RU2423380C2 - Сайт-направленная модификация fviii - Google Patents
Сайт-направленная модификация fviii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2423380C2 RU2423380C2 RU2007121517/10A RU2007121517A RU2423380C2 RU 2423380 C2 RU2423380 C2 RU 2423380C2 RU 2007121517/10 A RU2007121517/10 A RU 2007121517/10A RU 2007121517 A RU2007121517 A RU 2007121517A RU 2423380 C2 RU2423380 C2 RU 2423380C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fviii
- peg
- pegylated
- kda
- mutein
- Prior art date
Links
- 230000004048 modification Effects 0.000 title description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 title description 9
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 286
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 284
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 281
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 181
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 161
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 71
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 40
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 26
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 20
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 5
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 claims description 4
- JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylhexan-2-yloxymethyl)oxirane Chemical compound CCCCC(C)(C)OCC1CO1 JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 77
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 abstract 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 119
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 33
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 31
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 25
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 25
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 25
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 25
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 22
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 22
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 21
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 20
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 20
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- ILLKMACMBHTSHP-UHFFFAOYSA-N tetradecaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO ILLKMACMBHTSHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 16
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 13
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 13
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 10
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 10
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 10
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 9
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 9
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 6
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 6
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- -1 two N-terminus Chemical class 0.000 description 6
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 5
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- DTPCFIHYWYONMD-UHFFFAOYSA-N decaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO DTPCFIHYWYONMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 4
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- DHORSBRLGKJPFC-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO DHORSBRLGKJPFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HZYUNBJZCPLWPR-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO HZYUNBJZCPLWPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 3
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 101000604197 Homo sapiens Neuronatin Proteins 0.000 description 3
- 101000999322 Homo sapiens Putative insulin-like growth factor 2 antisense gene protein Proteins 0.000 description 3
- 206010023434 Kidney rupture Diseases 0.000 description 3
- 102100038816 Neuronatin Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 102100036485 Putative insulin-like growth factor 2 antisense gene protein Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- SGUXGJPBTNFBAD-UHFFFAOYSA-L barium iodide Chemical compound [I-].[I-].[Ba+2] SGUXGJPBTNFBAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940075444 barium iodide Drugs 0.000 description 3
- 229910001638 barium iodide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N nonaethylene glycol Chemical group OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO YZUUTMGDONTGTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLZWNFNQMJAZGY-UHFFFAOYSA-N octaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO GLZWNFNQMJAZGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methoxyethyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound COCCN1C(=O)C=CC1=O ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWTQQPNDSWCHOV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO OWTQQPNDSWCHOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIELXDCPHZJHGM-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NIELXDCPHZJHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHMUMDLGQBRJIW-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO ZHMUMDLGQBRJIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEXKUCOGQITOPO-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEXKUCOGQITOPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXSKAZFMTGADIV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(2-hydroxyethoxy)propoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCCOCCO KXSKAZFMTGADIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 101000629400 Homo sapiens Mesoderm-specific transcript homolog protein Proteins 0.000 description 2
- 101000693243 Homo sapiens Paternally-expressed gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 101001073409 Homo sapiens Retrotransposon-derived protein PEG10 Proteins 0.000 description 2
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100026821 Mesoderm-specific transcript homolog protein Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102100025757 Paternally-expressed gene 3 protein Human genes 0.000 description 2
- 241001662443 Phemeranthus parviflorus Species 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100035844 Retrotransposon-derived protein PEG10 Human genes 0.000 description 2
- 102100035123 Retrotransposon-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 2
- 229940105756 coagulation factor x Drugs 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- WRZXKWFJEFFURH-UHFFFAOYSA-N dodecaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO WRZXKWFJEFFURH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102220039283 rs199473359 Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- PSVXZQVXSXSQRO-UHFFFAOYSA-N undecaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO PSVXZQVXSXSQRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100296980 Arabidopsis thaliana PEP6 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000956004 Homo sapiens Vitamin D-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038460 Renal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical class [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 108010011035 endodeoxyribonuclease DpnI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 108010038082 heparin proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000051433 human GC Human genes 0.000 description 1
- 102000055276 human IL3 Human genes 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001341 hydroxy propyl starch Substances 0.000 description 1
- 235000013828 hydroxypropyl starch Nutrition 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000018592 inherited blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229960000292 pectin Drugs 0.000 description 1
- 108010092851 peginterferon alfa-2b Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940067631 phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005646 polycarboxylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000007847 structural defect Effects 0.000 description 1
- 125000005415 substituted alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в медицине. Предлагается конъюгат мутеина фактора свертывания крови VIII (FVIII), в котором не являющийся цистеином остаток в положении 41, 129, 377, 388, 468, 491, 556, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815 и/или 2118 заменен остатком цистеина, с полиэтиленгликолем (ПЭГ), где молекула ПЭГ связана с полипептидом по мутантному цистеиновому остатку. Улучшение фармакокинетических свойств FVIII в составе конъюгата по изобретению при сохранении прокоагулянтной активности фактора позволяет предложить новые ПЭГ-илированные мутеины FVIII для получения фармацевтических композиций, предназначенных для лечения гемофилии. 4 н. и 8 з.п.ф-лы, 38 ил., 8 табл.
Description
Перекрестная ссылка
Данная заявка имеет преимущество приоритета по заявке №60/627277 на патент США, поданной 12 ноября 2004 г., которая полностью включена здесь посредством ссылки.
Область изобретения
Данное изобретение относится к мутеинам фактора VIII (FVIII), которые обладают возможностью связываться в предварительно заданном сайте с одним или более биосовместимыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль. Кроме того, предлагаются основанные на них составы, дозировки и способы их введения в терапевтических целях. Эти модифицированные варианты FVIII и основанные на них композиции и способы пригодны для выбора метода лечения лиц, пораженных гемофилией А, в котором частота введения препарата уменьшена и иммуногенный ответ снижен.
Уровень техники
Гемофилия А является наиболее общим наследственным нарушением свертываемости крови с оценкой встречаемости одно на 5000 мужчин. Она вызывается дефицитом или структурными дефектами FVIII, основном компоненте природного пути свертывания крови. Современное лечение гемофилии А включает внутривенное введение человечьего FVIII. Человечий FVIII производят рекомбинантным методом в виде одноцепочечной молекулы размером приблизительно 300 кДа. Она состоит из структурных доменов А1-А2-В-А3-С1-С2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp.11-22). Продукт-предшественник преобразуется в две полипептидные цепочки размерами 200 кДа (тяжелая) и 80 кДа (легкая) в аппарате Гольджи, при этом две цепочки удерживаются вместе посредством ионов металлов (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p.6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p.2979).
Домен В мутеина FVIII представляется необязательным, поскольку FVIII с делетированным доменом В (BDD, А1-А2-тяжелая цепь 90 кДа плюс легкая цепь 80 кДа) также проявляет эффективность при заместительной терапии гемофилии А. Последовательность FVIII с делетированным В-доменом содержит делецию всех, кроме 14-ти, аминокислот В-домена.
Пациентов с гемофилией А в настоящее время лечат внутривенным введением FVIII по необходимости или путем профилактической терапии, назначаемой несколько раз в неделю. При профилактическом лечении дается 15-25 ME фактора VIII на 1 кг веса тела три раза в неделю. Это постоянно требуется пациенту. Ввиду короткого времени полувыведения у человека, FVIII должен вводиться часто. Несмотря на крупный размер в более чем 300 кДа протеина полной длины FVIII имеет у людей период полувыведения только около 11 часов (Ewenstein et al., 2004, Semin. Hematol. 41, pp.1-16). Необходимость частого внутривенного введения создает огромные барьеры в соблюдении больными режима и схемы лечения. Для пациентов было бы более удобным, если бы был разработан FVIII-продукт, который имеет более длительный период полувыведения и, следовательно, требует менее частого введения. Кроме того, если бы период полувыведения был увеличен, могла бы быть уменьшена стоимость лечения, поскольку в результате могло бы потребоваться меньшее количество доз.
Дополнительным недостатком существующей терапии является то, что примерно у 25-30% пациентов вырабатываются антитела, которые ингибируют активность FVIII (Saenko et al., 2002, Haemophilia 8, pp.1-11). Главные эпитопы ингибиторных антител локализованы внутри домена А2 на остатках 484-508, домена A3 на остатках 1811-1818 и домена С2. Выработка антител препятствует использованию FVIII при заместительной терапии, вынуждая эту группу пациентов искать еще более дорогое лечение с помощью высокодозировочного рекомбинантного фактора VIII и иммуноустойчивой терапии.
В последующих исследованиях были идентифицированы FVIII-эпитопы ингибиторных антител. При исследовании 25-ти ингибиторных образцов плазмы было обнаружено, что 11 из них связаны с фрагментом А3С1С2, вызванным тромбином и имеющим легкую цепь размером 73 кДа, 4 связаны с доменом А2, а 10 - с обоими фрагментами (Fulcher, С. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp.7728-32). В другом исследовании шесть из восьми ингибиторов домена А2 пациентов были нейтрализованы рекомбинантным А2-полипептидом (Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), pp.1767-75). Эпитопы для шести из девяти ингибиторов пациентов отмечены на остатках 379-538 домена А2 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp.6152-6). Эпитоп для 18-ти ингибиторов с тяжелой цепью был определен в той же N-концевой области размером 18,3 кДа домена А2 (Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp.1618-26).
Активная рекомбинантная гибридная молекула человек/свинья мутеина FVIII, полученная замещением остатков 387-604 домена А2 человека гомологичной последовательностью свиньи, проявляла устойчивость к ингибитору А2 пациента (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp.8639-41) и устойчивость к мышиному моноклональному антителу mАВ 413 IgG, которое конкурирует с ингибиторами А2 пациента в связывании с А2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), рр.665-71). В дальнейшем этот эпитоп домена А2 был обнаружен в остатке 484-508 домена А2, когда в результате экспериментов было выявлено, что мАВ 413 IgG и четыре ингибитора пациента не ингибируют гибридный человек/свинья мутеин FVIII, в котором остатки 484-508 домена А2 были замещены соответствующими остатками домена А2 свиньи (Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp.14505-9). Такой гибридный FVIII также был более устойчивым, по крайней мере, у половины из 23 пациентов, у которых исследовалась плазма (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp.564-8). При аланин-сканирующем мутагенезе был идентифицирован остаток 487 как основной для связывания со всеми пятью тестированными ингибиторами пациентов, несмотря на то что все остатки 484, 487, 489 и 492 являлись важными для взаимодействия с мАВ 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp.30191-5). Титры ингибиторных антител у мыши, получавшей мутант R484A/R489A/P492, а не мутант R484A/R489A, были значительно ниже, чем у мыши, получавшей контрольный человеческий BDD FVIII (Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp.704-10). Таким образом, область 484-508 домена А2, по-видимому, является сайтом связывания для ингибиторов с активностью FVIII.
Другой проблемой традиционной терапии, помимо иммунного ответа на FVIII, является то, что она требует частого введения дозы из-за короткого периода полувыведения FVIII in vivo. Были исследованы механизмы выведения FVIII из кровотока.
Выведение FVIII из кровотока частично объясняется специфическим связыванием с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности (LRP) и печеночному рецептору выведения с широкой лигандной специфичностью (Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp.133-139). Недавно было также показано, что рецептор липопротеина низкой плотности (LDL) играет некоторую роль в выведении FVIII, например, посредством совместного с LRP действия по регулированию уровней FVIII в плазме (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp.906-910). Оба взаимодействия облегчаются связыванием с гепарин сульфат протеогликанами (HSPGs) поверхности клеток. Период полувыведения из плазмы у мыши может быть пролонгирован до 3,3 раза, когда блокирован LRP, или в 5,5 раза, когда блокированы как LRP, так и HSPGs поверхности клеток (Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp.11970-11979). Предполагается, что HSPGs аккумулируют FVIII на клеточной поверхности и предоставляют его LRP. Сайты связывания LRP на FVIII локализованы на остатках 484-509 А2 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp.37685-37692), остатках 1811-1818 A3 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp.9370-9377) и эпитопе в домене С2 (Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp.23734-23739).
Кроме того, FVIII выводится из кровотока под действием протеаз. Чтобы понять этот эффект, нужно понять механизм, посредством которого FVIII вовлечен в свертывание крови. FVIII, связанный с фактором фон Виллебранда (vWF), циркулирует, как гетеродимер, состоящий из тяжелой и легкой цепей. vWF-связывание происходит на остатках 1649-1689 FVIII (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp.5230-5234) и части доменов С1 (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp.958-965) и С2 (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp.53691-8). FVIII активируется тромбином, который расщепляет пептидные связи после остатков 372, 740 и 1689, производя гетеротример из доменов А1, А2 и А3-С1-С2 (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp.12434-12439). По завершении активации FVIII диссоциирует от vWF и накапливается на поверхности клеток тромбоцитов посредством связывания с фосфолипидом. Фосфолипидное связывание включает остатки 2199, 2200, 2251 и 2252 FVIII (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp.6374-6381). Там он связывается с коагуляционным фактором IX (FIX) через взаимодействие с остатками 558-565 (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp.20522-20527) и остатками 1811-1818 FVIII (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp.1935-1940) и с коагуляционным фактором Х (FX) через взаимодействие с остатками 349-372 FVIII (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp.15763-15771) и действует как кофактор для FIX-активации FX, существенного компонента природного пути свертывания крови. Активированный FVIII (F Villa) частично инактивируется протеазой, которая активируется протеином С (АРС) через расщепление FVIII после остатков 336 и 562 (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp.3982-3987). Однако предполагаемым основным фактором инактивации является диссоциация домена А2 от доменов A1 и А3-С1-С2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp.8957-8962).
Одним из методов, который, как было продемонстрировано, увеличивает in vivo период полувыведения протеина, является ПЭГ-илирование. ПЭГ-илирование представляет собой ковалентное присоединение длинноцепочечных молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) к протеину или другой молекуле. ПЭГ может иметь линейную форму или разветвленную форму, чтобы получить различные молекулы с различными свойствами. Помимо увеличения периода полувыведения пептидов или протеинов ПЭГ-илирование используется для уменьшения образования антител, защиты протеина от протеазного расщепления и сохранения материала вне почечного фильтрата (Hams et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp.539-51). Кроме того, ПЭГ-илирование может также увеличивать общую стабильность и растворимость протеина. Наконец, поддерживаемая концентрация ПЭГ-илированных протеинов в плазме может уменьшать степень побочных эффектов посредством уменьшения провалов в пиковых уровнях лекарственного средства, снимая, таким образом, необходимость введения сверхфизиологических уровней протеина на ранних временных отрезках.
С различной степенью успеха опробовались случайные модификации FVIII, полученные путем направленного воздействия первичных аминов (N-концевой и лизины) крупными полимерами, такими как ПЭГ и декстран (WO 94/15625, патент US 4970300, патент US 6048720). Наиболее яркое улучшение, опубликованное в патентной заявке в 1994 г. (WO 94/15625), показало 4-кратное увеличение периода полувыведения, однако за счет 2-кратной потери активности после реакции FVIII полной длины с 50-кратным избытком ПЭГ. В WO 2004/075923 раскрываются конъюгаты FVIII и полиэтиленгликоля, которые образуются через случайные модификации. В прошлом случайно ПЭГ-илированные протеины, такие как интерферон-альфа (Kozlowski et al., 2001, BioDrugs 15, pp.419-429), одобрялись в качестве терапевтических средств.
Однако этот подход, основанный на случайных модификациях, является более проблематичным относительно гетеродимерного FVIII. FVIII имеет сотни потенциальных сайтов ПЭГ-илирования, включая 158 лизинов, два N-конца и множество гистидинов, серинов, треонинов и тирозинов, каждый из которых потенциально мог бы быть ПЭГ-илированным реагентами, первоначально нацеленными на первичные амины. Например, было показано, что главным позиционным изомером для ПЭГ-илированного интерферона Альфа-2b является гистидин (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp.10634-10640). Кроме того, результатом гетерогенной обработки полноразмерного FVIII может являться смесь исходного материала, которая в дальнейшем делает ПЭГ-илированные продукты более сложными. Дополнительным недостатком неконтролирования сайта ПЭГ-илирования на FVIII является потенциальное снижение активности, в тех случаях когда ПЭГ должен был присоединиться на или вблизи основных активных сайтов, особенно в тех случаях, когда более чем один ПЭГ или единичный ПЭГ крупного размера конъюгирует с FVIII. Поскольку случайное ПЭГ-илирование постоянно производит большое количество ПЭГ-илированных продуктов, очистка с целью получения именно моноПЭГ-илированных продуктов приведет к коренному снижению выхода этих продуктов. Наконец, огромная гетерогенность профиля продукта будет делать почти невозможным непрерывный синтез и исследование каждой серии. Поскольку товарное производство требует постоянного, хорошо исследованного продукта, гетерогенность продукта является барьером для коммерциализации. Ввиду всех этих причин желателен более определенный метод ПЭГ-илирования FVIII.
В недавнем обзоре (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, доступно он-лайн с 15 окт. 2005, прямой предметный идентификатор doi: 10.1016/j.cbpa.2005.10.007) были обобщенны различные стратегии сайт-направленного ПЭГ-илирования протеинов. Один из подходов включает введение неприродной аминокислоты в протеины посредством химического синтеза или рекомбинантной экспрессии, за которыми следует добавление производного ПЭГ, который будет специфично реагировать с неприродной аминокислотой. Например, неприродная аминокислота может быть такой, которая содержит кетогруппу, которая не встречается в нативных протеинах. Однако химический синтез таких крупных протеинов, как FVIII, невозможен. Современный предел пептидного синтеза составляет около 50 остатков. Для получения больших частей полипептида можно лигировать несколько пептидов, но, чтобы получить хотя бы FVIII с делетированным В-доменом, потребовалось бы более 20 лигирований, в результате чего выход продукта составлял бы менее 1% даже при идеальных условиях реакции. Рекомбинантная экспрессия протеинов с неприродными аминокислотами ограничена, главным образом, экспрессионными системами немлекопитающих. Полагают, что данный подход является проблематичным для крупного и сложного протеина, такого как FVIII, экспрессия которого необходима в системах млекопитающих.
Другой подход к сайт-направленному ПЭГ-илированию протеинов заключается в направленном воздействии амина N-конца основной цепи ПЭГ-альдегидами. При этом процессе требуется низкий рН для достижения специфичности относительно других аминных групп, который, однако, несовместим с узким интервалом почти нейтрального рН, необходимого для стабильности FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp.1-15). Более того, N-концевое ПЭГ-илирование FVIII может не привести к улучшению периода полувыведения из плазмы, если эта область не участвует в выведении из плазмы. В действительности, N-концевая область легкой цепи FVIII вовлечена в связывание с vWF, протеином-носителем, который является основным для сохранения FVIII при кровообращении. При N-концевой модификации фактора FVIII наиболее важная связь с vWF может быть разрушена или ослаблена. Таким образом, N-концевое ПЭГ-илирование FVIII может оказать противоположный эффект уменьшения периода полувыведения FVIII из плазмы.
WO 90/12874 раскрывает сайт-специфическую модификацию человеческого IL-3, колониестимулирующего фактора гранулоцитов и эритропоэтиновых полипептидов путем введения цистеина или заменой им другой аминокислоты с последующим добавлением лиганда, который содержит сульфгидрильную реактивную группу. Лиганд избирательно присоединяется к цистеиновым остаткам. Модификация FVIII или какого-либо его варианта не раскрывается.
По причинам, сформулированным выше, существует необходимость в улучшенном варианте FVIII, который обладает большей длительностью действия in vivo и пониженной иммуногенностью, сохраняя, в то же время, функциональную активность. Кроме того, желательно, чтобы такой протеин производился как гомогенный продукт надежным способом.
