KR101272351B1 - 새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법 - Google Patents

새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

kanA-kanB-kanK 및 기타 카나마이신 생산 관련 유전자를 발현하는 벡터 및 그 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 속 재조합 미생물, 상기 미생물로 카나마이신 항균물질을 생합성하는 방법 및 상기 미생물로 만들어진 신규 카나마이신 화합물이 제공된다. 본 발명의 재조합 미생물을 통해 반합성 카나마이신인 아미카신과 토브라마이신의 직접적인 미생물 발효 생합성이 가능해지며, 반합성 카나마이신의 전구체인 카나마이신 B의 생산성이 향상된다.

Description

새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법{New kanamycin compound, kanamycin-producing Streptomyces sp. and kanamycin producing method}
본 발명은 신규 카나마이신 화합물, 카나마이신을 생산하는 스트렙토마이세스속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 카나마이신의 생산 방법에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus)로부터 만들어지는 카나마이신은 4,6-치환 2-데옥시스트렙타민 함유 아미노글리코사이드 항생제인 겐타마이신과 토브라마이신, 4,5-치환 아미노글리코사이드인 네오마이신과 부티로신이 있다.
이러한 종류의 항생제는 주로 방선균(actinomycetes)에 의해 생산되며 오랫동안 널리 쓰여 왔다. 다른 항생제들과 마찬가지로, 아미노글리코사이드 변형 효소를 생산하는 아미노글리코사이드 내성 병원균의 출현은 심각한 문제를 일으킨다. 내성 문제는 아미카신(amikacin), 디베카신(dibekacin) 및 아르베카신(arbekacin)과 같은 천연 아미노글리코사이드의 반합성 변형물로 해결해왔다. 중심부 2-데옥시스트렙타민 (2-deoxystreptamine: 2-DOS) 및, 슈도다이사카라이드(pseudodisaccharide) 2'-N-아세틸파롬아민(2'-N-acetylparomamine), 파롬아민(paromamine) 및 네아민(neamine)은 대부분의 아미노글리코사이드의 공통된 생합성 중간산물이다. 중심부 및 파롬아민을 통한 네아민으로의 생합성 경로는 부티로신 및 네오마이신 생합성과 관련된 재조합 효소를 사용한 인 비트로(in vitro) 실험을 통해 밝혀진 바 있다.
카나마이신 클러스터 중 하나인 당전이효소(GT) KanE (KanM2라고도 함)는 유리딘 5'-다이포스포-D-글루코스 (UDP-Glc)를 공동기질로 사용하여 파롬아민의 당화과정을 촉매하여 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 C가 되게 한다. 카나마이신 C 및 카나마이신 B는 당전이효소 KanE에 의해서 카노사민 (kanosamine, Kns:D-3-글루코사민) 부분이 각각 파롬아민 및 네아민으로 옮겨짐으로써 만들어진다고 생각된다. 또는, 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 C가 카나마이신 C의 전구체로 여겨지기도 하는데, 이는 다시 카나마아신 C의 6' 위치가 아민화되어 카나마이신 B가 될 수 있다. 카나마이신 A는 2'-데아미노-2'-히드록시네아민에 카노사민을 KanE 촉매 첨가하거나 또는 카나마이신 B의 2' 위치에서 탈아민화함으로써 생합성될 수 있을 것으로 여겨진다. 그러나 슈도다이사카라이드 또는 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 C로부터 카나마이신을 만드는 생합성 과정에 대해서는 잘 알려지지 않았는데, 이는 아미노글리코사이드를 생산하는 방선균을 유전자 조작하고 기능적인 수용성 생합성 효소를 얻는 것이 쉽지 않기 때문이다.
본 발명자들은 유전자 조작된 스트렙토마이세스 베네주엘라에 (Streptomyces venezuelae)에 기초하여 효과적인 이종 숙주 발현 시스템을 구축하고 겐타마이신 A2의 생합성 과정을 효과적으로 밝혀낸 바 있다.
본 발명의 목적은 카나마이신의 생합성 과정을 밝혀내고 재조합 균주를 통한 새로운 카나마이신의 생산방법 및 이를 통해 만들어진 새로운 항생물질을 제공하는 것이다.
최근 본 발명자들은 S. kanamyceticus로부터 카나마이신 생합성 유전자 집단을 분리해냈다. 아미노글리코사이드를 생산하지 않는 이종균주인 S. venezuelae에서 상기 카나마이신 생합성 유전자 집단을 발현시켜서 카나마이신을 생산한 결과, 본 발명자들이 분리해 낸 유전자 세트가 카나마이신 복합체를 생산하기에 충분한 유전자 모두를 포함하고 있다는 것을 확인했다.
그러므로 상기와 같은 본 발명의 목적은 kanA-kanB-kanK 및 다른 카나마이신 관련 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 스트렙토마이세스 속 미생물, 상기 미생물로 카나마이신을 생합성하는 방법 및 상기 미생물로 만들어진 신규 카나마이신 화합물에 의해 달성된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명 및 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이다.
본 발명에 의해, 카나마이신을 생산하는 재조합 스트렙토마이세스 속 이종 미생물과 종래의 방법에 비해 효율적으로 카나마이신을 생산하는 방법 및 이를 통해 만들어진 새로운 카나마이신 화합물이 제공된다.
도 1은 (a) 2-DOS 포함 아미노글리코사이드의 구조, 및 (b) 종전에 제안된 카나마이신의 생합성 경로를 보여주는 도면이다. (a) 카나마이신, 토브라마이신 및 겐타마이신은 4,6-치환 아미노글리코사이드이고, 부티로신 및 네오마이신은 4,5-치환 아미노글리코사이드로 이것들은 모두 천연 생산물이다. 한편 아미카신, 디베카신 및 아르베카신은 카나마이신 유래의 반합성 아미노글리코사이드이다. AHBA: S-4-아미노-2-하이드록시부티르산. (b) 화합물 5를 생산하는 과정이 나타나있다(굵은 선). 그러나 최종산물인 화합물 8로의 완전한 생합성 경로(점선)는 알려지지 않았었다. 2-DOI: 2-데옥시-사일로(scyllo)-이노소스(inosose); 2-DOIA: 2-데옥시-사일로-이노사민; UDP-GlcNA: 유리딘 5'-다이포스포-D-2-N-아세틸글루코사민; UDP-Glc; UDP-D-글루코스.
도 2는 후보 유전자를 발현시킨 재조합 숙주로부터 인 비보(in vivo)로 얻어낸 것과 무세포 추출물을 이용한 인 비트로 (in vitro) 반응에 의해 얻어낸 카나마이신 생합성 중간물질을 HPLC-ESI-MS/MS 분석한 도면이다. (a) 각각 kanA-kanB-kanK(2-DOS 생합성 유전자), kanA-kanB-kanK-kanF(kanF는 첫번째 당전이효소를 암호화하는 유전자임), 및 kanA-kanB-kanK-kanF-kacA(kacA는 데아세틸라제를 암호화하는 유전자)를 발현하는 재조합체(DOS, DOSf 및 PAR)로부터의 생산물을 분석한 크로마토그램이다. 각 색 블록은 주석달린 유전자를 나타낸다. (b) 세 종류의 UDP 당 즉, UDP-글루코스(Glc), UDP-2-N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 UDP-2-글루코사민(GlcN)을 기질로 이용한 첫 번째 당전이효소 KanF에 의한 생산물 2 및 9의 크로마토그램이다. 각 상자는 kanF를 발현하는 재조합 숙주의 무세포 추출물을 나타내며, 검은 테두리 상자는 대조군인 끓인 무세포 추출물을 나타낸다. (c) kanA-kanB-kanK-KanF-kacA 및 kanC-kanD를 함께 발현하는 재조합체(PARcd)와 kanA-kanB-kanK-KanF-kacA 및 kanI-kacL를 함께 발현하는 재조합체(PARil)의 생산물 크로마토그램이다. (d) 파롬아민 및 2'-데아미노-2'-하이드록시파롬아민을 기질로 이용한 KanI-KacL의 촉매반응에 의해 생산된 화합물 4 및 10의 크로마토그램이다. (e) kanA-kanB-kanK-kanF-kacA와 kanE 발현체(KCXΔcΔd), kanA-kanB-kanK-kanF-kacA-kanE-kanC-kanD 발현체(KCX), kanA-kanB-kanK-kanF-kacA-kanE-kanl-kacL 발현체(KABΔcΔd), 및kanA-kanB-kanK-kanF-kacA-kanE-kanC-kanD-kanl-kacL 발현체(KAB)의 생산물 크로마토그램이다. (f) 파롬아민을 기질로 이용한 KanC-KanD 및 KanE의 촉매반응을 통해 생산된 화합물 5 및 6의 크로마토그램이다. 화살표는 연속 반응의 정지를 나타낸다. (g) 네아민을 기질로 이용한 KanC-KanD 및 KanE의 촉매반응을 통해 생산된 화합물 7 및 13의 크로마토그램이다. (h) KanI-KacL의 촉매반응에 의한 화합물 7 및 8의 생산을 보여주는 크로마토그램이다.
