JP5826772B2 - コンジュゲートタンパク質 - Google Patents
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Description
タンパク質
本発明の範囲内のタンパク質およびペプチドは、治療的処置に適するタンパク質/ペプチドであることが好ましい。このようなタンパク質には、血清タンパク質、例えば、血液凝固因子、ヘモグロビン、免疫グロブリン、抗体、Fab断片など、抗体の抗原結合断片、インターロイキン、アルファ-インターフェロン、ベータ-インターフェロン、ガンマ-インターフェロン、例えば、DR3、TNF1R、TNF2R、CD27、およびCD30など、TNF受容体ファミリーのメンバー、顆粒球コロニー刺激因子を含めたコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、およびホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)などのサイトカインが含まれるがこれらに限定されない。他のタンパク質には、インスリン、GLP-1、GLP-2、レクチンおよびリシンなどの植物タンパク質、腫瘍壊死因子および類縁の対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体およびインターロイキン受容体の可溶性形態、ヒト増殖ホルモン、TGFaまたはTGFpなどの組織増殖因子、上皮増殖因子などの増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素細胞刺激ホルモン(pigmentary hormone)、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベーターなどが含まれる。対象の免疫グロブリンには、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、およびこれらの断片が含まれる。
ANAFLγγLRPGSLγRγCKγγQCSFγγARγIFKDAγRTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP
γ:ガンマ-カルボキシル化Glu(「E」)残基を表わす。
阻害剤の混合物によりプロトロンビンおよびFXを処理して、微量の活性酵素を中和する。FV(135nMの最終濃度)、プロトロンビン(1.2uM)、TF経路阻害剤(0.1ug/ml)、および抗トロンビン抗体(AT、2.5uM)を、CaCl2(3mM)と混合し、4℃で一晩にわたり保存する。健常ボランティア被験者に由来する末梢血を、クエン酸中に入れる。M. Kjalke、Thromb. Heamostasis 78、1202〜1208頁、1997において説明される通りに、密度勾配遠心分離およびゲル濾過により血小板を単離し、37℃で15分間にわたり、50ug/mlのトロンビン受容体アゴニストペプチド(SFLLRN)と共にインキュベーションすることにより活性化する。血小板懸濁液のアリコートをTruCount試験管(Becton Dickinson)へと移し、製造元により説明される通り、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson)上で、蛍光ビーズを基準物質として用いることにより、血小板密度を決定する。約100,000個/ulの最終血小板密度を用いる。因子V(7ug/mlの最終濃度)を、タンパク質/Ca2+混合物に添加する。次いで、FVIIaコンジュゲート(50nM)を添加した後、血小板を添加して、200ulの最終容量を得る。150mMのNaCl、1mg/mlのBSA、1mMのEDTA、および50uMのPefabloc Xa(Pentapharm、Basel)を含有する、pH7.4の20mM Hepes中に0.5mMのChromozym TH(Roche Molecular Biochemicals)90ulに、10ulずつのアリコートを、時間間隔を置いて移す。20分後に、50%の酢酸100ulを添加することにより、基質の加水分解を停止させ、405nmにおける吸光度を測定する。トロンビン検量線から、トロンビン濃度を計算する。FVIIa活性を特徴づけるためのさらなるアッセイは、WO07031559;またはPerson、PNAS 98(24)、13583〜13588頁、2001;および本明細書で引用される参考文献において見出すことができる。
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
YNSGKLγγFVQGNLγRγCMγγKCSFγγARγVFγNTγRTTγFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
(A-W-B1-B2)z-アシアロタンパク質 (I)
[式中、
アシアロタンパク質は、末端のシアル酸が、グリカンから除去されているタンパク質を表わし、zは、値が1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の整数である。
B2は、構造
R1、R1'、R2、R3、R4、R5、およびR6は、B2をB1または水素と連結する結合であり、*は、アシアロ凝血因子への連結を指す。したがって、*で終わる結合は、結合だけ、すなわち、開かれた結合を表わす]
を伴うグリシル-シアル酸を表わす。
B1は、リンカーを表わす。
Wは、AとB1とを連結する化学基であり、
