JP5769142B2

JP5769142B2 - ピヒア属酵母において異種タンパク質を高分泌させる方法

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Publication number: JP5769142B2
Application number: JP2007229085A
Authority: JP
Inventors: 純平和田; 博子池田; 正木　和夫; 和夫正木; 力藤井; 家藤　治幸; 治幸家藤
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2007-09-04
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2027-09-04
Also published as: JP2009060804A

Description

本発明は、異種タンパク質を微生物（特に酵母）で培地中に分泌生産させるために必要な分泌シグナル配列、及び、それを用いて異種タンパク質遺伝子を高発現させ、異種タンパク質を高生産させる方法に関するものである。

一般的に目的タンパク質を異種タンパク質として生産させる場合、細胞内に生産させるものと細胞外に分泌生産させるものとがあるが、精製の容易さなどから目的タンパク質を分泌型として生産させるほうが好ましいとされている。細胞内生産型と細胞外分泌生産型の違いは、分泌シグナル配列の有無によるとされている。この考えは、「シグナル仮説」と呼ばれ、１９７５年にＧ．Ｂｌｏｂｅｌにより初めて提唱され、その後この仮説が正しかった事が証明されている。

「シグナル仮説」とは、タンパク質のＮ末端側に付加された疎水性アミノ酸に富む延長ペプチド配列をシグナル配列と名付け、そのシグナル配列がタンパク質の輸送先を決定しているという考えであった。これは、分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡを翻訳すると、目的タンパク質よりも分子量が大きなタンパク質が生産され、Ｎ末端側に余分なペプチドが付加していることに着目した事から考え出された。現在までに、そのシグナル配列を、ＲＮＡ−タンパク質複合体である“Ｓｉｇｎａｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｐａｒｔｉｃｌｅ（ＳＲＰ）”が認識、結合し、一時翻訳伸長反応が停止する。その後、小胞体膜にあるＳＲＰ受容体とＳＲＰ（シグナルペプチド認識粒子）の相互作用により小胞体の内腔を開き、そこを通りタンパク質が内腔を通過することが明らかとなっており、内腔通過後、シグナルペプチダーゼによりシグナル配列は切断され、タンパク質の翻訳伸長反応が再開されると考えられている。

なお、酵母の分泌発現系でよく利用されている“α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ”をはじめとするある種の分泌シグナル配列は、Ｐｒｅ配列とＰｒｏ配列を有している。タンパク質の上流にＰｒｏ配列、さらにその上流にＰｒｅ配列が付加している構造である。この場合、Ｐｒｅ配列（プレ配列）がシグナル配列に相当する配列となり、Ｐｒｏ配列（プロ配列）は様々な役割を果たしているとされている。α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ（α−因子プレ−プロリーダー）においては、Ｐｒｏ配列は分泌において重要である事が明らかとなっている。

サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主とし、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒを用いてヒトインスリン様成長因子１（Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ１）を発現させた場合、ｐｒｅ−ｐｒｏ配列を持つ株では高い分泌生産量が見られたが、Ｐｒｏ配列を取り除いた株では全く分泌が行われなかった。また、同じく分泌が見られなかったＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来Ｉｎｖｅｒｔａｓｅの分泌シグナルであるＳＵＣ２、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの分泌シグナルであるＰＨＯ５の下流にα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒのＰｒｏ配列を付加した株では、分泌能力の向上が報告されている。

更に、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）を宿主とし、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒを用いてＨｕｍａｎｌｙｓｏｚｙｍｅ（ヒトのリゾチーム）を発現させた場合、Ｐｒｏ配列を取り除く事により劇的に分泌生産量が減少することが報告されている。これらの原因は明らかとなっていないが、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒのＰｒｏ配列にはいくつかの糖鎖付加部位があり、ゴルジ体で糖鎖付加を受ける事によりタンパク質の安定性を高めていると考えられている。α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ以外にもＰｒｏ配列を持つタンパク質は多数存在し、折りたたみなどの立体構造の形成に寄与しているものなども存在する。

Ｊ．ＬＣｅｒｅｇｈｉｎｏ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ、（２０００）らによると、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主として異種タンパク質を生産させた際の各種シグナル配列使用数は分泌生産型の半数以上では、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒが用いられている。また、ネイティブシグナル配列以外では、ＳＵＣ２やＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来ａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの分泌シグナルであるＰＨＯ１などが用いられた例がいくつかあるが、現在高分泌生産に用いられている分泌シグナル配列の選択肢は少ない。また、分泌シグナル配列と目的タンパク質には相性があり、同じ分泌シグナル配列を用いた場合でも、目的タンパク質の種類により分泌生産量が増加したり減少したりすることが報告されている。このため、相性が合わずＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とした高分泌生産が難しいタンパク質も多数存在する。
バイオテクノロジー事典、１９８６年１０月９日、株式会社シーエムシー発行、第９７６〜９７７頁ＢｒｏｂｅｌＧ．，ＤｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎＢ．，ＴＲＡＮＳＦＥＲＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳＡＣＲＯＳＳＭＥＭＢＲＡＮＥＳ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９７５；６７：８３５−８６２ＣｅｒｅｇｈｉｎｏＪＬ．，ＣｒｅｇｇＪＭ．，ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２０００；２３：４５−６６