도 3은 카나마이신의 데칼코마니 형태의 생합성 경로를 보여준다. 각 색깔의 블록은 주석달린 유전자를 나타내고, 그것의 생산물은 카나마이신 중간체의 생합성 과정을 촉매한다는 것이 확인되었다. 각 색깔의 원은 같은 색의 블록으로 표시된 유전자의 생산물에 의해 형성되는 작용기를 나타낸다.
도 4는 첫 번째 당전이효소를 암호화하는 유전자를 바꾼 재조합 균주의 카나마이신 생합성 중간체의 HPLC-ESI-MS/MS 분석 도면이다. (a) kanA-kanB-kanK와 kanF(DOSf), nemD(DOSn), tobM1(DOSt1) 또는 gtmG(DOSg)를 함께 발현하는 재조합체의 생산물의 크로마토그램이다. 오른쪽의 막대 그래프는 각 재조합 균주에 의해 생산된 카나마이신 슈도다이사카라이드 중간체의 수득량을 나타낸다. 하얀 막대는 화합물 2, 회색 막대는 화합물 9를 나타낸다. 데이터는 세 번의 실험으로부터 얻어냈다. (b) kanA-kanB-kanK-kacA-kanE-kanC-kanD와, kanF, nemD, tobM1, 또는 gtmG 중 하나를 발현하는 재조합체(각각 KCX, KCXfn, KCXΔft1, 및 KCXΔfg)의 생산물의 크로마토그램이다. 막대그래프는 각 재조합 균주에 의해 생산된 카나마이신 슈도트라이사카라이드의 수득량을 나타낸다. 하얀 막대는 화합물 5 및 6을 나타내는데, 그것은 데칼코마니 형태의 합성경로에서 왼쪽 사이클의 화합물 7의 동질체(congener)이다. 회색 막대는 화합물 11 및 12의 수득량을 나타내는데, 그것은 오른쪽 사이클의 화합물 8의 동질체이다. (c) kanA-kanB-kanK-kacA-kanE-kanC-kanD-kanI-kacL와 kanE 또는 nemD를 발현하는 재조합체(KAB 및 KABΔfn)의 생산물 크로마토그램이다. 막대그래프는 재조합체에서 생산된 카나마이신의 수득량을 나타낸다. 하얀 막대는 화합물 6 및 7의 생산을 나타내고, 회색 막대는 화합물 12 및 8의 생산을 나타낸다.
도 5는 재조합 숙주에 의해 생산된 화합물 17, 19 및 20의 HPLC-ESI-MS/MS 분석 도면이다. (a) 7개의 부티로신 생합성 유전자(btrG-btrH-btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV)와 함께 화합물 12 생산 유전자 세트(kanA-kanB-kanK-kacA-kanE-kanC-kanD)를 발현하는 재조합체(KCXb) 또는 화합물 8 생산 유전자 세트(kanA-kanB-kanK-kacA-kanE-kanC-kanD-kanI-kacL)를 발현하는 재조합체(KABb)의 생산물의 크로마토그램이다. 화합물 15는 AHBA-결합 카나마이신 유도체인 아미카신이고, 화합물 17은 종전에는 알려지지 않은 AHBA-결합 카나마이신 유도체인 1-N-AHBA-카나마이신 X이다. (b) 유전자 aprD3-aprD4와 화합물 8 생합성 유전자 세트인 kanA-kanB-kanK-nemD-kacA-kanE-kanC-kanD-kanI-kacL 또는 kanA-kanB-kanK-nemD-kacA-tobM2-kanC-kanD-kanI-kacL를 함께 발현하는 재조합체(KABΔfna 및 KABΔfnΔet2a)의 생산물 크로마토그램이다. 화합물 16과 18은 토브라마이신과 토브라마이신 생합성 중간체인 네브라민이다. (c) aprD3-aprD4 및 tobM2 유전자를 발현하는 재조합체가 생산한 카나마이신 유사체의 구조이다. 색깔 원은 같은 색 블록으로 표시된 주석달린 유전자의 생산물에 의해 형성된 기능기를 가리킨다.
본 발명은 다음과 같은 유전자 조합을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 카나마이신 생산 재조합 스트렙토마이세스 속 미생물을 제공한다:
1) kanA, kanB 및 kanK (DOS 균주)
2) kanA, kanB, kanK 및 kanF (DOSf 균주)
3) kanA, kanB, kanK, kanF 및 kacA (PAR 균주)
4) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanC 및 kanD (PARcd 균주)
5) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanI 및 kacL (PARil 균주)
6) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA 및 kanE (KCXΔcΔd 균주)
7) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanC 및 kanD (KCX 균주)
8) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanI 및 kacL (KABΔcΔd 균주)
9) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI 및 kacL (KAB 균주)
10) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanC, kanD, btrG, btrH, btrI, btrJ, btrK, btrO 및 btrV (KCXb 균주)
11) kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI, kacL, btrG, btrH, btrI, btrJ, btrK, btrO 및 btrV (KABb 균주)
12) kanA,kanB, kanK 및 nemD (DOSn 균주)
13) kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, kanE, kanC 및 kanD (KCXΔfn 균주)
14) kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI 및 kacL (KABΔfn 균주)
15) kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI, kacL, aprD3 및 aprD4 (KABΔfna 균주)
16) kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, tobM2, kanC, kanD, kanI, kacL, aprD3 및 aprD4 (KABΔfnΔet2a 균주)
17) kanA, kanB, kanK 및 tobM1 (DOSt1 균주)
18) kanA, kanB, kanK, tobM1, kacA, kanE, kanC 및 kanD (KCXΔft1 균주)
19) kanA, kanB, kanK 및 gtmG (DOSg 균주)
20) kanA, kanB, kanK, gtmG, kacA, kanE, kanC 및 kanD (KCXΔfg 균주).
바람직하게는 상기 kanA, kanB, kanK, kanF, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI 및 kacL 유전자는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 (Streptomyces kanamyceticus)에서 유래하였고, 각각 서열번호 5 내지 14이다.
상기 aprD3, aprD4, tobM1 및 tobM2 유전자는 스트렙토마이세스 테네브라리우스 (Streptomyces tenebrarius)에서 유래하였으며, 각각 서열번호 15 내지 18이다.
상기 btrG, btrH, btrI, btrJ, btrK, btrO 및 btrV 유전자는 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans)에서 유래하였고, 각각 서열번호 19 내지 25이다.
상기 nemD 유전자는 스트렙토마이세스 프라디아에 (Streptomyces fradiae)에서 유래하였으며, 서열번호 26이다.
상기 gtmG 유전자는 마이크로모노스포라 에키노스포라 (Micromonospora echinospora)에서 유래한 것으로 서열번호 4이다.
또한 바람직하게는 상기 미생물은 카나마이신 내성 유전자를 더 발현한다. 더욱 바람직하게는 상기 카나마이신 내성 유전자는 마이크로모노스포라 에키노스포라 (Micromonospora echinospora)에서 유래한 gtmF-gtmK-gtmL이며, 각각 서열번호 1 내지 3의 유전자이다.
또한 바람직하게는 상기 미생물은 S. venezuelae이나 이에 한정되지는 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 미생물은 S. venezuelae KCTC11725BP이다. 또한 바람직하게는 상기 미생물은 S. venezuelae KCTC11726BP이다. 또한 바람직하게는 상기 미생물은 S. venezuelae KCTC11727BP이다. 또한 바람직하게는 상기 미생물은 S. venezuelae KCTC11728BP이다.
또한 본 발명은 상기 재조합 미생물로 카나마이신 항생물질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 생산되는 카나마이신 항생물질은 아래의 화합물 1 내지 20이다.
-화합물 1: 2-데옥시스트렙타민(2-DOS)
-화합물 2: 2'-N-아세틸파롬아민
-화합물 3: 파롬아민
-화합물 4: 네아민
-화합물 5: 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 C
-화합물 6: 카나마이신 C
-화합물 7: 카나마이신 B
-화합물 8: 카나마이신 A
-화합물 9: 2'-데아미노-2'-하이드록시파롬아민
-화합물 10: 2'-데아미노-2'-하이드록시네아민
-화합물 11: 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 X
-화합물 12: 카나마이신 X
-화합물 13: 3"-데아미노-3"-하이드록시카나마이신 B
-화합물 14: 카나마이신 D
-화합물 15: 아미카신
-화합물 16: 토브라마이신
-화합물 17: 1-N-AHBA-카나마이신 X
-화합물 18: 네브라민
-화합물 19: 3'-데옥시카나마이신 C
-화합물 20: 3'-데옥시카나마이신 A
또한 본 발명의 각 재조합 미생물에 따른 생산물은 아래와 같다.
-DOS: 화합물 1
-DOSf: 화합물 2 및 9
-PAR: 화합물 3 및 9
-PARcd: 화합물 3 및 9
-PARil: 화합물 4 및 10
-KCXΔcΔd: 화합물 5 및 11
-KCX: 화합물 6 및 12
-KABΔcΔd: 화합물 13 및 14
-KAB: 화합물 7 및 8
-KCXb: 화합물 17
-KABb: 화합물 15
-DOSn: 화합물 2 및 9
-KCXΔfn: 화합물 6 및 12
-KABΔfn: 화합물 7 및 8
-KABΔfna: 화합물 18, 19 및 20
-KABΔfnΔet2a: 화합물 16
-DOSt1: 화합물 2 및 9
-KCXΔft1: 화합물 6 및 12
-DOSg: 화합물 2 및 9
-KCXΔfg: 화합물 6 및 12
본 발명의 유전자 재조합 미생물, 특히 KABΔfn균주를 이용하여 카나마이신을 생산하는 경우 야생균주에 비해서 반합성 아미노글리코사이드인 아르베카신의 전구체인 카나마이신 B의 생산성이 향상된다.
