JP5806255B2 - サブチラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
a)以下の修飾:
*0AQSVPWG; A1T、V;Q2L;S3T、A、L;V4L、A;I8V、T;S9G、D、R、K、L、V;R10H、K;V11A;Q12D;A13V;P14S、T、D、A、M、V、K、Q、L、H、R、I;A15M、T;A16P;H17R;N18S、H;R19W、K、L、F、G、I;G20*、R、A;L21F、LP、LW、LA、LG;T22S、A、K、TV、TG、TL、TW、TV、G、L、TY;G23S;S24P;K27R、V28I;V30I;I35T、V;T38S;P40L;N43D;R45H、K;G46D;A48T;S49N;F50S;V51A、I、D;P52V、A;P55S、A;S57P;G61E、D、S、R、GP;N62D、ND、NE、DE、NG、E、S;V68A、S、L、I;T71A;I72V;L75I;N76S、D;N77S;S78T;V81A;A85T;S87C;A88V、T;E89G;K94N;V95C、T;L96LA、LG;G97E、D、W、A、GG、GA、GV、N、GS;A98S、D、E、T、AS、AD、AV、AE、AH、Q、N、M、L、G、R、V、S;S99D、L、A、AD、SD、SM、SG、DA、P、G、N、C、M、V、I;G100S、GE、C;S101SA、SK;G102D、S;S103D、E、Y、L、Q、H、T;V104T、S、R、I、N、M、L、D;S106D、E、T、M、G、A、L、F、I;I107T、V、M;A108V、T、S;L111I、V;A114V;N116S、D;G118D;M119L、I、V、A、S;H120N、D、Q、K、E、Y、S;V121A;L124C;L126I;G127E;S128N、I、G、C;P129PSN、T、E、D、S、N、A;S130P、T、C、*;P131M、F、W、L、A、H、T、*、PA、S、Q、R、E、G、D、C;S132G、T;A133ASA;T134A;Q137H、E、D;A138G、V;V139L、I;N140D、K;T143A;S144D、N、P;R145G;V150I;A151V、G;A152P;A158T、V、C、E、L、D、M;G160A、D;S163G、C、N、A;Y167K、A、I;A168G;A169G;R170C、S、H、L;Y171C;A172V;N173D;A174V;M175L、I、V、A、S、T;N183D;N184D、S;N185S、D;R186L、C、H;S188G;S190A;Y192H;G195F、E;V203S、A、L、Q、M、F、I;N204T、D、S;Q206L:Y209C、H;G211D;S212N、L:T213A;Y214C、H;A215D、T;N218D、S;M222L、I、V、A、S;A223G;T224A、S;A228T;A230V;A232S、L、T、P;V234I;Q236A、L、D、T、C、M、F、S;K237R;N238D;P239T、S;S240F;S242T;V244I、M、A;Q245R、K、E、D、T、F、N、V、W、G、I、S、C、L、A、M;N248P、D、S;K251E、R;N252G、H、D、V、M、S、T、E、Y、S、Q、K、A、L;A254S;T255A、S;S256N、R、G;L257G;G258K;S259A、N、G;T260A、R;N261D;L262S、Q、V;Y263H、F;G264E;S265G、R、N;V268L、I;N269T;N296K;E271A;T274S、L、A、Rのうちの少なくとも1つと組合せた、
位置62、68、97、98、99、106、131、170、245、252のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸残基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、Tのうちの1つの挿入、置換または欠失、あるいは
A108T+L111V;L124I+S125A;P129S+S130AT;L96LA+A151G+V203A;S49N+V203L+N218D;S3T+A16P+R45C+G100S+A230V;18V+R19K+V139I;N76D+A174AL+A194P+A230V;N185R;N62NE;H120Q+Q137E、G61GE、G61GS、G100L、A133D、V68A、N123D、L111F+Y263H、V11A+G61GE+V227A+S240F、A133E+S144K+N218D、S128A+P129S+S130SP、S9R+A15T+T22TQ+S101P、S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S、G97E、Q245W、S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H、S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D、S9R+A15T+L111I+Q137E、S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E、S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E、S9R+A15T+T260M、S9R+A15T、Q245I、S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D、S9R+A15T+S130P、Q245F、S9R+A15T+N218D、G63E+N76D+A194P+A230V、S9R+A15T+T224A、G100S、S9R+A15T+D60DG、A138V+V139I+A194P+N218D+A230V、A108V+A169G+R170A+Y171H、I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N、A133D+T134S+Q137A、Q137D、A98AH、V51D、Q12E+P14L+A15T、G63E+N76D+A194P+A230V、Q12E+P14L+A15T、G97GS
のうちの1つ、あるいは
を含むプロテアーゼ変異体に関する。
a)1つまたは複数の修飾:
X62D、XD、XE、XG、DE
X68A、S、L、I
X97E、D、W、A、N、XG、XA、XV、XS
X98S、D、E、T、XS、XD、XV
X99D、L、A、P、G、N、AD、XD、XM、XG、DA
X106D、E、T、M、G、A、L、F、I
X131M、F、W、L、A、H、T、*、S、Q、R、E、G、XA
X170C、S、H
X245R、K、E、D、T、F、N、V、W、G、I、S、C、L、A、
X252G、H、D、V、M、S、T、E、Y、S、Q、K
と、以下の修飾:
のうちの少なくとも1つ、
との組合せを含むプロテアーゼ変異体に関する。
(a)表1〜表13の変異体がプロテアーゼ活性を示し、そして
(b)各位置が図1および配列番号1に示されたズブチリシンBPN‘のアミノ酸配列の位置に対応する、
サブチラーゼ変異体に関する。
第五の態様では、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
第六の態様では、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に関する。
第七の態様では、本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体の製造方法であって、本発明の宿主が変異体の発現および分泌を促す条件下で培養され、そして変異体が回収される方法に関する。
第八の態様では、本発明は、本発明の変異体を含む清浄または洗浄用組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物に関する。
(a)表14〜表17の変異体がプロテアーゼ活性を示し、そして
(b)各位置が図1および配列番号1に示されたズブチリシンBPN‘のアミノ酸配列の位置に対応する、
サブチラーゼ変異体に関する。