Краткая сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером функционального полипептида FVIII, имеющего улучшенные фармакокинетические и терапевтические свойства.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером протеина FVIII с делетированным В-доменом, имеющего улучшенные фармакокинетические свойства.
Еще одной целью изобретения является обеспечение конъюгированного с биосовместимым полимером функционального полипептида FVIII, имеющего ослабленное связывание с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности (LRP), рецептором липопротеина низкой плотности (LDL), гепарин-сульфат протеогликанами (HSPGs) и/или ингибиторными антителами против FVIII.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного варианта FVIII, который обладает большей длительностью действия in vivo и уменьшенной иммуногенностью и который возможно производить как гомогенный продукт надежным способом.
В одном аспекте изобретения обеспечивается конъюгат, имеющий прокоагулянтную активность фактора FVIII, включающий функциональный полипептид фактора FVIII, ковалентно соединенный на одном или более своих предварительно заданных сайтах с одним или более биосовместимыми полимерами, где предварительно заданный сайт не является N-концевым амином. Изобретение также включает способ получения этого конъюгата, предусматривающий мутирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный полипептид фактора FVIII, с целью замещения в предварительно заданном сайте последовательностью, кодирующей цистеиновый остаток; экспрессию мутированной нуклеотидной последовательности для получения модифицированного цистеином мутеина; очистку мутеина; реагирование мутеина с биосовместимым полимером, который активирован для реагирования с полипептидами по существу только на введенных цистеиновых остатках таким образом, чтобы образовался конъюгат; и очистку конъюгата. Изобретение также направлено на фармацевтические композиции, включающие конъюгат и фармацевтически приемлемый адъювант, и на способы лечения гемофилии путем введения терапевтически эффективных количеств этих фармацевтических композиций млекопитающему, которое нуждается в них.
Изобретение также относится к способу сайт-направленного ПЭГ-илирования мутеина фактора FVIII, включающему (а) экспрессию сайт-направленного мутеина фактора FVIII, где мутеин имеет цистеиновое замещение в аминокислотном остатке на наружной поверхности мутеина фактора FVIII и этот цистеин кэпирован; (b) контактирование цистеинового мутеина с восстановителем при условиях, в которых цистеиновый мутеин мягко восстанавливается и отделяется кэп; (с) удаление кэпа и восстановителя из цистеинового мутеина; и (d) обработку, по крайней мере, спустя около 5 минут после удаления восстановителя, цистеинового мутеина с помощью ПЭГ, содержащего сульфгидрильный связывающий фрагмент при условиях, в которых образуется ПЭГ-илированный мутеин фактора FVIII.
Краткое описание фигур чертежей
Фиг.1. Карты векторов и стратегия мутагенеза для ПЭГ-мутеинов.
Фиг.2. Профиль поглощения УФ при 280 нм относительно времени для ПЭГ-2-протеина, очищенного через хроматографическую колонку с моноклональными антителами к FVIII. Хроматография выполнялась с использованием хроматографической системы АКТА® Explorer 100 от Amersham Bioscience.
Фиг.3. Трехстадийный способ сайт-направленного ПЭГ-илирования. ПЭГ представляет собой цистеин-реактивный ПЭГ, такой как ПЭГ-малеимид. Замкнутые полоски показывают дисульфидные образования, а незамкнутые - восстановленные цистеины.
Фиг.4. Сайт-направленное ПЭГ-илирование ПЭГ2.
Фиг.5. Сайт-направленное ПЭГ-илирование ПЭГ6.
Фиг.6а. Сайт-направленное ПЭГ-илирование BDD, ПЭГ2, 4, 5 и 6. Верхние панели были окрашены антителом к тяжелой (Н) цепи, а нижние панели - антителом к легкой (L) цепи. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.
Фиг.6b. ПЭГ-илирование ПЭГ15 и ПЭГ7 с ПЭГ2 и ПЭГ6 в качестве контроля. Сначала очищенные ПЭГ-мутеины (S) восстанавливали с помощью трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) и после удаления восстановителя («R») ПЭГ-илировали с помощью ПЭГ 12 кДа («12») или 22 кДа («22»). Образцы наносили на 6%-ный Трис-глицин SDS PAGE и окрашивали антителом к тяжелой цепи (НС) на левой панели или антителом к легкой цепи (LC) на правой панели. «U» - необработанный материал, содержащий как НС, так и LC. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.
Фиг.6с. ПЭГ-илирование ПЭГ2+6 с ПЭГ2 и ПЭГ6 в качестве контроля. ПЭГ2, ПЭГ6 или ПЭГ2+6 восстанавливали с помощью ТСЕР и после удаления восстановителя («R») ПЭГ-илировали с помощью ПЭГ 5 кДа («5») или 43 кДа («43»), ПЭГ2+6 также ПЭГ-илировали с использованием ПЭГ 12, 22 и 33 кДа. Образцы наносили на 6%-ный Трис-глицин SDS PAGE и окрашивали кумасси для протеинов слева или антителом к тяжелой цепи (Н) или легкой цепи (L). «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.
Фиг.6d. ПЭГ-илирование FVIII дикого типа полной длины (KG-2) с ПЭГ2 в качестве контроля. Левый гель окрашивали кумасси для протеинов, а правый гель - йодом для ПЭГ. «BDD U» - необработанный BDD-материал, содержащий как Н, так и L. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.
Фиг.7. Расщепление тромбином ПЭГ-илированного ПЭГ2. N-концевая половина домена А2 окрашена в голубой цвет, а С-концевая половина - в зеленый, эпитоп антитела R8B12 подцвечен темно-зеленым (правый образец FVIII). ПЭГ2 (дорожка 1) и 22 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2 (дорожка 2) обрабатывали тромбином (дорожки 3 и 4 соответственно) и затем наносили на 7%-ный Трис-ацетатный гель (Invitrogen) и окрашивали антителом R8B12. Каждая дорожка содержит 50 нг FVIII.
Фиг.8. Расщепление тромбином ПЭГ-илированного FVIII дикого типа полной длины (KG-2). «S» = исходный материал KG-2. «R» = восстановленный KG-2, восстановитель удален. «Р» = «R», ПЭГ-илированный ПЭГ 43 кДа. «Чистый» = «Р», очищенный от избытка ПЭГ. «L» = легкая цепь. ПЭГ-илированные полоски подцвечены точками.
Фиг.9. Окрашивание йодом ПЭГ-илированного ПЭГ2. 22- или 43 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2 наносили на 6%-ный Трис-глициновый гель и окрашивали антителом R8B12 к FVIII (дорожки 1 и 2) или йодом (дорожки 3 и 4). Два пятна были выровнены в соответствии с их маркерными дорожками молекулярного веса. Дорожки 1 и 2 содержат около 30 нг FVIII, в то время как дорожки 3 и 4 содержат около 2 мкг.
Фиг.10. MALDI-масс-спектрометрический анализ ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ2. MALDI-масс-спектрометрия выполнялась на ПЭГ2 (Фиг.10а) или на 22 кДа-ПЭГ-илированном ПЭГ2 (Фиг.10b). После ПЭГ-илирования пик тяжелой (Н) цепи ПЭГ2 значительно уменьшается и появляется новый пик (Н+ПЭГ) с центром на 111 кДа (ПЭГ 22 кДа + тяжелая цепь 89 кДа). Ожидавшегося пика ПЭГ-илированной легкой (L) цепи с центром на 100 кДа (ПЭГ 22 кДа + легкая цепь 83 кДа) не обнаруживается.
Фиг.11. MALDI-масс-спектрометрия ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ2 после расщепления тромбином.
Фиг.12. MALDI-масс-спектрометрический анализ ПЭГ-илированного ПЭГ6 до и после расщепления тромбином.
Фиг.13. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного ПЭГ2, очищенного на колонке, используемой при гель-хроматографии.
Фиг.14. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ6, очищенного на катион-обменной колонке.
Фиг.15. Профиль поглощения УФ на 280 нм ПЭГ-илированного и неПЭГ-илированного ПЭГ6, на колонке, используемой в гель-хроматографии.
Фиг.16. Сравнение активности ПЭГ-илированного протеина с активностью неПЭГ-илированного протеина, измеренной хромогенным анализом и коагуляционным анализом. Очищенный FVIII полной длины представлен как KG-2. Полученный процент активности определялся делением величины образца, обработанного ПЭГ после восстановления и удаления восстановителя, на величину образца, обработанного буферным контролем, принимая во внимание результат ПЭГ-илирования.
Фиг.17. Фармакокинетическое (РК) исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с ПЭГ2.
Фиг.18. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с BDD и ПЭГ2. Р-значения являются сравнениями между ПЭГ-илированным ПЭГ2 и BDD.
Фиг.19. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного ПЭГ6 в сравнении с BDD и ПЭГ6.
Фиг.20. РК-исследование кролика относительно ПЭГ-илированного FVIII дикого типа полной длины («fl») в сравнении с немодифицированнным FVIII fl.
Фиг.21. РК-исследование гемофильной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ6 в сравнении с BDD и ПЭГ6.
Фиг.22. РК-исследование нормальной мыши относительно 22- и 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2 в сравнении с BDD.
Фиг.23. РК-исследование 22 нормальной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 размером 22 кДа в сравнении с BDD в течение всего времени.
Фиг.24. Гистограмма сбора Гемофильного Мышиного (BDD) Фактора VIII, показывающая фармакокинетическую оценку периода полувыведения BDD-Фактора VIII у двух видов в анализе гемофильной мыши.
Фиг.25. Исследование разрыва почки гемофильной мыши относительно ПЭГ-илированного ПЭГ2 размером 22 кДа в сравнении с BDD. В результате обработки носителем мыши имели потерю крови 25 мкл/грамм веса тела.
Фиг.26. Хромогенная активность ПЭГ-илированного ПЭГ2 и BDD в присутствии увеличивающихся количеств антител к FVIII. Эпитоп антитела указан в скобках.
Фиг.27. Хромогенная активность ПЭГ-илированного ПЭГ2 в присутствии увеличивающихся количеств антител mAB 413 к FVIII.
Фиг.28. Хромогенная активность BDD, 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2, 33 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ6 и 33 кДа-диПЭГ-илированного ПЭГ2+6 в присутствии плазмы человека, происходящей от пациентов, у которых выработались ингибиторы к FVIII. Ингибиторный титр и данные о собранной крови отмечены сверху. Две верхние панели включают данные плазмы, собранной у пациентов, разведенной в 5-405 раз. Нижняя левая панель отображает разведение 1:15 для пациентов с плазмой HRF-828. Нижняя правая панель подтверждает, что 0,064 МЕ/мл, использованные для каждого образца FVIII на двух верхних панелях, не являются дозой насыщения.
Фиг.29. Метод скрининга и подтверждение ПЭГ-илирования. Верхняя панель показывает схематический скрининг ПЭГ-илирования транзиентно экспрессируемых ПЭГ-мутеинов. Нижняя панель показывает Вестерн-анализ ПЭГ-илированных продуктов с использованием специфичного антитела к тяжелой («Н») цепи (слева) или специфичного антитела к легкой («L») цепи (справа). ПЭГ-илированные полосы подцвечены точками. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.
Фиг.30. Скрининг ПЭГ-илирования ПЭГ15-17. Вестерн-анализ ПЭГ-илированных продуктов с использованием специфичных антител к тяжелой («Н») цепи (R8B12 и 58.12) или специфичных антител к легкой («L») цепи антител (C7F7 и GM). Все три мутеина отобраны по тяжелой цепи, с относительной эффективностью ПЭГ-илирования ПЭГ15~ПЭП6>ПЭГ17. ПЭГ-илированные полосы подцвечены точками. «U» - необработанный материал, содержащий как Н, так и L.
Фиг.31. Гель, показывающий ПЭГ-илирование ПЭГ2+14 как функцию концентрации восстановителя. ПЭГ2+14 обрабатывали 67-670 мкМ ТСЕР в течение 30 мин при 4°С. Восстановитель удаляли вращающейся колонкой, после чего следовало ПЭГ-илирование с помощью ПЭГ 12 кДа. Тяжелая и легкая цепи FVIII подцвечены «Н» и «L» соответственно. Две точки указывают на тяжелую и легкую ПЭГ-илированные цепи.
Фиг.32. Развернутые масс-спектры ПЭГ2+14, обработанного 67-670 мкМ ТСЕР с удаленным затем восстановителем.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии, что полипептиды, имеющие активность FVIII, могут быть ковалентно соединены на предварительно заданном сайте, который не является N-концевым амином, с биосовместимым полимером и что такие полипептиды в значительной мере сохраняют свою коагуляционную активность. Кроме того, эти полипептидные конъюгаты имеют улучшенное время циркуляции в крови и пониженную антигенность. Конъюгаты согласно изобретению обладают преимуществом над конъюгатами, известными из уровня техники, которые имеют случайные присоединения полимера к FVIII или имеют присоединения к N-концу. Сайт-направленное присоединение позволяет конструировать модификации, которые не затрагивают области, необходимые для биологической активности и, тем самым, существенно сохраняют активность FVIII. Оно также позволяет осуществить присоединение полимеров к блоку связывания на сайтах, вовлеченных в выведение FVIII. Сайт-направленное присоединение также позволяет получить более однородный продукт, нежели гетерогенные конъюгаты, получаемые в уровне техники путем случайного присоединения полимеров. За счет того что присоединение к N-концевому амину не осуществляется, конъюгаты согласно настоящему изобретению не теряют активности при присоединении лиганда на активном сайте полипептида FVIII. Предполагается, что N-концевая область легкой цепи участвует в связывании фактора vWF с FVIII, которое является стабилизирующим связыванием в кровотоке.
Определения
Биосовместимый полимер. Биосовместимый полимер включает полиалкилен оксиды, в частности, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстраны, коломиниковые кислоты или другие полимеры, основанные на углеводородах, полимеры аминокислот, производные биотина, поливиниловый спирт (PVA), поликарбоксилаты, поливинилпирролидон, сополимер этилена с ангидридом малеиновой кислоты, сополимер стирола с ангидридом малеиновой кислоты, полиоксазолин, полиакрилатморфолин, гепарин, альбумин, целлюлозы, гидролизаты хитозана, крахмалы, такие как гидроксиэтил-крахмалы и гидроксипропил-крахмалы, гликоген, агарозы и их производные, гуаровая камедь, пуллулан, инулин, ксантановая камедь, каррагенан, пектин, гидролизаты альгиновой кислоты, другие биополимеры и любые их эквиваленты. Предпочтительным является полиэтиленгликоль, и еще более предпочтительным является метоксиполиэтиленгликоль (mPEG). Другими полезными полиалкиленгликолевыми соединениями являются полипропиленгликоли (PPG), полибутиленгликоли (PBG), ПЭГ-глицидил эфиры (EpoxPEG), ПЭГ-оксикарбонилимидазол (CDI-PEG), разветвленные полиэтиленгликоли, линейные полиэтиленгликоли, вильчатые полиэтиленгликоли и многолучевые или «сверхразветвленные» полиэтиленгликоли (star-PEG).
Полиэтиленгликоль (ПЭГ). «ПЭГ» и «полиэтиленгликоль» используются здесь взаимозаменяемо и включают любой водорастворимый поли(этиленоксид). В типичном случае, ПЭГи для использования в соответствии с изобретением включают следующие структуры: «--(OCH2CH2)n--», где (n) - от 2 до 4000. Используемый здесь ПЭГ также включает «--CH2CH2-O(СН2СН2О)n--СН2СН2--» и «--(ОСН2СН2)nO--», в зависимости от того, замещены или не замещены терминальные кислороды. По всему описанию и пунктам притязаний следует помнить, что термин «ПЭГ» включает структуры, имеющие различные терминальные и «концевые кэпирующие» группы, такие, без ограничения, как гидроксильная или C1-20-алкокси группа. Термин «ПЭГ» также означает полимер, который содержит большинство, то есть более 50%, повторяющихся субъединиц --OCH2CH2--. Что касается специфических форм, ПЭГ может иметь любое число разновидностей молекулярных весов, а также структур или геометрий, таких как разветвленная, линейная, вильчатая и многофункциональная.
ПЭГ-илирование. ПЭГ-илирование - это процесс, посредством которого полиэтиленгликоль (ПЭГ) ковалентно присоединяется к молекуле, такой как протеин.
Активированная или активная функциональная группа. Когда функциональная группа, такая как биосовместимый полимер, обозначается как активированная, функциональная группа легко реагирует с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле.
FVIII с делетированным В-доменом (BDD). Термин BDD, используемый здесь, характеризуется наличием аминокислотной последовательности, в которой имеется делеция всех, кроме 14-ти, аминокислот В-домена FVIII. Первые 4 аминокислоты В-домена ((SFSQ, SEQ ID NO:1) связаны с 10 последними остатками В-домена (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO:2). (Lind, P. et al., 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp.19-27). Используемый здесь BDD имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
FVIII. Фактор VIII (FVIII) свертывания крови представляет собой гликопротеин, синтезируемый и выделяемый в кровоток печенью. При циркуляции крови он связывается с фактором фон Виллебранда (vWF, также известным как родственный Фактору VIII антиген) с образованием устойчивого комплекса. После активации тромбином он диссоциирует от комплекса и взаимодействует с другими факторами свертывания крови в коагуляционном каскаде, который в итоге ведет к образованию тромбов. Человечий FVIII полной длины имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, хотя возможны аллельные варианты.
Функциональный полипептид фактора VIII. Термин «функциональный полипептид фактора VIII», используемый здесь, означает функциональный полипептид или комбинацию полипептидов, которая способна, in vivo или in vitro, корректировать недостаточность фактора VIII у человека, характеризующуюся, например, гемофилией А. В натуральном состоянии фактор VIII имеет многочисленные деградационные и процессированные формы. Как показано здесь, они происходят протеолитически из предшественника, одноцепочечного протеина. Такой одноцепочечный протеин и также различные деградационные продукты, которые имеют биологическую активность коррекции недостаточности фактора VIII у человека, будут являться функциональным полипептидом фактора VIII. Вероятно, существуют аллельные варианты. Функциональными полипептидами фактора VIII будут являться все такие аллельные вариации, гликозилированные варианты, модификации и фрагменты, приводящие к производным фактора VIII в той мере, насколько они содержат функциональный сегмент человечьего фактора VIII, и особая, характерная для человечьего фактора VIII функциональная активность остается по существу не затронутой. Эти производные фактора VIII, обладающие требуемой функциональной активностью, могут быть легко идентифицированы описанными здесь простыми in vitro-тестами. Кроме того, функциональный полипептид фактора VIII способен катализировать конверсию фактора Х в Ха в присутствии фактора IXa, кальция и фосфолипида, а также корректировать коагуляционный дефект в плазме, происходящей от пораженных гемофилией А индивидуумов. Раскрытая здесь последовательность человечьего фактора VIII, аминокислотные последовательности и их функциональные области делают очевидными для специалистов в данной области техники фрагменты, которые могут быть выделены посредством разрезания рестрикционными ферментами ДНК или протеолитической или иной деградации протеина человечьего фактора VIII.
Термин «FIX», используемый здесь, означает Коагуляционный Фактор IX, который также известен как Человечий Фактор ГХ Свертывания Крови или Тромбопластиновый Компонент Плазмы.
Теримн «FX», используемый здесь, означает Коагуляционный Фактор X, который также известен под названием Человечий Фактор Х Свертывания Крови и под эпонимом фактор Стюарта-Прауера.
Фармакокинетика. «Фармакокинетика» («РК») - это термин используется для описания свойств поглощения, распределения, метаболизма и элиминирования лекарственного средства в теле. Улучшение фармакокинетики лекарственного средства означает улучшение тех его характеристик, которые делают лекарственное средство более эффективным in vivo в качестве терапевтического агента, особенно продолжительности его полезного действия в теле.
Мутеин. Мутеин представляет собой полученный посредством генетической инженерии протеин, возникающий как результат мутации протеина или полипептида, индуцируемой в лаборатории.
