JP5875761B2 - コラーゲン線維ゲルおよびその用途 - Google Patents
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Description
コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。また、コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では38℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では20℃を下回る場合もある。
1)生体内コラーゲンが持つ線維構造を持っていない。
2)コーティング層がディッシュに密着しているため、細胞移植用の基材としての利用が難しい。
3)コーティング層が薄く緻密なため、水溶性物質を含浸させることが難しい。
[1]コラーゲン濃度が0.25%〜0.53%の範囲にあり、弾性率が60kPa〜120kPaの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
[2]pH6〜10のリン酸緩衝液、pH1〜5のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される方法で作製された前記1に記載のコラーゲン線維ゲル。
[3]コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が25℃を超えるものである前記2に記載のコラーゲン線維ゲル。
[4]前記1〜3のいずれかに記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
[5]前記4に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
[6]前記1〜3のいずれかに記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその型について特に限定されるものではないが、工業的な利用という観点から、収量の多いI型コラーゲンあるいはそれを主成分とするコラーゲンが好ましい。
架橋剤の濃度については、リン酸ナトリウム緩衝液中の濃度よりもむしろ、コラーゲン水溶液と混合した後の濃度(ゲル中の濃度)がゲル形成の成否やゲルの物性を左右する。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度は5〜80mMの範囲が好ましい。コラーゲン線維ゲル中の架橋剤濃度が5mM未満の場合、コラーゲン分子に架橋が導入されにくくなり、ゲルの弾性率が不足する場合があり好ましくない。一方、架橋剤濃度が80mMを超えると、コラーゲン水溶液とリン酸ナトリウム緩衝液混合後のゲル化速度が速過ぎて、成形性が悪化する場合があり好ましくない。より好ましくは10〜30mMの範囲である。
本発明のコラーゲン線維ゲルは実質的にコラーゲンのみから成るため、既に実用化されているコラーゲン製創傷被覆材などと同様に生体に接触させても安全に用いることができる。
1.コラーゲン線維の観察
以下の操作により、コラーゲン線維ゲル中のコラーゲン線維を観察した。コラーゲン線維ゲルを2.5%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間浸した後、20、50、75、および99(v/v)%エタノール水溶液に各30分ずつ順次浸し、コラーゲン線維ゲルを脱水した。これを酢酸イソペンチルに15分ずつ2回浸した後、二酸化炭素による臨界点乾燥を行なった。乾燥したコラーゲン線維ゲルにイオンコーターを用いてタングステンを蒸着し、走査型電子顕微鏡(SEM)用試料とした。SEM観察は日立製S−3200Nを用いて、倍率15,000倍で行なった。
以下の操作により、コラーゲンゲルのゲル強度を求めた。
細胞培養用6wellプレート(IWAKI製)に、厚み2〜3mmになるようにコラーゲン線維ゲルを作製した。強度試験機(TA.XTplus、英弘精機製)を用いて、ゲルに対して内径5mmの円柱プローブを速度0.5mm/秒で押し込み、得られた応力−ひずみ曲線の初期の直線領域の傾き(ひずみ0.06未満)から弾性率を求めた。測定は6個のゲルについて行なった。
wellの内径が22mmの12wellプレート(IWAKI製)に厚みが2〜3mmになるように作製したコラーゲン線維ゲルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で十分に洗浄し、ラット骨髄間質細胞(BMSC)を播種した。37℃、5%CO2条件下α−MEM(15%ウシ胎児血清含有)で2日間培養した後、アスコルビン酸、β−グリセロフォスフェイト、デキサメタゾンをα−MEM(10%ウシ胎児血清含有)に添加し骨分化誘導を行った(DEX+)。非分化誘導群にはデキサメタゾンを加えない以外は上記組成と同じ培地を使用した(DEX−)。細胞を播種しなかったゲル(Blank)は、α−MEM(10%ウシ胎児血清含有)を使用した。3日毎に培地交換を行い、10日間培養を行った。培養10日目のコラーゲン線維ゲルを回収し、内径を測定した。
1.テラピアの皮からの可溶性コラーゲンの製造
(1)コラーゲンの抽出