또한 본 발명의 유전자 재조합 미생물, 특히 KABb 및 KABΔfnΔet2a 균주를 이용하여 반발효, 반합성에 의하지 않고 직접적인 미생물 발효로 아미카신 및 토브라마이신을 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 화학식 1의 신규 화합물을 제공한다.
Figure 112010054875240-pat00001
상기 신규 화합물은 화합물 17인 1-N-AHBA-카나마이신 X이다.
본 발명의 미생물에 의해 생산된 본 발명의 카나마이신 화합물들은 항균 효과를 가진다. 보다 구체적으로 본 발명의 화합물은 그람음성균에 항균효과를 가진다. 더욱 구체적으로 상기 화합물은 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균 (Escherichia coli)에 항균효과를 가지나 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 신규 화합물인 1-N-AHBA-카나마이신 X의 경우 아미카신 내성 P. aeruginosa 에도 항균효과를 가진다.
한편 최근 여러 연구에서 2-DOS 구조를 포함하는 아미노글리코사이드 항생제가 소의 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 뎅구열 바이러스 (DENV)를 비롯한 여러 바이러스의 복제를 억제하여 항바이러스 효능이 있다는 보고가 있었다. 또한 아미노글리코사이드계 항생제가 포유류의 리보솜이 미성숙 정지 코돈의 돌연변이를 감지하고 교정하게 자극함으로써 낭성섬유증, 근위축증, 후드러증후군, 모세혈관확장증 및 어셔증후군과 같은 관련 유전병의 치료 및 개선 효과가 있다는 많은 연구 결과 보고가 있었다. 본 발명의 카나마이신 화합물 역시 2-DOS를 중심구조로 포함하는 화합물로서 항바이러스 효능 및 상기와 같은 유전병의 치료 및 개선효과가 있다고 여겨진다.
그러므로 본 발명은 상기 카나마이신 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 카나마이신 화합물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 카나마이신 화합물을 유효성분으로 포함하는 낭성섬유증, 근위축증, 후드러증후군, 모세혈관확장증 및 어셔증후군으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 유전병을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 경구, 직장, 질, 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 활성 화합물의 투여량은 MIC, 치료 받을 대상, 치료할 특정 질환 또는 병리상태, 질환 또는 병리상태의 심각도, 투여 경로, 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다.
의도된 투여양식에 따라, 약학 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태일 수 있다. 투여 형태의 예는 정제, 산제, 캡슐, 좌약, 과립, 분말, 크림, 로션, 연고, 반창고, 액체 용액, 현탁액 및 분산액, 에멀션, 시럽 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 활성 성분은 리포솜, 미세입자, 또는 마이크로캡슐 등에 캡슐화될 수도 있다. 정제, 환제, 과립 등과 같은 고체 조성물은 편의상 코팅될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부형제, 담체, 희석제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 결합제, 착색제, 향미제, 방부제 및 농후제 등을 포함할 수 있으며, 이러한 첨가물은 투여 경로 및 제제화에 따라 당업자가 통상적으로 선택할 수 있다. 또한 필요에 따라 습윤제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 무독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 보조 물질은 아세트산염, 솔비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 및 트라이에탄올아민 올리에이트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 정맥내 투여를 위한 조성물인 경우 멸균 등장 수성 완충액 내의 용액일 수 있고 주사 부위의 통증을 완화시키기 위해 국소마취제를 포함할 수도 있다.
Figure 112010054875240-pat00002
본 발명자들은 S. kanamyceticus로부터 분리한 여러 후보 유전자들을 포함하는 플라스미드를 천연 데옥시슈가 (타이미딘(thymidine) 5'-다이포스포-D-데소사민(desosamine))의 생합성 유전자가 결여된 S. venezuelae 균주에 삽입함으로써 완전한 카나마이신의 생합성 과정을 재구축했다. 본 발명자들은 카나마이신 생합성 후보 유전자들을 PCR로 증폭시켜 사용하였으며 사용된 프라이머의 서열은 표 1과 같다.
본 발명자들은 본 발명에서 밝혀진 생합성 과정을 조작하여 카나마이신 B (화합물 7)가 주된 생산물이 되도록 하였는데, 이는 화합물 7을 생산할 경우 직접 발효에 의해서 3'-데옥시카나마이신 및 1-N-AHBA-결합 카나마이신을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 디베카신 및 아르베카신의 화학적 합성에 대한 가치 있는 대체물이 될 것이기 때문이다.
본 발명의 재조합체로부터 만들어진 카나마이신 유도체와 유사체의 구조를 확인한 결과, 본 발명의 재조합 미생물로부터 만들어진 화합물들 중 알려진 카나마이신 항균물질의 경우 시판 표준 카나마이신 유도체 또는 S. kanamyceticus 유래의 카나마이신 유도체와 비교하였을 때 종래의 것과 같은 특성을 가졌다. 그런데, 본 발명의 재조합 이종 균주를 사용하여 종래의 카나마이신 항균물질 외에 새로운 카나마이신 유도체인 1-N-AHBA-카나마이신 X가 만들어졌음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 일실시예에서는 우선 화합물 3을 합성하였다. Glc-6-포스페이트로부터 화합물 3을 합성하는 생합성 과정은 도 1b에 나타냈다. 예상한 바와 같이, kanA-kanB-kanK (DOS 균주)를 발현하는 재조합 이종 균주는 화합물 1을 생산했다(21.4μM) (도 2a). 아미노글리코사이드의 구조를 변형시키지 않고 S. venezuelae 내에서 카나마이신에 대한 내성을 가지게 하기 위해서, 겐타마이신 유전자 집단에서 뽑은 3개의 내성 유전자 gtmF-gtmK-gtmL를 재조합 이종숙주에 도입했다. 이러한 유전자를 발현하는 조작체는 대조 균주 (1.0 μg/ml)에 비해서 시판되는 카나마이신에 대해 높은 내성을 가졌다 (>10.0 mg/ml). 이 내성 유전자를 이후의 실험에서 이종 숙주에 카나마이신 생합성 유전자와 함께 발현시켰다.
첫 번째 당전이효소를 암호화하는 kanF 및 화합물 1을 생합성하는 유전자를 발현하는 재조합체 (DOSf 균주)로 화합물 2를 만들어냈다 (1.3 μM). 그런데 흥미롭게도 많은 양 (7.1μM)의 화합물 9가 함께 생성되었다. 또한 kanF를 발현하는 S. venezuelae의 무세포 추출물에 화합물 1을 당수용체 (glycosyl acceptor)로, UDP-Glc 또는 UDP-GlcNAc를 당공여체 (glycosyl donor)로 첨가하여 화합물 2번보다 9배나 많은 화합물 9를 생산하였다 (도 2b). 따라서 KanF가 UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc를 모두 공동기질로 취하지만 UDP-Glc를 더 선호하는 것으로 생각된다. 화합물 2/9 생합성 유전자와 함께 2'-N-아세틸파롬아민 데아세틸라제로서의 역할이 보고된 바 있는 kacA 를 발현하는 재조합 균주 (PAR 균주)로부터는 화합물 3을 생산하였다(2.2μM) (도 2a).
카나마이신 및 네오마이신의 생합성을 위해서는 화합물 3을 화합물 4로 전환시키는 것이 필요하다. 아미노글리코사이드 유전자 집단을 가상 실험 분석하여, KanI 및 KacL가 화합물 3을 화합물 4로 전환시키는데 관여할 것이라고 추측했다. 한편, KanC 및 KanD는 UDP-Glc의 C-3 하이드록실기를 아민화시켜서 UDP-kns을 만든다고 여겨진다. 또는, KanC 및 KanD가 화합물 5로부터 화합물 6을 형성하는데 관여한다고 생각되기도 한다.
본 발명의 일실시예에서는 KanI-KacL 및 KanC-KanD의 기능을 확인하기 위해서, PAR 균주에 kanC-kanD 유전자를 발현시켰는데 (PARcd 균주) 그것은 화합물 4를 합성하는데 실패했고, 대신 화합물 3 및 9를 생산하였다. 반면에 kanI-kacL를 발현하는 재조합 균주 (PARil 균주)는 화합물 4 (2.2μM)뿐만 아니라 화합물 10 (4.3 μM)도 역시 생산했다 (도 2c). kanI-kacL를 발현하는 재조합체의 무세포 추출물을 화합물 3 및 화합물 9와 함께 배양하자 각각 화합물 4 및 10을 만들어냈다 (도 2d).
