JP5848306B2 - 新規変異体ハイポクレアジェコリーナcbh2セルラーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2004年5月29日に提出された米国仮出願 No.60/640,398、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Foreman et al.及び、2003年6月3日に提出された米国仮出願 No.60/475,826、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Foreman et al.に対し優先権を主張する。
この研究の一部は、米国エネルギー省との主契約番号DE−AC36−99GO10337の下、再生可能エネルギー研究所との下請け契約番号ZCO−30017−01により資金提供されたものである。従って、米国政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、セロビオヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、セロビオヒドラーゼ酵素変異体及び単離された核酸配に関する。また、本発明は、組換えCBH2変異体ポリペプチドを生成する方法のほかに、前記核酸配列を含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞にも関する。
1. Sheehan and Himmel Biotechnology Progress 15、pp817−827(1999)
2. Matti Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9−11(1993)
3. Tuula T.Teeri Trends in Biotechnology 15、pp160−167(1997)
4. T.T.Teeri et al. Spec. Publ.−R.Soc.Chem.、246(Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering)、pp302−308.(1999)
5. PDB reference 1QK2 (Cel6A = CBH2)J.−Y. Zou、G.J.Kleywegt、J−Stahlberg、H.Drigues、 W−Nerinckx、 M.Claeyssens、 A.Koivula、T.T.Teeri.、T.A Jones、 Structure(LONDON)、V.7p.1035(1999)
6. PDB reference 2BVW Structural changes of the active site tunnel of Humicola insolens cellobiohydrolase、Cel6A、upon oligosaccharide binding.、Varrot A、 Schulein M、 Davies GJ、Biochemistry 1999 Ju1 13;38(28):8884−91
7. PDB reference 1DYS Structure and function of Humicola insolens family 6 cellulases:structure of the endoglucanase、Cel6B、at 1.6 A resolution.、Davies GJ、Brzozowski AM、Dauter M、Varrot A、Schulein M、Biochem J 2000 May 15;348 Pt 1:201−7。
ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina (配列番号2))由来のCBH2におけるV94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426及び/又はA429の1つ以上にの残基に気相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体CBH2セルラーゼに関係する。第一の側面において、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina(配列番号2))由来のCBH2におけるV94E、P98L、G118P、M120L、M134G/L/V、T142V、L144G/R/S、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、S210L/R、I212V、T214M/Y、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323L/M/Y、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E及び/又はA429Tの1つ以上にの残基に気相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体CBH2セルラーゼに関係する。
(a)好適な条件下で、酸を含むベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養してCBH2変異体を生成する工程と、
(b)CBH2変異体を得る工程とを含むことを特徴とするCBH2変異体を生成する方法を含む。
本発明は、ここで以下の定義と実施例を用いることで、参照により詳細に説明されるであろう。明確に参照されているすべての配列を含むすべての特許と出版物は、参照によりここに含まれる。