Термины «протеин» и «полипептид», используемые здесь, являются синонимами.
Термин «рецептор выведения FVIII», используемый здесь, означает рецепторную область на функциональном полипептиде FVIII, которая связывается или соединяется с одной или более другими молекулами, что приводит к выведению FVIII из кровотока. Рецепторы выведения фактора VIII включают, в частности, области молекулы FVIII, которые связываются с LRP, LDL-рецептором и/или HSPG.
Обсуждение
Представляется, что любой функциональный полипептид фактора FVIII может быть мутирован в предварительно заданном сайте и затем ковалентно соединен в этом сайте с биосовместимым полимером в соответствии со способами согласно изобретению. Пригодные полипептиды являются, в частности, полноразмерным фактором FVIII с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:4, и BDD FVIII, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3. BDD FVIII является предпочтительным.
Биосовместимый полимер, используемый в конъюгатах согласно изобретению, может представлять собой любой из полимеров, упомянутых выше. Биосовместимый полимер выбирается для того, чтобы достичь желаемого улучшения в фармакокинетике. Например, идентичность, размер и структура полимера выбирается такой, чтобы увеличить период полувыведения полипептида, имеющего активность FVIII, из кровотока или чтобы уменьшить антигенность полипептида без нежелательного снижения его активности. Предпочтительно, полимер включает ПЭГ и еще более предпочтительно имеет, по крайней мере, 50% молекулярного веса ПЭГ. В одном варианте выполнении полимер представляет собой полиэтиленгликоль, терминально кэпированный концевым кэпирующим фрагментом, таким как гидроксил, алкокси, замещенное алкокси, алкенокси, замещенное алкенокси, алкинокси, замещенное алкинокси, арилокси и замещенное арилокси. Еще более предпочтительными являются полимеры, включающие метоксиполиэтиленгликоль. И еще более предпочтительными являются полимеры, включающие метоксиполиэтиленгликоль, имеющий размер в интервале от 3 кДа до 100 кДа, более предпочтительно - от 5 кДа до 64 кДа или от 5 кДа до 43 кДа.
Предпочтительно, полимер содержит реакционный фрагмент. Например, в одном варианте выполнения изобретения полимер содержит сульфгидрильный реакционный фрагмент, который может реагировать с цистеином функционального полипептида фактора FVIII с образованием ковалентной связи. Такие сульфгидрильные реакционные фрагменты охватывают тиол, трифлат, трезилат, азиридин, оксиран, S-пиридил или малеимидные фрагменты. Предпочтительным является малеимидный фрагмент. В одном выполнении полимер является линейным и имеет на одном конце «кэп», который является не очень сильно реактивным по отношению к сульфгидрилам (таким, как метоксисоединение), и на другом конце - сульфгидрильный реакционный фрагмент. В предпочтительном выполнении конъюгат включает ПЭГ-малеимид и имеет размер в интервале от 5 кДа до 64 кДа.
На следующих далее примерах приводятся рекомендации по отбору пригодных биосовместимых полимеров.
Сайт-направленная мутация нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий активность FVIII, может быть осуществлена любым методом, известным в данной области техники. Предпочтительные методы включают мутагенез с целью введения цистеинового кодона в сайт, выбранный для ковалентного присоединения полимера. Это можно выполнить, используя коммерчески доступный набор для сайт-направленного мутагенеза, такой как набор для сайт-направленного мутагенеза Stratagene cQuickChange™ II, набор для сайт-направленного мутагенеза № K1600-1 Clontech Transformer, система для сайт-направленного мутагенеза №12397014 Invitrogen GenTaylor, набор системы для сайт-направленного мутагенеза in vitro № Q6210 Promega Altered Sites II или набор для ПЦР-мутагенеза № TAK RR016 Takara Mirus Bio LA.
Конъюгаты согласно изобретению могут быть приготовлены путем первоначального замещения кодона одной или более аминокислот на поверхности функционального полипептида FVIII кодоном цистеина с дальнейшим получением цистеинового мутеина в рекомбинантной экспрессионной системе, проведением реакции мутеина с цистеин-специфичным полимерным реагентом и очисткой мутеина.
В данном способе добавление полимера к сайту цистеина может быть выполнено за счет малеимида, функционально активного на полимере. Примеры этой технологии приводятся ниже. Количество используемого сульфгидрильного реакционного полимера должно быть, по крайней мере, эквимолярным молярному количеству цистеинов, которые должны быть произведены, а предпочтительно иметься в избытке. Предпочтительно, сульфгидрильный реакционный полимер используется, по крайней мере, в 5-кратном молярном избытке и еще более предпочтительно используется, по крайней мере, в десятикратном избытке. Другие условия, благоприятные для ковалентного присоединения, входят в объем знаний специалиста в данной области техники.
В примерах, которые следуют ниже, мутеины имеют традиционные в данной области техники названия. Полноразмерная аминокислотная последовательность зрелого фактора VIII, которая представлена в SEQ ID NO:4, является основой для придания названий мутантам. Будучи секретируемым протеином, FVIII содержит сигнальную последовательность, которая протеолитически отщепляется во время трансляционного процесса. После удаления сигнальной последовательности из 19 аминокислот первой аминокислотой секретированного FVIII-продукта является аланин.
Когда говорится о мутированных аминокислотах в BDD-FVIII, мутированные аминокислоты обозначаются в настоящем документе традиционным образом их положением в последовательности FVIII полной длины. Например, рассматриваемый ниже мутеин ПЭГ6 обозначается К1808С, поскольку в нем лизин (К) в положении, аналогичном положению 1808 в последовательности полной длины, заменен на цистеин (С).
Предварительно заданный сайт для ковалентного связывания полимера лучше всего выбирать из сайтов, расположенных на поверхности полипептида, которые не влияют на активность FVIII или другие механизмы, которые стабилизируют FVIII in vivo, такие как связывание с vWF. Кроме того, лучше выбирать такие сайты, участие которых известно в механизмах, посредством которых FVIII деактивируется или выводится из кровотока. Подробно выбор таких сайтов рассматривается ниже. Предпочтительные сайты охватывают аминокислотный остаток на или вблизи сайта связывания (а) протеина, родственного рецептору липопротеина низкой плотности, (b) гепаринсульфат протеогликана, (с) рецептора липопротеина низкой плотности и/или (d) антител, ингибирующих фактор FVIII. Выражение «на или вблизи сайта связывания» означает остаток, который находится достаточно близко к сайту связывания, так что ковалентное присоединение биосовместимого полимера к этому сайту привело бы к стерическому повреждению сайта связывания. Предполагается, что такой сайт, к примеру, находится в пределах 20 Å от сайта связывания.
В одном варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII на аминокислотном остатке в или вблизи (а) рецептора выведения фактора VIII, как определено выше, (b) сайта связывания протеазы, способной деградировать фактор VIII, и/или (с) сайта связывания ингибиторных антител к фактору VIII. Протеазы могут быть активированы протеином С (АРС). В другом варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII в предварительно заданном сайте, так что связывание протеина, родственного рецептору липопротеина низкой плотности, с полипептидом является более слабым, чем с тем же полипептидом, когда он неконъюгирован, и предпочтительно слабее более чем в два раза. В одном варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII в предварительно заданном сайте, так что связывание гепаринсульфат протеогликанов с полипептидом является более слабым, чем с тем же полипептидом, когда он неконъюгирован, и предпочтительно слабее более чем в два раза. В следующем варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII в предварительно заданном сайте, так что связывание ингибиторных антител к фактору VIII с полипептидом является более слабым, чем с тем же полипептидом, когда он неконъюгирован, предпочтительно слабее более чем в два раза, чем связывание с этим полипептидом, когда он неконъюгирован. В другом выполнении биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII в предварительно заданном сайте, так что связывание рецептора липопротеина низкой плотности с полипептидом является более слабым, чем с тем же полипептидом, когда он неконъюгирован, предпочтительно слабее более чем в два раза. В другом варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к функциональному полипептиду фактора VIII в предварительно заданном сайте, так что протеаза плазмы деградирует полипептид слабее, чем когда этот полипептид неконъюгирован. В следующем варианте выполнения изобретения деградация полипептида протеазой плазмы является более чем в два раза слабее, чем деградация этого полипептида, когда он неконъюгирован, при таких же самых условиях за такой же период времени.
Сродство связывания LRP, LDL и HSPG с FVIII можно определить, используя методику поверхностного плазмонного резонанса (Biacore). Например, FVIII может быть нанесен прямо или опосредованно через FVIII-антитело на Biacore™-чип, и, пропуская через чип различные концентрации LRP, можно измерить как скорость ассоциации, так и скорость диссоциации (Bovenschen N. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp.9370-7). Соотношение двух скоростей дает величину сродства. При ПЭГ-илировании было бы желательным двукратное, предпочтительно пятикратное, более предпочтительно десятикратное и еще более предпочтительно 30-кратное снижение сродства.
Деградация FVIII протеазой АРС может быть измерена любыми методами, известными специалистам в данной области техники.
В одном варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к полипептиду в одном или более положениях аминокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 и 2284 фактора VIII. В другом варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к полипептиду в одном или более положениях аминокислот 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 и 2284 фактора VIII, и (1) связывание конъюгата с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности, меньше, чем связывание неконъюгированного полипептида с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности; (2) связывание конъюгата с рецептором липопротеина низкой плотности меньше, чем связывание неконъюгированного полипептида с рецептором липопротеина низкой плотности; или (3) связывание конъюгата как с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности, так и с рецептором липопротеина низкой плотности меньше, чем связывание неконъюгированного полипептида с протеином, родственным рецептору липопротеина низкой плотности, и с рецептором липопротеина низкой плотности.
В другом варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к полипептиду в одном или более положениях аминокислот 377, 378, 468, 491, 504, 556 и 711 фактора VIII, и связывание конъюгата с гепаринсульфат протеогликаном меньше, чем связывание неконъюгированного полипептида с гепаринсульфат протеогликаном. В следующем варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к полипептиду в одном или более положениях аминокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 и 2284 фактора VIII, и конъюгат имеет меньшее связывание с ингибиторными антителами к фактору VIII, чем неконъюгированный полипептид. В дальнейшем варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к полипептиду в одном или более положениях аминокислот 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 и 2284, и предпочтительно в одном или более положениях из 377, 378, 468, 491, 504, 556, и 711 фактора VIII, и конъюгат подвергается меньшей деградации протеазой плазмы, способной деградировать фактор VIII, чем неконъюгированный полипептид. Более предпочтительно, чтобы протеаза плазмы являлась активированным протеином С.
В следующем варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер ковалентно присоединен к фактору VIII с делетированным В-доменом в положениях аминокислот 129, 491, 1804 и/или 1808, более предпочтительно в положениях 491 или 1808. В дальнейшем варианте выполнения изобретения биосовместимый полимер присоединен к полипептиду фактора VIII в положении аминокислоты 1804 и включает полиэтиленгликоль. Предпочтительно, один или более предварительно заданных сайтов для присоединения биосовместимого полимера контролируются сайт-специфичной мутацией цистеина.
Предварительно заданными сайтами для присоединения биополимера могут являться один или более сайтов, предпочтительно один или два сайта, на функциональном полипептиде фактора VIII. В конкретных выполнениях полипептид является моноПЭГ-илированным или диПЭГ-илированным.
Изобретение также относится к способу получения конъюгата, предусматривающему мутирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный полипептид фактора VIII, для замещения последовательности на цистеиновый кодон в предварительно заданном сайте; экспрессию мутированной нуклеотидной последовательности, чтобы произвести модифицированный цистеином мутеин; очистку мутеина; реагирование мутеина с биосовместимым полимером, который активирован для реакции с полипептидами по существу только с восстановленными цистеиновыми остатками, так что образуется конъюгат; и очистку конъюгата. Другой вариант выполнении изобретения - способ сайт-направленного ПЭГ-илирования мутеина фактора VIII, включающий: (а) экспрессию сайт-направленного мутеина фактора VIII, где мутеин имеет цистеиновое замещение аминокислотного остатка на наружной поверхности мутеина фактора VIII и этот цистеин кэпируют; (b) контактирование цистеинового мутеина с восстановителем при условиях, в которых цистеиновый мутеин мягко восстанавливается и отделяется кэп; (с) удаление кэпа и восстановителя из цистеинового мутеина; и (d) спустя, по крайней мере, около 5 минут, предпочтительно, по крайней мере, 15 минут, еще более предпочтительно, по крайней мере, 30 минут, после удаления восстановителя обрабатывают цистеиновый мутеин ПЭГом, включающим сульфгидрильный связывающий фрагмент, при таких условиях, чтобы образовался ПЭГ-илированный мутеин фактора VIII. Сульфгидрильный связывающий фрагмент ПЭГ выбирают из группы, состоящей из тиольного, трифлатного, трезилатного, азиридинового, оксиранового, S-пиридильного и малеимидного фрагментов, предпочтительно малеимида.
Изобретение также касается фармацевтических композиций для парентерального введения, включающих терапевтически эффективные количества конъюгатов настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый адъювант. Фармацевтически приемлемые адъюванты являются веществами, которые могут добавляться к активному ингредиенту, чтобы помочь сформулировать или стабилизировать препарат и не вызвать каких-либо значительных нежелательных токсикологических эффектов у пациента. Примеры таких адьювантов хорошо известны специалистам в данной области техники и включают воду, сахара, такие как мальтоза или сахароза, альбумин, соли и т.д. Другие адъюванты описаны, например, E.W.Martin в Remington's Pharmaceutical Sciences. Такие композиции будут содержать эффективное количество описанного здесь конъюгата вместе с подходящим количеством носителя, для того чтобы приготовить фармацевтически приемлемые композиции, пригодные для эффективного введения хозяину. Например, конъюгат может быть парентерально введен лицам, страдающим гемофилией А, в дозе, которая может изменяться в зависимости от тяжести случая кровотечения. Средние дозы, вводимые внутривенно, находятся в пределах 40 единиц на килограмм по предоперационным показаниям, 15-20 единиц на килограмм при небольшом кровотечении и 20-40 единиц на килограмм, вводимых в течение 8-часового периода в качестве поддерживающей дозы.
В одном варианте выполнения изобретения способ включает замещение одной или более расположенных на поверхности BDD аминокислот цистеином, получение цистеинового мутеина в экспрессионной системе млекопитающих, восстановление цистеина, который был кэпирован во время экспрессии цистеином из среды выращивания, удаление восстановителя, чтобы дать возможность BDD-дисульфидам восстановить структуру, и реагирование с реагентом цистеин-специфичного биосовместимого полимера, такого как ПЭГ-малеимид. Примерами таких реагентов являются ПЭГ-малеимид с размерами ПЭГ 5,22 или 43 кДа, доступных от Nektar Therapeutics (Сан Карлос, Калиф.) под номерами каталога Nektar 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5000 Да, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 кДа, 2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 кДа соответственно, или 12 либо 33 кДа, доступных от NOF Corporation (Токио, Япония) под номерами каталога NOF Sunbright ME-120MA и Sunbright МЕ-300МА соответственно. ПЭГ-илированный продукт очищают, используя ионообменную хроматографию для удаления непрореагировавшего ПЭГ и гель-хроматографию для удаления непрореагировавшего BDD. Этот метод может быть использован для идентификации и избирательной защиты от любых нежелательных взаимодействий с FVIII, таких как опосредованное рецептором выведение из кровотока, связывание ингибиторными антителами и деградация протеолитическими ферментами. Нами замечено, что ПЭГ-реагент, поставляемый Nektar или NOF как имеющий размер 5 кДа, протестированный в нашей лаборатории, оказался имеющим размер 6 кДа, и, аналогично, ПЭГ-реагент, поставляемый как линейный 20 кДа, по тестированию оказался имеющим размер 22 кДа; поставляемый как 40 кДа по тестированию имел 43 кДа; и поставляемый как 60 кДа был тестирован как имеющий 64 кДа в нашей лаборатории. Чтобы избежать путаницы, мы здесь в обсуждении используем молекулярный вес, как он был определен в нашей лаборатории, за исключением ПЭГ 5 кДа, о котором мы говорим как о имеющем размер 5 кДа, как он идентифицирован производителем.
В дополнение к цистеиновым мутациям в положениях 491 и 1808 в BDD (раскрыто выше) были осуществлены цистеиновые мутации в положениях 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 и 1804, чтобы потенциально блокировать LRP-связывание после ПЭГ-илирования. Кроме того, чтобы после ПЭГ-илирования блокировать LRP- и HSPG-связывание, были осуществлены цистеиновые мутации в положениях 377, 378 и 556. Положения 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 и 2284 были выбраны как равнорасположенные на BDD, чтобы сайт-направленное ПЭГ-илирование ПЭГами крупного размера (>40 кДа) в этих положениях совместно с ПЭГ-илированием на нативных сайтах гликозилирования (41, 239 и 2118) и сайтах LRP-связывания полностью охватывало поверхность BDD и чтобы можно было идентифицировать новый механизм выведения из кровотока для BDD.
В одном варианте выполнения изобретения среда для культивирования клеток содержит цистеины, которые «кэпируют» цистеиновые остатки в мутеине посредством образования дисульфидных связей. При приготовлении конъюгата цистеиновый мутеин, произведенный в рекомбинантной системе, кэпируют цистеином из среды культивирования и этот кэп удаляют путем мягкого восстановления, которое освобождает кэп, перед добавлением цистеин-специфичного полимерного реагента. Другие методы, известные в данной области для сайт-специфической мутации FVIII, также могут быть использованы, поскольку они очевидны для специалиста в этой области.
Примеры
АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ СТРУКТУРНЫХ СВЯЗЕЙ FVIII. FVIII и BDD-FVIII являются очень большими сложными молекулами со многими различными сайтами, вовлеченными в биологические реакции. Предшествующие попытки ковалентно модифицировать их, чтобы улучшить фармакокинетические свойства, имели противоречивые результаты. То, что молекулы можно было бы специфически мутировать и затем сайт-специфичным образом добавлять полимер, было неожиданным. Кроме того, неожиданными были также результаты в улучшении фармакокинетических свойств и сохранении активности, принимая во внимание, что ранее известным полимерным конъюгатам были присущи проблемы возникновения неспецифичного увеличения и уменьшения активности.
В одном варианте выполнения изобретения предусматривается сайт-направленный мутагенез с использованием цистеин-специфичных лигандов, таких как ПЭГ-малеимид. Немутированный BDD не имеет каких-либо цистеинов, доступных для реагирования с ПЭГ-малеимидом, так что только мутированное положение цистеина было бы сайтом ПЭГ-илирования. Более конкретно, BDD-FVIII содержит 19 цистеинов, 16 из которых образуют дисульфиды и остальные 3 из которых являются свободными цистеинами (McMullen et al., 1995, Protein Sci. 4, pp.740-746). Структурная модель BDD предполагает, что все 3 свободных цистеина находятся внутри структуры (Stoliova-McPhie et al., 2002, Blood 99, pp.1215-1223). Поскольку оксисленные цистеины не могут быть ПЭГ-илированы ПЭГ-малеимидами, то 16 цистеинов, которые образуют в BDD дисульфиды, не могут быть ПЭГ-илированы, пока сначала не будут восстановлены. На основании структурной модели BDD 3 свободных цистеина в BDD не могут быть ПЭГ-илированы без предварительной денатурации протеина, чтобы эти цистеины стали доступны ПЭГ-реагенту. Таким образом, неочевидно возможно достичь специфичного ПЭГ-илирования BDD ПЭГ-илированием на нативных цистеиновых остатках без серьезного изменения структуры BDD, что, весьма вероятно, приведет к нарушению его функции.