본 발명의 일실시예에서는 슈도트라이사카라이드 카나마이신을 생합성했다. 두 번째 당전이효소를 암호화하는 kanE 및 화합물 3 및 9의 생합성 유전자를 발현하는 균주 (KCXΔcΔd 균주)로 화합물 5 (3.2μM) 및 지금까지 생합성 중간체로 알려지지 않은 화합물인 화합물 11 (4.5μM)을 생산했다 (도 2e). KCXΔcΔd 균주에 추가로 kanC-kanD를 발현시키자 (KCX 균주), 화합물 6 (1.6μM) 및 화합물 12 (6.0μM)를 생산해냈는데, 그것은 C-3" 아민화에 KanC-KanD가 협력적 작용을 한다는 것을 의미한다. KCXΔcΔd 균주에 kanI-kacL를 함께 발현시킨 균주 (KABΔcΔd 균주)는 화합물 13 (2.0μM)과 화합물 14 (3.2μM)를 만들어냈다. 또한 KABΔcΔd 균주에 kanC-kanD를 발현시켜서 (KAB 균주) 1.0 mg/l (2.1μM)의 화합물 7 및 3.1 mg/l (6.3μM)의 화합물 8을 생산했다 (도 2e).
본 발명의 일실시예에서는 UDP-Glc로부터 생합성된 UDP-kns가 슈도다이사카라이드의 C-6 부분에 결합하는지, 슈도트라이사카라이드의 글루코오스 부분이 카노사민으로 전환되는지를 확인하기 위해서, kanE 또는 kanC-kanD를 발현하는 재조합 S. venezuelae의 무세포 추출물을 각각 준비했다. 화합물 3 및 4를 UDP-Glc와 함께 넣고 배양하여 각각 화합물 5/6 및 13/7을 생산하였다. kanE를 발현하는 재조합 균주의 무세포 추출물에 화합물 3 및 4를 UDP-Glc와 함께 넣고 반응시켰을 때, 각각 화합물 5 및 13이 만들어졌다. 이 반응을 차례로 정지시키고 kanC-kanD를 발현하는 균주의 무세포 추출물과 함께 배양하자 화합물 5 및 13은 남아있고 더 이상의 전환은 탐지되지 않았다. 그러나 화합물 3 및 4를 UDP-Glc 및 kanC-kanD를 발현하는 균주의 무세포 추출물과 함께 반응시켰을 때, 각각 화합물 6 및 7이 생성되었다 (도 2f,g). 유사한 결과가 화합물 9 및 10을 기질로 사용했을 때도 관찰되었다. 이러한 결과는 카노사민의 생합성에 있어서, 이 효소 쌍의 작용에 의해 당전이 이전에 UDP-Glc의 하이드록실기가 아민화된다는 것을 보여주며, 이러한 예는 리파마이신을 생산하는 균주인 아미콜라톱시스 메디테라네 (Amycolatopsis mediterranei)에서의 카노사민 생합성 과정에서도 관찰된다.
또한 kanI-kacL를 발현하는 균주의 무세포 추출물을 화합물 6 및 12와 함께 배양하자 화합물 7 및 8이 각각 생산되었다. KanI 및 KacL은 화합물 7, 8뿐만 아니라 4, 10의 생합성에 관여하는 것으로 보인다 (도 2d,h). 이것은 슈도다이- 및 트라이사카라이드에 대한 그것들의 이중 작용을 나타낸다. 종합해 보면, 기질에 유연성이 있는 KanF 및 KanE 당전이효소에 의해 지배되는 카나마이신 복합체의 데칼코마니 형태의 대칭적 생합성 경로가 확인되었다 (도 3).
본 발명의 일실시예에서는 카나마이신 생합성 과정을 변화시켜 보았다. 화합물 8은 야생 카나마이신 생산자인 S. kanamyceticus 와 이종 숙주인 S. venezuelae에서 모두 카나마이신 생합성의 주 생산물이다. 앞서 실험한 결과 KanF 당전이효소가 UDP-GlcNAc보다는 UDP-Glc를 더 선호한다는 것을 알 수 있었다. KanI-KacL이 화합물 6에 비해 화합물 12를 기질로 더 선호한다는 것 또한 화합물 8과 7의 생산 비율에 관여한다 (도 2h). 아미카신 (화합물 15)은 화합물 8로부터 합성될 수 있지만, 내성균에 효능이 있는 최근의 반합성 아미노글리코사이드인 아르베카신은 화합물 7에서 3',4'-인접 하이드록실기를 제거하고 AHBA로 1-N-아실화함으로써 만들어질 수 있다. 만약 화합물 7/8 생합성을 위한 유전자 조합체(KAB 균주)에서 첫 번째 당전이효소 암호화 유전자인 kanF를 당공여체로서 UDP-Glc보다 UDP-GlcNAc를 더 선호하는 당전이효소를 암호화하는 다른 유전자로 치환한다면, 카나마이신 생합성 과정은 화합물 7의 생산을 늘리는 쪽으로 변화할 것이라고 가정하였다. 우선, 본 발명자들은 DOS균주의 KanF를 네오마이신, 토브라마이신 및 겐타마이신으로부터의 서로 다른 3개의 당전이효소 암호화 유전자인 nemD, tobM1, 및 gtmG로 각각 바꾸었다. kanF를 발현하는 대조군인 DOSf는 화합물 2 (1.4μM; 총 슈도다이사카라이드의 14%) 및 화합물 9 (7.1μM; 79%)를 생산했다. 반면 nemD를 발현하는 균주 (DOSn 균주)는 화합물 2 (4.4μM; 57%) 및 9 (3.4μM; 36%)를 생산하여 NemD 역시 UDP-당에 대해 유연성이 있지만 KanF에 비해서는 UDP-GlcNAc를 더 이용하는 것처럼 보인다. tobM1 및 gtmG로 kanF를 대체했을 때는 (각각 DOSt1 및 DOSg 균주), 화합물 2와 9의 생산 비율 사이에 유의적인 차이가 없었다 (도 4a).
또한 본 발명의 다른 실시예에서는 KCX 균주에서 당전이효소 암호화 유전자 kanF를 개별적으로 치환해보았다. KCX 균주에 의해 생산되는 화합물 6과 12의 비율 (1.6μM, 16% 및 6.0μM, 60%)을 비교해보니 nemD를 발현하는 재조합 균주 (KCXΔfn)에서 슈도다이사카라이드 6과 12의 수율이 바뀌었다 (6: 5.0μM, 65%; 12: 0.4μM, 7%). 그러나 tobM1 (KCXΔft1) 또는 gtmG (KCXΔfg) 발현 균주는 슈도트라이사카라이드 산물 6과 12의 비율이 서로 유사하였다 (도 4b). 또, KAB 균주에 의해 생산되는 화합물 7 및 8의 수율은 각각 21% (2.3μM) 및 61% (6.8μM)였는데 KAB 균주의 kanF를 nemD로 치환한 균주 (KABΔfn)는 화합물 7의 생산이 46%까지 늘었다 (도 4c).
본 발명의 다른 실시예에서는 1-N-AHBA-카나마이신과 3'-데옥시카나마이신을 직접 발효하여 생산해보았다. 본 발명자들은 화합물 15와 같은 AHBA 함유 1-N-아실화 카나마이신 및 화합물 16과 같은 3'-데옥시카나마이신을 직접 인 비보 생산하도록 카나마이신 경로를 조작했다. AHBA 분자구조는 원래 천연물인 부티로신에서 관찰되었다. 최근 btrG-btrH-btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV 유전자 세트가 부티로신의 생합성 과정 중 C-1 부위의 아미노기에 AHBA 측쇄를 도입하는 것을 담당한다고 알려졌다. 이 유전자들을 KCX 균주에 도입하여 (KCXb 균주) 새로운 아미노글리코사이드인 화합물 17을 만들어냈다 (0.6 mg/l, 1.0μM). 또한 KAB 균주에 btr 유전자 세트를 함께 발현시켜서 (KABb 균주) 0.5 mg/l의 화합물 15를 성공적으로 생합성했다(0.8μM) (도 5a,c).
또한 본 발명자들은 아미노글리코사이드 유전자 클러스터를 바이오인포매틱스 분석하여 토브라마이신 (화합물 16)을 소량 생산하는 균주인 S. tenebrarius로부터 두 개의 추정 아프라마이신 유전자인 aprD3-aprD4를 찾아냈는데, 이들은 슈도다이- 및/또는 -트라이사카라이드의 C-3'-탈산소화를 담당하는 것으로 보인다.
본 발명의 일실시예에서는 화합물 7을 더 생산하도록, 제작된 KABΔfn 숙주에 aprD3-aprD4 유전자를 도입해 보았다. 만들어진 숙주 (KABΔfna)는 주 생산물로 화합물 18을 만들었고, 그 외에도 화합물 19 및 화합물 20을 생산하였지만 16은 생산하지 않았다 (도 5b,c). 이러한 결과는 AprD3-AprD4의 연합 활성을 통해 화합물 3, 10 및 4에서도 3'-하이드록실기를 제거한다는 것을 의미한다. 두 번째 당전이효소인 KanE는 카노사민을 선택적으로 화합물 3 및 10에 전달하고 화합물 18에는 전달하지 않았다. 카노사민을 화합물 18에 전달하여 화합물 16을 생산할 수 있는 당전이효소를 선택하기 위해서, S. kanamyceticus 및 S. tenebrarius의 무세포 추출물을 준비하고 화합물 18과 함께 배양하였다. 두 번째 당전이효소 암호화 유전자로 tobM2를 가지는 S. tenebrarius의 무세포 추출물은 화합물 18을 16으로 전환시켰고, 한편 S. kanamyceticus의 무세포 추출물은 그렇지 않았다. 그에 따라 본 발명자들은 당전이효소를 암호화하는 유전자인 nemD, tobM2 및 aprD3-aprD4와 화합물 7을 생합성하는 유전자를 발현하는 새로운 균주 (KABΔfnΔet2a)를 구축했고 화합물 16을 생산했다 (0.4 mg/l; 0.8μM) (도 5b,c). aprD3-aprD4를 발현하는 균주의 무세포 추출물은 화합물 4를 화합물 18로 전환하였지만 화합물 7을 화합물 16으로 전환하지는 않았다. 이는 이러한 효소들의 슈도다이사카라이드에 대한 활성이 제한됨을 보여준다.