本明細書において用いられる、「ポリペプチド」という語は、ペプチド結合による一本鎖アミノ酸残基による組成物を言う。「タンパク質」という語は、ここで用いられる「ポリペプチド」と同義ある。
「CBH2発現」という語は、cbh2遺伝子の転写及び翻訳をいう、この生産物はRMA前駆体、mRNA、ポリペプチド、翻訳後調節過程のポリペプチド及びトリコデルマコニンギ(Trichoderma koningii)、ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorin)(トリコデルマロンギブラキアタム(Trichoderma Longibrachiatum)(リコデルマレーシ(reesei))、又はトリコデルマビリデ(Trichoderma viride)、としても知られている)及び、ハイポクレアシュワイニッチ(Hypocrea schweinitzii)等の、関連種由来の新規タンパク質を有する生産物を言う。実施例で示す方法であるが、CBH2発現を測定する方法は、CBH2タンパクについてのウエスタンブロット、cbh2のmRNAに対してのノザンブロット測定、並びに、以下で説明されているリン酸膨張セルラーゼ及びPAHBAHアッセイ、(a)PASC:(Karlsson、J.et al.(2001)、Eur.J.Biochem、268、6498−6507、Wood、T.(1988)in Methods in Enzymology、Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose (Wood、W.&Kellog、S.Eds.)、 pp.19−25、Academic Press、San Diego、CA、USA)及び(b)PAHBAH:(Lever、M.(1972)Analytical Biochemistry、47、273、 Blakeney、A.B.&Mutton、L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture、31、889、Henry、R.J.(1984)Journal of the Institute of Brewing、90、37)を含む。
糸状菌はすべて真菌類及び卵菌類に再分類される。糸状菌は、菌糸の伸長と偏好気性である炭素代謝による栄養生長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁を持っている栄養菌糸によって特徴付けられている。
セルラーゼは、当該技術分野において、セルロース(ベータ−1,4グルカン又はベータD−グルコシド結合)を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロビオオリゴサッカライド及び同種のものを生産する酵素として知られている。上記のように、セルラーゼは伝統的に3つの主クラスに分類される:エンドグルカナーゼ(EC3−2−1−4)(“EG”)、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ(EC3−2−1−91)(“CBH”)及びベータグルコシダーゼ(EC3−2−1−21)(“BG”)(Knowles et al.、 TIBTECH 5、255−261、1987;Schulen、1988)である。
セルラーゼ組成物は、綿を含む布製品を分解し、最終的にこの布製品において強度が低くなることが示唆され(米国特許No.4,822,516)、セルラーゼ組成物を市販の洗剤成分に使用することをためらう原因となっている。エンドヌクレアーゼ成分から成っているセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼシステムから成っている組成物に比べて綿を含んだ布に対して低い強度損失を示すことが示唆されている。
1つの実施態様において、本発明は糸状菌の中で機能的するプロモーターのコントロール下で変異体のCBH2遺伝子の発現を提供するものである。これらについて本発明は、組み換え遺伝子の分野の定型技術を用いている。 本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、Sambrook et al.、 Molecular Cloning、A Laboratory Manual(2nd ed.1989);Kriegler、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)及びAusubel et al.、eds.、 Current Protocols in Molecular Biology(1994)がある。
野生型ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)CBH2の核酸配列を図1に示す。本発明は、1つの側面において、ここで述べるCBH2相同体をエンコードしている核酸分子を含む。この核酸はDNA分子である。
突然変異を導入することができる本技術分野で知られているどのような方法でも本発明に用いることができる。
A. 変異体cbh型核酸
野生型ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)cbh2の核酸配列を図1に示す。本発明はここで述べる変異体セルラーゼをエンコードする核酸分子を包含する。この核酸は、DNA分子である。