Окислительно-восстановительное состояние 4-х цистеинов в В-домене FVIII полной длины неизвестно. ПЭГ-илирование 4-х цистеинов в В-домене может быть возможным, если они не образуют дисульфидов и расположены на поверхности структуры. Однако, поскольку полноразмерная FVIII и BDD имеют сходный фармакокинетический (РК) профиль и сходные периоды полувыведения in vivo (Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, pp.251-260), то маловероятно, что ПЭГ-илирование В-домена приведет к улучшению периода полувыведения из плазмы, если только не окажется, что ПЭГ также защищает области, не относящиеся к В-домену.
Чтобы предварительно определить сайт полипептида, имеющего активность FVIII, для присоединения полимера, который сохранит активность фактора VIII и улучшит фармакокинетику, предлагаются следующие рекомендации, основанные на BDD-FVIII. Модификации должны быть направлены на механизмы выведения, инактивации и иммуногенные механизмы, такие как LRP, HSPG, АРС, и на сайты связывания ингибиторных антител. Структура BDD показана в Stoilova-McPhie. S. et al., 2002, Blood 99(4), pp.1215-23. Например, чтобы пролонгировать период полувыведения, можно ввести единичный ПЭГ в специфический сайт на или вблизи сайтов LRP-связывания в интервале остатков 484-509 домена А2 и в интервале остатков 1811-1818 домена A3. Введение объемного ПЭГ в эти сайты должно прервать способность FVIII связываться с LRP и уменьшить выведение FVIII из кровотока. Предполагается также, что для пролонгирования периода полувыведения без значительного влияния на активность ПЭГ может быть введен на остаток 1648, который находится на сочленении В-домена и А3-домена в молекуле полной длины, и в 14-аминокислотный линкер I BDD между доменами А2 и A3.
Специфичность ПЭГ-илирования можно достичь путем введения единичных цистеиновых остатков в домены А2 или A3, используя методики мутагенеза с помощью рекомбинантных ДНК, применяя после этого сайт-специфичное ПЭГ-илирование введенного цистеина посредством цистеин-специфичного ПЭГ-реагента, такого как ПЭГ-малеимид. Другое преимущество ПЭГ-илирования на остатках 484-509 и 1811-1818 состоит в том, что эти два эпитопа представляют два из трех главных классов ингибиторных антигенных сайтов у пациентов. Для достижения максимального эффекта улучшения периода полувыведения из кровотока и уменьшения иммуногенного ответа можно ПЭГ-илировать как А2, так A3 сайты LRP-связывания, чтобы получить диПЭГ-илированный продукт. Следует заметить, что ПЭГ-илирование внутри области 1811-1818 может привести к значительной потере активности, так как эта область вовлечена также в связывание FIX. Сайт-направленное ПЭГ-илирование внутри области 558-565 должно устранить HSPG связывание, однако может также снизить активность, поскольку эта область также связывается с FIX.
Чтобы идентифицировать новый механизм выведения FVIII, можно также ПЭГ-илировать дополнительные сайты на его поверхности. ПЭГ-илирование домена А2 может дать дополнительное преимущество в том, что домен А2 диссоциирует от FVIII после активации и, предположительно, удаляется из кровотока быстрее, чем остаток молекулы FVIII, из-за его меньшего размера. С другой стороны, ПЭГ-илированный А2 может оказаться достаточно большим, чтобы избежать выведения почками, и иметь период полувыведения из плазмы, сравнимый с таковым для остатка FVIII, и, таким образом, можно восстановить активированный FVIII in vivo.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЙТОВ ПЭГ-илирования В ОБЛАСТЯХ А2 и A3. Пять положений (Y487, L491, К496, L504 и Q468, соответствующих положениям PEG1-5) в или вблизи предполагаемой области LRP-связывания А2 были выбраны в качестве примеров сайт-направленного ПЭГ-илирования, основываясь на поверхностном расположении и направлении в наружнюю сторону траектории Сα-Сβ. Кроме того, эти остатки приблизительно равноудалены друг от друга в пространственной структуре молекулы, поэтому вместе они могут представлять целую область. Восемь положений (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804, соответствующих PEG6-14) в или вблизи предполагаемой области LRP-связывания A3 были выбраны в качестве примеров для проведения сайт-направленного ПЭГ-илирования. ПЭГ6 (К1808) граничит с 1811-1818 и природным N-связанным сайтом гликозилирования в положении 1810. ПЭГ-илирование в положении 1810 (ПЭГ7) приводит к замещению сахара на ПЭГ. Мутация в положении Т 1812 ПЭГ8 также ликвидирует сайт гликозилирования. Хотя, как предсказывалось, ПЭГ9-положение (K1813) направлено вовнутрь структуры, оно было выбрано на случай, если модель структуры является неправильной. ПЭГ 10 (Y1815) является объемной гидрофобной аминокислотой внутри петли LRP-связывания и может являться основным остатком взаимодействия, поскольку гидрофобные аминокислоты обычно находятся в центре протеин-протеиновых взаимодействий. Поскольку область 1811-1818, как было указано, участвует в связывании как LRP, так и FEX, то было сделано предположение, что ПЭГ-илирование внутри этой петли может привести к пониженной активности. В связи с этим, вблизи петли 1811-1818, но не внутри ее, были сконструированы ПЭГ11-ПЭГ14 (1795, 1796, 1803, 1804), чтобы стала возможной диссоциация связывания LRP и FIX с ПЭГ разных размеров.
Чтобы одновременно блокировать оба сайта LRP-связывания, может быть осуществлено двойное ПЭГ-илирование, например, в положениях ПЭГ2 и ПЭГ6.
Так как область 558-565, как было показано, связывается как с HSPG, так и с FIX, внутри этой области сайты не создавались. Вместо этого, между областями LRP-и HSPG-связывания А2 были сконструированы ПЭГ15-ПЭГ17 (377, 378 и 556), чтобы присоединенный ПЭГ мог как препятствовать взаимодействиям, так и прерывать возможные взаимодействия между ними. Дополнительные сайты, которые расположены на поверхности и направлены наружу, могли бы быть выбраны внутри или вблизи областей LRP- и HSPG-связывания. Чтобы идентифицировать новые механизмы выведения, можно систематически ПЭГ-илировать FVIII. В дополнение к ПЭГ1-17 в качестве привязочных точек для ПЭГ-илирования можно использовать три других природных сайта гликозилирования, а именно N14, N239 и N2118, соответствующих ПЭГ 18-20, поскольку они должны быть расположены на поверхности. На BDD-модели в дополнение к сайтам функционального взаимодействия для vWF, FIX, FX, фосфолипида и тромбина были картированы области поверхности в радиусе 20 ангстрем от Сβ-атомов ПЭГ2, ПЭГ6, а также четыре сайта гликозилирования.
Затем, основываясь на их возможности охватывать почти полностью остающуюся поверхность BDD с радиусом 20 ангстрем от каждого из их Сβ-атомов, были выбраны ПЭГ21-29, соответствующие Y81, F129, К422, К523, К570, N1864, Т1911, Q2091 и Q2284. Поскольку эти положения полностью расположены на поверхности, являются внешне направленными и находятся далеко от природных цистеинов, они также были выбраны, чтобы минимизировать возможные некорректные образования дисульфидов. Радиус 20 ангстрем был выбран, так как предполагается, что крупный ПЭГ, такой как разветвленный ПЭГ 64 кДа, имеет возможность охватить сферу с радиусом около 20 ангстрем. ПЭГ-илирование ПЭГ21-29 совместно с ПЭГ2 и ПЭГ6 и сайтами гликозилирования ПЭГ 18, 19 и 20 вероятно предохранит почти полностью нефункциональную поверхность FVIII.
Положения ПЭГ-илирования, которые приводят к улучшенным свойствам, таким как улучшенный РК-профиль, более высокая стабильность или уменьшенная иммуногенность, могут быть скомбинированы, чтобы получить мультиПЭГ-илированный продукт с максимально улучшенными свойствами. ПЭГ30 и ПЭГ31 были сконструированы посредством удаления дисульфидов, расположенных на поверхности А2- и А3-доменов соответственно. Для проведения ПЭГ-илирования ПЭГ30, или С630А должен быть освобожден от своего дисульфидного партнера С711. Также, ПЭГ31, С1899А должны дать возможность С1903 быть ПЭГ-илированным.
МУТАГЕНЕЗ. Субстраты для сайт-направленного ПЭГ-илирования FVIII могут быть созданы введением цистеинового кодона в сайт, выбранный для ПЭГ-илирования. Для получения всех ПЭГ-мутантов использовали набор для сайт-направленного мутагенеза Stratagene cQuickChange™ II (набор Stratagene 200523 от Stratagene Corporation, Ла Йола, Калиф.). Метод сайт-направленного мутагенеза cQuickChange™ осуществляли, используя PfuTurbo® ДНК-полимеразу и температурный циклер. Два комплементарных олигонуклеотидных праймера, содержащих желаемую мутацию, элонгировали, используя PfuTurbo, которая не смещает праймеры. В качестве матрицы использовалась двунитевая ДНК, содержащая ген FVIII дикого типа. После множества циклов элонгации продукт расщепляли эндонуклеазой DpnI, которая специфична к метилированной ДНК. Вновь синтезированная ДНК, содержащая мутацию, не была метилированной, в то время как родительская ДНК дикого типа была метилированной. Расщепленная ДНК затем использовалась для трансформации суперкомпетентных XL-1 Blue клеток.
Эффективность мутагенеза составила почти 80%. Реакции мутагенеза осуществляли либо в pSK207+BDD C2.6, либо в pSK207+BDD (Фигура 1). Успешный мутагенез подтверждался ДНК-секвенированием, и подходящие фрагменты, содержащие мутацию, включались в основной участок вектора экспрессии млекопитающих pSS207+BDD, кодирующий FVIII. После ведения все мутации вновь подтверждались секвенированием. Для А3-мутеинов ПЭГ 6, 7, 8, 9 и 10 мутагенез проводили в векторе pSK207+BDD C2.6. После подтверждения секвенированием мутантный фрагмент KpnI/Pme субклонировали в pSK207+BDD. BDD-мутеин затем субклонировали в экспрессирующий вектор pSS207+BDD. Для А3-мутеинов ПЭГ 11, 12, 13, 14 мутагенез проводили непосредственно в векторе pSK207+BDD и подтвержденный секвенированием мутант BDD затем субклонировани в pSS207+BDD. Для А2-мутеинов ПЭГ 1, 2, 3, 4 и 5 мутагенез проводили в векторе pSK207+BDD C2.6. Подтвержденный секвенированием мутант субклонировали в pSK207+BDD, а затем в pSS207+BDD.
ПРАЙМЕРЫ (ТОЛЬКО СМЫСЛОВАЯ НИТЬ), ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ДЛЯ МУТАГЕНЕЗА, ПЕРЕЧИСЛЕНЫ ДЛЯ КАЖДОЙ РЕАКЦИИ:
ЭКСПРЕССИЯ МУТЕИНА. После введения в вектор, который придает устойчивость к Гигромицину В (Гигр В), ПЭГ-мутеины были трансфецированы в НКВ11-клетки (Патент США 6136599), смешанные с Реагентом для Трансфекции 293 Фектин (Invitrogen Corp. кат. №12347-019) по инструкциям производителя. Экспрессию FVIII в трехсуточный посттрансфекционный период оценивали посредством хромогенного анализа Коатест (Chromogenix Corp. кат. №821033, см. Пример 12, хромогенный анализ) (Таблица 1). Затем трансфецированные клетки помещали при селективном действии 50 мкг/мл Гигр В в ростовую среду, дополненную 5% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS). После появления устойчивых к Гигр В колоний их собирали и скринировали на экспрессию FVIII посредством хромогенного анализа Коатест. Затем стабильные экспрессирующие FVIII клетки вносили в среду, содержащую добавку HSPG. Клетки выращивали и высевали в концентрации 1 × 106 клеток/мл в качалочные колбы со свежей средой. Культуральную жидкость (TCF), собранную по истечении 3 суток, использовали для очистки FVIII BDD-мутеинов. Активность FVIII из TCF анализировали с помощью Коатеста (Таблица 1). (N/A = анализ не проводился).
Таблица 1 | |||
Уровень экспрессии ПЭГ-мутеинов при транзиентной и стабильной трансфекциях | |||
Суммарные титры ПЭГ-мутеинов | |||
Титр (МЕ/мЛ) | |||
Мутация | ID Мутеина | Транзиент. | Стаб. клетки |
Y487C | ПЭГ1 | 0,07 | N/A |
L491C | ПЭГ2 | 0,60 | 1,96 |
K496C | ПЭГ3 | 0,45 | N/A |
L504C | ПЭГ4 | 0,38 | 5,57 |
Q468C | ПЭГ5 | 0,69 | 8,14 |
K1808C | ПЭГ6 | 0,54 | 2,73 |
N1810C | ПЭГ7 | 0,21 | 0,5 |
Т1812С | ПЭГ8 | 0,16 | N/A |
К1813С | ПЭГ9 | 0,35 | 7,74 |
Y1815C | ПЭГ10 | 0,09 | N/A |
D1795C | ПЭГ11 | 0,27 | N/A |
Q1796C | ПЭГ12 | 0,29 | N/A |
R1803C | ПЭГ13 | 0,11 | N/A |
K1804C | ПЭГ14 | 0,18 | 1,14 |
L491C/K1808C | ПЭГ2+6 | 0,11 | 2,48 |
L491C/K1804C | ПЭГ2+14 | 0,13 | 7,19 |
K377C | ПЭГ15 | 0,11 | 12,58 |
Н378С | ПЭГ16 | 0,15 | 0,97 |
K556C | ПЭГ17 | 0,09 | 0,15 |
N41C | ПЭГ18 | 0,05 | N/A |
N239C | ПЭГ19 | 0,16 | N/A |
N2118C | ПЭГ20 | 0,13 | N/A |
Y81C | ПЭГ21 | 0,36 | N/A |
F129C | ПЭГ22 | 0,25 | 2,55 |
K422C | ПЭГ23 | 0,28 | N/A |
K523C | ПЭГ24 | <0,05 | N/A |
K570C | ПЭГ25 | <0,05 | N/A |
N1864C | ПЭГ26 | 0,15 | N/A |
Т1911С | ПЭГ27 | 0,28 | N/A |
Q2091C | ПЭГ28 | 0,20 | N/A |
Q2284C | ПЭГ29 | 0,17 | N/A |
С630А | ПЭГ30 | <0,05 | 0,20 |
С1899А | ПЭГ31 | 0,30 | 1,80 |
ОЧИСТКА МУТЕИНОВ. После сбора супернатанта клеточной культуры, содержащего секретированный мутеиновый протеин FVIII, супернатант фильтровали через 0,2-микронный мембранный фильтр, чтобы удалить все оставшиеся клетки. Затем супернатант концентрировали либо посредством ультрафильтрации, либо с помощью анионного обмена. Затем его направляли на иммуноаффинную колонку, где компоненты среды культивирования клеток и большинство примесных протеинов хозяйских клеток удалялись. Затем элюат с иммуноаффинной колонки буферировали диафильтрацией в буферный состав, содержащий сахарозу, и замораживали. Выход и сбор протеина через колонку с моноклональными к FVIII антителами оценивали хромогенным анализом. Образцы нагруженных, протекающих через колонку, различных элюированных фракций, полосы и диафильтрованного элюата хроматографического исследования были проанализированы на FVIII-активность (Таблица 2). Таблица 2 показывает сбор ПЭГ2-мутеина с колонки с моноклональными антителами. Антитела представляют собой антитела C7F7. Процент сбора в Таблице 2 определен с помощью хромогенного анализа. Конечный выход составлял 73%. На Фигуре 2 показан график UV-поглощения при 280 нм относительно времени для ПЭГ2-протеина, очищенного через хроматографическую колонку с моноклональными антителами к FVIII. Хроматографию осуществляли с использованием хроматографической системы АКТА® Explorer 100 от Amersham Bioscience. В этой системе используется многоволновый UV-Visible монитор и пропускная ячейка 2 мм. ПЭГ2-мутеин элюирован с колонки в присутствии высшей соли, и пик элюирования указывается как поглощением при 280 нм, так анализом активности FVIII.
Таблица 2 | |
Сбор ПЭГ2-мутеина с колонки с моноклональными антителами к FVIII | |
Этап | % восстановления |
C7F7 нагруженный | 100 |
C7F7 в потоке | 1,1 |
C7F7 промытый | 0,2 |
C7F7 элюат | 86 |
C7F7 полоса | 0,0 |
C7F7 UF/DF | 73 |
ПЭГИЛИРОВАНИЕ. Нативный FVIII полной длины или BDD не может быть ПЭГ-илирован цистеин-специфичными ПЭГ без восстановления и денатурации при более чем 100-кратном избытке ПЭГ: протеиновое соотношение (данные не показаны) подтверждает гипотезу, основанную на модели структуры BDD, что все нативные цистеины образуют дисульфиды или находятся внутри FVIII. Цистеиновые FVIII-мутеины, экспрессированные и очищенные с использованием перечисленных выше стандартных протоколов, не могли бы быть ПЭГ-илированы цистеин-специфичным ПЭГ-малеимидным реагентом, предположительно, потому, что введенный FVIII-цистеин кэпирован посредством реакции с сульфгидрильными группами, такими как цистеин и β-меркаптоэтанол, присутствующими в среде роста клеток. Этот вопрос потенциально может быть решен элиминированием цистеинов и β-меркаптоэтанола из среды культивирования, но это может привести к снижению продукции FVIII, и не препятствовало бы сульфгидрилам, освобождаемым клетками, блокировать введенный FVIII-цистеин.
В другом аспекте изобретения был разработан трехстадийный метод, дающий возможность сайт-специфического ПЭГ-илирования FVIII (Фигура 3). На стадии 1 очищенный цистеиновый FVIII-мутеин в количестве около 1 мкМ мягко восстанавливали восстановителями, такими как примерно 0,7 мМ Трис(2-кабоксиэтил)фосфина (ТСЕР) или 0,07 мМ дитиотреитола (DTT), в течение 30 минут при 4°С, чтобы отделить «кэп». На стадии 2 восстановитель удаляли вместе с «кэпом» посредством метода гель-хроматографии (SEC), такого как прохождение образца через вращающуюся колонку (BioRad®), чтобы дать возможность дисульфидам FVIII реформироваться, оставляя при этом введенный цистеин свободным и восстановленным. На стадии 3 спустя, по крайней мере, 30 минут после удаления восстановителя освобожденный цистеиновый FVIII-мутеин обрабатывали, по крайней мере, 10-кратным молярным избытком ПЭГ-малеимида размерами в интервале от 5 до 64 кДа (Nektar Therapeutics и N.O.F. Corporation) в течение, по меньшей мере, 1 часа при 4°С. Этот метод дает профиль продукта, хорошо согласующийся с воспроизводимыми данными для множества реакций, повторенных различными исследователями.
Ввиду того что метод вращающейся колонки для удаления ТСЕР не является масштабным, была выбрана гель-фильтрационная хроматография с обессоливанием. Однако после проверки этого метода с использованием образца, меченного ТСЕР, было показано, что ТСЕР элюировался в измеряемом количестве в поры колонки и не прямо в солевую фракцию, как это ожидалось бы от молекулы с низким молекулярным весом. Вестерн-блот анализ показал значительный фон ПЭГ-илирования, вероятно, вследствие неполного удаления ТСЕР. В отдельных промежуточных экспериментах было показано, что очищенный C7F7-материал мог бы быть существенно очищен в дальнейшем от других примесных протеинов использованием среды анионообменной хроматографии, комбинированной с солевым градиентом. Затем было решено восстановить C7F7-материал с помощью ТСЕР, как описано выше, и потом обработать этот материал через анионообменную колонку. Вследствие различия в заряде, FVIII-протеин удерживался бы, в то время как ТСЕР протекал бы через колонку и не оставался. В то же самое время в течение элюирования в солевом градиенте FVIII-протеин очищался бы от большинства оставшихся примесных протеинов. Это означает, что позднее получающееся ПЭГ-илирование было бы теоретически более гомогенным при более чистом исходном материале. Однако после тестирования посредством образца, меченного ТСЕР, было показано, что измеримые уровни ТСЕР обнаруживались элюированными в градиенте с FVIII. Поэтому было решено после анионообменной хроматографии применить гель-фильтрационную хроматографию с обессоливанием, чтобы эти две стадии, последовательно использованные, приводили к полному удалению ТСЕР и исключению неспецифичного ПЭГ-илирования.