일 실시예에서 본 발명에 의해 만들어진 카나마이신 중간체 및 유도체들의 항균범위를 시험하였다. 항균범위는 전형 균주인 그람 음성균 (E. coli 및 Pseudomonas aeruginosa)과 임상적으로 분리한 4개의 균주로 실험하였다 (표 2).
슈도트라이사카라이드 중에서 6'-아미노 화합물인 4 및 10은 6'-하이드록실기를 가지는 화합물 3 및 9에 비해 상대적으로 카나마이신 감수성 E. coli 균주에 대해 더 큰 활성을 가졌다. 또한 화합물 6 및 12에 비해 그것의 6'-아미노 대응체인 화합물 7 및 8이 카나마이신 감수성 균주에 약간 더 활성을 가졌다. 한편 3"-아미노 유도체인 화합물 6, 7, 8 및 12는 3"-하이드록시 유도체인 화합물 5, 13, 14 및 11에 비해서 실험 균주들에 대해 더 큰 항균 활성을 보였다. 따라서 카나마이신의 C-6' 및/또는 C-3" 하이드록실기를 아민화하면 항균력이 증가되는 것으로 보이는데, 이는 과거의 연구결과와 일치한다.
아미카신 감수성 P. aeruginosa 임상 분리 균주로 실험했을 때, 화합물 6, 7, 8 및 12를 제외한 대부분의 카나마이신 중간체들이 매우 낮은 항균활성을 보였다. 흥미롭게도, 아미카신 (화합물 15)과 비교했을 때 새로운 화합물 17은 모든 실험 균주에 대해 향상된 항균력을 보였다. 특히, 화합물 15가 임상적으로 분리한 아미카신 내성 균주 P. aeruginosa에 아무런 활성을 보이지 않은데 비해 화합물 17은 훨씬 강력한 활성 (MIC ~64)을 보였다.
그람음성균에 대한 항균 범위
카나마이신 관련
아미노글리코사이드 		MIC (/)
전형 균주 임상 문리 균주
E. coli
ATCC 25922
(Kan S ) 		P. aeruginosa
ATCC 27853
(Kan R ) 		E. coli
CCARM 1A020
(Kan S ) 		E. coli
CCARM 1A023
(Kan R ) 		P. aeruginosa
CCARM 2206
(Amk S ) 		P. aeruginosa
CCARM 2178
(Amk R )
슈도다이사카라이드 3 128 NA 128 NA NA NA
9 128 NA 128 NA NA NA
4 64 NA 64 NA 128 NA
10 64 NA 64 NA 128 NA
슈도트라이사카라이드 6 16 NA 16 NA 64 NA
12 16 NA 16 NA 64 NA
5 128 NA NA NA NA NA
11 NA NA NA NA NA NA
7 2 NA 4 NA 32 NA
8 2 NA 4 NA 16 NA
13 128 NA 128 NA NA NA
14 128 NA 128 NA NA NA
AHBA-슈도트라이사카라이드
15 128 64 128 32 ≤0.25 NA
17 16 16 32 16 0.25 64
MIC: 최소 억제 농도, 전형 균주 및 임상 분리균주는 각각 ATCC (American Type Culture Collection, USA) 및 CCARM (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, 한국)의 것이다.
KanS 및 KanR는 각각 카나마이신 감수성 및 내성 균주를 나타낸다. AmkS 및 AmkR는 각각 아미카신 감수성 및 내성 균주를 나타낸다.
NA는 128 μg/mL에서 활성이 없었음을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 KanF 및 NemD와 같은 당전이효소의 3D-모델을 구축하였다. 3D-모델은 MshA의 결정 구조를 템플리트로 사용하여 상동관계 모델링하여 생성시켰다. 이 효소들은 총 서열에서 각각 40%를 공유했다. 중요 잔기 및 그것의 상호관계는 강력한 지지 보존 촉매 결합 기전 (strongly supporting conserved catalytic association mechanisms)에 보존되었다. 촉매 기전을 확인하기 위해서 KanF 또는 NemD와 당공여체/당수용체간의 상호관계 시뮬레이션을 반복했다.
먼저 오도도크 (AutoDock)를 사용하여 당공여체 (UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc)를 두 개의 당전이효소, KanF 및 NemD의 추정 결합 위치에 각각 도킹 (docking)하였다. 그 다음 CDOCKER를 사용하여 당수용체 (화합물 1)를 각 당전이효소/당공여체 복합체의 추정 당수용체 결합 위치에 도킹하고, Glc 또는 GlcNAc의 부분에 깊숙이 도킹하여 당공여체 및 각 당전이효소의 주변 잔기들과의 이상적인 상호관계를 이루게 했다.
당공여체의 C1 원자와 화합물 1의 O3 원자의 거리는 매우 좁은 범위에서 변했다 (~3.0 ). [KanF 또는 NemD/당공여체/화합물 1] 복합체의 총 에너지는 안정화되었고 시뮬레이션하는 동안 안정화된 상태를 유지하였다. 복합체에 대한 회전 반경은 시뮬레이션 내내 약 20 로 안정되게 나타났는데, 그것은 복합체 내에 화합물 1이 없을 때보다 화합물 1이 있을 때 단백질을 좀 더 조밀하게 만드는 것을 암시한다. 당전이효소 KanF (또는 NemD)의 두 개의 도메인 사이에는 커다란 친수성 포켓이 있다. 포켓은 당공여체와, Glu14(Glu41), Gln19(Gln46), Gln20(Gln47), His88(His115), Tyr110(Tyr137), Thr111(Thr138), Asp117(Asp204), Lys218(Lys245), Asn272(Asn299), Glu292(Glu319), Glu293(Glu320), Ser297(Ser324) 및 Glu300(Glu327)과 같은 이웃하는 친수성 잔기로 만들어진다. 도킹 구조에서의 친수성-친수성 결합의 분석을 통해 이런 잔기들이 상호관계에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었다. 당공여체의 당부분과 화합물 1 사이에는 결합 부위에 친수성 잔기가 상호작용하는 것으로 생각된다. 두 당공여체의 우라실 부분은 Gly243(Gly270), Phe269(Phe296) 및 Ile275(Ile302)와 소수성 상호작용을 하고, 리보스 부분은 Ser297(Ser324) 및 Glu300(Glu327)와 친수성 상호작용을 하는 것으로 생각된다. 화합물 1과 Tyr110(Tyr137) 간의 친수성 접촉은 강력한데 왜냐하면 화합물 1이 페놀기 위에 위치할 때 Tyr의 페놀기가 원래의 위치에서 다소 안쪽으로 또는 바깥쪽으로 움직여서 화합물 1과 Tyr110(Tyr137)이 좀 더 근접하도록 하기 때문이다. 그러나 Leu89(Leu116)는 전혀 움직이지 않고 화합물 1과 강력한 소수성 상호작용을 한다. 화합물 1의 아미노기가 C3 위치에서 Asp177(Asp204)과 상호작용하여 화합물 1의 탈국지화된 음전하가 소실되게 한다. 화합물 1의 C6 위치에서 하이드록실기가 His88(His115)과 친수성 상호작용을 하고, 한편 화합물 1의 고리부분은 Gly16(Gly43) 및 Val17(Val44)와 소수성 상호작용을 한다. 당공여체의 Glc 또는 GlcNAc 부분은 Glu292(Glu319), Glu293(Glu320), 및 Leu294(Leu321)에 의해 형성된 포켓에 결합하는데, 이러한 잔기가 이 복합체의 안정에 중요한 역할을 할 것이라는 것을 암시한다. 당공여체의 당 부분은 Glu292(Glu319) 및 Glu293(Glu320) 사이의 카르복실 부분 사이에 놓인다. Leu294(Leu321)는 당 부분과의 소수성 및 친수성 상호작용의 거의 중앙에 위치한다.
본 발명자들은 또한 분자역학 및 결합 자유 에너지 분석을 수행했다. 당공여체는 위와 같이 여러 친수성기를 가지기 때문에 그것의 당전이효소 및 용매 분자와의 활성 부위에서의 수소결합 상호작용은 KanF 및 NemD와 밀착된 결합을 하는데 중요하다. KanF와 UDP-Glc의 수소결합 수 (~5)는 KanF와 UDP-GlcNAc 간의 수 (~2)에 비해 크고, NemD와 UDP-Glc 간의 수 (~3)는 NemD와 UDP-GlcNAc 간의 수 (~6)보다 작다. 이는 KanF의 경우 UDP-GlcNAc에 비해 UDP-Glc와의 결합력이 상대적으로 더 크며, NemD의 경우 반대로 UDP-Glc에 비해 UDP-GlcNAc와의 결합력이 더 크다는 것을 의미한다.
UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc가 KanF 및 NemD에 결합하는 자유 에너지는 각각 -42.2, -47.3, -41.4, 및 -46.7 kJ/mol로 계산되었다 (표 3).
Figure 112010054875240-pat00003
* 결합 자유 에너지(G)는 분자 동력학 시뮬레이션에 기초하여 계산하였다:
Figure 112010054875240-pat00004

여기서 <>는 UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc와 같은 기질 (sub)과 KanF 및 NemD와 같은 효소의 주변 잔기 (enz) 사이의 평균 발데르발스 (vdW) 및 정전기적 (Elec) 상호작용을 나타낸다. 0.2 및 0.5는 각각 vdW 및 Elec의 조정계수 (scaling factor)이다.
본 발명자들은 기질-유연성을 가지는 당전이효소의 KanF가 화합물 1에 부가하는 공동기질로 UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc 모두를 취해서 화합물 9 및 2를 합성한다는 것을 밝혀냈다. 화합물 9의 구조 발견을 통해 KanF가 N-아세틸글루코사민 전이효소일 뿐만 아니라 글루코스 전이효소라는 것도 밝혀냈다. 이러한 당전이효소의 활성은 종전 아미노글리코사이드 생합성에서는 알려지지 않았었다. 또한 화합물 9는 KanI-KacL에 의해 화합물 3이 4로 전환되는 것과 같은 방식으로 화합물 10으로 전환된다. KanI-KacL는 또한 화합물 6 및 12를 각각 7 및 8로 변환시킨다. 두 번째 당전이효소인 KanE 역시 당수용체에 대한 두드러진 기질 유연성을 보이는데 UDP-Kns을 화합물 3, 4, 9 및 10으로 옮겨서 각각 화합물 6, 7, 12, 및 8을 만들어낸다. KanE는 또한 UDP-Glc를 당공여체로 취하고, UDP-Glc를 상기 슈도다이사카라이드로 옮겨서 화합물 5, 13, 11, 및 14를 생성시킨다(도 2,3).
본 발명의 재조합 균주를 사용하여 AHBA-결합 카나마이신을 직접 생산하는 방법은 반합성 아미노글리코사이드의 직접적인 발효 생산 방법으로서는 최초이다.
또한 본 발명에 의해 만들어진 새로운 아미노글리코사이드인 화합물 17 (1-N-AHBA-카나마이신 X)은 KanR 및 AmkR 실험 균주 모두에 강력한 항균활성을 가졌다. 화합물 15와 17의 유일한 구조적 차이점은 C-6' 위치에 붙은 작용기이다 (도 5c). 이것은 화합물 15에서 아미노글리코사이드 6'-아세틸트랜스퍼라제의 표적으로 작용하는 6'-아미노기를 떼면 화합물 15에 내성을 가지는 병균에 효과적이라는 것을 보여준다. 화합물 17의 또 다른 장점은 아미노기의 수가 감소했기 때문에 독성이 감소할 것이라는 것이다.
또한, 조작된 경로를 통해 화합물 16을 직접 인 비보로 생산하는 것은 S. tenebrarius에 의해 생산되는 총 네브라마이신 인자 (factor)의 9%를 차지하는 6"-O-카르바모일토브라마이신의 가수분해를 통한 종래의 방법에 비해 훨씬 경제적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재료의 준비
표준 카나마이신, 카나마이신 B, 네오마이신, 파로모마이신, 토브라마이신 및 아미카신은 시그마사(Sigma, 미국)로부터 구입하였다. 2-머캅토에탄올, 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 페놀/클로로포름/아이소아밀알코올(25:24:1), 유리딘 5'-다이포스포-D-글루코스(UDP-Glc) 및 유리 비드(150 내지 212 μm)도 시그마사로부터 구입하였다. 헵타플루오로부티르산(HFBA)은 플루오카사(Fluka)에서, HPLC-등급 아세토니트릴, 메탄올 및 물은 제이티베이커사(J.T. Baker)로부터 공급받았다. 2-데옥시스트렙타민(2-DOS, 화합물 1) 및 UDP-2-N-아세틸-D-글루코사민(UDP-GlcNAc)은 국내의 진켐사로부터 구입했다. 양이온성 고체상 교환기(OASIS MCX SPE, 3 mL/60 mg) 및 진공 매니폴드는 워터스사(Waters)의 것이고, 배지 성분, 대두분, 효모추출물 및 맥아추출물은 비디사이언스사(BD Science, USA)에서 구입하였다.
파롬아민 및 네아민은 메탄올분해를 통해 파롬마이신 및 네오마이신으로부터 만들었다. UDP-2-D-글루코사민(UDP-GlcN)은 글루코사민-1-포스페이트 및 유리딘 5'-트라이포스페이트(UTP)를 UDP-D-글루코스 피로포스포릴라제로 효소 반응시켜서 제조하였다. 서브클로닝을 위해 대장균(E. coli) DH10B 및 플라스미드 Litmus28(New England Biolabs)를 사용하였다. 강력한 ermE* 프로모터와 티오스트렙톤 저항 마커를 가지는 다복제(high-copy number) 대장균-스트렙토마이세스(E. coli-Streptomyces) 셔틀 벡터 pSE34를 발현 플라스미드로 사용하였다.
<실시예 2>
균주 배양
S. venezuelae의 재조합 균주는 30℃, 액상 R2YE에서 배양하여 원형질체를 만든 다음 티오스트렙톤(30 μg/mL)을 첨가한 R2YE 고체 배지에서 다시 배양하였다. 서브클로닝에 사용한 E. coli 균주는 암피실린(50 μg/mL)이 첨가된 LB 배지에서 배양했다.
카나마이신 생합성 중간물질 및 그 유사체를 만들기 위해서, 생합성 후보 유전자를 발현하는 S. venezuelae를 티오스트렙톤(25μg/mL) 첨가 R2YE 배지 300mL에서 30℃로 4일간 배양하였다. S. kanamyceticus ATCC 12853을 액상의 ISP2(0.4% 효모추출물, 1.0% 맥아추출물, 0.4% 포도당)에서 30℃로 5일간 배양하였고, S. tenebrarius ATCC 17920는 발효 배지(2.0% 포도당, 2.0% 수용성 전분, 4.0% 대두분, 0.5% 효모 추출물, 0.5% CaCO3, 및 0.4% MgSO47H2O, pH 7.0)에서 30℃로 5일간 배양하였다.
카나마이신 생합성 중간산물 및 유사체의 항균 범위를 확인하기 위해 총 6종의 그람양성균을 사용하였다: 카나마이신 감수성(KanS) E. coli ATCC 25922, 카나마이신 내성(KanR) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, KanS E. coli CCARM (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, 한국) 1A020, KanR E. coli CCARM 1A023, 아미카신 감수성(AmkS) P. aeruginosa CCARM 2206, 및 아미카신 내성(AmkR) P. aeruginosa CCARM 2178.
<실시예 3>
발현 플라스미드 및 재조합 S. venezuelae 균주의 구축 및 복제
내재성 데옥시슈가 티미딘 5'-다이포스포(TDP)-D-데소사민 생합성 유전자가 제거된 S. venezuelae 돌연변이주를 이종숙주로 사용하였다
카나마이신 변형 유전자(aphII)를 없애기 위해서 유전자 교체 플라스미드로 pYJ188을 증식성 플라스미드 매개 상동 재조합 기술(replicative plasmid-mediated homologous recombination)로 S. venezuelae YJ003 변이체의 원형질에 도입시켰다. 서던 하이브리다이제이션을 통해 카나마이신 감수성 및 유전자형에 따른 여러 종류의 이중 교차 변이체(double crossover mutants)를 동정해냈다.
여러 가지 카나마이신 생합성 유전자를 포함하는 DNA 단편을 pSKC2로부터 특정 데옥시올리고뉴클레오타이드 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. NemD, GtmG, AprD3, AprD4, TobM1 및 TobM2를 암호화하는 DNA 단편은 S. fradiae ATCC 10745, M. echinospora ATCC 15385 및 S. tenebrarius ATCC 17920의 게놈 DNA를 이용하여 PCR-증폭하여 얻었다. btrI, btrJ, btrK, btrO, btrV, btrG, 및 btrH 유전자를 포함하는 DNA 단편은 S-4-아미노-2-하이드록시부티르산(AHBA) 생합성 및 전달을 위해서 필요한데, B. circulans NR3312의 게놈 DNA를 템플리트로 사용하여 PCR-증폭했다. 각 프라이머 쌍은 각 DNA 단편의 서브클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위를 가졌다.
Pfu 폴리머라제(Fermentas)를 사용하여 사용설명서에 따라 PCR을 수행했다. 모든 PCR 산물을 Litmus 28로 클로닝하고 서열을 확인했다.