野生型ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)CBH2のアミノ酸配列を図1に示す。変異CBH2ポリペプチドは、ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)(配列番号2)由来CBH2のV94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426及び/又はA429残基の1以上の対応する部位の置換又は欠損を含む。
配列検索は通常、ジーンバンク(GenBank)DNA配列及び他の公的データベースの核酸配列に対する所与の核酸配列を評価する、BLASTNプログラムを用いて行う。BLASTXプログラムは、ジーンバンク(GenBank)タンパク質配列及び他の公的データベースのアミノ酸配列に対する全てのリーディングフレームにおける置換を有する核酸配列を検索するのに適している。BLASTN及びBLASTXは、11.0のオープンギャップペナルティー及び1.0のエクステンドギャップペナルティーの規定パラメーター及びBLOSUM−62マトリックス(Altschul et al.、1997)を用いて行われる。
必要とされるCBH2発現のための方法を特定することは意図しないけれども、変異体のCBH2を表現するためには本発明に係る方法においては使用細胞に依存する。
CBH2をエンコードする天然のまたは合成のポリヌクレオチド断片(「CBH2エンコード核酸配列」)は、糸状菌又は酵母菌細胞に導入することが可能で、複製することができる非相同核酸構成物又はベクターに組み込まれる。ここで開示しているこのベクターと方法は、CBH2を発現する宿主細胞に用いることに適している。それが、導入される細胞の中で複製され、育成できる限り、どのようなベクターでも使用することができる。数多くの適したベクター及びプロモーターは本技術分野において知られており、商業的に入手可能である。クローニング及び発現ベクターはSambrook et al.、1989、 Ausubel FM et al.、1989、及びStrathern et al.、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、1981において開示されており、それらは明示的に参照によってここに組み込まれる。細菌(糸状菌)に対する適切な発現ベクターは、van den Hondel、C.A.M.J.J.et al.(1991)In:Bennett、J. W.and Lasure、L.L.(eds.)More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press、 pp.396−428に記載されている。適切なDNAシーケンスは、さまざまな処置によって、プラスミドまたはベクター(「ベクター」としてここに集合的に参照される)に挿入される。一般的に、DNAシーケンスは標準的な操作法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような処置と関連したサブクローニング処置は、当業者の知識の範囲の中にあると考えられる。
(i)糸状菌
本発明は、結果的に対応する形質変換されていない親真菌との関連において、CBH2変異体の生産又は発現に効果的な方法で変換され、選択され、培養される細胞からなる糸状菌を提供する。
本発明はまたCBH2生産のために、宿主細胞として酵母を使用する場合もある。 加水分解酵素をエンコードしているいくつかの他の遺伝子は、酵母菌S.cerevisiaeの様々な系統の中で発現されている。これらは、Trichoderma reesei(Cummings and Fowler、 Curr.Genet.29:227−233、1996)由来の2つのエンドゴルカナーゼ(Penttila et al.、Yeast vol.3、pp 175−185、1987)、2のセロビオハイドラーゼ(Penttila et al.、 Gene、63:103−112、1988)及び1のベータ−グルコシダーゼ、Aureobasidlium pullulans(Li and Ljungdahl、Appl.Environ.Microbiol. 62、No.1、pp.209−213、1996)由来の1のキシラナーゼ小麦(Rothstein et al.、Gene 55:353−356、1987)由来の1のアルファ−アミラーゼ等をエンコードしている配列を含んでいる。さらに、ブチリビブリオ-フィブリソルベンスエンドー[ベータ]−1、4グルカナーゼ(END1)、Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase(CBH1)、Ruminococcus flavefaciens cellodextrinase(CEL1)、およびEndomyces fibrilizercellobiase(Bgl1)をエンコードしているセルラーゼ遺伝子カセットはS.cerevisiaeの実験室株の中での発現には成功している。(Van Rensburg et al.、Yeast、vol.14、pp.67−76、1998)
C.宿主細胞へのCBH2エンコーディング核酸配列の導入
本発明は、さらに外部発生的に提供される変異体CBH2エンコーディング核酸シーケンスから成る、遺伝的に変性させられた細胞と細胞組成を提供する。親細胞または細胞系は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み替え(すなわち、形質導入、形質変換、又は移入)が行われた。ベクターは、上で開示したように、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどという形であるかもしれない。