Aは、アルブミン結合疎水性側鎖基;ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグを表わす。
好ましい実施形態では、Aが、アルキレン鎖*-(CH2)n-*[式中、n=8〜26であり、場合によって、アリール置換基、およびカルボン酸、スルホン酸、スルフェン酸、スルフィン酸、ホスホン酸、またはホスフィン酸、アシルスルホンアミド、テトラゾール、ヒドロキシオキサゾールなどのカルボン酸等価体など、負に帯電した基に連結される]などの疎水性基を含む。
さらなる実施形態では、Aが、構造
R7は、水素、-COOH、テトラゾリル、または-C(=O)-NHS(=O)2-R7a、
nは、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、および25から選択され、R7aは、C1〜6アルキル、フェニル、またはC1〜6アルキルフェニルから選択され、*は、基Aの残りの部分に対する結合を示す。さらなる実施形態では、R7が、-COOHである。別の実施形態では、nが、14、16、および18から選択される。さらなる実施形態では、R7が、-COOHであり、nが、14、16、および18から選択される]
を有する]
を有する。
[式中、*は、Wを介するB1への結合を示し、したがって、*で終わる結合は、結合だけ、すなわち、開かれた結合を表わす]
から選択される。
であり、場合によって、窒素原子を介してB1の構造的要素を相互連結するか、またはB2のアミンに連結される。
から選択される。
から選択される。特定の実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、タンパク質のN-グリカンに結合させる。別の実施形態では、側鎖を、O-グリカンに結合させる。別の実施形態では、側鎖を、FVIIIのO-グリカンに結合させることに加えて、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIIのN-グリカンに結合させる。さらなる実施形態では、40kDaのPEGを、FVIIIのO-グリカンに結合させることに加えて、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIIのN-グリカンに結合させる。さらなる実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIaのN-グリカンのうちの1または2以上に結合させる一方で、別のグリカンをPEGで修飾する。別の実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FIXのN-グリカンのうちの1または2に結合させる一方で、別のグリカンまたは同じ(分枝した)グリカンをPEGで修飾する。
基をタンパク質へと連結する化学的方法は、部位選択的なものもあるが、非選択的となる傾向にある。しかし、大半の方法で一般的なのは、洗浄剤または有機溶媒など、有害な添加剤を添加しない限り、水性緩衝液中では、疎水性基を含有する試薬を用いることができないという事実である。水性環境におけるそれらの不溶性のために、疎水性基をタンパク質に連結することは元来困難である一方で、タンパク質が可溶性であるのは、水性環境内に限られる。
CV=カラム容量
FLD=蛍光検出
MQ=MilliQ水(高純度精製水)
m/z=質量対電荷比
MS=質量分析
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
RP=逆相
LC-MS=液体クロマトグラフィー-質量分析
NMR=核磁気共鳴分光法
rtまたはRT=室温
Boc=tertブチルオキシカルボニル
O-f-Bu=tertブチルエステル
f-Bu=tertブチル
CMP=シチジン一リン酸
DCM=ジクロロメタン、CH2Cl2、塩化メチレン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(ジフェニル-p-トリル-メチル)アミノ]-2-アミノ-ヘキサン酸
Thx=trans-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
GSC=グリシルシアル酸CMPエステル
MBP=マンノース結合タンパク質
NAN=N-アセチルノイラミン酸
NMP=N-メチルピロリジン-2-オン
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
TIPS=トリイソプロピルシラン
UM=4-メチルウンベリフェリル
Lac=ラクトシルまたはラクトース
HC=重鎖
LC=軽鎖
SC=単鎖(HCとLCとが、共有結合により連結されている)
PSC=ポリエチレングリコールシアル酸CMPエステル
wt=野生型
アミノ酸の略号は、IUPACの慣用法に従う。
緩衝液の略号は、Stoll, V. S.およびBlanchard, J. S.、「Methods of Enzymology」、182、1990、Academic Press、24〜38頁に従う。
全体的手順
HPLC
Agilent ZorbaxシリカカラムまたはVydac C18シリカカラム(典型的には、4.6mm×50mm、5μm、300Å)を用いるAgilent 1100システムにおいて、RP-HPLC解析を実施した。検出は、214nmおよび280nmにおけるUVにより行った。標準的な水/0.1%TFAの(A)緩衝液およびアセトニトリル/TFAの(B)緩衝液による適切な勾配を用いて、溶出を実施した。