第十一の態様では、本発明は、以下の変化:M119L、I、V、A、S;M175L、I、V、A、SおよびM222L、I、V、A、Sのうちの1つまたは複数を、上記の表1〜表13および表14〜表17に列挙されたサブチラーゼ変異体と組合せて含むサブチラーゼ変異体に関する。
アラインメントおよびナンバリングに関しては、ズブチリシンBPN’(a)(BASBPN)およびズブチリシン309(b)(BLSAVI)間のアラインメントを示す図1が参照される。このアラインメントは、本特許出願においては、残基のナンバリングのための参照として用いられる。
本発明をさらに詳細に考察する前に、以下の用語および慣例を先ず定義する。
アミノ酸および核酸の命名法についての詳細な説明に関しては、WO 00/71691(5ページから始まる)(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)に委ねる。
本発明により産生されるかまたは意図される種々のサブチラーゼ酵素変異体の説明に際しては、以下の命名法および慣例が参照を容易にするために適合されてきた:
ズブチリシンBPN’(BASBPN)を有する単離または親酵素を整列することにより、参照の枠を先ず限定する。
以下のパラメーターを用いて、変異体に番号をつけるためにGCGパッケージバージョン9.1のギャップルーチンにより、アラインメントが得られる:ギャップ作製ペナルティー=8およびギャップ拡張ペナルティー=8、ならびにそれらのデフォルト値に保持される他の全てのパラメーター。
それにより、多数の欠失および挿入が、BASBPN(配列番号1)に関して限定される。図1では、ズブチリシン309(配列番号2)は、BASBPNと比較した場合、位置36、58、158、162、163および164に6つの欠失を有する。これらの欠失は、図1では、星印(*)で示されている。
遺伝子操作によりポリペプチド中に導入される修飾の名称の詳細な説明に関しては、WO 00/71691,PP.7-12(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)に委ねる。
タンパク質基質中のアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼまたは(互換可能的に)ペプチダーゼとして分類される(Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3参照)。
別記されない場合、本明細書中で用いられるアミノ酸ナンバリングはサブチラーゼBPN’(BASBPN)配列のものに対応する。BPN’配列のさらなる説明に関しては、図1、配列番号1またはSiezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737を参照されたい。
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、この場合、活性部位に必須セリン残基が存在する(White, Handler and Smith, 1973 “Principles of Biochemistry,” Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272)。細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ダルトンの範囲の分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより抑制される。それらは、単純末端エステルを加水分解し、そしてこれもセリンプロテアーゼである真核生物キモトリプシンと活性が類似する。より狭義の用語であるアルカリ性プロテアーゼ(亜群を網羅する)は、pH9.0〜11.0のセリンプロテアーゼの高pH最適条件を示す(再検討のためには、Priest (1977) Bacteriological Rev. 41, 711-753参照)。
暫定的にサブチラーゼと命名されたセリンプロテアーゼの一亜群は、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737およびSiezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523により提唱された。それらは、以前ズブチリシン様プロテアーゼとして言及されたセリンプロテアーゼの170より多いアミノ酸配列の相同分析により限定される。ズブチリシンは以前はしばしば、グラム陽性細菌または真菌により産生されるセリンプロテアーゼとして定義されたが、現在は、Siezen等によれば、サブチラーゼの一亜群である。広範な種々のサブチラーゼが同定されており、多数のサブチラーゼのアミノ酸配列が確定されている。このようなサブチラーゼおよびそれらのアミノ酸配列のより詳細な説明に関しては、Siezen等(1997)を参照する。
サビナーゼ(商標)は、NOVOZYMES A/Sにより市販されている。それはバシラスレンタスB. Lentusからのズブチリシン309であり、一位置(N87S)のみがBAALKPと異なる。サビナーゼ(商標)は、図1および配列番号2においてb)と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
「親サブチラーゼ」という用語は、Siezen等(1991および1997)により定義されたサブチラーゼを記述する。さらなる詳細に関しては、上記の「サブチラーゼ」の説明を参照されたい。親サブチラーゼは、天然供給源から単離されたサブチラーゼでもあり、この場合、サブチラーゼの特質を保持しながら、その後の修飾がなされた。さらに親サブチラーゼは、J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999)により記載されたようなDNAシャッフリング技法により調製されたサブチラーゼでもあり得る。
あるいは「親サブチラーゼ」という用語は、「野生型サブチラーゼ」と呼ばれ得る。
参照のために、本明細書中に記述された種々のサブチラーゼに関する頭字語の表を提示するが、さらなる頭字語に関しては、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737およびSiezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523を参照されたい。
本明細書中で用いられる「修飾(1または複数)」という用語は、サブチラーゼの化学的修飾、ならびにサブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作を包含するよう定義される。修飾(1または複数)は、アミノ酸側鎖(1または複数)の交換(1または複数)、当該アミノ酸(1または複数)中のまたはアミノ酸での置換(1または複数)、欠失(1または複数)および/または挿入であり得る。
本発明の情況では、サブチラーゼ変異体または突然変異化サブチラーゼという用語は、本来のまたは親遺伝子を保有し、そして対応する親酵素を生成した親微生物由来の突然変異体遺伝子を発現している生物体により産生されたサブチラーゼを意味し、この場合、親遺伝子は、適切な宿主中で発現された場合に上記突然変異化サブチラーゼプロテアーゼが産生される突然変異体遺伝子を生成するために、突然変異化されている。
2つのアミノ酸配列間の相同は、この情況においては、パラメーター「同一性」により記述される。
2つのサブチラーゼ間の同一性の程度を確定するために、GCGパッケージバージョン9.1のギャップルーチンが、同一設定を用いて適用され得る(下記)。ルーチンからの出力は、アミノ酸アラインメントのほかに、2つの配列間の「同一性%」の算定である。
この記述に基づいて、本発明により修飾され得る適切な相同サブチラーゼを当業者が同定することは、ルーチンである。