2-DOS 생합성 유전자를 발현시키기 위해서, kanA-kanB 및 kanK를 포함하는 PCR-증폭 단편을 각각 BamHI/SpeI 및 XbaI/HindIII로 절단하고, 동시에 BamHI와 HindIII로 잘려진 pSE34와 연결해서, pDOS를 만들었다. kanF의 SpeI/HindIII-분해 DNA 단편을 pYJ489로부터 분리한 저항성 유전자 세트(gtmF-gtmK-gtmL)의 XbaI/HindIII 단편과 연결시키고 pDOS를 XbaI/HindIII 단편으로 삽입함으로써 2-DOS 생합성 유전자와 함께 kanF를 발현하는 플라스미드 pDOSf(kanA-kanB-kanK-kanF-gtmF-gtmK-gtmL)를 구축하였다.
플라스미드 pPAR, pPARcd, pPARil, pKCXΔcΔd, pKCX, pKABΔcΔd, pKAB, pDOSn, pDOSt1, pDOSg, pKCXΔfn, pKCXΔft1, pKCXΔfg, 및 pKABΔfn를 구축하기 위한 모든 후속 복제 과정은 앞서 설명한 바와 같이 SpeI 및 XbaI 위치의 양립성 결합 말단을 이용하였다.
1-N-AHBA 카나마이신을 직접 발효하여 생산하기 위해서, btrG-btrH를 포함하는 플라스미드 Litmus 28을 SpeI/SnaBI 제한 효소로 처리하고 XbaI/SnaBI에 의해 잘린 DNA 단편 btrI-btrJ와 연결하였다. 만들어진 btrG-btrH-btrI-btrJ를 포함하는 플라스미드를 동일한 방법으로 btrK-btrO-btrV와 연결하였다. 그 다음, btrG-btrH-btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV를 포함하는 플라스미드를 XbaI/SpeI로 분해하고, pKCX 및 pKAB의 XbaI 위치(표 2 참조)에 이식하여 각각 pKCXb 및 pKABb를 만들었다. pKCXb 및 pKABb 내에서의 btrG-btrH-btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV을 포함하는 DNA 단편의 정확한 위치를 확인하기 위해서 제한 단편 분석을 실시했다.
그 다음, 3'-데옥시카나마이신을 in vivo 생산하기 위해서 플라스미드 pKABΔfna 및 pKABΔfnΔet2a를 구축하였다.
aprD3를 포함하는 플라스미드 Litmus 28을 SpeI/HindIII으로 분해시키고, aprD4을 포함하는 XbaI/HindIII DNA 단편과 결합시켰다. aprD3-aprD4 유전자 세트를 포함하는 플라스미드를 nemD-kanE-kanC-kanD-kanI-kacA-kacL-gtmF-gtmK-gtmL을 포함하는 XbaI/HindIII DNA 단편과 연결시켰다. 만들어진 플라스미드를 kanA-kanB-kanK(pDOS)를 포함하는 pSE34의 XbaI/HindIII로 이동시켜서 pKABΔfna를 만들었다. 플라스미드 pKABΔfnΔet2a는 pKABΔfna에 kanE 대신 tobM2를 넣은 것이다.
카나마이신 생합성 유전자들의 기능을 규명하기 위한 S. venezuelae 재조합 균주의 무세포 추출물을 확보하기 위하여 우선 kanF, kanE, kanI-kacL, kanC-kanD, 및 aprD3-aprD4을 포함하는 DNA 단편들을 XbaI/HindIII 단편으로서 pSE34에 클로닝하여, pKanF, pKanE, pKanI-KacL, pKanC-KanD, 및 pAprD3-AprD4를 만들었다. 만들어진 모든 플라스미드를 S.venezuelae의 조작 균주에 이식하여 대응하는 재조합체를 만들었다.
<실시예 4>
카나마이신 생합성 중간산물 및 유사체의 분리 및 동정
실시예 3에 따라 조작된 재조합 숙주의 생산물을 Spherisorb S5 ODS2(250×20 mm, Waters) 세미-프렙 칼럼을 이용하여 HPLC-ESI-MS/MS 분석용 이동상으로 용리시켜서 HPLC를 수행했다. 유속 12 mL/분으로 150분간 용리시켰고, 이 용리액을 3-mL부분으로 구획화해서 HPLC-ESI-MS/MS로 확인하여 각 카나마이신-연관 생합성 중간산물 및 유사체를 확인하였다. 관심 있는 산물을 포함하는 구획을 모아놓고 OASIS MCX SPE로 추출한 다음 동결건조했다. 298 K에서 Varian INOVA 500 분광광도계를 사용하여 1H, 13C, 및 2D 1H-1H COSY NMR 스펙트럼을 얻었다. 트리메틸실일-2,2,3,3-테트라데유테로프로피온산(TSP)을 내부표준으로 사용하여 화학적 이동을 ppm 단위로 기록하였다. 이전에 규명된 1H and 13C NMR 스펙트럼과 비교하여 각 화합물의 구조를 확인하였고, NMR 데이터는 MESTREC(Magnetic Resonance Companion) 소프트웨어를 이용하여 처리하였다.
<실시예 5>
카나마이신 생합성 중간산물 및 유사체의 분석
여러 가지 조합의 아미노글리코사이드 생합성 유전자를 발현하는 S. venezuealae 재조합 균주에 의해 생산된 카나마이신 생합성 중간산물 및 그 유사체를 OASIS MCX(Waters) SPE 정제 과정을 이용하여 발효 배지로부터 추출하고 HPLC-ESI-MS/MS로 분석하였다.
시료를 XTerra MS C18 칼럼(50×2.1 mm, 3.5 , Waters)에서 10 mM에서 시작하는 헵타플루오로부티르산(Fluka) 아세토니트릴 구배액을 이용하여 45분간 분리하였다. 화합물의 분석은 다중 반응 모니터링 모드의 MS/MS 분석을 통해 이루어졌다. 모이온으로부터 산출 이온으로의 전이를 탐지하기 위해 아래와 같이 분석체에 대한 특정 중량 쌍을 고름으로써 정량하였다: 화합물 1, 163 > 84; 화합물 2, 366 > 163; 화합물 3 및 10, 324 > 163 ; 화합물 4, 323 > 163; 화합물 5, 12 및 14, 486 > 163; 화합물 6, 8 및 13, 485 > 163; 화합물 7, 484 > 163; 화합물 9, 325 > 163; 화합물 11, 487 > 163; 화합물 15, 586 > 264; 화합물 16, 468 > 163; 화합물 17, 587 > 264; 화합물 18, 307 > 163; 및 화합물 19 및 20, 469 > 163. 세 번씩 배양하고 각각 추출하였다.
<실시예 6>
AprD3-AprD4 활성 인 비트로 반응
슈도다이- 또는 트라이사카라이드에서의 3'-탈산소화 반응에 대한 AprD3-AprD4 쌍의 활성을 측정하기 위해서 인 비트로 실험을 하였다. aprD3-aprD4 유전자를 발현하는 재조합 숙주로부터 얻은 무세포 추출물에 100μM의 네아민 또는 카나마이신 B를 가하였다. 30℃에서 2시간 동안 배양한 후에 반응을 정지시켰다. 이렇게 만들어진 관심 산물을 포함하는 상층액을 OASIS MCX SPE를 이용하여 추출한 다음, HPLC-ESI-MS/MS 분석을 하였다. 실험은 각각 2번 수행했다.
<실시예 7>
KanF의 당전이 인 비트로 반응
S.venezuelae의 무세포 추출물은 유리 비드 균질화를 통해 만들었다. 만들어진 무세포 추출물을 100 mM TrisHCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 6 mM 2-머캅토에탄올 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF; Sigma)를 함유하는 트리스 완충액에 현탁시키고 단백질 농도를 교정시켰다. kanF만 발현하는 재조합 숙주의 무세포 추출물에 100μM의 2-DOS 및 200μM UDP-Glc(Sigma), UDP-GlcNAc(GeneChem) 또는 UDP-GlcN를 공동기질로 첨가함으로써 KanF에 의한 당전이 반응을 시작시켰다. 100μM의 6'-하이드록시 슈도다이- 및 -트라이사카라이드 3, 6, 9 및 12를 kanI-kacL를 발현하는 재조합 숙주의 무세포 추출물과 섞어 반응시킴으로써 6'-아미노화에 대한 KanI-KacL의 활성을 측정하였다. 30℃에서 2시간 배양한 후에, 얼음처럼 차가운 페놀/클로로포름/아이소아밀 알코올(25:24:1; Sigma)로 반응을 정지시키고 18,000g로 5분간 원심분리하였다. 관심 산물을 포함하는 상층액을 OASIS MCX SPE를 이용해 추출하고, 100μl의 물을 넣은 다음, HPLC-ESI-MS/MS 분석을 하였다.
