JP5883355B2 - バイオフィルム除去剤組成物 - Google Patents
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1w/v%の濃度でカゼイン(ハマーステイン:メルク社)を含む50mmol/Lホウ酸緩衝液(pH10.5)1mLを30℃で5分間保温した後、本発明のバイオフィルム除去剤0.1gと混合し、30℃で15分間反応を行う。反応停止液(0.11mol/Lトリクロロ酢酸−0.22mol/L酢酸ナトリウム−0.33mol/L酢酸)2mLを加え、室温で10分間放置する。次に酸変性タンパク質をろ過(No.2ろ紙;ワットマン社製)し、ろ液0.5mLにアルカリ性銅溶液[1w/v%酒石酸カリウム・ナトリウム水溶液:1w/v%硫酸銅水溶液:炭酸ナトリウムの0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液溶解物(炭酸ナトリウム濃度2w/v%)=1:1:100(V/V)]2.5mLを添加し30℃、10分間保温する。さらに、希釈フェノール試薬[フェノール試薬(関東化学社製)をイオン交換水で2倍に希釈したもの]0.25mLを加え、30℃で30分間保温後、このサンプルの660nmにおける吸光度を測定する。また、上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えたものをブランクとして同様に吸光度を測定する。次にサンプルとブランクとの吸光度差により、遊離してきた酸可溶性のタンパク質分解物量(チロシン換算された量)が得られ、これを反応時間(本条件の場合:15分)及び酵素溶液量(本条件の場合:0.1g)で除して、タンパク質分解活性(PU/g)を求めることができる。なお、1PUは、上記の反応条件において1分間に1mmolのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とする。
<キレート剤のpKCaの測定方法>
緩衝液として0.1mol/リットルのNH4Cl−NH4OH(pH10.0)溶液を調製する。この緩衝液を用いて全ての試料溶液を調製する。また、これら試料溶液の温度をすべて20℃にして測定を行う。Ca2+濃度の測定には、一例として、オリオン(株)製のイオンメーター920AとCa2+イオン電極を用いることができる。
先ず、塩化カルシウム濃度と電極の電位の関係を求め、検量線を作成する。塩化カルシウムの5.36×10-2mol/L溶液、キレート剤の5.36×10-4mol/L溶液を調製する。調製したキレート剤溶液100mlに塩化カルシウム溶液を1ml加え、5分間撹拌する。残存しているCa2+濃度をCa2+イオン電極を用いて測定する。キレート剤はCa2+と1:1でキレート錯体を形成すると仮定して下記の式からpKCa(カルシウム安定度定数、Ca安定度定数)を求める。
(A)成分を含む高濃度品と(B)成分を含む高濃度品とを別々に調製しておき、対象物への適用前にそれぞれの高濃度品を水と混合する方法で組成物を調製する場合、組成物を調製してから適用するまでの時間は、(A)成分の安定性を考慮して1週間以内であることが好ましく、24時間以内であることがより好ましく、12時間以内であることが更に好ましい。
(A)成分を含む高濃度品としては、(A)成分、水を含有する濃縮液が挙げられる。かかる濃縮液中の(A)成分の含有量は限定されない。また、一般に酵素製剤として市販されている(A)成分を含有する組成物、例えば酵素含有液状組成物などはそのまま高濃度品として使用することもできる。このとき(A)成分を含む高濃度品は(B)成分を含有しないものが好ましい。(B)成分を含む高濃度品としては、(B)成分、水を含有する濃縮液が挙げられ、かかる濃縮液中の(B)成分の濃度は2質量%以上、更に5質量%以上、そして、60質量%以下、更に40質量%以下が好ましい。(B)成分を含む高濃度品は(A)成分を含有しないものが好ましい。
表1に示す処理液を、以下の方法で調製した。得られた組成物を用いてバイオフィルムの除去性能を下記の要領で評価した。結果を表1に示す。
尚、表1中の濃度はバイオフィルム除去剤組成物全量に対する有効分濃度(質量%)である。また、表1中、pKCaは、20℃、pH10におけるpKCaである。また、以下の記載においては、特に断りのない限り、「%」は「質量%」の意を示す。
・プロテアーゼ:エバラーゼ16L(ノボザイム社)、酵素含有量7質量%、タンパク質分解活性12PU/g
<キレート剤>
・EDTA・4Na:クレワットT(ナガセケムテック社)
・EDTA・2Na:クレワットN(ナガセケムテック社)
・MGDA・3Na:トリロンM(BASF社、純分40%)
・GLDA・4Na:ディゾルビンGL−47−S(アクゾノーベル社、純分47%)
<pH調整剤>