АНАЛИЗ ПЭГИЛИРОВАНИЯ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ (SDS-PAGE) И ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГА. ПЭГ-илированный продукт может быть проанализирован с помощью электрофореза на восстанавливающем 6% ТрисГлицин SDS-полиакриламидном геле (Invitrogen). При продолжении электрофореза гель может быть окрашен Кумасси Голубым (Coomassie Blue) для идентификации всех протеинов или быть подвергнут стандартному Вестерн-блот протоколу для идентификации рисунка ПЭГ-илирования в различных областях FVIII. Окрашивание блота мышиным моноклональным антителом R8B12 или C7F7, созданным к С-концевой области тяжелой цепи FVIII или N-концевой области легкой цепи FVIII соответственно, должно идентифицировать ПЭГ-илирование соответствующих цепей. Окрашивание с помощью 413-антитела к области 484-509 FVIII должно определить, является ли ПЭГ-илирование действительно сайт-специфичным или нет, для мутеинов, таких как ПЭГ1-4. Аналогично, окрашивание с помощью антитела CLB-CAg А, которое распознает область 1801-1823 FVIII, должно определить, является ли ПЭГ-илирование действительно сайт-специфичным или нет, для мутеинов, таких как ПЭГ6-10.
Было показано, что ПЭГ-илирование ПЭГ2 (L491C) является избирательным для тяжелой цепи относительно легкой цепи и особенно избирательным для области 484-509 (Фигура 4), в то время как ПЭГ6 (K1808C), как было показано, является избирательным для легкой цепи относительно тяжелой цепи (Фигура 5).
Для исследования, изображенного на Фигуре 4, ПЭГ2-мутеин (дорожки 1 и 8) восстанавливали с помощью ТСЕР, после чего ТСЕР удаляли (дорожки 2 и 9) и обрабатывали с помощью 5-, 12-, 22-, 33- или 43-кДа ПЭГ-малеимида (дорожки 3-7 и 10-14). НеПЭГ-илированный FVIII исследовался в виде необработанной (H+L) и обработанных полос тяжелой (Н) и легкой (L) цепей. Все три полосы обнаруживаются на геле, окрашенном Кумасси Голубым (внизу справа), в то время как Western-окрашивание специфичными к цепи антителами показало только непрореагировавшую и соответствующую цепь. При окрашивании R8B12 (вверху слева) полоса тяжелой цепи (Н) сильно уменьшалась в интенсивности, когда ПЭГ2 обрабатывали ПЭГ-малеимидом, и создавалась новая полоса, которая оказывалась выше, чем родительская Н-полоса, пропорционально размеру ПЭГ. При окрашивании C7F7 (внизу слева) полосы легкой цепи (L) (многочисленные полосы вследствие гетерогенного гликозилирования) не изменялись в интенсивности. Необработанная H+L полоса в обоих окрашиваниях сдвинута, поскольку Н-цепь является частью необработанного FVIII. Окрашивание Кумасси также подтверждает гораздо большее ПЭГ-илирование тяжелой цепи, т.е. уменьшение интенсивности Н-полосы, чем легкой цепи. Наконец, ПЭГ-илированные полосы теряют относительно больше в интенсивности при окрашивании 413-антителом (вверху справа), чем при окрашивании с помощью R8B12, в зависимости от размера ПЭГ, предположительно, вследствие сайт-специфичного ПЭГ-илирования в 491, которое блокирует связывание 413-антитела с 484-509. Количества FVIII, нанесенного на дорожку, составляют около 30 нг для двух левых гелей, около 1000 нг для верхнего правого геля и около 2000 нг для нижнего правого геля.
Восстановление, за которым следует удаление восстановителя, не изменяет миграции FVIII (дорожка 1 по сравнению с дорожкой 2 и дорожка 8 по сравнению с дорожкой 9). Добавление 22 кДа-ПЭГ к ПЭГ2 блокирует связывание 413-антитела, что согласуется со специфичным ПЭГ-илированием в положении 491 (Фигура 4, верхний правый гель). Это также предполагает, что ПЭГ-илированный ПЭГ2 будет иметь более низкую иммуногенность у человека, потому что 413-антитело, как было показано, имеет тот же самый эпитоп, что и ингибиторные антитела к А2 человека (Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, pp.665-71).
Для исследования, изображенного на Фигуре 5, ПЭГ6-мутеин восстанавливали с помощью ТСЕР, после чего ТСЕР удаляли (дорожки 1 и 6) и обрабатывали с помощью 5-, 12-, 22- или 33 кДа-ПЭГ-малеимида (дорожки 2-5 и 7-10). НеПЭГ-илированный FVIII исследовался в виде необработанной (H+L) и обработанных полос тяжелой (Н) и легкой (L) цепей. Ввиду мутированных остатков ПЭГ6 (K1808) на легкой цепи ПЭГ-илирование было обнаружено только на легкой цепи, но не на тяжелой. Количество FVIII, нанесенного на дорожку, составляет около 100 нг для левого геля и около 30 нг для правого геля.
BDD, который испытывался в качестве контроля, не показал какого-либо значительного ПЭГ-илирования после обработки более чем 100-кратным молярным избытком ПЭГ-малеимида, даже после описанной выше процедуры восстановления и удаления восстановителя (Фигура 6а). Этот же самый метод был применен к ПЭГ4 и ПЭГ5 (Фигура 6а). Если сравнивать с ПЭГ2, эти мутеины не были ПЭГ-илированы настолько эффективно, но они были избирательными к тяжелой цепи, подобно ПЭГ2 (L491C). Эффективность ПЭГ-илирования ПЭГ6 (К1808С) является относительно низкой, вероятно потому, что он очень близок к сайту N-связанного гликозилирования на N1810, который может блокировать ПЭГ-илирование в положении 1808. Поэтому нами был сконструирован ПЭГ7 (N1810C), чтобы удалить сайт нативного гликозилирования в 1810. ПЭГ7 показывает улучшенную эффективность ПЭГ-илирования по сравнению с ПЭГ6, если сравнивать их «голова к голове» (Фигура 6b). Аналогично, ПЭГ15 показывает несколько лучшую эффективность ПЭГ-илирования, чем ПЭГ2.
ПЭГ2+6, двойной мутант BDD, может быть ПЭГ-илирован как на тяжелой, так и на легкой цепи, поскольку ПЭГ2 является цистеиновой мутацией тяжелой цепи, в то время как ПЭГ6 представляет собой мутацию легкой цепи (Фигура 6с). Этот метод был применен также к FVIII дикого типа полной длины (Фигура 6d). ПЭГ-илирование было обнаружено для самого большого фрагмента тяжелой цепи, которая включает A1, A2 и большую часть В-домена. Рисунок ПЭГ-илирования дает основание полагать моноПЭГ-илирование, и что имеется лишь единственный ПЭГ-илированный цистеин.
АНАЛИЗ ПЭГИЛИРОВАНИЯ ПОСРЕДСТВОМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ТРОМБИНОМ И ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГА. ПЭГ-илированный продукт можно обработать тромбином (40 МЕ/мкг FVIII) при 37°C в течение 30 минут. Используемый тромбин содержит также АРС в качестве примеси. Расщепление тромбином приводит к появлению 50 кДа-A1- и 43 кДа-А2-домена из тяжелой цепи, в то время как расщепление АРС приводит далее к расщеплению А2-домена на фрагменты 21 и 22 кДа (Фигура 7). Окрашивание с помощью R8B12-антитела, которое распознает С-конец тяжелой цепи, будет идентифицировать только интактный А2-домен и 21 кДа-С-концевой фрагмент (FVIII 562-740). Таким образом, если ПЭГ-илирование ПЭГ2 было бы специфичным для положения 491, 43 кДа-А2-домен должен был бы быть ПЭГ-илированным, за исключением 21 кДа С-концевого фрагмента. Это было действительно подтверждено Вестерн-блоттингом для 22 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2, показанным на Фигуре 7. Таким образом, посредством элиминирования ПЭГ-илирование ПЭГ2 было локализовано на N-концевом 22 кДа-фрагменте (FVIII 373-561) А2-домена. Поскольку ПЭГ-малеимид является полностью избирательным к цистеинам при рН 6,8 и единственные нативные FVIII-цистеины в области 373-561 происходят из скрытого дисульфида между 528 и 554, весьма вероятно, что ПЭГ2 ПЭГ-илирован на введенном цистеине в положении 491. Western-окрашивание обработанного тромбином ПЭГ-илированного ПЭГ2 с помощью N-концевой части антитела к тяжелой цепи FVIII не показало ПЭГ-илирования А1-домена (данные не показаны). Избирательное ПЭГ-илирование ПЭГ2 с использованием метода тромбинового расщепления было также подтверждено для ПЭГ 5, 12, 33 и 43 кДа (данные не показаны). Расщепление тромбином ПЭГ-илированного FVIII дикого типа полной длины показывает, что ПЭГ-илирован только В-домен (Фигура 8).
АНАЛИЗ ПЭГИЛИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ ОКРАШИВАНИЯ ЙОДОМ. Чтобы подтвердить, что появившиеся новые полосы, выявленные окрашиванием Кумасси Голубым и Western, действительно являются полосами, свидетельствующими о ПЭГ-илировании, было применено окрашивание йодидом бария, которое является специфичным для ПЭГ (Фигура 9). ПЭГ-илированный ПЭГ2 исследовался на 6%-ном ТрисГлициновом геле (Invitrogen) и окрашивался R8В12-антителом к тяжелой цепи или раствором йодида бария (Lee et al., Pharm Dev Technol. 1999 4:269-275). ПЭГ-илированные полосы обнаруживались между двумя пятнами, используя маркер молекулярного веса для их выравнивания, подтверждая, таким образом, ПЭГ-илирование тяжелой цепи FVIII.
АНАЛИЗ ПЭГИЛИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ MALDI-MACC-СПЕКТРОСКОПИИ. Для подтверждения ПЭГ-илирования А2-домена в тяжелой цепи образец rFVIII до и после ПЭГ-илирования анализировали посредством масс-спектрометрии с использованием лазерной десорбции/ионизации в присутствии матрикса (MALDI). Образцы смешивали и кристаллизовали на мишеневом MALDI-планшете с матриксом из синапиновой кислоты в 30% ацетонитриле, 0,1% TFA. Затем их анализировали в спектрометре Voyager DE-PRO в положительном, линейном режиме. Результаты, представленные на Фигуре 10, показали, что легкая цепь ПЭГ2 имеет центр на 83 кДа, а тяжелая цепь (НС) - на 89 кДа. Полученный для ПЭГ-илированного образца спектр показал уменьшение НС-пика и образование нового пика с центром на 111 кДа. Это подтверждает ПЭГ-илирование тяжелой цепи. Никакого ПЭГ-илирования легкой цепи (на 105 кДа) выше предела обнаружения не наблюдалось.
Затем образцы подвергали расщеплению тромбином при 20 единицах тромбина/мг FVIII при 37°С в течение 30 минут и определяли концентрацию FVIII аминокислотным анализом (Commonwealth Biotechnologies, Inc.). Тяжелая цепь была расщеплена на 48 кДа (A1) N-концевую фракцию и 43 кДа (А2) фракцию. Полученный MALDI-спектр для ПЭГ-илированного образца (Фигура 11) показывает потерю пика 43 кДа и появление нового пика 65 кДа, вследствие ПЭГ-илированного А2-домена. ПЭГ-илирование легкой цепи выше предела обнаружения снова не наблюдалось. Эти результаты вновь подтверждают ПЭГ-илирование А2-домена FVIII. Такой же самый анализ был применен для ПЭГ-илированного ПЭГ6 и подтвердил ПЭГ-илирование А3С1С2-фрагмента легкой цепи (Фигура 12).
ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ
КОАГУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ. Тест-метод свертывания FVIII:С представляет собой одностадийный анализ, основанный на активированном парциальном тромбопластиновом времени (аРТТ). В присутствии Фактора IXa, кальция и фосфолипида FVIII действует как кофактор в ферментативном превращении Фактора Х в Ха. В этом анализе разведенные тестируемые образцы инкубируют при 37°С со смесью субстрата из FVIII-дефицитной плазмы и аРТТ-реагента. К инкубированной смеси добавляют хлорид кальция, и начинается коагуляция. Между временем (в секундах), которое требуется для образования сгустка, и логарифмом концентрации FVIII:C существует обратное соотношение. Уровни активности для неизвестных образцов интерполируют, сравнивая время свертывания различных разведений тестируемого материала с кривой, построенной из серий разведений стандартного материала с известной активностью, и выражают в Международных Единицах на мл (МЕ/мл).
ХРОМОГЕННЫЙ АНАЛИЗ. Метод хромогенного анализа состоит из двух последовательных стадий, где интенсивность цвета пропорциональна активности FVIII. На первой стадии Фактор Х активируют до FXa FIXаом с помощью его кофактора, FVIIIa в присутствии оптимальных количеств ионов кальция и фосфолипидов. Избыточные количества Фактора Х таковы, что скорость активирования Фактора Х зависит единственно от количества FVIII. На второй стадии Фактор Ха гидролизует хромогенный субстрат, давая хромофор, и интенсивность цвета считывается фотометрически при 405 нм. Вычисляется значение неизвестного, и достоверность анализа проверяется с помощью статистического метода тангенса угла наклона кривой. Активность выражают в Международных Единицах на мл (МЕ/мл).
Петля 1811-1818 вовлечена в связывание с FIX, однако важность индивидуальных положений внутри этой петли не была определена. Мутеины ПЭГ7-10 обнаруживают почти идентичную специфическую хромогенную активность относительно нативного FVIII (Таблица 3). Таблица 3 показывает в процентах специфическую активность (СА) ПЭГ-мутеинов и ПЭГ-илированного ПЭГ2 или ПЭГ6 относительно BDD. СА определяли делением хромогенной, коагуляционной активности или активности vWF-связывания на суммарное антигенное значение ELISA (ТАЕ). Затем СА ПЭГ-илированных мутеинов делили на СА BDD (8 МЕ/мкг хромогенной, 5 МЕ/мкг коагуляционной и 1 vWF/TAE) и умножали на 100, чтобы получить процент СА приведенный в Таблице 3 под заголовками «хромогенная», «коагуляционная» и «vWF/TAE».
Таблица 3 | ||||
Процент специфической активности (СА) ПЭГ-мутеинов и ПЭГ-илированных ПЭГ2 и ПЭГ6 относительно BDD | ||||
Мутация | Хромогенная | Коагуляционная | vWF/TAE | |
BDD | 100 | 100 | 100 | |
ПЭГ1 | Y487C | |||
ПЭГ2 | L491C | 125 | 130 | 138 |
ПЭГ2 красный | L491C | 137 | 141 | 98 |
ПЭГ2-5 кДа | L491C | 124 | 93 | 125 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ2-12 кДа | L491C | 118 | 25 | 71 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ2-22 кДа | L491C | 103 | 13 | 87 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ2-33 кДа | L491C | 130 | 17 | 59 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ2-43 кДа | L491C | 91 | 9 | 57 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ3 | K496C | |||
ПЭГ4 | L504C | |||
ПЭ5 | Q468C | 92 | ||
ПЭГ6 | K1808C | 83 | 60 | 100 |
ПЭГ6-33 кДа | K1808C | 42 | 6 | 90 |
ПЭГ | ||||
ПЭГ7 | N1810C | 100 | ||
ПЭГ8 | Т1812С | 100 | ||
ПЭГ9 | K1813C | 83 | ||
ПЭГ10 | Y1815C | 75 | ||
ПЭГ11 | D1795C | |||
ПЭГ12 | Q1796C | |||
ПЭГ13 | R1803C | |||
ПЭГ14 | K1804C | |||
ПЭГ2+6 | 491С/1808С | |||
ПЭГ15 | K377C | 82 | ||
ПЭГ16 | Н378С | 126 | ||
ПЭГ17 | K556C | 43 | ||
ПЭГ18 | N41C | 80 | ||
ПЭГ19 | N239C | |||
ПЭГ20 | N2118C | 127 | ||
ПЭГ21 | Y81C | |||
ПЭГ22 | F129C | 83 | ||
ПЭГ23 | K422C | |||
ПЭГ24 | K523C | |||
ПЭГ25 | K570C | |||
ПЭГ26 | N1864C | |||
ПЭГ27 | Т1911С | |||
ПЭГ28 | Q2091C | |||
ПЭГ29 | Q2284C |
Как показано в Таблице 3, «ПЭГ2 красный» - это ПЭГ2-мутеин, который был обработан восстановителем с последующим удалением последнего. Эта процедура восстановления незначительно изменяет три функциональные активности FVIII. ПЭГ2-мутеин, конъюгированный с ПЭГ, имеющими размер в интервале от 5 кДа (ПЭГ2-5кДа) до 43 кДа (ПЭГ2-43кДа), не теряет значительного количества хромогенной активности, но имеет гораздо более низкую коагуляционную активность, когда размер ПЭГ увеличивается за пределы 5 кДа. Возможно также умеренное уменьшение vWF-связывания для ПЭГ-илированного ПЭГ2 более крупного размера.
СУММАРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ ELISA (ТАЕ). FVIII переносят на микротитровальный планшет, который покрыт поликлональным антителом к FVIII. Связывание FVIII обнаруживается с помощью биотинилированного поликлонального антитела к rFVIII и конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (КСП). Пероксидаз-стрептавидиновый комплекс дает цветовую реакцию после добавления тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата. Концентрации образцов интерполируют со стандартной кривой, используя модели с четырьмя подходящими параметрами. Результаты FVIII выражают в мкг/мл.
ELISA vWF-СВЯЗЫВАНИЕ. FVIII давали связываться с vWF с сильно гемофильной плазмой в растворе. Затем комплекс FVIII-vWF переносили на микротитровальный планшет, покрытый vWF-специфичным моноклональным антителом. Связывание FVIII с vWF обнаруживается с помощью биотинилированного поликлонального антитела к rFVIII и конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (КСП). Пероксидаз-стрептавидиновый комплекс дает цветовую реакцию после добавления субстрата. Концентрации образцов интерполируют со стандартной кривой, используя модели с четырьмя подходящими параметрами. Результаты FVIII-связывания выражают в мкг/мл. Не было обнаружено какого-либо существенного влияния на любую из активностей после ПЭГ-илирования, которое согласовывалось бы с ПЭГ-илированием в В-домене.