<실시예 8>
KanC-KanD 활성 인 비트로 반응
KanC-KanD의 활성을 확인하기 위한 반응은 kanE 또는 kanC-kanD를 발현하는 두 개의 S. venezuelae 균주의 무세포 추출물을 이용하여 수행했다. kanE(또는 kanC-kanD)를 발현하는 균주의 무세포 추출물에 200μM UDP-Glc와 100μM 화합물 3 또는 4를 넣고 실시예 7에서 설명한 바와 같은 조건으로 배양한 후 반응을 정지시켰다. 반응 산물을 포함하는 상층액을 kanC-kanD(또는 kanE)를 발현하는 균주의 무세포 추출물과 함께 30℃에서 2시간 배양한 후에 반응을 다시 정지시켰다. 만들어진 상층액을 위와 같은 정제과정을 거친 후 HPLC-ESI-MS/MS 분석했다. 슈도다이사카라이드 9 및 10으로도 두 가지 무세포 추출물을 이용한 연속 반응을 수행했다. 실험은 각각 2번씩 수행했다.
<실시예 9>
야생형 S. kanamyceticus 및 S. tenebrarius 로부터 추출한 무세포 추출물을 이용한 인 비트로 반응
S. kanamyceticus의 KanE 및 S. tenebrarius의 TobM2의 3'-데옥시네아민, 즉 네브라민에 대한 당전이 활성을 측정하기 위해서 in vitro 실험을 하였다. S. kanamyceticus의 무세포 추출물(SK CFE) 및 S. tenebrarius 무세포 추출물(ST CFE)에 100μM의 네브라민을 첨가하였다. 반응을 간섭할 수 있는 야생형 균주의 카나마이신- 또는 토브라마이신-연관 동질체(congener)가 최소한으로 남아있게 하기 위해서 무세포 추출물은 유리 비드 균질화 후에 추가로 다음과 같이 OASIS MCX SPE 통과 처리하였다. 우선, 두 야생형 균주로부터 얻은 무세포 추출물을 각각 메탄올과 물로 헹군 SPE 카트리지에 넣었다. 그 다음 카트리지를 통과한 용리 샘플을 확보하였다. 이상의 추출과정은 4℃ 정도의 차가운 상태에서 수행했다. 이렇게 만들어진 무세포 추출물을 30℃에서 화합물 18과 함께 2시간 동안 반응시킨 후에 다시 OASIS MCX SPE 정제과정을 거친 후 HPLC-ESI-MS/MS 분석을 하였다. 두 번의 실험을 하였다.
화합물 6, 7 또는 12의 카나마이신 8로의 전환반응은 100 μM의 화합물 6, 7 또는 12를 S. kanamyceticus의 무세포 추출물에 첨가함으로써 측정했다. 이 무세포 추출물은 유리 비드 균질화 후에 위에 설명한 바와 같이 OASIS MCX SPE 통과 처리 하였다. 30℃에서 2시간 배양한 다음 반응을 종료시켰다. 원하는 산물을 함유하는 상층액을 OASIS MCX SPE로 추출하고 HPLC-ESI MS/MS 분석을 하였다. 실험은 각각 2번 수행했다.
<실시예 10>
카나마이신 생합성 중간산물 및 유사체의 MIC 측정
다양한 카나마이신-관련 슈도다이- 및 트라이사카라이드들과 AHBA-결합 유사체(화합물 16, 18, 19 및 20 제외)들의 MIC를 CLSI(Clinical and Laboratory Standard Institute, 구 NCCLS)의 마이크로-희석법으로 측정하였다. 실시예 2에 기재한 바와 같이, 그람음성 E. coli 및 P. aeruginosa 균주 및 임상적으로 분리한 균주를 30℃에서 뮐러 힌톤 브로스(BD Science)에서 배양했다. 아미노글리코사이드를 연속적으로 2배 희석하여 최종 농도가 0.25-128μg/ml사이가 되도록 했다. 물 부분표본을 음성 대조군으로 사용했다. 실험 균주들의 생장은 랩시스템즈 바이오스크린(Labsystems Bioscreen) C 리더로 관찰했고, MIC는 브로스 배지에 희석된 아미노글리코사이드의 실험 세균의 생장을 억제하는 최저 농도로 결정하였다.
<실시예 11>
KanF 및 NemD와 같은 당전이효소에 대한 3D 구현
두 당전이효소 KanF 및 NemD에 대해서 MODELLER18로 상동관계 모델링을 하였고 MshA(PDB code: 3C48)의 원자 좌표를 템플리트로 사용하여 FoldX로 최적화하였다. VADAR로 3D 구조 모델을 산정하였다. 당공여체(UDP-Glc 및 UDP-GlcNAc) 및 수용체(2-DOS)에 대한 결합 형태를 결정하기 위해서 분자 도킹 모델을 사용하였고, 분자 역학 시뮬레이션을 위해서 HF/6-31G(d)를 이용하여 가우시안03(Gaussian03)으로 에너지를 최소화하고 구조를 최적화하였다.
당공여체 및 2-DOS의 당전이효소에 대한 도킹은 일차적으로 몇 가지 알고리즘에 의한 예측 지형 결합 부위에 따라 만들어졌다. MMFF 역장 및 AutoDock 4.0 프로그램 스위트에 기초한 CDOCKER 프로그램(Accelrys, Inc.)으로 자동 도킹을 하였다. 활성 부위는 KanF 및 NemD의 예상 촉매 중심으로부터 6Å반지름의 구로 정의하였다. 각 복합체 모델을 정육면체 상자의 TIP3 물분자로 용매화하고 KanF 및 NemD 단백질의 전체 표면과 그것의 당공여체/2-DOS가 12Å이상의 두께를 가진 물층으로 덮이도록 했다. 최대 경사 알고리즘(steepest descent algorithm)과 CHARMM의 결합 구배법(conjugate gradient method)을 순차적으로 이용하여 각 복합체에 대한 에너지를 최소화하였다. 그 다음 CHARMM 패키지를 이용하여 상기 단백질 및 당공여체/2-DOS로 500-ps 위치 제한 분자 역학을 수행하였다. 마지막으로, 300K에서 맥스웰 분포(Maxwellian distribution)로부터 초기 속도를 취함으로써 3-ns 분자역학을 시작했다. 용매 및 당공여체/2-DOS는 각각 약하게 온도조에 결합했고, 완화시간은 0.1-ps였다. 시스템 역시 등방성으로 약하게 완화시간 0.5ps로 1 기압 하에서 압력조에 결합했고 등온 압축률은 0.5×10-3 였다. 원거리 정전기력은 입자 메쉬 에발트법(particle-mesh Ewald method)으로 계산하였다. 단거리 반데르발스 및 쿨롱 작용은 각각 0.1Å을 경계로 나누었다. 모든 결합 길이는 SHAKE 알고리즘을 이용하여 제한하였고, 시간 단계는 0.002-ps로 맞추었다. 당공여체 및 KanF(또는 NemD) 사이의 결합 자유 에너지는 기본 변수를 사용하여 선형 상호 에너지법(linear interaction energy method)으로 계산하였다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 의해, 카나마이신을 생산하는 재조합 스트렙토마이세스 속 이종 미생물과 종래의 방법에 비해 효율적으로 카나마이신을 생산하는 방법 및 이를 통해 만들어진 새로운 카나마이신 화합물이 제공된다.
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Claims (22)

  1. kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, kanE, kanC, kanD, kanI, kacL, aprD3 및 aprD4 로 구성된 유전자 셋트를 포함하는 네브라민(nebramine) 생성용 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 aprD3 및 aprD4 유전자는 스트렙토마이세스 테네브라리우스(Streptomyces tenebrarius)에서 유래된 것을 특징으로 하는 네브라민 생성용 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 aprD3 및 aprD4 유전자의 발현은 슈도다이사카라이드의 C-3'-하이드록실기를 제거하는 것을 특징으로 하는 네브라민 생성용 벡터.
  4. 제1항의 벡터가 도입된 스트렙토마이세스 베네주엘라에 균주.
  5. 제1항의 벡터가 도입된 균주를 배양하여 네브라민을 생산하는 방법.
  6. kanA, kanB, kanK, nemD, kacA, tobM2, kanC, kanD, kanI, kacL, aprD3 및 aprD4로 구성된 유전자 셋트를 포함하는 토브라마이신(tobramycin) 생성용 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 aprD3 및 aprD4 유전자는 스트렙토마이세스 테네브라리우스(Streptomyces tenebrarius)에서 유래된 것을 특징으로 하는 토브라마이신 생성용 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 tobM2는 카노사민을 네브라민에 전달하는 당전이 효소를 암호화하는 것을 특징으로 하는 토브라마이신 생성용 벡터.
  9. 제6항 또는 제7항의 벡터가 도입된 스트렙토마이세스 베네주엘라에 균주.
  10. 삭제
  11. 제6항의 벡터가 도입된 균주를 배양하여 토브라마이신을 생산하는 방법.
  12. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장균(E.coli) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas species)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 그람음성균에 대한 항균용 조성물이며, 상기 항균용 조성물은 아미노글리코사이드 내성 균주와 아미노글리코사이드 감수성 균주 모두에 대해 항균 활성을 가지는 것인 항균용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112012100066819-pat00005

  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 상기 E.coli는 E. coli ATCC 25922, E. coli CCARM 1A020 및 E. coli CCARM 1A023로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나이며, 상기 슈도모나스 종은 P. aeruginosa ATCC 27853, P. aeruginosa CCARM 2206 및 P. aeruginosa CCARM 2178로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 것인 항균용 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제12항에 있어서, 상기 슈도모나스 종(Pseudomonas species)은 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)인 것인 항균용 조성물.
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