2つのPerkin Elmer Series 200 Microポンプ、Perkin Elmer Series 200オートサンプラー、Applied Biosystems 785A UV検出器を装備した、PE-Sciex API 150質量分析器において、LC-MS解析を実施した。HPLCシステムの場合と同じ緩衝液を用いて、室温、1.5ml/分、3.0mm×50mmで5μmのWaters Xterra C18シリカカラムを溶出させた。5%のB緩衝液でカラムを平衡化し、5%のB緩衝液で1.0分間にわたり、次いで、7分間で5〜90%にわたるB緩衝液の直線勾配で溶出させた。検出は、214nmにおけるUV検出、および全イオン流により行った。カラム溶出物の画分を、PE-Sciex API 100質量分析器のイオンスプレーインターフェースへと導入した。試行中2秒ごとに、100〜800amuの質量範囲を走査した。
Akta Explorerクロマトグラフィーシステム、およびGE Health Care製のカラムにおいて、タンパク質のクロマトグラフィーを実施した。
NuPAGE 7%トリスアセテートゲル(Invitrogen)を用いて、SDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を実施した。ゲルは、クーマシー染色(Invitrogen;LC6065)または銀染色(SilverQuest染色キット;Invitrogen)し、必要な場合はまた、M. M. Kurfurst、Anal.Biochem. 200(2):244〜248頁、1992により説明される通りに、ヨウ化バリウムでPEGについて染色した。
減衰係数を14.6(1%)とするUV測定(280nmの吸光度)により、FVIIIおよびFVIIIコンジュゲートの濃度を決定した。代替的に、必要な場合は、HPLC法も用いた。粒子サイズを5mm、流速を200mL/分とする、Grace Vydac(Mikrolab、Aarhus、Denmark)214TP5215 C4カラム(2.1×150mm)を40℃で用いるAgilent 1100システムにおいて、解析を実施した。溶媒は、Milli-Q水中に0.07%のトリフルオロ酢酸(TFA)(溶媒A)、およびアセトニトリル中に0.1%のTFA(溶媒B)であった。60分間で40%〜55%にわたる溶媒Bの直線勾配により、因子VIIIタンパク質を溶出させた。個々の試料のタンパク質濃度は、HPLCクロマトグラムにおける面積を積分し、因子VIIIの基準物質と比較することにより決定した。基準物質における因子VIII濃度は、110℃の6N HCl中で24時間にわたる加水分解後におけるアミノ酸解析により決定した。本質的に、製造元(Agilent Technologies, note 5968-5658E)により説明される通りに、蛍光標識を用いて、HP1100 HPLCにおいて試料を解析した。
GSC(グリシルシアル酸シトシン5'-一リン酸エステル)は、解析的HPLC(Zorbax C18 4.6×50mm;A:10mMの重炭酸アンモニウム水溶液;B:90%のアセトニトリル+10%のA;流速:1ml/分;勾配:16分間で0〜100%にわたるB;40℃のオーブン温度;UV(214nm、280nm)検出;GSC:反応時間=0.5分間)により、純度74%で、Albany Molecular Research Inc.から購入した。
組換えBドメイン欠失型(truncated)O-グリコシル化因子VIIIの生成
細胞系および培養工程
因子VIIIのcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、Bドメイン欠失因子VIII、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1〜740を含む因子VIII重鎖、および全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1649〜2332を含む因子VIII軽鎖(本明細書では、この分子を「N8」と称する場合がある;Thimら、Haemophilia(2010)、16、349頁を参照されたい)をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸741〜750および1638〜1648による配列を含む21アミノ酸のリンカー(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR:配列番号4)により連結した。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、このプラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。
細胞培養培地から、Bドメイン欠失因子VIII(Y1680F)を単離するために、Capto MMCカラムにおける濃縮ステップ、ELISA(immunoabsorbent)およびクロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、ならびに最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を使用した:11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、0.02%のTween 80、pH=7.5中で平衡化したCapto MMC(GE Healthcare、Sweden)によるカラム(1.6×12cm)へと、流速15ml/分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、1.5MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、2.5MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH=7.5により、流速1ml/分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、因子VIII活性についてアッセイした(比色アッセイ)。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。