変異体CBH2エンコーディング核酸構成物によって変換している細胞系による変異体CBH2の表現を評価するための検定が、タンパク質レベル、RNAレベルで、またはセロビオハイドラーゼの活性、および/または生産に対する機能的な生物検定を利用することにより行うことができる。
細胞培養中に生産された変異体CBH2タンパク質は培地の中に分泌され、そして精製され、又は単離される。しかし、場合によっては、変異体のCBH2タンパク質は細胞溶解産物から回復することが必要となる細胞の品種によって生み出される場合もある。かかる場合にには、変異体CBH2タンパク質は、当業者によって通常用いられている技術を利用して、かかる細胞から精製される。例えば、アフィニティークロマトグラフィー (Tilbeurgh et al.、FEBS Lett.16:215、1984)、高い分解パワーを有する原料を使ったイオン交換をも含めた、イオン交換クロマトグラフ法(Goyal et al.、 Bioresource Technol.36:37−50、1991;Fliess et al.、Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17:314−318、1983;Bhikhabhai et al.、J.Appl.Biochem.6:336−345、1984;Ellouz et al.、J.Chromatography 396: 307−317、1987)、(Medve et al.、J.Chromatography A 808:153−165、1998)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz、J.Chromatography A 865:123−128、1999)、及び二相仕切り(two−phase partitioning)(Brumbauer、et al.、Bioseparation 7:287−295、1999)などかあるが、これらに限定されるものではない。
変異体cbh核酸、変異体CBH2タンパク質、および変異体CBH2タンパク質活性から成る組成物の広範囲にわたる用途を発見することは高く評価される。(このような用途のいくつかについて以下に説明する。)
新規で改良された、さまざまな量のBGタイプ、EGタイプ及び変異体CBHタイプのセルラーゼから成るセルラーゼ組成物は、柔軟剤として作用し、および/または、綿織物の感触を高める(例えば、「ストーンウォッシュ」又は「バイオポリッシュ」)ことができる高い洗浄能力有する洗浄剤組成物や、木材パルプを糖へ分解する組成物(例えば、バイオエタノールの生産)や、及び/又は食品組成物へ適用する用途がある。各タイプのセルラーゼの単離及びその特徴によって、係る組成物の特徴をコントロールすることができる。
本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物(セロビオハイドラーゼ内容物とは関係なく、すなわち、セロビオハイドラーゼ無添加、セロビオハイドラーゼが実質的に無添加、セロビオハイドラーゼを多く含むものがある。)のほかに、陰イオン性、非イオン性、および両性の界面活性物質を含む界面活性物質、加水分解酵素、造形剤、漂白剤、青味剤、および蛍光色素、固化抑制剤、可溶化剤、陽イオン界面活性剤、およびそれに類したものが含まれる。これらの全ての成分は、洗剤の分野においてよく知られている。上記のセルラーゼ組成物は、液体の希釈液の中、顆粒の中、エマルジョンの中、ゲルの中、ペーストの中のいずれかまたは同種のものの洗浄剤組成物中に添加することができる。係る製品は当業者によく知られている。固形洗浄剤組成物が使用される時、セルラーゼ組成物は顆粒として製剤化することが好ましい。また好ましくは、この顆粒は、セルラーゼ保護因子を含むように製剤化することができる。更に理解を深めるために、ここに参照により取り込まれている、題名“Detergent compositions containing cellulase compositions deficient inCBH2 type components”U.S.Patent Number 6、162、782を参照のこと。
既知のCel6Aセルラーゼのアラインメント
いくつかの変異体は、構造の情報及び調節機構を用いて、8のファミリーメンバーに対するハイポクレアジェコリーナCel6Aの一次配列(first aligning)により41のファミリーメンバーから選択された。図3はフミコーラインソランス(Humicola insolens)(QClS9)、アクレモニウムセルロイティカス(Acremonium cellulotyticus)(O93837)、アグリカスビスポラス(Agahcus bisporvs)(P49075)、ハイポクレアコニンギ(Hypocrea koningii)(AF315681)、ファネロキエートクリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)(S76141)、タラロマイセスエメルソニ(Talaromyces emersonii)(Q8N1 B5)、レンチヌラエドダス(Lentinula edodes)(AF244369)、ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina)(P0798742)由来のCBH2分子のアラインメントを示す。アラインメントは、ギャップペナルティーが10に設定されているベクター(Vector)NITスーツ(Suite)ソフトウェアープログラムを用いたクラスタル(Clustal)Wにより行った。
cbh2構築体の調製
図2において示されたCBH2のcDNA配列を遺伝子増幅のテンプレートとした。この配列は変異導入のためのテンプレートとしても用いた。