Таблица 4 | ||||||||||
Специфическая активность (СА) FVIII дикого типа полной длины (KG-2) до и после ПЭГ-илирования посредством ПЭГ различного размера | ||||||||||
Образец | ТАЕ, мкг/мл | Коагуляционный анализ | Хромогенный анализ | vWF ELISA | ||||||
МЕ/мл | IU/ug | % Исх. | МЕ/мл | МЕ/мкг | % Исх. | мкг/мл | vWF/TAE | % Исх. | ||
KG-2 исходный | 1,31 | 4,8 | 3,6 | 100 | 5,60 | 4,3 | 100 | 0,42 | 0,32 | 100 |
Только восстан. | 0,93 | 3,1 | 3,4 | 93 | 4,08 | 4,4 | 103 | |||
KG-2-5кДа ПЭГ | 0,71 | 2,5 | 3,5 | 96 | 3,09 | 4,3 | 102 | |||
KG-2-12 кДа ПЭГ | 0,59 | 2,3 | 3,9 | 107 | 2,99 | 5,0 | 118 | |||
KG-2-22 кДа ПЭГ | 0,63 | 2,5 | 3,9 | 108 | 3,06 | 4,8 | 113 | 0,19 | 0,30 | 94 |
KG-2-30 кДа ПЭГ | 0,59 | 2,5 | 4,1 | 114 | 3,01 | 5,1 | 119 | 0,19 | 0,32 | 100 |
KG-2-43 кДа ПЭГ | 0,52 | 2,4 | 4,6 | 128 | 2,86 | 5,5 | 129 |
ОЧИСТКА ПЭГ-илированного FVIII ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ. ПЭГ-илированный FVIII пропускают через анион-обменную или катион-обменную колонку, где протеин связывается с колонкой, в то время как избыток свободного ПЭГ-реагента не связывается и удаляется, проходя через колонку. Затем ПЭГ-мутеин элюируют с колонки с помощью градиента хлорида натрия. Для подтверждения того что элюированные с колонки фракции содержат ПЭГ-илированный мутеин, использовали окрашенный йодидом бария 4-12% Бис-Трис-гель нагруженных, проходящих через колонку и обработанных в градиенте фракций.
ОЧИСТКА ПЭГ-илированного FVIII ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЕЙ Анион-обменные фракции, содержащие большую часть ПЭГ2-мутеина, объединяют и концентрируют с помощью ультрафильтрации, которую затем вводят в колонку, используемой в гель-хроматографии. Затем колонку элюируют, используя буферный состав. Вследствие различия в размере и форме протеина, в зависимости от того, связан ли ПЭГ с протеином, эта колонка отделяет ПЭГ-илированный ПЭГ2-мутеин от любого из остальных ПЭГ2, которые не ПЭГ-илированы. Фракции ПЭГ-илированного FVIII-мутеина объединяют на основании наличия значительной активности FVIII, затем замораживают для последующих исследований на животных и молекулярного исследования. На Фигуре 13 сравнивается элюирование неПЭГ-илированного ПЭГ2-мутеина с элюированием 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2-мутеина. ПЭГ-илированный ПЭГ2 элюирует значительно раньше, что указывает на увеличение его размера и формы от ковалентно присоединенного ПЭГ.
Что касается таких мутеинов, как ПЭГ6, которые показывают более низкую эффективность ПЭГ-илирования, т.е. менее 50%, то самой эффективной схемой очистки, дающей высокочистый моноПЭГ-илированный продукт, является использование комбинации катион-обменной хроматографии с последующей гель-хроматографией. Например, что касается ПЭГ6, катион-обменная хроматография очищает ПЭГ-илированный ПЭГ6 (ранее элюирующая фракция, Фигура 14) от большей части неПЭГ-илированного ПЭГ6 (позднее элюирующая фракция, Фигура 15). После этого с помощью гель-хроматографии ПЭГ-илированный протеин (ранее элюирующая фракция, Фигура 15) окончательно очищается от остатка неПЭГ-илированного протеина (позднее элюирующая фракция, Фигура 15).
ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРА ПЭГ НА АКТИВНОСТЬ. Чтобы проверить, влияют ли размеры ПЭГ на коагуляционную и хромогенную активности FVIII после ПЭГ-илирования, очищенный FVIII полной длины, ПЭГ2, ПЭГ6 и ПЭГ 14 восстанавливали с помощью ТСЕР с последующим удалением восстановителя и реакцией с буферным контролем или ПЭГ, имеющими размер в интервале от 6 кДа до 64 кДа. Полученный ПЭГ-илированный FVIII анализировали непосредственно, без удаления избытка ПЭГ или неПЭГ-илированного FVIII. Контрольные эксперименты показали, что избыток ПЭГ не влияет на активность FVIII.
На Фигуре 16 показаны результаты этого исследования. Очищенный FVIII полной длины представлен на Фигуре 16 как KG-2. Процент активности, показанный на Фигуре 16, определяли делением величины образца, обработанного ПЭГ после восстановления и удаления восстановителя, на величину образца, обработанного буферным контролем, принимая во внимание результат ПЭГ-илирования. Результат ПЭГ-илирования сравнивали со всеми ПЭГ для любого данного FVIII-конструкта. Он составляет примерно 80% для KG-2, ПЭГ2 и ПЭГ14 и около 40% для ПЭГ6. Например, обработанный буферным контролем ПЭГ14 имеет коагуляционную активность 6,8 МЕ/мл в отличие от 3,2 МЕ/мл для 12 кДа-ПЭГ-илированного образца ПЭГ14. Однако эффективность ПЭГ-илирования составляла около 80%, и значение 3,2 МЕ/мл представляет собой агрегатную активность примерно 80% ПЭГ-илированного и 20% неПЭГ-илированного. Полагая, что неПЭГ-илированный образец имеет такую же активность, что и обработанный буферным контролем ПЭГ14, процент активности неПЭГ-илированного к ПЭГ-илированному ПЭГ14 составляет 34%=(3,2-6,8 раза 20%)/(6,8 раза 80%).
ПЭГ-илирование внутри А2- или А3-домена в положении ПЭГ2, ПЭГ6 и ПЭГ14 BDD ведет к большой потере коагуляционной активности, когда размер ПЭГ увеличивается за пределы 6 кДа. Однако ПЭГ-илирование внутри В-домена в цистеине В-домена нативного FVIII полной длины не влияет на коагуляционную активность. Интересно, что хромогенная активность всех ПЭГ-илированных конструктов не изменяется. Это может быть обусловлено различиями в анализах. Возможно, субстрат небольшого хромогенного пептида имеет более легкий доступ к ПЭГ-илированному комплексу FVIII/FIX/FX, чем субстрат более крупного протеина, используемый в коагуляционном анализе. Альтернативно, ПЭГ может влиять на активацию мутеина. Это было бы легче обнаружить с помощью одностадийного коагуляционного анализа, чем двухстадийным хромогенным анализом.
Для подтверждения наблюдаемых ПЭГ-эффектов на коагуляционную активность ПЭГ2, 6 и 14 несколько ПЭГ-илированных конструктов были очищены от избытка ПЭГ и неПЭГ-илированного материала. Поскольку ПЭГ никак не влияет на хромогенную активность, отношение хромогенной активности к коагуляционной хорошо оценивается по относительному воздействию ПЭГ на коагуляционную активность (Таблица 5). Более крупные ПЭГ в данном положении, такие как ПЭГ2 и большее количество ПЭГов, как в данном случае с конструктом ПЭГ2+6, вызывают более высокую потерю коагуляционной активности.
Таблица 5 | |||
Соотношение хромогенной и коагуляционной активности для очищенного ПЭГ-илированного BDD | |||
ПЭГ-илированный BDD | Хромогенная МЕ/мл/Коагуляционная МЕ/мл | ||
ID-образец | ПЭГ | Необработанное отношение | Отношение относительно BDD |
BDD | без ПЭГ | 1,7 | 1 |
ПЭГ2 (пул 2) | 22 кДа 491 | 9 | 5 |
ПЭГ2 | 43 кДа* 491 | 25 | 15 |
ПЭГ6 | 12 кДа 1808 | 5 | 3 |
ПЭГ6 (прежний) | 33 кДа 1808 | 13 | 7 |
ПЭГ6 (новый) | 33 кДа 1808 | 8 | 5 |
ПЭГ2+6 (LSP25) | 33 кДа в 491, Моно | 10 | 6 |
ПЭГ2+6 (LSP22) | 33 кДа в 491/1808, Ди | 24 | 14 |
ПЭГ2+6 (ESP) | 33 кДа в 491/1808/А3, Три | 60 | 35 |
ПЭГ22 | 64 кДа*129 | 14 | 8 |
ПЭГ14 | 12 кДа 1804 | 3,2 | 1,9 |
ПЭГ14 | 20 кДа*1804 | 4,2 | 2,5 |
ПЭГ14 | 33 кДа 1804 | 5 | 2,9 |
ПЭГ2+14 (ESP19) | 33 кДа в 491/1804, Ди | 21 | 12 |
* разветвленный ПЭГ |
РК ИССЛЕДОВАНИЕ КРОЛИКА. Чтобы понять влияние ПЭГ-илирования на фармакокинетику (РК) FVIII, РК-исследования проводили на ряде видов. Для исследования были использованы NZW SPF-кролики: 10 самок, 5 кроликов в группе, 2 группы (ПЭГ2 FVIII и 22 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2). Образцы разводили в стерильном PBS с конечной концентрацией 100 МЕ/мл (хромогенные единицы). Каждому кролику вводили в крайнюю ушную вену дозу в 1 мл/кг (100 МЕ/кг) разведенного тестируемого или контрольного вещества. В различное после введения время отбирали образцы крови (1 мл) в 1 мл-шприц (наполненный 100 мкл 3,8%-ного Na-цитрата) из центральной ушной артерии в заданные периоды времени после введения дозы. Образцы плазмы инкубировали R8B12-антителом к тяжелой цепи, помещенным на 96-луночный планшет, для специфичного захвата вводимого человечьего FVIII. Активность захваченного FVIII определяли хромогенным анализом (Фигура 17). ПЭГ-илированный ПЭГ2 и ПЭГ-илированный ПЭГ6 сравнивались также с BDD (Фигуры 18 и 19), при этом количество выделенных ПЭГ-илированных мутеинов из плазме стало более высоким по сравнению с количеством BDD. ПЭГ-илированный FVIII дикого типа полной длины явно не проявил такого свойства (Фигура 20).
РК ИССЛЕДОВАНИЕ МЫШИ. В качестве второго вида в РК исследованиях использовались ICR-нормальные или гемофильные, FVIII-дефицитные мыши (Taconic, Гудзон, Нью-Й.). Нормальные мыши использовались для исследования; по 5 мышей в группе за один период времени. Тестируемые материалы разводили в составном буфере до номинальной конечной концентрации 25 МЕ/мл. Каждой мыши вводили 4 мл/кг (~0,1 мл от общего объема) разведенного тестируемого материала через хвостовую вену. Образцы крови (0,45 или 0,3 мл для исследования нормальной или гемофильной мыши соответственно) отбирали в 1 мл-шприц (наполненный 50 или 30 мкл 3,8%-ного Na-цитрата для исследования нормальной или гемофильной мыши соответственно) из нижней полой вены в заданный период времени (одно животное на образец). Образцы плазмы анализировали на концентрацию FVIII, используя описанный выше метод хромогенного анализа. Большее количество ПЭГ-илированного ПЭГ6 выделяется из плазмы по сравнению с BDD или ПЭГ6 (Фигура 21). Большее количество ПЭГ-илированного ПЭГ2 выделяется из плазмы по сравнению с BDD (Фигуры 22 и 23).
Таблица 6 | ||
Итоговые результаты РК-исследования ПЭГ-илированного FVIII, показывающие период полувыведения из плазмы в часах. *Начальный препарат 33 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ6 с периодом полувыведения 9,6 ч у кроликов был не таким чистым, как последующий препарат, который дал период полувыведения 17,4 ч | ||
Конструкт | Период полувыведения, ч | Виды |
BDD | 6.6 | Нормальный кролик |
ПЭГ2 | 4.8 | Нормальный кролик |
ПЭГ2-22 кДа ПЭГ | 7.5 | Нормальный кролик |
ПЭГ2-43 кДа ПЭГ | 8.0 | Нормальный кролик |
ПЭГ6-12 кДа ПЭГ | 8.2 | Нормальный кролик |
ПЭГ6-33 кДа ПЭГ* | 9.6 | Нормальный кролик |
ПЭГ6-33 кДа ПЭГ | 17.4 | Нормальный кролик |
BDD | 4.5 | Нормальная мышь |
ПЭГ2-22 кДа ПЭГ | 7.3 | Нормальная мышь |
ПЭГ6-12 кДа | 5.3 | Нормальная мышь |
ПЭГ14-33 кДа ПЭГ | 7.3 | Нормальная мышь |
ПЭГ14-12 кДа ПЭГ | 5.5 | Нормальная мышь |
ПЭГ22-64 кДа | 9.2 | Нормальная мышь |
Таблица 7 | ||
Сбор ПЭГ-илированных ПЭГ-мутеинов из плазмы у гемофильных мышей. Показано количественное улучшение сбора из плазмы при постинъекционном периоде 16 часов по сравнению с BDD-контролем, проведенным при таких же условиях | ||
Мутеин | ПЭГ | Количество раз |
ПЭГ 6 | 12 кДа | 2.9 |
ПЭГ 6 | 33 кДа | 2.9 |
ПЭГ 2+6 | 33 кДа | 3.3 |
ПЭГ 14 | 33 кДа | 2.5 |
ПЭГ 2+6 | 33 кДа | 4.4 |
ПЭГ 2+14 | 33 кДа | 2.1 |
ПЭГ 22 | 64 кДа | 3.2 |
СБОР (BDD) ФАКТОРА VIII ГЕМОФИЛЬНОЙ МЫШИ. Гистограмма сбора (BDD) Фактора VIII гемофильной мыши, показанная на Фигуре 24, иллюстрирует фармакокинетическую (РК) оценку периода полувыведения двух видов BDD-Фактора VIII в анализе гемофильной мыши. Этот анализ был проведен для измерения концентрации в плазме как BDD-Фактора VIII (обозначен на Фигуре 24 как «wt» или BDD-Фактора VIII дикого типа), так и ПЭГ 2+6 двойного ПЭГ-илированного варианта BDD-Фактора VIII (и идентифицированного здесь как L491C, K1808 двойной вариант BDD-Фактора VIII) в трех временных точках после внутривенного введения в мышиную модель. В то время как оценки для времени 0,8 и 4 часа были сравнимы, 16-часовая оценка заслуживает особого внимания. Что касается 16-и часов, то спустя 16 часов после введения в мышиной плазме оставалось примерно в четыре раза (400%) больше варианта двойного ПЭГ-илированного BDD Фактора VIII (ПЭГ 2+6) по сравнению с неПЭГ-илированной молекулой.
МОДЕЛЬ РАЗРЫВА ПОЧКИ. Чтобы определить, являются ли ПЭГ-илированные FVIII-мутеины эффективными для прекращения кровотечения у гемофильной мыши, использовалась модель разрыва почки. Гемофильную мышь (C57/BL6 с нарушенным FVIII-геном) анестезировали под изофлуораном и взвешивали. Обнажали нижнюю полую вену и вводили 100 мкл либо физиологического раствора, либо FVIII, используя калибровочную иглу 31-го размера. Иглу аккуратно удаляли и прилагали давление к месту инъекции на 30-45 секунд, чтобы предотвратить кровотечение. Спустя две минуты правую почку обнажали и удерживали между зажимами вдоль вертикальной оси. Используя скальпель №15, почку надрезали горизонтально на глубину 3 мм. Для обеспечения равномерности глубины повреждения почку слегка придерживали в средней части, чтобы обнажилась одинаковая ткань на каждой стороне зажима. Обнаженную поверхность почки разрезали до глубины зажима. Потерю крови подсчитывали, как описано выше. Для определения соотношения дозы и ответа FVIII на почечное кровотечение на мышах тестировались различные дозы FVIII. ПЭГ-илированный ПЭГ2 показывает сравнимую с BDD активность уменьшения потери крови после повреждения почки мыши (Фигура 25). Таким образом, хотя коагуляционная активность ПЭГ-илированного ПЭГ2 ниже, чем у BDD, данная модель разрыва почки показывает, что эффективность in vivo ПЭГ-илированного ПЭГ2 не была заметно снижена по сравнению с BDD, что согласуется с данными хромогенного анализа.
АНАЛИЗ ИНГИБИРОВАНИЯ АНТИТЕЛАМИ. Добавление полимера с высоким молекулярным весом, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ), специфично в положение 491 (т.е. ПЭГ2) должно уменьшать связывание с и чувствительность к mАВ 413, в значительной мере увеличивая долю ингибиторных антител у пациентов, поскольку у многих пациентов вырабатываются ингибиторные антитела к этому же самому эпитопу mАВ 413. Чтобы проверить это, увеличивающиеся количества mАВ 413 инкубировали с ненасыщающими количествами (0,003 МЕ/мл) BDD или 43 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ2 и тестировали на функциональную активность хромогенным анализом (Фигура 26). В качестве контроля использовали R8B12, неингибиторное антитело, и ESH4, ингибиторное антитело, нацеленное на С2-домен. ПЭГ-илированный ПЭГ2 действительно более устойчив к ингибированию mAB 413, чем BDD, и показывает сходный рисунок ингибирования в присутствии контрольных антител, которые не связываются вблизи положения 491. Кроме того, защитный эффект ПЭГ против ингибирования mAB 413 зависит от размера ПЭГ, при этом чем крупнее ПЭГ, тем сильнее эффект (Фигура 27). Чтобы проверить, является ли ПЭГ-илированный FVIII более устойчивым к ингибиторным антителам у пациентов, хромогенную активность измеряли в присутствии ряд выбранных образцов плазмы, происходящей от пациентов с гемофилией А, у которых выработались ингибиторы к FVIII. В 8 протестированных образцах плазмы пациентов 43 кДа-ПЭГ-илированный ПЭГ2 был более устойчивым к ингибированию плазмы пациентов, чем BDD в 4 образцах плазмы пациентов. Например, ПЭГ-илированный ПЭГ2, ПЭГ6 или ПЭГ2+6 показали более высокую остаточную активность, чем BDD в плазме одного пациента по сравнению с другой плазмой (Фигура 28). ДиПЭГ-илированный ПЭГ2+6, по-видимому, является более устойчивым, чем моноПЭГ-илированный ПЭГ2 или ПЭГ6. Эти результаты дают основание полагать, что ПЭГ-илированные ПЭГ-мутеины могут быть более эффективными при лечении пациентов, у которых вырабатываются ингибиторы к FVIII.
ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЙ СКРИНИНГ ПЭГИЛИРОВАНИЯ. Эффективность ПЭГ-илирования конкретного ПЭГ-мутеина непредсказуема, особенно ввиду того, что не имеется прямой структурной информации о BDD. Например, основываясь на структурной модели BDD, можно предсказать, что эффективность ПЭГ-илирования ПЭГ4 или ПЭГ5 должна быть очень высокой, подобно активности ПЭГ2 и ПЭГ15, поскольку все три положения находятся на поверхности и обращены кнаружи в соответствии со структурой. Таким образом, чтобы использовать ПЭГ для поиска нового механизма выведения через систематическое ПЭГ-илирование потребуется скринировать большое число мутеинов.
Чтобы быстро скринировать большое число ПЭГ-мутеинов, был разработан новый высокопроизводительный метод, с помощью которого можно проверить эффективность ПЭГ-илирования и функциональную активность ПЭГ-илированных продуктов от транзиентно трансфецированных мутеинов. Только 5-10 мл транзиентно экспрессированных ПЭГ-мутеинов с таким малым хромогенным значением FVIII, как 0,1-0,2 МЕ/мл, концентрируют примерно в 50 раз, используя устройство MWCO 30K Amicon-centra Ultra, так что концентрация FVIII достигает более 1 нМ, почти приближаясь к величине сродства антитела для взаимодействия с FVIII. Концентрированный ПЭГ-мутеин (~300 мкл) инкубируют с ~30 мкл полимера C7F7-антитела к FVIII в течение ночи при 4°С, промывают, элюируют, подвергают диализу и восстанавливают. Восстановитель удаляют и восстановленные ПЭГ-мутеины ПЭГ-илируют и исследуют с помощью Western-анализа, как описано выше (Фигуры 29 и 30). Относительная эффективность ПЭГ-илирования транзиентно экспрессированных ПЭГ-мутеинов точно соответствует таковой очищенных ПЭГ-мутеинов.