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然遺伝子環境から除去されており、したがって他の異質のまたは望ましくないコード配列を含有しない、ということを意味し、そして遺伝子工学処理タンパク質産生系内で用いるのに適した形態である。このような単離分子は、それらの天然環境から分離されるものであり、cDNAおよびゲノムクローンを包含する。本発明の単離DNA分子は、それらが普通に会合される他の遺伝子を含有しないが、しかし天然5’および3’非翻訳領域、例えばプロモーターおよびターミネーターを含み得る。会合領域の同定は、当業者には明らかである(例えばDynan and Tijan, Nature 316: 774-78,1985参照)。「単離ポリヌクレオチド」という用語は、代替的に「クローン化ポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。
タンパク質に適用される場合、「単離された」という用語は、タンパク質がネイティブ環境から除去された、ということを指す。好ましい形態では、単離タンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質(即ち「相同不純物」)を実質的に含有しない(下記参照)。
単離されたタンパク質は、SDS-PAGEにより確定した場合、10%より高い、好ましくは20%より高い、さらに好ましくは30%より高い純度を有する。さらに、高精製形態で、即ちSDS-PAGEにより確定した場合、40%より高い、60%より高い、80%より高い、さらに好ましくは95%より高い、さらに好ましくは99%より高い純度を有するタンパク質を提供するのが好ましい。
「単離されたタンパク質」という用語は、代替的に「精製されたタンパク質」と呼ばれ得る。
「相同不純物」という用語は、本発明のサブチラーゼが本来得られる相同細胞から生じる任意の不純物(例えば本発明のサブチラーゼ以外の別のポリペプチド)を意味する。
〜得られる
「〜得られる」という用語は、特定の微生物供給源に関連して本明細書中で用いる場合、特定の供給源により、あるいは供給源からの遺伝子が挿入された細胞によりポリヌクレオチドおよび/またはサブチラーゼが産生されることを意味する。
プロテアーゼに関する基質と関連して用いられる「基質」という用語は、その最も広い形態で、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受け易い少なくとも1つのペプチド(アミド)結合を含有する化合物を含む、と解釈されるべきである。
産物
プロテアーゼ酵素的反応由来の産物と関連して用いられる「産物」という用語は、本発明の情況では、サブチラーゼプロテアーゼを包含する加水分解反応の産物を含むと解釈されるべきである。産物は、その後の加水分解反応における基質であり得る。
本発明の情況では、「洗浄性能」という用語は、例えば洗浄または硬質表面清浄化中に清浄にされるべき対象上に存在するタンパク質様または有機汚れを除去する酵素の能力として用いられる。本明細書中の実施例3における洗浄性能試験も参照されたい。
本発明の一部であるよう意図される変異体は、野生型サブチラーゼと比較した場合、1つまたは複数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、または挿入されたような変異体であり、上記の変異体は、少なくとも:
*0AQSVPWG; A1T、V;Q2L;S3T、A、L;V4L、A;18V、T;S9G、D、R、K、L、V;R10H、K;V11A;Q12D;A13V;P14S、T、D、A、M、V、K、Q、L、H、R、I;A15M、T;A16P;H17R;N18S、H;R19W、K、L、F、G、I;G20*、R、A;L21F、LP、LW、LA、LG;T22S、A、K、TV、TG、TL、TW、TV、G、L、TY;G23S;S24P;K27R、V28I;V30I;I35T、V;T38S;P40L;N43D;R45H、K;G46D;A48T;S49N;F50S;V51A、I、D;P52V、A;P55S、A;S57P;G61E、D、S、R、GP;N62D、ND、NE、DE、NG、E、S;V68A、S、L、I;T71A;I72V;L75I;N76S、D;N77S;S78T;V81A;A85T;S87C;A88V、T;E89G;K94N;V95C、T;L96LA、LG;G97E、D、W、A、GG、GA、GV、N、GS;A98S、D、E、T、AS、AD、AV、AE、AH、Q、N、M、L、G、R、V、S;S99D、L、A、AD、SD、SM、SG、DA、P、G、N、C、M、V、I;G100S、GE、C;S101SA、SK;G102D、S;S103D、E、Y、L、Q、H、T;V104T、S、R、I、N、M、L、D;S106D、E、T、M、G、A、L、F、I;I107T、V、M;A108V、T、S;L111I、V;A114V;N116S、D;G118D;M119L、I、V、A、S;H120N、D、Q、K、E、Y、S;V121A;L124C;L126I;G127E;S128N、I、G、C;P129PSN、T、E、D、S、N、A;S130P、T、C、*;P131M、F、W、L、A、H、T、*、PA、S、Q、R、E、G、D、C;S132G、T;A133ASA;T134A;Q137H、E、D;A138G、V;V139L、I;N140D、K;T143A;S144D、N、P;R145G;V150I;A151V、G;A152P;A158T、V、C、E、L、D、M;G160A、D;S163G、C、N、A;Y167K、A、I;A168G;A169G;R170C、S、H、L;Y171C;A172V;N173D;A174V;M175L、I、V、A、S、T;N183D;N184D、S;N185S、D;R186L、C、H;S188G;S190A;Y192H;G195F、E;V203S、A、L、Q、M、F、I;N204T、D、S;Q206L:Y209C、H;G211D;S212N、L:T213A;Y214C、H;A215D、T;N218D、S;M222L、I、V、A、S;A223G;T224A、S;A228T;A230V;A232S、L、T、P;V234I;Q236A、L、D、T、C、M、F、S;K237R;N238D;P239T、S;S240F;S242T;V244I、M、A;Q245R、K、E、D、T、F、N、V、W、G、I、S、C、L、A、M;N248P、D、S;K251E、R;N252G、H、D、V、M、S、T、E、Y、S、Q、K、A、L;A254S;T255A、S;S256N、R、G;L257G;G258K;S259A、N、G;T260A、R;N261D;L262S、Q、V;Y263H、F;G264E;S265G、R、N;V268L、I;N269T;N296K;E271A;T274S、L、A、R
のうちの少なくとも1つ、
と組合せた、位置62、68、97、98、99、106、131、170、245、252のうちの1つまたは複数におけるアミノ酸残基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、Tのうちの1つの挿入、置換または欠失、あるいは
A108T+L111V;L124I+S125A;P129S+S130AT;L96LA+A151G+V203A;S49N+V203L+N218D;S3T+A16P+R45C+G100S+A230V;18V+R19K+V139I;N76D+A174AL+A194P+A230V;N185R;N62NE;H120Q+Q137E、G61GE、G61GS、G100L、A133D、V68A、N123D、L111F+Y263H、V11A+G61GE+V227A+S240F、A133E+S144K+N218D、S128A+P129S+S130SP、S9R+A15T+T22TQ+S101P、S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S、G97E、Q245W、S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H、S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D、S9R+A15T+L111I+Q137E、S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E、S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E、S9R+A15T+T260M、S9R+A15T、Q245I、S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D、S9R+A15T+S130P、Q245F、S9R+A15T+N218D、G63E+N76D+A194P+A230V、S9R+A15T+T224A、G100S、S9R+A15T+D60DG、A138V+V139I+A194P+N218D+A230V、A108V+A169G+R170A+Y171H、I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N、A133D+T134S+Q137A、Q137D、A98AH、V51D、Q12E+P14L+A15T、G63E+N76D+A194P+A230V、Q12E+P14L+A15T、G97GS