ATGATTGTCGGCATTCTCAC(このプライマーは5’末端にハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina )CBH2のシグナル配列をコードする)(配列番号3)
attB2を除くFRG362の配列は、
TTACAGGAACGATGGGTTTGCG(このプライマーは3’末端にハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)CBH2の触媒部位をコードする)(配列番号4)
ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)cbh2 cDNAをテンプレートとして提供した。用いたこのcDNAは、Pamela K. Foreman et al、 Journal of Biological Chemistry Vol 278 No.342003 page 31989の開示に基づき調製したcDNAライブラリー由来である。このライブラリーは表1に示すプライマーを用いて、CBH2触媒ドメインプローブをスクリーニングした。
コンビネーションライブラリー
SDMスクリーニングの間に同定された一部位変異体の結果:98、134、206、212、312、316、411及び413、に基づいて、2つのクイックチェンジライブラリー(QC2C及びQC2D)を構築した。
領域変異誘発
上述のように、SDMスクリーニングの間に同定された一部位変異体の結果に基づいて、ランダムに変異されているCBH2の3D構造を同定し、熱安定性をスクリーニングした。空間領域を構成するアミノ酸(群)は、[210、214]、[253、255、257、258]、[411、413、415]、[412、414、416]、[312、313]、323、[212、149、152]、[134、144]及び98である。
多重変異体
一部位変異誘発の発現及び熱安定性の結果に基づき、振とうフラスコの中でのみ生成する多重変異体のセットを設計した。
CBH2及びその変体の発現及び振とうフラスコ育成からの単離
熱変性試験の(実施例9)におけるTm測定のための試料を提供するために、発現クローンを振とうフラスコ内で育成し、以下のようにCBH2分子を精製した。
熱失活によるCBH2変異体の熱安定性
不可逆的な熱失活に対する安定性が変更されたCBH2分子と野生型CBH2との比較は、ストリンジェント条件下での各種温度のインキュベーション前後における、無細胞上清と等量のPASC活性の測定により同定した。用いたストリンジェント条件は、0.1mM酢酸ナトリウム、pH4.85で1:1希釈剤した上清を、(示されたように)61℃又は65℃のいずれかの温度で、1時間インキュベートし、10分間氷上に置くという条件である。残留活性%(評価条件でインキュベートした後の残りの活性の%)は初期活性(ストリンジェント条件に曝す前のPASCに対するCBH2活性)を残留活性で除して算出した。
以下の溶液/培地をCBH2変異体の不可逆的な熱失活に対する安定性の決定に用いた。
ii.このビーカーを氷上に置く.
iii.150mlの氷上冷却した85%オルト−リン酸(Art.1000573 メルク)を添加し、約1時間、ウルトラツラックス(ultra turrax)をもちいてシブキを生じないように高速で撹拌する.
iv.100mlの氷上冷却したアセトンを添加し、非常に濃厚なスラリーに対してはセルロースアモルファスの沈殿を緩やかに生ずるので、必要に応じてスパチュラーでよく混合する.
v.この非常に濃厚なスラリーを1リットルまでの水で希釈し、6×250mlのソーバル(Sorvall)コンテナへ移すのに十分な液体を調製する.
vi.10kで15分間、遠沈し、上清を廃棄する.
vii.ペレットとビーカーに入るだけの水とを混合し、再度遠沈する.
viii.工程v及びviを少なくとも3回繰り返し、pHが4.0−5.0にする.
ix.リン酸をよく洗浄するために、4NのNaOHを一滴水に添加する.
x.ペレットを300mlまでの水と混合し、ホモジナイズする.
xi.このスラリーの濃度を乾燥重量で測定する.
このスラリーを121℃で20分間滅菌し、冷却後冷蔵庫で保管する。
4.セロビオースストック溶液は、セロビオースをMQ水に、0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.7、及び1mg/mlの濃度で調製する.
B.サンプル調製
1.1エウェルあたり、200μl最小培地+マルトース(上記)を含む96Wフィルター処理されたMTP’s(ミリポア #MAGVS2210)中のA.niger変異体を80−90%の湿度のオービタルシェーカーにおいて7日間33℃で育成する.
2.育成インキュベートの後、この培養物をバキューム連結管を用いて、フィルターろ過し、ろ過液(上清)を新たな96WフラットMTP’s(グレイナー、#655101)の中に収集し、4℃で保管する。
1.1ウェルあたり60μlの上清を60μlの100mMのNaAc、pH4.85で希釈する(1:1希釈)。(残りの上清について、残っている糖を調べる場合には、190μlの100mMNaAc、pH4.8を1ウェルあたり10μlの上清に添加し、この希釈された上清の溶液20μlに、150μlのPAHBAH試薬を添加してPAHBAH残留糖アッセイを行う(Eを参照のこと).
2.20μlの希釈上清を新たなフラット96WMTPに移し、4℃で保存する(残留活性に供するため).
3.残りの希釈上清(約100μl)を1時間61℃(又は65℃)で(残留活性のために)インキュベートする.