Этим методом можно скринировать множество ПЭГ-мутеинов за один-два месяца. Например, ПЭГ14 (K1804C BDD) имел, по меньшей мере, около 80% ПЭГ-илирования в легкой цепи 12 кДа-ПЭГом и не имел ПЭГ-илирования в тяжелой цепи (данные не показаны), что согласуется с K1804C-мутацией, расположенной на легкой цепи. На основании структуры BDD Сα-Сβ расстояние между K1804 и K1808 (ПЭГ6-положение) составляет только 8,4 ангстрема, и можно предположить, что введение 43 кДа-ПЭГ в это положение приведет к улучшению РК, подобному для 33 кДа-ПЭГ-илированного ПЭГ6 с намного лучшим результатом ПЭГ-илирования. Относительный результат ПЭГ-илирования для всех протестированных ПЭГ-мутеинов подытожен в Таблице 8. ПЭГ-илирование было высокоизбирательным для той конкретной цепи FVIII, где была введена цистеиновая мутация и в которой каждый мутеин с цистеином в тяжелой цепи становится ПЭГ-илированным только на тяжелой цепи, в то время как каждый мутеин с цистеином в легкой цепи становится ПЭГ-илированным только на легкой цепи. Номера мутеинов 2-31 представляют цистеиновые мутации замещения нативной аминокислоты в BDD в положении, обозначенном цистеином. ПЭГ2+6 является двойным мутеином BDD, где положения 491 и 1808 были замещены цистеинами. А1 и А2 (и В-домен для KG-2, FVIII полной длины) принадлежат тяжелой цепи, в то время как A3, С1 и С2 принадлежат легкой цепи. Эффективность ПЭГ-илирования оценивали по исследованию ПЭГ-илированных продуктов на SDS PAGE, сравнивая интенсивности ПЭГ-илированной полосы с неПЭГ-илированной полосой: +++ ~>80% результат ПЭГ-илирования, ++ ~30-70% результат, + ~10-30% результат и - ~<10% результат.
Таблица 8 | ||||
Эффективность ПЭГ-илирования для различных ПЭГ-илированных FVIII | ||||
ПЭГ-мутеин | Положение | Домен | Н-ПЭГ | L-ПЭГ |
2 | 491 | А2 | +++ | - |
4 | 504 | А2 | + | - |
5 | 468 | А2 | + | - |
6 | 1808 | A3 | - | ++ |
7 | 1810 | A3 | - | ++ |
8 | 1812 | A3 | - | - |
9 | 1815 | A3 | - | - |
11 | 1795 | A3 | - | + |
12 | 1796 | A3 | - | + |
13 | 1803 | A3 | - | ++ |
14 | 1804 | A3 | - | +++ |
15 | 377 | А2 | +++ | - |
16 | 378 | А2 | +++ | - |
17 | 556 | А2 | ++ | - |
20 | 2118 | A3 | - | + |
21 | 81 | А1 | ++ | - |
22 | 129 | А1 | ++ | - |
23 | 422 | А2 | - | - |
25 | 570 | А2 | - | - |
26 | 1864 | A3 | - | ++ |
27 | 1911 | A3 | - | +++ |
28 | 2091 | С1 | - | ++ |
29 | 2284 | С2 | - | + |
ПЭГ-мутеин | Положение | Домен | н-ПЭГ | L-ПЭГ |
30 | 711 | А2 | + | - |
31 | 1903 | A3 | - | ++ |
2+6 | 490/1808 | А2/А3 | +++ | ++ |
2+14 | 490/1804 | А2/А3 | +++ | +++ |
KG-2 | В | +++ | - |
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОССТАНОВЛЕННЫХ ПЭГ-МУТЕИНОВ. Чтобы определить идентичность «кэпа», который предотвращает прямое ПЭГ-илирование ПЭГ-мутеинов или FVIII полной длины, ПЭГ2+14 восстанавливали с помощью ТСЕР при концентрациях в интервале от 67 мкМ до 670 мкМ. Результат ПЭГ-илирования улучшался пропорционально увеличению количества ТСЕР (Фигура 31). Те же самые образцы анализировали также масс-спектроскопией до ПЭГ-илирования (Фигура 32). Для того чтобы получить протеиновый домен, который можно было бы изучать непосредственно, образцы расщепляли тромбином при соотношении 20 единиц/мг FVIII в течение 30 минут при 37°С. Расщепление тромбином производит А2-фрагмент, который включает остатки 372-740 и не занят сайтами гликозилирования. Расщепленные образцы вводили в систему жидкостной хроматографии с обращенной фазой С4 и элюент с колонки вводили непосредственно в квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр через распылительный интерфейс. Масс-спектр от нижней части хроматографического пика, соответствующего А2-домену, развертывался, чтобы дать значение массы интактного протеина. До восстановления А2-домен ПЭГ2+14 давал массу, которая на 118 дальтон больше, чем предсказывалось теоретически. Когда концентрация ТСЕР увеличивается, появляется новый пик, который имеет точную предсказанную массу А2-домена. Доля этого нового пика возрастает при увеличении концентрации ТСЕР. Разница в 118 дальтон может быть отнесена на счет цистеинилирования на остатке Cys 491 через образование дисульфида с цистеином (119 Да) и инструментальной погрешности. Таким образом, это показывает, что ПЭГ-мутеины кэпированы цистеином, что предотвращает непосредственное ПЭГ-илирование.
Все раскрытые здесь ссылки включены сюда во всей их полноте.
Claims (12)
1. Конъюгат с прокоагулянтной активностью фактора VIII, представляющий собой мутированный полипептид фактора VIII с SEQ ID NO:3, в котором нецистеиновый остаток в положении 41, 129, 377, 378, 491, 468, 556, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815 и/или 2118 согласно нумерации остатков в SEQ ID NO:4 замещен цистеиновым остатком, где мутированный полипептид фактора VIII ковалентно соединен с полиэтиленгликолем по мутантному цистеиновому остатку.
2. Конъюгат по п.1, где полиэтиленгликоль содержит метоксиполиэтиленгликоль.
3. Конъюгат по п.2, где метоксиполиэтиленгликоль имеет размер в интервале от 5 до 64 кДа.
4. Конъюгат по п.1, где связывание ингибиторных антител фактора VIII с конъюгатом меньше, чем с фактором VIII с делегированным В-доменом.
5. Конъюгат по п.1, где полиэтиленгликоль присоединен к мутированному полипептиду фактора VIII в положении аминокислоты 1804 согласно нумерации остатков в SEQ ID NO:4.
6. Способ получения конъюгата с прокоагулянтной активностью фактора VIII, предусматривающий:
мутирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный полипептид фактора VIII с SEQ ID NO:3, для замещения кодона нецистеинового аминокислотного остатка в положении 41, 129, 377, 378, 491, 468, 556, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815 и/или 2118 согласно нумерации остатков в SEQ ID NO:4 кодоном цистеинового аминокислотного остатка;
экспрессию мутированной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, которую культивируют в клеточной культуральной среде, содержащей сульфгидрильные группы;
очистку мутеина;
контактирование мутеина с восстановителем при условиях, в которых мутеин мягко восстанавливается и высвобождаются сульфгидрильные группы;
удаление высвободившихся сульфгидрильных групп и восстановителя из мутеина;
реагирование мутеина с полиэтиленгликолем, который активирован для реакции с восстановленными цистеиновыми остатками с помощью сульфгидрильного фрагмента, спустя, по меньшей мере, около 5 мин после удаления восстановителя;
очистку конъюгата.
мутирование нуклеотидной последовательности, которая кодирует функциональный полипептид фактора VIII с SEQ ID NO:3, для замещения кодона нецистеинового аминокислотного остатка в положении 41, 129, 377, 378, 491, 468, 556, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815 и/или 2118 согласно нумерации остатков в SEQ ID NO:4 кодоном цистеинового аминокислотного остатка;
экспрессию мутированной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, которую культивируют в клеточной культуральной среде, содержащей сульфгидрильные группы;
очистку мутеина;
контактирование мутеина с восстановителем при условиях, в которых мутеин мягко восстанавливается и высвобождаются сульфгидрильные группы;
удаление высвободившихся сульфгидрильных групп и восстановителя из мутеина;
реагирование мутеина с полиэтиленгликолем, который активирован для реакции с восстановленными цистеиновыми остатками с помощью сульфгидрильного фрагмента, спустя, по меньшей мере, около 5 мин после удаления восстановителя;
очистку конъюгата.
7. Способ по п.6, в котором мутеин реагирует с малеимидными группами на полиэтиленгликоле.
8. Способ по п.6, в котором высвободившуюся сульфгидрильную группу и восстановитель удаляют из мутеина посредством вытеснительной по размеру молекул или ионообменной хроматографии.
9. Способ по п.6, в котором сульфгидрильный фрагмент ПЭГ выбирают из группы, состоящей из тиольного, трифлатного, трезилатного, азиридинового, оксиранового, S-пиридильного и малеимидного фрагментов.
10. Способ по п.6, в котором полиэтиленгликоль представляет собой ПЭГ-малеимид и имеет размер в интервале от 5 до 64 кДа.
11. Фармацевтическая композиция с прокоагулянтной активностью фактора VIII для парентерального введения, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата по п.1 и фармацевтически приемлемый адъювант.
12. Способ лечения гемофилии, предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества композиции по п.11.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62727704P | 2004-11-12 | 2004-11-12 | |
US60/627,277 | 2004-11-12 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007121517A RU2007121517A (ru) | 2008-12-20 |
RU2423380C2 true RU2423380C2 (ru) | 2011-07-10 |
Family
ID=36337298
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007121517/10A RU2423380C2 (ru) | 2004-11-12 | 2005-11-14 | Сайт-направленная модификация fviii |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7632921B2 (ru) |
EP (9) | EP2772500B1 (ru) |
JP (5) | JP2008524117A (ru) |
KR (7) | KR20180110192A (ru) |
CN (6) | CN103102406B (ru) |
AU (1) | AU2005304622B2 (ru) |
BR (2) | BR122016022033B8 (ru) |
CA (1) | CA2586379C (ru) |
CY (3) | CY1119292T1 (ru) |
DK (3) | DK2363414T3 (ru) |
ES (4) | ES2633916T3 (ru) |
FR (1) | FR19C1031I2 (ru) |
HK (3) | HK1117875A1 (ru) |
HN (1) | HN2007015683A (ru) |
HR (2) | HRP20180481B1 (ru) |
HU (5) | HUE033776T2 (ru) |
IL (3) | IL182903A (ru) |
LT (5) | LT2371856T (ru) |
LU (1) | LUC00118I2 (ru) |
MA (1) | MA29663B1 (ru) |
MX (2) | MX2007005466A (ru) |
NL (1) | NL300989I2 (ru) |
NO (3) | NO20210454A1 (ru) |
NZ (1) | NZ555032A (ru) |
PH (2) | PH12014500352A1 (ru) |
PL (3) | PL1824988T3 (ru) |
PT (4) | PT1824988T (ru) |
RU (1) | RU2423380C2 (ru) |
SI (4) | SI2363414T1 (ru) |
UA (1) | UA95225C2 (ru) |
WO (1) | WO2006053299A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200703696B (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2631801C2 (ru) * | 2012-05-22 | 2017-09-26 | Имнейт Сарл | Фактор коагуляции viii с уменьшенной иммуногенностью |
RU2695428C2 (ru) * | 2014-01-20 | 2019-07-23 | Октафарма Аг | СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ФАКТОРА VIII, ИМЕЮЩЕГО УЛУЧШЕННОЕ СООТНОШЕНИЕ FVIII:C/FVIII:Ag |
RU2789085C2 (ru) * | 2018-05-18 | 2023-01-30 | Чжэнчжоу Дженсайнсес Инк. | Улучшенный белок слияния fviii и его применение |
Families Citing this family (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2338333B1 (en) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
WO2006005058A2 (en) | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymer-factor ix moiety conjugates |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
SI2586456T1 (sl) | 2004-10-29 | 2016-05-31 | Ratiopharm Gmbh | Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF) |
WO2006053299A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of fviii |
EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
EP2360170A3 (en) | 2005-06-17 | 2012-03-28 | Novo Nordisk Health Care AG | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
US20090252720A1 (en) * | 2006-05-24 | 2009-10-08 | Novo Nordisk Health Care Ag | Prolonged FIX Analogues and Derivatives |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
DK2101821T3 (da) | 2006-12-15 | 2014-10-06 | Baxter Healthcare Sa | Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo |
ES2406267T3 (es) | 2007-04-03 | 2013-06-06 | Biogenerix Ag | Métodos de tratamiento usando G-CSF glicopegilado |
WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
KR20100095441A (ko) * | 2007-11-09 | 2010-08-30 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법 |
PL2257311T3 (pl) * | 2008-02-27 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Koniugaty cząsteczek czynnika VIII |
CN102112144A (zh) | 2008-05-16 | 2011-06-29 | 拜耳医药保健有限公司 | 靶向性凝固因子及其使用方法 |
KR20110017420A (ko) * | 2008-06-04 | 2011-02-21 | 바이엘 헬스케어 엘엘씨 | 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 fviii 뮤테인 |
KR101648734B1 (ko) | 2008-06-24 | 2016-08-18 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 viii, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체 |
WO2010019263A2 (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-18 | Genzyme Corporation | Soluble flt constructs for treating cancers |
KR20110071012A (ko) * | 2008-10-17 | 2011-06-27 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 낮은 수준의 수용성 중합체를 포함하는 개질된 혈액 인자 |
EP2352515A4 (en) * | 2008-11-03 | 2012-04-25 | Bayer Healthcare Llc | METHOD FOR TREATING HEMOPHILIA |
JP2012510060A (ja) * | 2008-11-24 | 2012-04-26 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおけるpeg化血液凝固因子の活性の測定方法 |
EP2387413A4 (en) * | 2009-01-19 | 2015-12-23 | Bayer Healthcare Llc | PROTEIN CONJUGATE WITH AN ENDOPEPTIDASE-SPLICABLE BIOPROTEKTIVES PART |
MX362028B (es) | 2009-02-03 | 2019-01-04 | Amunix Pharmaceuticals Inc | Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos. |
CN102333788A (zh) * | 2009-02-19 | 2012-01-25 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 因子viii的修饰 |
EP2408800B1 (en) * | 2009-03-20 | 2016-05-25 | Hanmi Science Co., Ltd. | Method for preparing a site-specific conjugate of a physiologically active polypeptide |
CN102427823A (zh) * | 2009-03-24 | 2012-04-25 | 拜耳医药保健有限公司 | 因子viii变体及使用方法 |
JP5908401B2 (ja) | 2009-07-27 | 2016-04-26 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | 血液凝固タンパク質複合体 |
HUE028056T2 (en) | 2009-07-27 | 2016-11-28 | Baxalta GmbH | Blood coagulation protein conjugates |
WO2011012850A2 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Lipoxen Technologies Limited | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
US8642737B2 (en) | 2010-07-26 | 2014-02-04 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
US8809501B2 (en) | 2009-07-27 | 2014-08-19 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
AU2010290077C1 (en) * | 2009-08-24 | 2015-12-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
ES2880038T3 (es) | 2009-12-06 | 2021-11-23 | Bioverativ Therapeutics Inc | Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos |
US8765432B2 (en) | 2009-12-18 | 2014-07-01 | Oligasis, Llc | Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates |
CN102770449B (zh) | 2010-02-16 | 2016-02-24 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 具有降低的vwf结合的因子viii分子 |
RS59827B1 (sr) * | 2010-02-21 | 2020-02-28 | Bayer Healthcare Llc | Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula |
CN106432557A (zh) | 2010-04-15 | 2017-02-22 | 科迪亚科学企业公司 | 高分子量的含两性离子的聚合物 |
GB201007356D0 (en) | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Leverton Licence Holdings Ltd | Conjugated factor VIIa |
GB201007357D0 (en) * | 2010-04-30 | 2010-06-16 | Leverton Licence Holdings Ltd | Conjugated factor VIII |
WO2012006623A1 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Biogen Idec Hemophilia Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
EP2635297B1 (en) * | 2010-11-05 | 2019-02-27 | Baxalta GmbH | A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity |
JP2014501227A (ja) * | 2010-12-16 | 2014-01-20 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 第viii因子水溶液 |
CA2822591C (en) | 2010-12-22 | 2020-12-29 | Baxter International Inc. | Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein |
AU2012262428C1 (en) * | 2011-05-27 | 2018-10-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
PL2717898T3 (pl) | 2011-06-10 | 2019-06-28 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Związki o działaniu prokoagulacyjnym i sposoby ich stosowania |
CN103930440A (zh) | 2011-07-01 | 2014-07-16 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 松弛素融合多肽及其用途 |
RS58578B1 (sr) | 2011-07-08 | 2019-05-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu |
CA2849673A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Novo Nordisk A/S | Novel glucagon analogues |
KR20130049671A (ko) * | 2011-11-04 | 2013-05-14 | 한미사이언스 주식회사 | 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법 |
ES2771208T3 (es) | 2012-02-15 | 2020-07-06 | Bioverativ Therapeutics Inc | Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas |
EP2814502B1 (en) | 2012-02-15 | 2017-09-13 | CSL Behring GmbH | Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity |
EP3549953A1 (en) | 2012-02-15 | 2019-10-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
CA2875246A1 (en) | 2012-06-08 | 2013-12-12 | Biogen Idec Ma Inc. | Procoagulant compounds |
EP2870250B2 (en) | 2012-07-06 | 2022-06-29 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof |
EP2908847B1 (en) | 2012-10-18 | 2022-03-30 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of using a fixed dose of a clotting factor |
WO2014070953A1 (en) | 2012-10-30 | 2014-05-08 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of Using FVIII Polypeptide |
LT2968477T (lt) | 2013-03-15 | 2020-03-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Faktoriaus viii polipeptido kompozicijos |
US20160030524A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-04 | Bayer Healthcare Llc | Recombinant factor viii formulations |
AU2014228938B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
KR20160021758A (ko) | 2013-04-18 | 2016-02-26 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 의학용으로 사용하기 위한 안정하고 연장된 glp-1/글루카곤 수용체 코-아고니스트 |
EP2796145B1 (en) | 2013-04-22 | 2017-11-01 | CSL Ltd. | A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge |
TW201519900A (zh) * | 2013-04-28 | 2015-06-01 | Bayer Healthcare Llc | 用於誘導對凝血因子蛋白之免疫耐受性的組成物及方法 |
WO2015023894A1 (en) | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Biogen Idec Ma Inc. | Recombinant factor viii proteins |
WO2015023891A2 (en) | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-xten fusions and uses thereof |
WO2015035342A2 (en) | 2013-09-08 | 2015-03-12 | Oligasis Llc | Factor viii zwitterionic polymer conjugates |
EP3060242A1 (en) * | 2013-10-22 | 2016-08-31 | DBV Technologies | Method of treating haemophilia by inducing tolerance to blood factors |
EP3065769A4 (en) | 2013-11-08 | 2017-05-31 | Biogen MA Inc. | Procoagulant fusion compound |
RU2546297C1 (ru) * | 2013-11-19 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Средство, улучшающее реологические свойства крови |
ES2967617T3 (es) | 2013-12-06 | 2024-05-03 | Bioverativ Therapeutics Inc | Herramientas de farmacocinética poblacional y sus usos |
KR102382402B1 (ko) | 2014-02-04 | 2022-04-01 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도 |
EP3114138B1 (en) | 2014-03-05 | 2021-11-17 | Pfizer Inc. | Improved muteins of clotting factor viii |
MX2016012447A (es) | 2014-03-24 | 2017-01-06 | Biogen Ma Inc | Formulaciones de factor ix liofilizadas. |
US11181534B2 (en) * | 2014-04-04 | 2021-11-23 | Bloodworks | Routine laboratory and point-of-care (POC) testing for hemostasis |
WO2015157335A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-10-15 | Bayer Healthcare Llc | Compounded media powder formulation and method of preparation of liquid medium for cell culture |