のうちの1つ、あるいは
を含む。
(a)表1〜表13、および表14〜表17の変異体はプロテアーゼ活性を有し、そして
(b)各位置は、ズブチリシンBPN’(配列番号1)のアミノ酸配列の位置に対応する。
本発明の第一の態様のサブチラーゼ変異体は、天然から同定され、単離された親または野生型サブチラーゼであり得る。このような親野生型サブチラーゼは、当該技術分野で既知の標準技法により、特定的にスクリーニングされ得る。
サブチラーゼは、それらのDNAおよびアミノ酸配列が相同であるという意味で、一群の保存酵素である。したがって当該ポリヌクレオチド配列に隣接する相対的に特異的なプライマーを構築し得る。
親サブチラーゼは、天然からのまたは多様性の人工作製からの酵素のため、ならびに親サブチラーゼからの変異体の設計および産生のために、亜群I-S2またはI-S2、特に亜群I-S2に属するのが好ましい。
亜群I-S2からの変異体に関しては、BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP、BLSUBL)、BYSYAB、BAPB92、TVTHERおよびBSAPRSまたは亜群I-S2の特質を保持しているそれらの機能的変異体からなる群から親サブチラーゼを選択するのが好ましい。
特に親サブチラーゼはBLSAVI(サビナーゼ(商標)、NOVOZYMES A/S)であり、したがって本発明の好ましいサブチラーゼ変異体はサビナーゼ(商標)の変異体である。
27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252および274、のいずれかにおける1つまたは複数の修飾(1または複数)と有益に組合せられ得る。
K27R、*36D、S56P、N62D、V68A、N76D、S87N、G97N、S99SE、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、S106A、H120D、H120N、N123S、G159D、Y167A、R170S、R170L、A194P、N204D、V205I、Q206E、L217D、N218S、N218D、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A。
S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K
を含有する変異体である。
さらに本発明の主な態様(1または複数)のサブチラーゼ変異体は、好ましくは位置129、131および194のいずれかにおける1つまたは複数の修飾(1または複数)、好ましくは129K、131Hおよび194P修飾、最も好ましくはP129K、P131HおよびA194P修飾と組合される。それらの修飾(1または複数)のいずれかが、その産生においてより高い発現レベルのサブチラーゼ変異体を提供すると予測される。
洗浄性能における改良は、本明細書中の実施例3で限定されるいわゆる強度値(Int)を算定することにより定量され得る。
S(2)=変異体は、3つの酵素濃度(5、10および30 nM)の全てで参照より良好に遂行し、
S(1)=変異体は、1つまたは2つの濃度で参照より良好に遂行する。
明らかに、本発明の変異体は、少なくとも規定最低レベルに関して、さらに好ましくは規定最高レベルで、上記判定基準を満たす、というのが好ましい。
サブチラーゼをクローニングするための、そして遺伝子(例えばサブチラーゼ遺伝子)に置換、欠失または挿入を導入するための多数の方法が、当該技術分野で周知である。
概して、遺伝子のクローニングのためのそして上記遺伝子中に突然変異(無作為および/または部位特異的)を導入するための標準手法は、本発明のサブチラーゼ変異体を生成するために用いられ得る。適切な技法のさらなる説明のために、本明細書中の実施例1(下記)ならびに(Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY;Ausubel, F.M. et al.(eds.) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995;Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990)、ならびにWO 96/34946が参照される。
本発明の酵素をコードするDNA構築物を含む組換え発現ベクターは、組換えDNA手法に付されると便利である任意のベクターであり得る。
ベクターの選択はしばしば、それが導入されるべきである宿主細胞によっている。したがってベクターは、自律的複製ベクター、即ちその複製が染色体複製と無関係である染色体外存在物、例えばプラスミドとして存在するベクターである。
あるいはベクターは、宿主細胞中への導入時に、一部分またはその全部が宿主細胞中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体(1または複数)と一緒に複製されるものであり得る。
プロモーターは、選定宿主細胞中で転写活性を示す任意のDNA配列であり、そして宿主細胞に対して同種であるかまたは異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。
本発明の酵素をコードするDNA配列はまた、必要な場合、適切なターミネーターに作用可能に接続され得る。
宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA配列は、当該宿主に対して同種であるかまたは異種であり得る。宿主細胞に対して同種である場合、即ち現実に宿主細胞により産生される場合、それは典型的には別のプロモーター配列と、あるいは適用可能な場合には、その天然環境における以外の別の分泌シグナル配列および/またはターミネーター配列と作用可能に接続される。「同種の」という用語は、当該宿主生物から生じる酵素をコードするDNA配列を含むよう意図される。「異種の」という用語は、現実に宿主細胞により発現されないDNA配列を含むよう意図される。したがってDNA配列は別の生物からであり、あるいはそれは合成配列であり得る。
培養時に本発明の酵素を産生し得る細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバシラス属の菌株、例えば枯草菌Bacillus subtilus、バシラス・リケニフォルミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフィルス、バシラス・アルカロフィルス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・コアギュランス、バスラス・サーキュランス、バスラス・ラウツス、バシラス・メガテリウムまたはバシラス・ツリンギエンシス、あるいはストレプトミセス属の菌株、例えばストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・ムリヌス、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌である。
細菌、例えば大腸菌中で酵素を発現する場合、酵素は、典型的には不溶性顆粒(封入体として既知である)として細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞膜周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて、変性され、その後、酵素は変性剤を希釈することにより再フォールディングされる。後者の場合、酵素は、細胞を崩壊させることにより、例えば音波処理または浸透圧ショックにより細胞膜周辺腔から回収されて、細胞膜周辺腔の内容物を放出し、そして酵素を回収する。