4.氷上で10分間冷却する。
1.新しいフラットTMP’s中に、180μl/ウェルの良く撹拌された50mM NaAc、pH4.85中0.5%PASC溶液を調製する.
2a.残留活性を測定するための1つのプレートに、PASC−MTP’sに予備インキュベートされた調製済みの希釈上清を1ウェルあたり20μl移す(上下に混合する).
2b.初期活性を測定するための第二のプレートに、1ウェルあたり180μlのPASC溶液を保存されていた20μlの未処理希釈剤上清に添加し、上下に混合する.
3.上清―PASCMTP’sを密閉し、900rpmで撹拌しながら50℃で2時間インキュベートする.
4.氷上で10分間冷却する.
5.上清-PASC混合液を新たなフィルターMTPに移し、バキューム連結管においてろ過し、ろ過液を収集する。
1.新しい96WフラットMTPに1ウェルあたり150μlのPAHBAH試薬を入れる.2.20μlの上清―PASC溶液のフィルターろ過液をPAHBAHに添加する(上下に混合する).
3.第一のMTP;20μlのセロビオースストック溶液の1列をキャリブレーションラインの中に置く(A4参照).
4.69℃、1時間、900rpmでインキュベートし、室温で冷却し、2000rpm、2分間で遠沈する.
5.スペクトラマックス(SpectraMaxs)スペクトロフォトメーター(スペクトラ、サニーバリュー、カリフォルニア、米国)のMTPリーダーでOD410のエンドポイントを直接測定する。
1.セロビオースの希釈ウェルの読み取り値から、OD410に対するセロビオース濃度(mg/ml)のキャリブレーションラインをプロットする.
2.キャリブレーションカーブ及びサンプルウェルの読み取り値を用いて、各サンプルの初期及び残留活性セロビオース濃度(mg/ml)を計算する.
3.残留活性%を計算する。
表15及び16に示した2つの結果は、実施例4において生成された変異体を異なる温度においてインキュベーションし、残留活性を測定した結果である。
Tm測定によりCBH2変異体の熱安定性
CBH2セルラーゼ変異体を実施例7に従って、クローン化し、発現させ、及び精製した。熱変性データは、MIcrocal(ミクロカル)(ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国)のVP−DSCミクロカロリーメータにより収集した。緩衝液条件は図のように、50mMビストリスプロパン/50mM酢酸アンモニウム/氷酢酸、pH5.5又は5.0であった。タンパク質濃度は約0.25mgs/mlであった。90(cal/℃)のスキャン速度において、25乃至80℃の3つの熱スキャンを行った。第一スキャンはCBH2の熱変性を示し、熱変性の中点を決定するために用いた。Tm:用いたソフトウェアーは温度(℃)カーブに対するCp(cal/℃)を作成する。この曲線に従ってTmを決定する。第二及び第三スキャンにおける熱変性の欠失により示されるように、熱変性は全てのケースで不可逆的であった。
CBH2変異体のPASC特異活性
この実施例は、A.nigerでクローン化された野生型配ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)CBH2と比較したCBH2変異体のリン酸膨張セルラーゼにおける特異性能を試験する。
PASCはWalseth(1971)Tappi 35:228(1971)及びWood Biochem J.121:353(1971)に記載の方法に従って、アビセルから調製した。この物質を緩衝液及び水で希釈し、酢酸ナトリウムの最終濃度が50mM、pH5.0になるように、1%w/vまで希釈した。
CBH2変異体のPCS特異活性
この試験は、CBH2変異体の前処理されたコーンストーバーにおける活性を、A.niger内でクローン化された野生型ハイポクレアジェコリーナ(H.jecorina)と比較する。
コーンストーバーをSchell、D.et al.、J.Appl.Biochem. Biotechnol.105:69−86(2003)に記載のように、2%w/wのH2SO4で前処理し、その後、脱イオン水で複数回洗浄し、pH4.5のペーストを得る。酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)最終濃度50mMの酢酸ナトリウムになるように添加し、必要に応じて、この混合物を、1N NaOHを用いてpH5.0に滴定する。反応混合物中のセルロース濃度は約7%である。CBH2の特異性は53℃、700rpm、20時間でPSCとインキュベーションすることにより試験した。0.75、1.5及び2.5mg/gセルロースの異なる3つの濃度のCBH2(PCS中)を、8.5mgCBH2欠失セルラーゼ株ブロス/gセルロースに添加した(ハイポクレアジェコリーナ(トリコデルマレーシとも言う)におけるCBH2の欠失の議論のため。米国特許No.5、861、271及び5、650、322参照のこと。結果を図10に示す。CBH2を後で加えないCBH2欠失株(ベースライン活性を示す。CBH2変異体は、PCSの再構成された全セルラーゼにおいて、野生型CBH2と同様の活性を有していた。このことは、欠失株に戻し添加された野生型株は欠失株以上の活性を有することを示す。変異体は同様の条件において同様の活性を有していた。