C16脂肪族二塩基酸γ-Glu NHSエステルをGSCへと連結して、シアリルトランスフェラーゼの基質1を得る
アルブミン結合剤であるNHSエステル2の調製
1. Fmoc-Lys(Mtt)-OH:6ml中に1.12g
2. Fmoc-OEG-OH:12ml中に1.39g(2つの連結)
3. Fmoc-Glu-OtBu:6ml中に0.77g
4. Fmoc-Thx-OH:6ml中に0.68g
5. C16二酸モノt-ブチルエステル(WO2005/012347A2の実施例4を参照されたい):6ml中に0.62g
NHSエステルをGSCへと連結して、基質3を得る
基質1の蛍光標識ラクトースへの連結
緩衝液:HEPES 100mM、pH 7.5
酵素:CalBiochem製(型番566218)のラット組換えα2,3-(N)-シアリルトランスフェラーゼ。該酵素を、緩衝液中で希釈し、10kDaのMillipore Biomax限外濾過デバイスにより約10倍に濃縮した:100μlを2台のデバイスの各々に分注し、室温、12.000Gで2+6分間にわたり遠心分離した。最終容量を、約8〜10μlずつ(各デバイス)とし、濃度を、1700mU/mlとした。反応には、12.5mU、7.5μlを用いた。
アクセプター:Lac-UM。トリス50mM、pH7.4+1mM CaCl2中に0.5mg/ml(1mM)の溶液。各反応では、容量2.5μl(2.5ナノモル)を用いた。
ドナーである基質1:各反応では、12.5ナノモル、3μlを用いた。
対照ドナー:CMP-NAN 1.4mg、すなわち、4.1mMのHEPES 540μl、pH 7.5中に2.2マイクロモル。各反応では、12.5ナノモル、すなわち、3μlを用いた。
C18脂肪族二塩基酸γGlu-OEG-OEG NHSエステルをGSCに連結して、シアリルトランスフェラーゼ基質4を得る
基質3の蛍光標識ラクトースへの連結
酵素:ラットMBP-ST3Gal-III、1.06U/mg;0.9mg/ml(0.954mU/μl)。各反応では、2.6μl(2.5mU)を用いた(この酵素については、US7220555B2を参照されたい)。
ドナーである基質3:イミダゾール緩衝液中に2.5μg/μl;各反応では、10μl(13.4ナノモル)を用いた。
対照ドナー:4.1mM HEPES緩衝液中に1.4mgのCMP-NAN
反応1:アクセプター(2.5μl)+ドナー(10μl)+酵素(2.6μl)
反応2:アクセプター(2.5μl)+対照ドナー(4μl)+酵素(2.6μl)
反応3:アクセプター(2.5μl)+ドナー(10μl)(酵素なし)
反応1:2時間後にほぼ完全に生成物へと転換した。
反応2:1時間後にほぼ完全に生成物へと転換した。
反応3:反応は生じなかった。
生成物は、LCMSにより同定した。
ST3Gal-IIIを用いて、基質1を、野生型Bドメイン欠失FVIIIのN-グリカン(「N8」)へと連結する
野生型Bドメイン欠失FVIII:150μlの緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、500mMのNaCl、1Mのグリセロール、pH7.3)中に0.3mg
シアリダーゼ/ノイラミニダーゼ:アガロース上に60μl(約72mU)(Sigma製のVI-A型ウェルシュ菌(C. perfringens)N-5254株;ゲル1ml当たり0.6〜1.8U)(懸濁液)
基質1:4μl、4.1mM;10mM NH4HC03中に16ナノモル
ST3Gal-III:300μl(0.9mg/ml)。実施例7で用いたのと同じバッチ。
100μlのFVIII緩衝液により、1μlの試料を希釈した。各試料から25μlずつを2連で採取し、トロンビンによる前処理を伴う解析、またはトロンビンによる前処理を伴わない解析にかけた。
SilverQuestにより、ゲルを染色した。
レーン(2〜5および7〜12は、それぞれ、トロンビンによる前処理を伴ったレーン、またはトロンビンによる前処理を伴わなかったレーンである):
2:野生型Bドメイン欠失FVIII:2つの強いバンドが、重鎖および軽鎖に対応し、強度の低いバンドが単鎖に対応する。
3:シアリダーゼを伴う3時間後における反応混合物:レーン1と同一。
4および5:基質1およびST3Gal-IIIを伴う1時間後と23時間後における反応混合物:レーン2と同一であるが、ST3Gal-IIIに対応するさらなるバンドを伴う。
7:野生型Bドメイン欠失FVIII:軽鎖(A3-C1-C2ドメイン)、A1ドメイン、およびA2ドメインに対応する一連のバンド。
8:シアリダーゼを伴う3時間後における反応混合物:レーン7と同一。
9および10:基質1およびST3Gal-IIIを伴う1時間後と23時間後における反応混合物。レーン7および8と酷似するが、脂肪酸部分による基質1の修飾に対応して、A1バンドおよびA3-C1-C2バンドが、高分子量側へとわずかにシフトしていたことが注目される。