US10570184B2 (en) | 2014-06-04 | 2020-02-25 | Novo Nordisk A/S | GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use |
DK3164150T3 (da) | 2014-07-02 | 2021-02-08 | CSL Behring Lengnau AG | Modificeret von willebrand-faktor |
MA40864A (fr) | 2014-10-31 | 2017-09-05 | Biogen Ma Inc | Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères |
US11155601B2 (en) | 2015-03-06 | 2021-10-26 | CSL Behring Lengnau AG | Modified von Willebrand factor having improved half-life |
EP3298036B1 (en) | 2015-05-22 | 2022-04-06 | CSL Behring Lengnau AG | Methods for preparing modified von willebrand factor |
JP6573989B2 (ja) | 2015-05-22 | 2019-09-11 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド |
EA201890423A1 (ru) | 2015-08-03 | 2018-07-31 | Биовератив Терапьютикс Инк. | Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения |
US9849125B1 (en) | 2015-11-03 | 2017-12-26 | Banner Lifie Sciences LLC | Anti-overingestion dosage forms |
SG11201805497QA (en) | 2016-01-07 | 2018-07-30 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Mutated truncated von willebrand factor |
SG10201912857XA (en) | 2016-01-07 | 2020-02-27 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated von willebrand factor |
CN109689683A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-04-26 | 财团法人牧岩生命科学研究所 | 重组单链fvⅲ及其化学缀合物 |
DK3538133T3 (da) | 2016-11-11 | 2021-04-19 | CSL Behring Lengnau AG | Trunkeret von willebrand faktor polypeptider til behandling af hæmofili |
JP2020504082A (ja) | 2016-11-11 | 2020-02-06 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 血液凝固障害の処置又は予防における血管外投与のための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド |
BR112019010034A2 (pt) | 2016-11-16 | 2019-09-03 | Bayer Healthcare Llc | fator viii alvejado de hemácia e método de uso do mesmo |
BR112019011198A2 (pt) | 2016-12-02 | 2019-12-17 | Bioverativ Therapeutics Inc | métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação |
BR112019011115A2 (pt) | 2016-12-02 | 2019-10-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos |
AU2018215092A1 (en) | 2017-01-31 | 2019-08-29 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX fusion proteins and methods of making and using same |
US10335375B2 (en) | 2017-05-30 | 2019-07-02 | Patheon Softgels, Inc. | Anti-overingestion abuse deterrent compositions |
KR20190086269A (ko) * | 2018-01-12 | 2019-07-22 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법 |
JP2021523878A (ja) | 2018-05-18 | 2021-09-09 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 血友病aを処置する方法 |
JP2022553640A (ja) | 2019-10-10 | 2022-12-26 | コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド | 眼障害を処置する方法 |
WO2021091881A1 (en) * | 2019-11-04 | 2021-05-14 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | High concentration cell penetrating caspase inhibitor conjugates compositions and methods thereof |
EP4069269A4 (en) * | 2019-12-06 | 2023-12-27 | The Children's Hospital Of Philadelphia | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FACTOR VIII FUNCTION |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0871649A1 (en) * | 1995-09-29 | 1998-10-21 | Pharmacia & Upjohn Aktiebolag | Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer |
RU2199347C2 (ru) * | 1996-08-02 | 2003-02-27 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. | Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером |
US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59172425A (ja) * | 1983-03-18 | 1984-09-29 | Nippon Chemiphar Co Ltd | 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤 |
US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
US4970300A (en) | 1985-02-01 | 1990-11-13 | New York University | Modified factor VIII |
US5422260A (en) | 1986-05-29 | 1995-06-06 | Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs | Human factor VIII:c muteins |
US5451521A (en) | 1986-05-29 | 1995-09-19 | Genetics Institute, Inc. | Procoagulant proteins |
US5171844A (en) | 1987-06-12 | 1992-12-15 | Gist-Brocades N.W. | Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
EP0690126B1 (en) | 1987-06-12 | 2001-11-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
AU2473388A (en) * | 1987-11-16 | 1989-06-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Treatment of factor viii inhibitors |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
SE465222C5 (sv) | 1989-12-15 | 1998-02-10 | Pharmacia & Upjohn Ab | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
US5766897A (en) | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
US6376463B1 (en) | 1992-04-07 | 2002-04-23 | Emory University | Modified factor VIII |
US6037452A (en) | 1992-04-10 | 2000-03-14 | Alpha Therapeutic Corporation | Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate |
DK0627924T3 (da) | 1992-10-02 | 2001-04-30 | Genetics Inst | Sammensætning, der omfatter koagulationsfaktor VIII formulering, fremgangsmåde til dens fremstilling og anvendelse af et overfladeaktivt middel som stabilisator |
WO1994015625A1 (en) * | 1993-01-15 | 1994-07-21 | Enzon, Inc. | Factor viii - polymeric conjugates |
SE504074C2 (sv) | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
EP0730660A4 (en) | 1993-10-29 | 1998-02-25 | Incyte Pharma Inc | CHIMEAN PROTEINE PROTEASE NEXIN-1 CONTAINING VARIANTS |
IL113010A (en) | 1994-03-31 | 1999-10-28 | Pharmacia & Upjohn Ab | Pharmaceutical formulation comprising factor viii with an activity of at least 500iu/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration |
BE1008491A3 (fr) * | 1994-07-14 | 1996-05-07 | Croix Rouge De Belgique Depart | Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci. |
EP0788375A2 (en) | 1994-11-09 | 1997-08-13 | Robin Ewart Offord | Functionalized polymers for site-specific attachment |
AU691111B2 (en) * | 1995-06-21 | 1998-05-07 | Google Technology Holdings LLC | Method and antenna for providing an omnidirectional pattern |
WO1997003195A1 (en) | 1995-07-11 | 1997-01-30 | Chiron Corporation | Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered protease sites |
AT403438B (de) | 1996-05-24 | 1998-02-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische präparation mit faktor viii prokoagulationsaktivität und vwf-bindungsaktivität |
US6458563B1 (en) * | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
CA2225189C (en) | 1997-03-06 | 2010-05-25 | Queen's University At Kingston | Canine factor viii gene, protein and methods of use |
ATE375363T1 (de) | 1997-07-14 | 2007-10-15 | Bolder Biotechnology Inc | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
WO1999020288A1 (en) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Harvest Technologies Corporation | Precipitation of growth-factor-enriched fibrinogen concentrate from platelet rich plasma |
EP0922446A1 (en) | 1997-12-03 | 1999-06-16 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates |
PT1079805E (pt) | 1998-04-27 | 2005-03-31 | Opperbas Holding Bv | Composicao farmaceutica compreendendo factor viii e lipossomas neutros |
US6759216B1 (en) | 1998-11-06 | 2004-07-06 | Emory University | Glycosylated, low antigenicity low immunogenicity factor VIII |
DK1129186T4 (da) | 1998-11-10 | 2017-02-06 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Et faktor VIII-polypeptid med faktor VIII:C-aktivitet |
US6136599A (en) | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
US6358703B1 (en) | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
IL144259A0 (en) | 1999-01-14 | 2002-05-23 | Bolder Biotechnology Inc | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
WO2000071714A2 (en) | 1999-05-24 | 2000-11-30 | The American National Red Cross | Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor |
RU2278123C2 (ru) * | 2000-02-11 | 2006-06-20 | Максиджен Холдингз Лтд. | Молекулы, подобные фактору vii или viia |
JP2004525608A (ja) | 2000-09-19 | 2004-08-26 | エモリー ユニバーシテイ | 修飾された因子viii |
JP2005518181A (ja) | 2001-01-12 | 2005-06-23 | ジ・アメリカン・ナショナル・レッド・クロス | 第viii因子のヘパラン硫酸プロテオグリカン仲介性クリアランスを低下させるための方法および組成物 |
AU2002249096B2 (en) * | 2001-03-22 | 2007-06-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor VII derivatives |
WO2002098454A2 (en) | 2001-05-31 | 2002-12-12 | D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijsen Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven | Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools |
WO2002096454A1 (en) | 2001-05-31 | 2002-12-05 | D. Collen Research Foundation Vzw | Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools |
ES2331909T3 (es) | 2001-06-14 | 2010-01-20 | The Scripps Research Institute | Factor viii estabilizado con enlaces disulfuro modificados geneticamente. |
CA2461443C (en) | 2001-10-05 | 2011-07-12 | Emory University | Nucleic acid and amino acid sequences encoding high-level expressor factor viii polypeptides and methods of use |
BR0308860A (pt) | 2002-04-18 | 2005-01-04 | Merck Patent Gmbh | Fator viii modificado |
JP4412461B2 (ja) | 2002-11-20 | 2010-02-10 | 日油株式会社 | 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体 |
US8003117B2 (en) | 2002-11-20 | 2011-08-23 | Nof Corporation | Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance |
WO2004060965A2 (en) | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers |
ES2308032T5 (es) | 2002-12-31 | 2017-04-24 | Nektar Therapeutics | Derivados poliméricos de ácido maleámico y sus bioconjugados |
KR101207247B1 (ko) | 2003-01-06 | 2012-12-03 | 넥타르 테라퓨틱스 | 티올-선택성 수용성 중합체 유도체 |
CN1767857A (zh) * | 2003-02-26 | 2006-05-03 | 尼克塔治疗亚拉巴马公司 | 聚合物-因子ⅷ部分共轭物 |
US20040180054A1 (en) * | 2003-03-13 | 2004-09-16 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
US20050176108A1 (en) * | 2003-03-13 | 2005-08-11 | Young-Min Kim | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
KR20060028675A (ko) * | 2003-05-12 | 2006-03-31 | 아피맥스, 인크. | 신규한 폴리 (에틸렌 글리콜) 개질 화합물 및 그의 용도 |
EP2644206B1 (en) | 2003-05-23 | 2019-04-03 | Nektar Therapeutics | PEG derivatives containing two PEG chains |
EP1502921A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-02-02 | ZLB Behring GmbH | Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability |
WO2005046583A2 (en) | 2003-10-30 | 2005-05-26 | Emory University | Modified fviii having reduced immunogenicity through mutagenesis of a2 and c2 epitopes |
US7211559B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-05-01 | University Of Maryland, Baltimore | Factor VIII compositions and methods |
WO2005055930A2 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-23 | University Of Rochester | Recombinant factor viii having increased specific activity |
WO2006027111A1 (en) | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Zlb Behring Gmbh | Modified coagulation factor viii with enhanced stability |
WO2006053299A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of fviii |
EP1871801A2 (en) | 2005-04-01 | 2008-01-02 | Novo Nordisk Health Care AG | Blood coagulation fviii analogues |
CA2647314A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Baxter International Inc. | Pegylated factor viii |
US7645860B2 (en) * | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
-
2005
- 2005-11-14 WO PCT/US2005/041205 patent/WO2006053299A2/en active Search and Examination
- 2005-11-14 HU HUE05849392A patent/HUE033776T2/en unknown
- 2005-11-14 HU HUE16186901A patent/HUE050542T2/hu unknown
- 2005-11-14 EP EP14165736.1A patent/EP2772500B1/en not_active Revoked
- 2005-11-14 HR HRP20180481AA patent/HRP20180481B1/hr active IP Right Grant
- 2005-11-14 EP EP11153300.6A patent/EP2363414B1/en active Active
- 2005-11-14 KR KR1020187027821A patent/KR20180110192A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-11-14 EP EP16186901.1A patent/EP3130601B1/en active Active
- 2005-11-14 KR KR1020127028644A patent/KR20120136413A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-11-14 NZ NZ555032A patent/NZ555032A/en unknown
- 2005-11-14 EP EP05849392.5A patent/EP1824988B1/en active Active
- 2005-11-14 MX MX2007005466A patent/MX2007005466A/es active IP Right Grant
- 2005-11-14 LT LTEP11153297.4T patent/LT2371856T/lt unknown
- 2005-11-14 EP EP17201672.7A patent/EP3323829B1/en active Active
- 2005-11-14 PT PT58493925T patent/PT1824988T/pt unknown
- 2005-11-14 LT LTEP11153300.6T patent/LT2363414T/lt unknown
- 2005-11-14 PH PH12014500352A patent/PH12014500352A1/en unknown
- 2005-11-14 CN CN201210455152.1A patent/CN103102406B/zh active Active
- 2005-11-14 CN CN2005800464698A patent/CN101124331B/zh active Active
- 2005-11-14 PT PT111533006T patent/PT2363414T/pt unknown
- 2005-11-14 HU HUE11153300A patent/HUE060016T2/hu unknown
- 2005-11-14 EP EP17170687.2A patent/EP3243834A1/en not_active Withdrawn
- 2005-11-14 PL PL05849392T patent/PL1824988T3/pl unknown
- 2005-11-14 LT LTEP05849392.5T patent/LT1824988T/lt unknown
- 2005-11-14 ES ES05849392.5T patent/ES2633916T3/es active Active
- 2005-11-14 PL PL11153300.6T patent/PL2363414T3/pl unknown
- 2005-11-14 JP JP2007541405A patent/JP2008524117A/ja active Pending
- 2005-11-14 AU AU2005304622A patent/AU2005304622B2/en active Active
- 2005-11-14 CN CN201610201090.XA patent/CN105753968A/zh active Pending
- 2005-11-14 US US11/273,896 patent/US7632921B2/en active Active
- 2005-11-14 RU RU2007121517/10A patent/RU2423380C2/ru active
- 2005-11-14 NO NO20210454A patent/NO20210454A1/no unknown
- 2005-11-14 KR KR1020147002721A patent/KR101483917B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-14 ES ES11153297T patent/ES2930143T3/es active Active
- 2005-11-14 MX MX2014005051A patent/MX350293B/es unknown
- 2005-11-14 KR KR1020147018134A patent/KR101654011B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-14 ES ES16186901T patent/ES2821832T3/es active Active
- 2005-11-14 LT LTEP16186901.1T patent/LT3130601T/lt unknown
- 2005-11-14 PT PT111532974T patent/PT2371856T/pt unknown
- 2005-11-14 KR KR1020137007423A patent/KR101468345B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2005-11-14 NO NO20200044A patent/NO345800B1/no unknown
- 2005-11-14 ES ES11153300T patent/ES2930159T3/es active Active
- 2005-11-14 KR KR1020167023706A patent/KR101904630B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-14 SI SI200532308T patent/SI2363414T1/sl unknown
- 2005-11-14 BR BR122016022033A patent/BR122016022033B8/pt active IP Right Grant
- 2005-11-14 BR BRPI0517795A patent/BRPI0517795B8/pt active IP Right Grant
- 2005-11-14 EP EP16186902.9A patent/EP3153181A1/en not_active Withdrawn
- 2005-11-14 DK DK11153300.6T patent/DK2363414T3/da active
- 2005-11-14 HU HUE11153297A patent/HUE059193T2/hu unknown
- 2005-11-14 PT PT161869011T patent/PT3130601T/pt unknown
- 2005-11-14 CN CN201610838893.6A patent/CN107082806A/zh active Pending
- 2005-11-14 SI SI200532158T patent/SI1824988T1/sl unknown
- 2005-11-14 KR KR1020077013131A patent/KR101243564B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2005-11-14 PL PL11153297.4T patent/PL2371856T3/pl unknown
- 2005-11-14 EP EP11153297.4A patent/EP2371856B1/en active Active
- 2005-11-14 DK DK11153297.4T patent/DK2371856T3/da active
- 2005-11-14 CN CN201510612184.1A patent/CN105148287B/zh active Active
- 2005-11-14 CA CA2586379A patent/CA2586379C/en active Active
- 2005-11-14 SI SI200532283T patent/SI3130601T1/sl unknown
- 2005-11-14 EP EP17166910.4A patent/EP3243833B1/en active Active
- 2005-11-14 CN CN201310125428.4A patent/CN103214569B/zh active Active
- 2005-11-14 DK DK05849392.5T patent/DK1824988T3/en active
- 2005-11-14 UA UAA200706559A patent/UA95225C2/ru unknown
- 2005-11-14 SI SI200532309T patent/SI2371856T1/sl unknown
-
2007
- 2007-05-01 IL IL182903A patent/IL182903A/en active IP Right Grant
- 2007-05-08 ZA ZA200703696A patent/ZA200703696B/xx unknown
- 2007-05-11 HN HN2007015683A patent/HN2007015683A/es unknown
- 2007-06-06 MA MA29972A patent/MA29663B1/fr unknown
- 2007-06-08 HR HRP20070268AA patent/HRP20070268B1/hr active IP Right Grant
- 2007-06-12 NO NO20072997A patent/NO344606B1/no unknown
-
2008
- 2008-07-15 HK HK08107795.4A patent/HK1117875A1/xx unknown
-
2009
- 2009-08-13 US US12/540,703 patent/US9364520B2/en active Active
-
2012
- 2012-10-19 JP JP2012231926A patent/JP6109523B2/ja active Active
-
2013
- 2013-01-24 US US13/748,983 patent/US9096656B2/en active Active
- 2013-08-13 HK HK13109463.4A patent/HK1182121A1/xx unknown
-
2014
- 2014-05-11 IL IL232540A patent/IL232540A/en active IP Right Grant
- 2014-09-02 IL IL23443314A patent/IL234433B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-02-09 JP JP2015022993A patent/JP6018238B2/ja active Active
- 2015-07-20 US US14/803,677 patent/US20160051633A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-06-13 HK HK16106727.9A patent/HK1218718A1/zh not_active IP Right Cessation
- 2016-12-02 JP JP2016234756A patent/JP6487895B2/ja active Active
- 2016-12-02 JP JP2016234757A patent/JP6559642B2/ja active Active
-
2017
- 2017-07-14 CY CY20171100753T patent/CY1119292T1/el unknown
-
2019
- 2019-05-07 HU HUS1900026C patent/HUS1900026I1/hu unknown
- 2019-05-07 FR FR19C1031C patent/FR19C1031I2/fr active Active
- 2019-05-08 LU LU00118C patent/LUC00118I2/fr unknown
- 2019-05-09 LT LTPA2019509C patent/LTC1824988I2/lt unknown
- 2019-05-10 NL NL300989C patent/NL300989I2/nl unknown
- 2019-05-10 CY CY2019024C patent/CY2019024I1/el unknown
- 2019-07-09 PH PH12019501613A patent/PH12019501613A1/en unknown
-
2020
- 2020-10-05 CY CY20201100928T patent/CY1123384T1/el unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0871649A1 (en) * | 1995-09-29 | 1998-10-21 | Pharmacia & Upjohn Aktiebolag | Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer |
RU2199347C2 (ru) * | 1996-08-02 | 2003-02-27 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. | Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером |
US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2631801C2 (ru) * | 2012-05-22 | 2017-09-26 | Имнейт Сарл | Фактор коагуляции viii с уменьшенной иммуногенностью |
US10087233B2 (en) | 2012-05-22 | 2018-10-02 | Imnate Sarl | Coagulation factor VIII with reduced immunogenicity |
RU2695428C2 (ru) * | 2014-01-20 | 2019-07-23 | Октафарма Аг | СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ФАКТОРА VIII, ИМЕЮЩЕГО УЛУЧШЕННОЕ СООТНОШЕНИЕ FVIII:C/FVIII:Ag |
US10822393B2 (en) | 2014-01-20 | 2020-11-03 | Octapharma Ag | Process for manufacturing factor VIII having an improved ratio of FVIII:C/FVIII/AG |
RU2789085C2 (ru) * | 2018-05-18 | 2023-01-30 | Чжэнчжоу Дженсайнсес Инк. | Улучшенный белок слияния fviii и его применение |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2423380C2 (ru) | Сайт-направленная модификация fviii | |
AU2012203813B2 (en) | Site-directed modification of FVIII | |
AU2020256332A1 (en) | Site-directed modification of FVIII | |
AU2013203348B2 (en) | Site-directed modification of FVIII |