各種温度におけるCBH2変異体の特異活性
この実施例は各種温度において各酵素(安定化変異体及び野生型)が活性をどれくらい長く保持しているかを試験する。
他のセルラーゼとのCBH2特異活性
この実施例は、CBH2変異体(安定化された)を他のセルラーゼと組み合わせてバイオマス転換への使用を行った。
Claims (12)
- 変異体CBH2セルラーゼであって、前記変異体が、ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina)由来(配列番号2)のCBH2におけるS413Yの置換を含むことを特徴とする、変異体CBH2セルラーゼ。
- 変異体CBH2セルラーゼであって、前記変異体CBH2がハイポクレアジェコリーナ(配列番号2)由来のCBH2における
v.M134V/V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Y;
vi.P98L/M134L/L144R/S210L/T214Y/S316P/V323Y/S413Y;
vii.P98L/M134L/L144R/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y;
viii.P98L/M134L/L144R/S316P/S413Y;
ix.P98L/M134L/L144R/S316P/V323Y/S413Y;
x.P98L/M134L/L144R/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Y;
xi.P98L/M134L/L144R/V206L/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y;
xii.P98L/M134V/I212V/S316P/S413Y;
xiii.P98L/M134V/I212V/T312S/S316P/S413Y;
xv.P98L/M134V/S316P/S413Y;
xvi.P98L/M134V/S316P/V323Y/S413Y;
xvii.P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/F411Y/S413Y;
xviii.P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/S413Y;
xix.P98L/M134V/T154A/I212V/T312S/S316P/S413Y;
xxi.P98L/M134V/T154A/V206L/I212V/S316P/F411Y/S413Y;
xxv.P98L/M134V/V206L/I212V/T312S/S316P/S413Y;
xxvi.P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Y;
xxvii.P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y;
xxviii.P98L/M134V/V206L/S316P/S413Y;
xxx.P98L/V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Y;
xxxi.S316P/S413Y;
xxxvi.V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Y;および
xxxvii.V206L/I212V/T312S/S316P/S413Y;から成る群より選択される変異を必ず含むことを特徴とする、変異体CBH2セルラーゼ。 - 請求項1または2に記載の変異体CBH2セルラーゼをコードする核酸。
- 請求項3の変異体CBH2セルラーゼをコードする核酸を含むベクター。
- 請求項4のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
- 変異体CBH2セルラーゼを生成する方法であって、
(a)好適な条件下で、請求項5の宿主細胞を培養して変異体CBH2セルラーゼを生成する工程と、
(b)変異体CBH2セルラーゼを得る工程とを含むことを特徴とする方法。 - 界面活性剤及び請求項1または2に記載の変異体CBH2セルラーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。
- 洗濯用洗剤であることを特徴とする、請求項7に記載の洗剤組成物。
- 食器用洗剤であることを特徴とする、請求項7に記載の洗剤組成物。
- 請求項1または2に記載の変異体CBH2セルラーゼを含む食品添加物。
- 請求項1または2に記載の変異体CBH2セルラーゼにウッドパルプを接触させる工程を含むことを特徴とするウッドパルプを処理する方法。
- バイオマスを請求項1または2に記載の変異体CBH2セルラーゼに接触させる工程を含むことを特徴とするバイオマスを転化する方法。
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