基質1とST3Gal-IIIとによる反応を介する、N-グリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII(「N8」):化合物5の調製
アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIII(1mg;800μlの緩衝液(ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、Tween 80(0.1mg/ml)、NaCl(500mM)、スクロース(3mg/ml))中に5.6ナノモル)を、ST3Gal-III(500μl;50μl、500mUへと濃縮する)および基質1(20μl、80ナノモル)で処理した。反応物を、32℃で22時間にわたりインキュベートした。試料を採取して、SDS PAGE解析にかけた。次いで、CMP-NAN溶液(2mg;20μlの緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、500mMのNaCl、1Mのグリセロール、pH=7.3)中に3.1マイクロモル)を添加し、32℃で1時間にわたりインキュベートした。
基質3とST3Gal-IIIとによる反応を介する、N-グリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII:化合物6の調製
アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIII(1mg;800μlの緩衝液(ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、Tween 80(0.1mg/ml)、NaCl(500mM)、スクロース(3mg/ml))中に5.6ナノモル)を、ST3Gal-III(500μl;50μl、500mUへと濃縮する)および基質3(45μl、60ナノモル)で処理した。反応物を、32℃で21.5時間にわたりインキュベートした。試料を採取して、SDS PAGE解析にかけた。次いで、CMP-NAN溶液(2mg;20μlの緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、500mMのNaCl、1Mのグリセロール、pH=7.3)中に3.1マイクロモル)を添加し、32℃で1時間にわたりインキュベートした。
基質3とST3Gal-Iとによる反応を介する、O-グリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII:化合物7の調製
緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3、500mMのNaCl)中の野生型Bドメイン欠失FVIII(5.7mg/ml、352μl、10.2ナノモル)を、シアリダーゼ(アルトロバクター・ウレアファシエンス(A. ureafaciens)、12μl、0.43mg/ml、130U/ml;ChristensenおよびEgebjerg、Bio-technol. Appl. Biochem.、41、225〜231頁を参照されたい)、HIS-ST3Gal-I(21.6U/mg、100μl)および基質3(150μl、200ナノモル)と混合した。混合物を32℃で2.5時間にわたりインキュベートし、その後、シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより、コンジュゲートFVIIIを単離した。この物質を、固定化シクロデキストリンカラムへと投入し、18mlの出発緩衝液で洗浄した。100%の溶出緩衝液までの段階として溶出を実施したところ、2.5ml中に730μgとして、生成物が溶出された。次いで、生成物を、CMP-NAN(40μl、34mg/ml)およびMBP-SBD-ST3Gal-III(200μl、0.33mg/ml、約0.5U/ml)により、32℃で1時間にわたり処理し、凍結させた。融解後、実施例9で概観した通りに、生成物を、AIECスピンカラムにより精製し、5倍濃度の緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3、1MのNaCl)350μlで最終的な溶出を実施し、700ul中に586μgのコンジュゲートを得た。得られたコンジュゲートを、Superdex 200 10/30 GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、Tween 80(0.1mg/ml)、NaCl(18mg/ml)、スクロース(3mg/ml)で溶出させた。溶出物は、0.58カラム容量に1つの主要なピークを含有し、これを回収したところ、2.5ml中に348μgのコンジュゲート(7)を含有した。非還元SDS PAGEにより生成物を特徴づけたが、これにより、修飾グリカンを含有するHCに対応するバンドが、高分子量側へとわずかにシフトしたことが示される。また、野生型Bドメイン欠失FVIIIをスパイクした解析的シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィー、およびこれをスパイクしない解析的シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより、該コンジュゲートは、シクロデキストリンに結合するが、野生型Bドメイン欠失FVIIIは、シクロデキストリンに結合しないことが分かった。