グラム陽性細菌、例えばバシラス属またはストレプトミセス属菌株中で酵素を発現する場合、酵素は細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞外培地に向けられる。後者の場合、酵素は、下記のように培地から回収され得る。
本発明は、本発明による単離酵素の製造方法を提供するが、この場合、酵素をコードするDNA配列で形質転換された適切な宿主細胞は、酵素の生成を可能にする条件下で培養され、その結果生じた酵素が培養から回収される。
酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが異種宿主細胞中で形質転換される場合、本発明の酵素の異種組換え生成を可能にすると思われる。それにより、同種不純物を含有しないことを特徴とする高度精製サブチラーゼ組成物を製造し得る。
本発明の酵素は付加され、したがって洗浄用組成物の一構成成分になる。概して、清浄および洗浄用組成物は当該技術分野で十分に記載されており、適切な清浄および洗浄用組成物のさらなる説明に関しては、WO 96/34946;WO 97/07202;WO 95/30011が参照される。
特定の態様において、本発明は、本発明の酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、1つまたは複数のその他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、アkルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ぺクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼを含み得る。
適切なプロテアーゼとしては、動物、植物または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾またはタンパク質工学処理突然変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシラス属由来のもの、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシン309、ズブチリシン147およびズブチリシン168である(WO 89/06279に記載)。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン(例えばブタまたはウシ起源の)およびフザリウムプロテアーゼである(WO 89/06270およびWO 94/25583に記載)。
好ましい市販プロテアーゼ酵素としては、デュラザイム(商標)、レラーゼ(商標)、アルカラーゼ(商標)、サビナーゼ(商標)、プリマーゼ(商標)、デュララーゼ(商標)、エスペラーゼ(商標)、オボザイム(商標)およびカンナーゼ(商標)(Novozymes A/S)、マキサターゼTM、マキサカルTM、マキサペムTM、プロペラーゼTM、プラフェクトTM、プラフェクトOxPTM、FN2TM、FN3TMおよびFN4TM(Genencor International, Inc.)が挙げられる。
適切なリパーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学処理突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ属(異名サーモミセス属)からの、例えばEP 258 068およびEP 305 216に記載されたようなフミコラ・ラヌギノサ(サーモミセス・ラヌギノズス)からの、あるいはWO 96/13580に記載されたようなフミコラ・インソレンスからのリパーゼ、例えばシュードモナス・アルカシゲネスまたはシュードモナス・シュードアルカリゲネス(EP 218 272)、シュードモナス・セパシア(EP 331 376)、シュードモナス・スツツェリ(GB 1,372,034)、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス属菌株SD 705(WO 95/06720およびWO 96/27002)、シュードモナス・ウイスコンシネンシス(WO 96/12012)からのシュードモナス リパーゼ、例えば枯草菌(Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360)、バシラス・ステアロサーモフィルス(JP 64/744992)またはバシラス・プミルス(WO 91/16422)からのバシラス リパーゼが挙げられる。
好ましい市販リパーゼ酵素としては、リペックス(商標)、リポラーゼ(商標)およびリポラーゼウルトラ(商標)(Novozymes A/S)が挙げられる。
適切なアミラーゼ(αおよび/またはβ)としては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学処理突然変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えばバシラス属、例えばGB 1,296,839により詳細に記載されたバシラス・リケニフォルミスの特定菌株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
有用なアミラーゼの例は、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873およびWO 97/43424に記載された変異体、特に以下の位置:15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444のうちの1つまたは複数における置換を有する変異体である。
市販アミラーゼは、デュラミル(商標)、テルマミル(商標)、フンガミル(商標)およびバン(商標)(Novozymes A/S)、ラピダーゼTMおよびプラスターTM(Genencor International Inc.)である。
適切なセルラーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学処理突然変異体が含まれる。適切なセルラーゼとしては、バシラス属、シュードモナス属、フミコラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えば米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号およびWO 89/09259に開示されたフミコラ・インソレンス、ミセリオフトラ・サーモフィラおよびフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌セルラーゼが挙げられる。
市販セルラーゼとしては、セルザイム(商標)およびカレザイム(商標)(Novozymes A/S)、クラジナーゼTMおよびプラダックスHATM(Genencor International Inc.)およびKAC-500(B)TM(Kao Corporation)が挙げられる。
適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼとしては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾またはタンパク質工学処理突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、WO 93/24618およびWO 98/15257に記載されたもののような担子菌類のヒトヨタケ(Coprinus cinereus)からのペルオキシダーゼおよびその変異体が挙げられる。市販ペルオキシダーゼとしては、グアルドザイム(商標)(Novozymes A/S)が挙げられる。
洗剤組成物は、1つまたは複数の界面活性剤を含み、これらは非イオン性、例えば半極性および/または陰イオン性および/または両イオン性であり得る。界面活性剤は、典型的には0.1重量%〜60重量%のレベルで存在する。