・モノエタノールアミン:(和光純薬工業株式会社)
・NaOH:(南海化学株式会社、純分25%)
<界面活性剤>
・非イオン界面活性剤1:ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、商品名:プルラファックLF901(BASF社)
・非イオン界面活性剤2:アルキルアミンオキサイド、商品名:アンヒトール20N(花王株式会社)
緑膿菌(NBRC13275)1株を、25mlのLB培地(和光純薬工業株式会社製)で37℃、22時間振盪培養した。
波長600nmの濁度を測定し(濁度計 HITACHI社製 U−2800)、濁度が0.1となるようにLB培地で希釈した後、底面が平面である滅菌96ウェルプレート(ファルコン社製)の各ウェルに0.15ml添加して、37℃、48時間静置培養した。また、ポジティブコントロールとして、同じプレートの異なるウェルに菌を含まないLB培地を0.15ml加えたサンプルも調製した。
上澄みを廃棄後、各ウェルに0.2mlの滅菌イオン交換水(以下、滅菌水という)を添加し、室温(25℃)にて3分間保持し、上澄みを廃棄する操作(以下、washという)を2回行った。次いで、各ウェルに0.2mlの滅菌水を添加し、この状態でバイオフィルム除去性能の評価に用いるまで、室温(25℃)で保管した。
前述の通りに作成した滅菌水を添加したモデルバイオフィルムの上澄みを廃棄し、その直後に室温(25℃)で保存した表1に示す各バイオフィルム除去剤組成物を各ウェルに添加し、室温(25℃)で1分間放置した。
その後、上澄みを廃棄し、2回washした。また、バイオフィルム除去剤の代わりに滅菌水を用いて同様の操作を行ったものをネガティブコントロールとした。
その後、各ウェルに、クリスタルバイオレット(和光純薬工業株式会社製)の0.1質量%水溶液0.2mlを添加し、室温(25℃)で10分間放置した。滅菌水で2回washした後、95%エタノール溶液(シグマ社製)0.2mlを各ウェルに添加し、4℃で一晩放置した。次いで、各ウェルに関し、570nmの吸光度を測定した。得られた吸光度値を下記の式に代入し、バイオフィルム除去率を算出した。結果を表1に示す。
なお、上記全ての工程は無菌状態にて実施した。
As:サンプル吸光度
An:ネガティブコントロール吸光度
Ap:ポジティブコントロール吸光度
Claims (8)
- (A)プロテアーゼ、(B)20℃、pH10におけるpKCaが5以上のキレート剤、及び水を含有し、20℃のpHが10以上であるバイオフィルム除去剤組成物であって、
(B)成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる1種又は2種以上のキレート剤である、
バイオフィルム除去剤組成物。 - (D)界面活性剤の含有量が1質量%以下である、請求項1記載のバイオフィルム除去剤組成物。
- (D)界面活性剤を含有する請求項1又は2記載のバイオフィルム除去剤組成物。
- (D)成分の含有量と(A)成分の含有量の質量比(D)/(A)が、0.5以上50以下である、請求項3記載のバイオフィルム除去剤組成物。
- 請求項1〜4の何れか1項記載のバイオフィルム除去剤組成物を対象物に適用するバイオフィルム除去方法。
- (A)プロテアーゼと(B)20℃、pH10におけるpKCaが5以上のキレート剤とを含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、(A)プロテアーゼ、(B)20℃、pH10におけるpKCaが5以上のキレート剤、及び水を含有し、20℃のpHが10以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法であって、
(B)成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる1種又は2種以上のキレート剤である、
バイオフィルム除去方法。 - (A)プロテアーゼを含む濃縮液と、(B)20℃、pH10におけるpKCaが5以上のキレート剤を含む濃縮液と、水とを、対象物への適用前もしくは適用時に混合して、(A)プロテアーゼ、(B)20℃、pH10におけるpKCaが5以上のキレート剤、及び水を含有し、20℃のpHが10以上であるバイオフィルム除去剤組成物を調製し、該組成物を対象物に適用する、バイオフィルム除去方法であって、
(B)成分が、エチレンジアミン四酢酸、グルタミン酸二酢酸、メチルグリシン二酢酸、及びそれらの塩からなる群より選ばれる1種又は2種以上のキレート剤である、
バイオフィルム除去方法。 - 対象物が医療器具である請求項5〜7の何れか1項記載のバイオフィルム除去方法。
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