O-グリカンをPEG化し/N-グリカンを疎水性側鎖基により修飾した野生型Bドメイン欠失FVIII:化合物8の調製
WO2009/108806A1において説明される通りに、野生型Bドメイン欠失FVIII(1mg、5.6ナノモル)を、シアリダーゼ(アルトロバクター・ウレアファシエンス)、ST3Gal-I、および40kDaのPSC(この化合物の説明については、WO2007/056191A2を参照されたい)を用いるPEG化反応にかけた。反応の完了後、生成物を、Superdex 200 10/30 GLゲル濾過カラムに適用し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3、25mMのNaClで溶出させた。PEG化FVIIIを含有する生成物は、0.38〜0.54カラム容量における、部分的に分離した2つのピークとして溶出した。実施例9で概観した通りに、このプールを、AIECスピンカラムにより精製し(ステップ3を省略する)、3倍濃度の緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3、1MのNaCl)300μl、により最終的な溶出を実施し、PEG化FVIIIを600μl中240μgとした。次に、生成物を、MBP-SBD-ST3Gal-III(125μl、0.33mg/ml、約0.5U/ml)および基質3(15μl、20ナノモル)で処理した。反応混合物を32℃で20時間にわたりインキュベートし、その後、CMP-NAN(34mg/ml、14μl)を添加し、32℃で1時間にわたり反応させた。次いで、反応混合物を、-80℃で凍結させた。融解させた試料を、25mlの緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3)で希釈し、実施例9で概観した通りに、AIECスピンカラム上で精製した。3倍濃度の緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、1Mのグリセロール、pH=7.3、1MのNaCl)250μlにより最終的な溶出を実施した。プールを、Superdex 200 10/30 GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、Tween 80(0.1mg/ml)、NaCl(18mg/ml)、スクロース(3mg/ml)で溶出させた。溶出物は、非PEG化FVIIIを含有する0.58カラム容量における1つのピーク、および約0.43カラム容量付近における2つの非分離ピークを含有した。早期におけるこれらの2つのピークの溶出が、おそらくST3Gal-III(凝集形態にある)であるのに対し、後期における溶出ピークは所望の化合物を含有した。低量のST3Gal-IIIと共に所望の化合物(8)を含有する画分を回収した(2.5ml中に50μg)ところ、非還元SDS PAGEは、HCが高分子量側へとシフトすることを示したが、これは、PEGのO-グリカンへの結合と符合した。トロンビンによりあらかじめ切断させた状態での非還元SDS PAGEは、修飾グリカンを含有する、A1およびA3-C1-C2に対応するバンドが、高分子量側へとシフトすることを示したが、これは、基質3のN-グリカンへの結合と符合した。
アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIII
アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIIIは、2つの経路を介して、野生型Bドメイン欠失FVIIIをシアリダーゼで処理することにより得た。第1の経路は、シアリルトランスフェラーゼを介して、FVIIIのO-グリカンまたはN-グリカンに修飾基を連結する直前または連結するのと同時に(ワンポット)、野生型Bドメイン欠失FVIIIをシアリダーゼで処理することを包含した。これは、実施例8、11、および12で説明されている。
基質4のアシアロトランスフェリンへの酵素的連結。N-グリカン修飾トランスフェリンの調製
基質4(2.7mg、2.0ナノモル)を、20%(w/v)HPCDを含有する100μlのイミダゾール緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、0.02%のTween 80、150mMのNaCl、1Mのグリセロール、pH=7.3)中で溶解させた。200μlのイミダゾール緩衝液中のアシアロトランスフェリン(0.4mg)溶液を添加した後、20μlのHepes緩衝液(14mMのHepes;140mMのNaCl、50%(v/v)のグリセロール、pH7.0)中のMBP-SBD-ST3Gal-III酵素(0.33mg/ml)を添加した。混合物に、さらなるイミダゾール緩衝液(80μl)を添加して、全反応物容量を400μlとし、次いで、室温で2時間にわたりインキュベートした。LC/MSD TOF(Agilent technology(商標))により、反応混合物を解析し、300〜2000Daで測定したスペクトルに、デコンボリューションアルゴリズムを適用した。ピーク強度(収量;m/z)に基づき生成物の分布:非反応アシアロトランスフェリン(28%;78386.3869Da);モノ誘導体化アシアロトランスフェリン(48%;79409.8768Da);二重誘導体化アシアロトランスフェリン(24%;80440.8368Da)を計算した。この例は、基質4の疎水性側鎖基が、ポリペプチド(トランスフェリン)のアシアログリカンへと転移したことを検証するために、形成された生成物の質量を示す解析データを、後に得ることが可能であることを示す。