原料の魚皮として、鱗と身が除去され、天日で乾燥されたテラピア(日本名イズミダイ)の皮を用いた。クロロホルムとメタノールを等容積混合した溶液0.7Lに、魚皮100gを12時間浸漬して脱脂した。この操作を再度行った後、魚皮を70%エタノール0.7Lで5回繰り返し洗浄し、流水で6時間洗浄してエタノールを除去した。脱脂した魚皮を10℃の0.5M酢酸1.2Lに浸漬し、3日間静置した。膨潤した魚皮をナイロンメッシュでろ過し、ろ液を10,000×gで30分遠心して不溶物を沈殿させ、上清をメンブランフィルターでろ過し、ろ液1.0Lを回収した。
(2)コラーゲンの精製
上記コラーゲン溶液1.0Lに対し、終濃度0.7Mになるように塩化ナトリウムを加え、24時間撹拌した。塩析により生じた白い不溶物を10,000×gで30分遠心して沈殿を回収し、沈殿を0.5M酢酸1Lに加え、撹拌して溶解した。この操作を3回繰り返して、無色透明なコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を、セルロースチューブを用いて精製水とpH3希塩酸に対して透析し、濃度0.9%のコラーゲン水溶液を得た。得られたコラーゲンの変性温度は36℃であった。
210mMの塩化ナトリウムを含有したpH7、30mMリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、35mMのEDC水溶液を調製し、10℃に冷却した。このEDC水溶液5mLと、同じく10℃に冷却した0.8%のコラーゲン水溶液10mLを混合し、6wellおよび12wellプレート(IWAKI製)に、深さ2〜3mmになるように流し込み、室温で1時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを10℃の冷蔵庫に静置し、24時間以上経過したものを力学試験および細胞試験に用いた。
SEMにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造を図1に、弾性率を表1に示す。また、細胞培養10日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表1に、サイズを図2に示す。
250mMの塩化ナトリウムを含有したpH7、30mMリン酸ナトリウム緩衝液を溶媒として、40mMのEDC水溶液を調製し、10℃に冷却した。このEDC水溶液8mLと、同じく10℃に冷却した0.5%のコラーゲン水溶液13mLを混合し、6wellプレート(IWAKI製)に、深さ2〜3mmになるように流し込み、室温で1時間静置し、ゲル化を完了させた。ゲルを10℃の冷蔵庫に静置し、24時間以上経過したものを力学試験に用いた。
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるEDC水溶液の溶媒を120mMの塩化ナトリウムを含有したpH7、30mMリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、EDCの濃度を24mMに変更し、酸性コラーゲン水溶液とEDC水溶液の混合比を5/12(mL/mL)に変更した以外は、実施例1と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。SEMにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図1と同様であった。弾性率を表1に示す。細胞培養10日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表1に、サイズを図2に示す。
コラーゲン線維ゲルの作製に用いるEDC水溶液の溶媒を60mMの塩化ナトリウムを含有したpH7、30mMリン酸ナトリウム緩衝液に変更し、EDCの濃度を24mMに変更し、酸性コラーゲン水溶液とEDC水溶液の混合比を4/16(mL/mL)に変更した以外は、実施例1と同様の方法でコラーゲン線維ゲルを作製した。SEMにより観察したコラーゲン線維ゲルのコラーゲン線維構造は図1と同様であった。弾性率を表1に示す。細胞培養10日目におけるコラーゲン線維ゲルの収縮を表1に、サイズを図2に示す。
Claims (7)
- コラーゲン濃度が0.25%〜0.53%の範囲にあり、弾性率が60kPa〜120kPaの範囲にある、コラーゲン分子間が架橋されているコラーゲン線維ゲル。
- コラーゲンがテラピア皮由来である請求項1に記載のコラーゲン線維ゲル。
- pH6〜10のリン酸緩衝液、pH1〜5のコラーゲン水溶液および水溶性カルボジイミドを混合し、線維化途上に架橋が導入される工程を有する請求項1または2に記載のコラーゲン線維ゲルの製造方法。
- コラーゲンが魚皮由来であり、前記コラーゲン水溶液のコラーゲンの変性温度が25℃を超えるものである請求項3に記載のコラーゲン線維ゲルの製造方法。
- 請求項1または2に記載のコラーゲン繊維ゲルを含む細胞培養用の培地。
- 請求項5に記載の培地と細胞培養用容器とを含む細胞培養基材。
- 請求項1または2に記載のコラーゲン線維ゲルおよび前記ゲルに一体化してなる培養細胞とを有する動物移植材料。
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