その中に含まれる場合、洗剤は通常は約0.2%〜約40%の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体(「グルカミド」)を含有する。
洗剤は、1つまたは複数のポリマーを含み得る。例は、カルボキシメチル−セルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニル−ピリジン−N−オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーである。
洗剤は、他の慣用的洗剤成分、例えば布帛状態調節剤、例えば粘土、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ沈殿防止剤、防汚再沈着剤、染料、殺細菌剤、蛍光発光剤、ヒドロトロープ剤、金属変色防止剤または香料も含有し得る。
局所的および部分的条件、例えば水硬度および水温の変化は、部分洗剤組成物を必要とする。洗剤例1および2は、それぞれ典型的ラテンアメリカ洗剤および典型的欧州粉末洗剤の組成物に関する範囲を提供する。
本発明の酵素はさらに、WO 97/07202(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)に開示された洗剤処方物中に混入され得る。
テキスタイル
標準テキスタイル片は、EMPA St. Gallen, Lerchfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Switzerlandから入手される。特にEMPA116型(血液、ミルクおよびインク汚れ付き綿テキスタイル)およびEMPA117型(血液、ミルクおよびインク汚れ付きポリエステル/綿テキスタイル)。
バシラス・レンタス菌株309は、NCIBに寄託され、寄託番号NCIB 10309を与えられ、米国特許第3,723,250号(この記載内容は、参照により本明細書中で援用される)に記載される。親サブチラーゼ309またはサビナーゼ(商標)は、菌株309から得られる。発現宿主生物は枯草菌Bacillus subtilusである。
プラスミドpSX222は、大腸菌−枯草菌シャトルベクターおよび枯草菌発現ベクターとして用いられる(WO 96/34946に記載)。
別記しない限り、DNA操作および形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施される(Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY;Ausubel, F.M. et al.(eds.) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995;Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990)。
別記しない限り、DNA操作のための全酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は、New England Biolabs, Inc.から得られる。DNA操作のための酵素は、供給元の仕様書に従って用いられる。
サブチラーゼ酵素の生成のための発酵は、15 mlの二重TY培地を含有する50 ml試験管中で2〜3日間、225 rpmで回転振盪台上でpH7.3で37℃で実施される。
TY培地の説明に関しては、page 1.1.3, Media Preparation and Bacteriological Tools in “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and Sons, 1995;Harwood, C.R., and Cutting, S.M.を参照されたい。
宿主細胞から分泌されるサブチラーゼ変異体は、周知の手法により、例えば遠心分離または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質様構成成分を沈殿させ、その後、クロマトグラフィー手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により、培地から回収されるのが便利である。
洗剤組成物中の選定サブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、洗浄実験を実施する。自動機械応力検定(AMSA)を用いて、本出願の酵素変異体を試験する。AMSA試験を用いて、大量の小容積酵素−洗剤溶液の洗浄性能が検査され得る。AMSAプレートは、溶液を試験するための多数のスロット、ならびに全てのスロット開口部に対して洗浄されるべきテキスタイル材料見本をしっかり圧搾する蓋を有する。洗浄時間中、プレート、試験溶液、テキスタイルおよび蓋は激しく振盪されて、試験溶液をテキスタイルと接触させ、機械的応力を適用する。さらなる説明に関しては、WO 02/42740、特にページ23〜24の段落「特定方法実施形態」を参照されたい。
本発明のサブチラーゼ酵素の洗浄性能試験のための洗剤は、市場で完全処方市販洗剤を購入し、その後、加熱処理(水溶液中で85℃で5分間)により酵素構成成分を不活性化することにより得られる。さらに、酵素を含まない市販洗剤基剤は、メーカーから直接購入され得る。さらに適切なモデル洗剤は、本明細書中のページ19〜24の提示に従って構成され、洗浄性能試験のために用いられ得る。
部位特異的突然変異誘発:
所望の突然変異を含有するオリゴを用いてPCRにより産生されるDNA断片の伝統的クローニング(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Haror, 1989)により、特定の挿入/欠失/置換を含む本発明のズブチリシン309(サビナーゼ(商標))部位特異的変異体を作製する。
ズブチリシン309変異体を大腸菌中で形質転換する。これらの形質転換体の一晩培養から精製されたDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA断片の精製、結繋、枯草菌の形質転換により、枯草菌中で形質転換する。Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221により記載されたように、枯草菌の形質転換を実施する。
部位特異的突然変異誘発を実施するために用いられる全体的戦略を以下に示す:
突然変異の部位に隣接するDNA配列に対応する突然変異誘発性プライマー(オリゴヌクレオチド)を合成し、挿入/欠失/置換を限定するDNA塩基対により分離する。
本明細書中の2ページの表1〜表13に列挙した変異体の各々を、上記のように構築し得る。
本発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含むpSX222発現プラスミドをコンピテント枯草菌株中で形質転換して、上記のように発酵させた。
発酵後、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(HCIC)およびその後の真空濾過を用いて、ズブチリシン変異体の精製を成し遂げる。
酵素を捕捉するために、HCICは、4−メルカプト−エチル−ピリジン(4-MEP)が結合されるセルロースマトリックスを用いる。
80〜100 μmのサイズのセルロースマトリックスのビーズを酵母抽出物およびズブチリシン変異体を分泌し得る形質転換化枯草菌を含有する培地と混合し、Unifilter(商標)微小プレート中でpH9.5デインキュベートする。
ビーズから酵素を溶離するために、溶離緩衝液(pH5)でフィルターを洗浄することにより、ここでpHを下げる。それにより、酵素がビーズから分離し、緩衝液から回収され得る。
精製酵素を異なる濃度で高親和性阻害剤CI-2Aとともにインキュベートして、種々の量の活性部位を抑制する。プロテアーゼおよび阻害剤は1:1比で互いに結合し、したがって酵素濃度は阻害剤の濃度に直接関連し、その時点で全プロテアーゼは不活性になる。残存プロテアーゼ活性を測定するために、基質(トリス/HCl緩衝液中0.6 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)を阻害剤とのインキュベーション後に付加し、その後4分間、分解産物pNA(パラニトロフェノール)の発生を、Elisa読取器で405 nmで定期的に測定する。