疎水性側鎖基とコンジュゲートされたFVIIIのアルブミン結合
GE Healthcare instruction leaflet 71-7006-00 ATに従い、HiTrap NHSカラム(GE Healthcare;CV 1ml;型番17-0716-00 AT)を用いて、セファロース-HSA(ヒト血清アルブミン)カラムを調製した。置換は、10マイクロモル/mlであった。SigmaによるHSA(A1653)を用いた。1mlの緩衝液中に1mgの量を、連結に用いた。上述の指示書冊子において説明されるプロトコールにより、連結効率を、71%と決定した。
流速:0.5ml/分
平衡化緩衝液:A緩衝液:20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、pH7.3、10%のグリセロール
溶出緩衝液:B緩衝液:A緩衝液中に20mMのヒドロキシプロピルシクロデキストリン
温度:22℃
検出:蛍光検出;励起波長:315nm、発光波長:375nm
0%〜20%(保持時間:3分)から、60%(5.25分)を経て、100%(7.5分)へと段階を踏む、B緩衝液の段階的勾配を用いた。
1)ブランク試料:ピークではなく、ヒドロキシルプロピルシクロデキストリンの段階的勾配に対応する、強度が低く幅の広いシグナルを示すこと;
2)野生型Bドメイン欠失FVIII(「N8」)試料:保持時間2.5分において、カラムの空容量に対応するピークを示すので、このタンパク質は、カラムに対するアフィニティーを有さないこと;
3)実施例10の化合物6と同様に調製されたアルブミン結合剤とのFVIIIコンジュゲートの粗反応混合物試料:20%のB緩衝液における溶出に対応する、保持時間7.5分のピークに加えて、保持時間2.5分において、カラムの空容量に対応するピークを示す。したがって、該タンパク質の画分は、カラムに結合した。この画分を単離したところ、化合物6に対応する、疎水性側鎖により修飾されたFVIIIであることが判明した。これは、SDS PAGE解析における、軽鎖および重鎖に対応するバンドのシフトを観察することにより決定したこと;
により調べた。
疎水性側鎖とコンジュゲートされたFVIIIの、in vitroにおける活性(FVIII:C)の特徴づけ
以下の通りに、Coatest SP試薬(Chromogenix)を用いるFVIII比色アッセイにおいて、FVIII誘導体5〜8のFVIII活性(FVIII:C)を評価した:Coatestアッセイ緩衝液(防腐剤を伴う、50mMのトリス、150mMのNaCl、1%のBSA、pH7.3)中で、FVIII試料およびFVIII基準物質(例えば、NIBSCによる、国際FVIII基準物質第7版に照らして較正した精製野生型rFVIII)を希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレート(Nunc)に二連で添加した。Coatest SPキットによる因子IXa/因子X試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を、5:1:3(容量:容量:容量)で混合し、このうちの75μlを、ウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後、50μlの因子Xa基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを添加し、反応物を室温で10分間にわたりインキュベートしてから、pH3の1Mクエン酸25μlを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー(Molecular Devices)上で、415nmにおける吸光度を測定した。陰性対照による値を、すべての試料から減じ、FVIII濃度と対比してプロットした吸光度値の線形回帰により、検量線を作成した。試料の活性を、HPLCにより決定されるタンパク質濃度で除することにより、比活性を計算した。
一段階血栓アッセイにおいて測定されたFVIII:C
以下の通り、一段階FVIII血栓アッセイにより、FVIII誘導体5〜8のFVIII:Cをさらに評価した。HBS/BSA緩衝液(1%のBSAを伴う、20mMのhepes、150mMのNaCl、pH7.4)中で、FVIII誘導体試料およびFVIII基準物質(例えば、NIBSCによる、国際FVIII基準物質第7版に照らして較正した精製野生型rFVIII)を、約10U/mlまで希釈した後、VWF(Dade Behring)を含有するFVIII欠損血漿中で10倍に希釈した。その後、試料を、HBS/BSA緩衝液中で希釈した。単一因子プログラムを用いて、ACL300R測定器またはACL5000測定器(Insturumentation Laboratory)上で、APTT血栓形成時間を測定した。VWF(Dade Behring)を伴うFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、SynthASil(HemosIL(商標);Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いた。血栓測定器では、希釈した試料または基準物質を、37℃で、FVIII欠損血漿およびaPTT試薬と混合した。塩化カルシウムを添加し、血栓形成までの時間を、濁度により決定した。FVIII基準物質の希釈液による血栓形成時間の検量線に基づき、試料中のFVIII:Cを計算した。Table 2(表3)におけるデータは、FVIII誘導体5〜8に対する血栓アッセイにより測定されたFVIII:Cの比活性が、良好〜極めて良好であったことを裏付ける。
