, Inc.)で解析するまで、細胞は暗所で4℃に保持した。1万(10,000)個の細胞を試料ごとに解析し、結果を%蛍光及び蛍光指数(FI)値として示した。%蛍光は、フルオレッセイン標識化S.ニュモニエ細胞を100で除した数であり、FI値は、Mab上清で処理した肺炎球菌の蛍光値を、接合体のみ又は対照の無関係なMabで処理した肺炎球菌の蛍光値で除した平均値である。FI値1は、該Mabが細菌の表面で検出されなかったことを指すのに対し、2より高いFI値は、少なくとも10%の肺炎球菌細胞が標識化されているときにポジティブと考えられ、該Mabは細胞表面露出エピトープと反応性であることを示した。下表11には、フローサイトメトリーで試験したMabsで得られたデータがまとめれれている。
この実施例は、BVH-3及びBVH-11-2のペプチドエピトープによる動物の免疫化について述べる。
Mab 3A4-エピトープ(配列番号:24)をコードするDNA断片(配列番号:5上のヌクレオチド2421〜2626)を含有する組換えpSCREEN-Tベクター(Novagen, Madison, WI)を、エレクトロポレーション(Gene Pulser II apparatus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada)で大腸菌Tuner(λDE3)pLysS[BL21(F'ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacYI pLysS (Cmr)](Novagen)に形質転換した。この株では、融合タンパク質の発現は、T7 RNAポリメラーゼ(λDE3プロファージ上に存在し、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なlacプロモーターの制御下のそれ自体)によって認識されるT7プロモーターで制御される。pLysSプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼの天然インヒビターであるT7リゾチームのコーディングによる基本的な融合タンパク質発現レベルを減少させる。
この実施例は、BVH-3断片及びその変異体を用いた肺炎球菌に対する抗体応答の改善について述べる。
実施例2、3及び6で提示した不完全な遺伝子産物、エピトープ発現コロニー及び生きている無傷肺炎球菌とのMab反応性の研究から得られた結果を合わせると、表面露出エピトープと内部エピトープとを線引きすることができる。効率的に肺炎球菌細胞に結合されるMabsによって検出されるエピトープは、配列番号6に示されるBVH-3のアミノ酸残基223〜1039間に含まれる領域に認められた。BVH-3-カルボキシルハーフ内の保護エピトープの存在は、NEW1分子で免疫化したマウスがP4241株による致死的感染から保護されることを実証することで確認された。
*下線を付したアミノ酸残基は、タンパク質配列の修飾を示す。ヌクレオチド/アミノ酸残基は、NEW105、NEW106及びNEW107構成物で欠失されている。
**サイレント突然変異、すなわちポリペプチドはNew1と同一である。
要するに、保護及び肺炎球菌の抗体結合性データは、NEW1又はNEW40分子及びその変異体を用いたワクチン接種が、保存されている保護的な表面露出エピトープへの免疫応答を方向づけることを示している。
この実施例は、すべてではないにしても多くのS.ニュモニエ株に存在するBVH-11-2保存保護的表面露出エピトープに対応するキメラエピトープをコードするキメラ欠失(deletant)BVH-11-2遺伝子のクローニング及び発現について述べる。
S.ニュモニエ株SP64 BVH-11-2遺伝子由来のヌクレオチド1662〜1742、1806〜2153、2193〜2414及び2484〜2627にわたる配列番号:5から生じる断片を増幅するように操作されたオリゴヌクレオチドの対を用いるPCRによって、4つの遺伝子領域に対応するBVH-11-2遺伝子断片を増幅した。
生成したNEW43遺伝子配列(配列番号:257)は図33に示される。
NEW43タンパク質(配列番号:258)の推定アミノ酸配列は図34に示される。
* 下線を付したアミノ酸残基は、タンパク質配列の修飾を表す。ヌクレオチド/アミノ酸残基は、NEW88D1、NEW88D2及びNEW88構成物では欠失されている。
この実施例は、カルボキシル末端又はアミノ末端でのNEW43又はその変異体に対する融合におけるBVH-3又はその変異体のカルボキシ末端領域に対応するキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子のクローニング及び発現について述べる。
BVH-3の不完全な変異遺伝子及びNEW43又はNEW43変異遺伝子を含むキメラ遺伝子は、実施例1で述べた手順に従って設計した。これらキメラ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、表22にリストされている。要するに、プライマーが5'末端に制限エンドヌクレアーゼを有するように操作されたオリゴヌクレオチドの対を用いてPCRにより、キメラ遺伝子に包含されるべき遺伝子断片が増幅され、その結果として該増幅産物の消化プラスミドベクターへの方向性インフレームクローニングが可能になった(表23及び表24)。PCR増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、線状プラスミドpSL301ベクターに結合した。生成したプラスミド構成物をヌクレオチド配列解析で確認した。PCR産物を含有する組換えpSL301プラスミドを同一のエンドヌクレアーゼ制限酵素で再消化してDNA挿入断片を得た。結果として生じたDNA挿入断片を精製し、所定のキメラ遺伝子に対応する挿入断片をキメラ遺伝子生成用pURV22-NdeIベクターに結合した。発現された組換えタンパク質は、複数のクロマトグラフ的精製工程を用い、超音波処理した熱誘導大腸菌培養の遠心分離から得られた上清フラクションから精製した。
* キメラに対してコードされたアミノ酸が遺伝子産物として現され、追加のアミノ酸残基が加えられた。Mはメチオニン、Gはグリシン、Pはプロリンである。
Claims (4)
- 医薬的に許容性のキャリヤー又は希釈剤、及び配列番号8の位置227〜838のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド断片を含むワクチン組成物であって、
該ポリペプチド断片がストレプトコッカス・ニュモニエに対する免疫応答を誘発することができること
を特徴とする前記ワクチン組成物。 - 該ポリペプチド断片が、配列番号8の位置227〜838のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1記載のワクチン組成物。
- 該ポリペプチド断片が、サッカリドに融合していることを特徴とする請求項1又は2記載のワクチン組成物。
- ストレプトコッカス感染に感受性の個体におけるストレプトコッカス感染の治療用又は予防用医薬を製造するための請求項1〜3のいずれか1項記載のワクチン組成物の使用。
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