下記のように洗剤中の洗浄性能に関して、既知の濃度の表1〜表13の変異体を試験した。
市販洗剤基剤組成物中での選定サブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、洗浄実験を実施した。自動機械応力検定(AMSA)を用いて、本出願の酵素変異体を試験した。AMSA試験を用いて、大量の小容積酵素−洗剤溶液の洗浄性能が検査され得る。AMSAプレートは、溶液を試験するための多数のスロット、ならびに全てのスロット開口部に対して洗浄されるべきテキスタイル材料見本をしっかり圧搾する蓋を有する。洗浄時間中、プレート、試験溶液、テキスタイルおよび蓋は激しく振盪されて、試験溶液をテキスタイルと接触させ、機械的応力を適用する。さらなる説明に関しては、WO 02/42740、特にページ23〜24の段落「特定方法実施形態」を参照されたい。
その特定酵素変異体とともに洗浄されたテキスタイル試料の色の明度として、酵素変異体の性能を測定する。明度は、白色光で照明した場合にテキスタイル試料から反射する光の強度としても表され得る.テキスタイルが汚れると、反射光の強度は、清浄テキスタイルより低くなる。したがって反射光の強度を用いて、酵素変異体の洗浄性能を測定し得る。
走査画像から光強度に関する値を抽出するために、特別設計ソフトウエアアプリケーションを用いる(Novozymes Color Vector Analyzer)。プログラムは画像から24ビットピクセル値を回収し、それらを赤、緑および青に関する値(RGB)に変換する。ベクトルとして一緒にRGB値を付加し、次にその結果生じたベクトルの長さを考慮することにより、強度値(Int)を算定する:
P=Int(v)−Int(r)
式中、Int(v)は、酵素変異体で洗浄されたテキスタイル表面の光強度値であり、そして
Int(r)は、参照酵素ズブチリシン309(BLSAVI)で洗浄されたテキスタイル表面の光強度値である。
下記の表23〜表26および表24〜表36に示した結果は、試験した酵素変異体の性能(P)を合計した性能スコア(S)である。
S(2)は、3つの濃度(5、10および30 Nm)の全てで変異体が参照より良好に実施したことを示し、そして
S(1)は、1または2つの濃度で変異体が参照より良好に実施したことを示す。
Claims (13)
- サブチリシン変異体であって、当該変異体が下記の変更:
S9R+A15T
S9R+A15T+G97GV+H120D
I8V+S9R+A15T+R19W+V30I+G61D+S99SD+S256N
S9R+A15T+G20*+L21F+N62D+Q245N
S9R+A15T+G97GA+H120D+P131H+Q137E
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245V
S9R+A15T+G97GV+P131T+Q137H
S9R+A15T+T22TL+N62D+Q245W
S9R+A15T+G97GG+H120D+Q137E
S9R+A15T+G97GV+Q137H
S9R+A15T+G20A+G97GV+H120D+P131H
S9R+A15T+T22TW+N204D+Q245I
S9R+A15T+G97GA+H120N+S212L
S9R+A15T+G97GG+P131S+Q137H
S9R+A15T+L96LG+H120D+P131H+R186L
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245G
S9R+A15T+G97GA+H120D+Q137D
S9R+A15T+T22TL+N62D+I107V+V139L+Q245W
S9R+A15T+A16P+G97GA+P131S+Q137D+N204S
S9R+A15T+L96LG+H120D+G160D
S9R+A15T+L21LP+T22TV+M119I+N218D+Q245I
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245S
S9R+A15T+G97GV+H120D+Q137H
S9R+A15T+G61E+A85T+P239L+Q245C
S9R+A15T+L96LG+H120N+P131H+Q137E
S9R+A15T+P131H+S144P
S9R+A15T+L96LG+H120D+P131S+Q137E
S9R+A15T+G97GA+Q137E
S9R+A15T+H120N+P131T+N218D
S9R+A15T+G97GA+H120Q+P131H+Q137E
V4A+S9R+A15T+G97GV+H120D
S9R+A15T+L21LW+G100S+V139L+Q245V
S9R+A15T+G97GA+Q137H+N218S
S9R+A15T+G97GA+H120Y+Q137H
S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+G97GA+Q137D
S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137E
S9R+A15T+F50S+H120D+P131H
S9R+A15T+L96LG+P131T+Q137H
S9R+A15T+L96LG+P131H+Q137D
S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S
S9R+A15T+F50S+H120D+P131H
S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137D+N248D
S9R+A15T+Q245F
S9R+A15T+L96LG+P131Q+Q137D
S9R+A15T+Q245S
S9R+A15T+T22G+V139L+Q245L
S9R+A15T+G97GV+H120Q
S9R+A15T+Q245V
S9R+A15T+G97GA+Q137E+L262V
S9R+A15T+T22A+V139L+Q245E
S9R+A15T+G127E+P131R+Q137H
S9R+A15T+T22L+V139L+Q245V+A254S
S9R+A15T+Q245L
S9R+A15T+N62NG+Q245T
S9R+A15T+G61E+A85T+P239S+Q245V
S9R+A15T+G61GP+Q245L
S9R+A15T+G61E+A85T+Q206L+Q245R
S9R+A15T+G61E+A85T+Q137H+Y209C+Q245G
S9R+A15T+G102S+M175T+Q245R+N252D
S9R+A15T+G61E+A85T+P239S+Q245C
S9R+A15T+N62D+Q245W+N252V
S9R+A15T+S24P+G61E+A85T+P239S+Q245A
S9R+A15T+N62D+Q245R+N252M
S9R+A15T+T22A+N62D
S9R+A15T+N62D+Q245W+N252S
S9R+A15T+T22TQ+S101P
S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H
S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S
S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D
S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D
S9R+A15T+L111I+Q137E
S9R+A15T+S130P
S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E
S9R+A15T+N218D
S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E
S9R+A15T+T224A
S9R+A15T+T260M
S9R+A15T+D60DG
S9R+A15T+N62D+H120N+P131T
S9R+A15T+T22TL+G61E+L96LG+Q137D+Q245R