疎水性側鎖とコンジュゲートされたFVIIIの薬物動態的特徴づけ
rFVIII変異体の薬物動態を、FVIII欠損マウス(Taconic M&Bにおいて飼育された、C57Bl/6のバックグラウンドを有する、FVIIIエクソン16ノックアウト(KO)マウス)またはvWF欠損マウス(Charles River、Germanyで飼育された、C57Bl/6のバックグラウンドを有する、vWFエクソン4+ 5 KOマウス)において評価した。vWF-KOマウスのFVIII:Cが13%で正常であったのに対し、FVIII-KOマウスは、FVIII:Cが検出可能でなかった。体重約25グラムで16〜28週齢の範囲の雄および雌の混合集団(約1:1)を用いた。マウスには、尾静脈に単回の静脈内rFVIII(280IU/kg)注射を施した。投与の64時間後までの時点において、コーティングなしのガラス細管を用いて、眼窩静脈叢から血液を採取した。各マウスから3回ずつ試料を採取し、各時点において2〜4例ずつの試料を採取した。クエン酸ナトリウムにより、血液を速やかに安定化させ、4倍濃度のFVIII Coatest SP緩衝液(実施例16を参照されたい)中で希釈してから、4000×gで5分間にわたる遠心分離にかけた。希釈した血液から得た血漿を、ドライアイス上で凍結させ、-80℃で保存した。実施例16で説明した通り、比色アッセイにおいて、FVIII:Cを決定した。WinNonlin Pro version 4.1ソフトウェアを用いる、ノンコンパートメント法(NCA)により、薬物動態解析を実施した。Table 3(表4)は、薬物動態パラメータ:半減期(t1/2)、クリアランス(CL)、および平均滞留時間(MRT)についての推定値を示す。データは、FVIIIが疎水性側鎖とコンジュゲートされると、クリアランスが減少し、半減期および平均滞留時間が延長されることを示す。
N-グリカンを疎水性側鎖で修飾したFVIIaの調製
以下の試薬を用いた。
アシアロFVIIa(内部バッチ):Gly-Gly緩衝液、pH6中(1.39mg/ml);500μl、13ナノモルを用いた。
基質1(アルブミン結合剤-GSC):(分子量:1869):2mg/ml;30μlまたは32ナノモルを用いた。
MBP-SBP-ST3Gal-III:1.2U/ml;100μlを用いた。
N-グリカンを疎水性側鎖で修飾したFIXの調製
以下の試薬を用いた:
FIX(内部バッチ):10mMのヒスチジン、3mMのCaCl2、50mMのNaClによる緩衝液、pH6中(11mg/ml)。
緩衝液(20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、pH7.3、10%のグリセロールpH7.3)により、100μl(20ナノモル)を1mlまで希釈した。100μl(2ナノモル)を用いた。
基質1(アルブミン結合剤-GSC、分子量:1869):2mg/ml;7.5μl(8ナノモル)を用いた。
MBP-SBP-ST3Gal-III:1.2U/ml;25μlを用いた。
シアリダーゼ/ノイラミニダーゼ:アガロース上に50μl(6.7mU)(Sigma製のVI-A型ウェルシュ菌N-5254株;ゲル1ml当たり0.6〜1.8U)(懸濁液)
Claims (8)
- 共有結合により少なくとも1つの疎水性側鎖基にコンジュゲートされる組換えタンパク質であって、前記疎水性側鎖基が、シアル酸を介して前記タンパク質に連結され、前記タンパク質が凝固因子であり、前記凝固因子がFVIII分子であり、前記FVIII分子が低下したvWF結合能を有する、組換えタンパク質。
- 疎水性側鎖基が、脂肪酸および脂肪族二塩基酸からなる群のうちの1または複数から選択される、請求項1に記載の組換えタンパク質。
- 疎水性側鎖基が、シアル酸を介して、共有結合によりO-グリカンにコンジュゲートされ、前記O-グリカンが、欠失型Bドメインに位置し、因子VIIIの活性化が、前記疎水性側鎖基の除去を結果としてもたらす、請求項1または2に記載の組換えタンパク質。
- 前記FVIII分子が少なくとも1つの親水性ポリマーとさらにコンジュゲートされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
- シアリルトランスフェラーゼ触媒反応を介する、疎水性側鎖基の組換えタンパク質への結合を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を作製する方法。
- 薬物としての、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含む医薬組成物。
- 血友病を治療するための、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を含む医薬組成物。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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EP10153716 | 2010-02-16 | ||
EP10153716.5 | 2010-02-16 | ||
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