S9R+A15T+S99C+H120N+P131S+Q137H+M222S
S9R+A15T+A98G+S99C+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+S99G+G100S+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+T38S+A98R+S99C+G100S+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+A98S+G100S+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+G20*+L21F+N62E+Q245R
S9R+A15T+G20*+L21F+N62D+Q245R
S9R+A15T+G20*+L21F+P52T+N62D+Q245R
S9R+A15T+G20*+L21F+N62D+Q245R+S259G
S9R+A15T+N62S+H120N+P131T+N218D
S9R+A15T+H120N+P131T+N218D+N269T
S9R+A15T+A88V+A98R+S99G+G100C+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+G61E+H120S+Q137D+V139L+N218D
S9R+A15T+A98C+G100S+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S+Q137H+M222S
S9R+A15T+G20*+L21F+G61E+*61aP+Q245R
S9R+A15T+G61E+A98S+S99M+Q245R
S9R+A15T+A98S+S99G+G100S+H120N+P131S+Q137H
S9R+A15T+Y167I+R170L
S9R+A15T+G20*+L21F+*62aS+N218D+Q245R
S9R+A15T+G20*+L21F+*63aG+Q245R+N272V
S9R+A15T+G61E+A85T+N218D+P239S+Q245L
S9R+A15T+G20*+L21F+*61aA+V68A+Q245R
S9R+A15T+S24P+G61E+A85T+P239S+Q245A
S9R+A15T+T22L+V139L+Q245V+A254S
S9R+A15T+G61E+A85T+Q137H+Y209C+Q245G
S9R+A15T+T224A
S9R+A15T+G61E+A85T+P239S+Q245C
S9R+A15T+Q245L
S9R+A15T+N62D+Q245W+N252V
S9R+A15T+N62NG+Q245T
S9R+A15T+N62D+Q245R+N252M
S9R+A15T+N62ND+V139L+Q245E
S9R+A15T+N62D+Q245W+N252S
S9R+A15T+N62ND+V139L+N261D
S9R+A15T+G20*+L21F+N62D+Q245R
S9R+A15T+L111I+Q137E
S9R+A15T+G20*+L21F+N62E+Q245R
S9R+A15T+G97GA+Q137E
S9R+A15T+G97GA+H120D+Q137H+M222V
S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H
S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137D+N248D
S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S
S9R+A15T+L21LW+G100S+V139L+Q245V
S9R+A15T+G97GV+H120Q
S9R+A15T+G20*+L21F+N62D+Q245N
S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E
S9R+A15T+L21LC+V139L+R186H+Q245M
S9R+A15T+G97GV+P131S
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245G
S9R+A15T+K94N+H120N+P131H
S9R+A15T+T22TL+N62D+I107V+V139L+Q245W
S9R+A15T+N76S+L111V+P131H+Q137D
S9R+A15T+T22TQ+S101P
S9R+A15T+F50S+H120D+P131H
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245V
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S9R+A15T+T22TL+N62D+Q245W
S9R+A15T+L96LG+P131Q+Q137D
S9R+A15T+T22TW+N204D+Q245I
S9R+A15T+T22A+V139L+Q245E
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S9R+A15T+S130P
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S9R+A15T+Q245F
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S9R+A15T+Q245S
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V4A+S9R+A15T+G97GV+H120D
S9R+A15T+N77S+L96LG+H120D+P131Q
S9R+A15T+L96LG+H120D+G160D
S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137E
S9R+A15T+G97GA+H120N+S212L
S9R+A15T+G97GA+Q137E+L262V
S9R+A15T+P131H+S144P
S9R+A15T+G127E+P131R+Q137H
の1つを含み、
(a)当該変異体がプロテアーゼ活性を有し、そして
(b)各位置が、配列番号:1に示されるサブチリシンBPN'のアミノ酸配列の位置に対応する、サブチリシン変異体。 - 親サブチリシンが亜群I-S1に属する請求項1に記載のサブチリシン変異体。
- 親サブチリシンが亜群I-S2に属し、そして当該親がBLSAVI(サビナーゼ(商標))である、請求項1又は2に記載のサブチリシン変異体。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のサブチリシン変異体をコードするDNA。
- 請求項4に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞。
- バシラス属である請求項6記載の微生物宿主細胞。
- 真菌または酵母である請求項6に記載の微生物宿主細胞。
- 請求項6〜8のいずれかに記載の宿主細胞を、変異体の発現および分泌を促す条件下で培養し、そして変異体を回収する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のサブチリシン変異体の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異体を含む清浄または洗浄用組成物。
- 洗濯または食器洗浄用組成物である、請求項10に記載の洗浄用組成物。
- セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ラクターゼ、グリコアミラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リグニナーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項10又は11に記載の組成物。
- 洗濯用および/または食器洗浄用洗剤中の請求項1〜3のいずれかに1項に記載の変異体の使用。
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