上記したように、各種微生物（宿主）でうまく働く分泌シグナル配列は、外来タンパク質（異種タンパク質）の分泌生産に必要なものである。しかしながら、現在のところ、どのような場合においても利用可能な分泌タンパク質のシグナル配列は存在しておらず、それぞれの宿主において利用可能な選択肢は限られている。多くの場合はそれぞれの宿主において分泌生産されているタンパク質を検索し、そのシグナル配列を利用するが、そもそも酵母においての分泌酵素はそれほど多くは無く、最適なシグナル配列を探し出すことは難しい作業である。ましてや、異種の生物が利用するシグナル配列の検索はさらにその有効な配列を見つけ出すことは非常に難しい作業となる。そのことは、すなわち、現在までに少数のシグナル配列しか提案されておらず、さらにそれらシグナル配列では分泌生産できないタンパク質が多く存在することからも、新規シグナル配列の開発の難しさと重要性を示すことにほかならない。

シグナル配列の重要性及び新規シグナル配列開発の困難性に鑑み、そこで、この現状を改善すべく、発明者らはこれまでの多くの経験と知識を利用しＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とした際に高分泌能が期待される新規分泌シグナル配列の検索を行い、その有用性について確認し、ついに利用可能なシグナル配列を見出すのにはじめて成功したものである。

本発明は、高発現能を有する新規シグナル配列を提案することにより、分泌シグナル配列の選択性の幅を広げ、これまでに報告されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて高発現の難しかった異種タンパク質の高分泌生産を可能とするものである。

本発明者らは、ピヒア属酵母、例えばピヒア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を宿主として使用した際に目的とする異種タンパク質を高分泌生産させることのできる新規分泌シグナル配列を開発する目的で各方面から鋭意検討、研究した結果、黄麹菌アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ：Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ（Ｔａｋａ−ａｍｙｌａｓｅ）：ＴＡＡ）の分泌シグナル（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）配列が上記目的を達成しうることをはじめて見出した。

そして、該新規分泌シグナル配列（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列）が宿主Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて高分泌能を有し、異種タンパク質を高分泌高生産することもはじめて確認し、これらの有用新知見に基づき、本発明を完成するに至った。

本発明は、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて新たに分泌シグナル配列として使用する点を重要な特徴のひとつとして有するものであって、次の態様を包含するものである。

（１）アスペルギルス・オリーゼ（黄麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ：Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ（Ｔａｋａ−ａｍｙｌａｓｅ：ＴＡＡ）の分泌シグナル配列（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列）を使用すること、を特徴とするピヒア属酵母（例えば、ピヒア・パストリス：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において異種タンパク質を高分泌させる方法。
（２）該ＴＡＡシグナル配列が、１もしくはそれ以上の数個のアミノ酸が欠失もしくは置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つシグナル配列としての活性を有するものであること、を特徴とする上記（１）に記載の方法。

（３）該ＴＡＡシグナル配列に対応するＤＮＡ配列（遺伝子塩基配列）の直下に、又は、１もしくはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列（遺伝子塩基配列）を介して、その下流に異種タンパク質に対応するＤＮＡ配列（塩基配列）、すなわち異種タンパク質をコードする遺伝子（構造遺伝子）を配してなること、を特徴とする組換え分泌プラスミド及びその構築（製造、作成）方法。
なお、ＴＡＡシグナル配列の上流にプロモーター（例えば、ＡＯＸ１）、また異種タンパク質構造遺伝子のほか、プラスミド上にマーカー（例えば、ＨＩＳ４遺伝子）、抗生物質耐性遺伝子を配してもよい。

（４）上記（３）にしたがって構築した組換え分泌プラスミドを用いて、エレクトロポレーション等の常法にしたがってピヒア・パストリスを形質転換して形質転換体を製造する方法、及び、同方法によって得られた形質転換体。

（５）上記（４）に記載の形質転換体を培養し、培養液から異種タンパク質を回収すること、を特徴とする異種タンパク質の製造方法、ないしは、異種タンパク質の高分泌生産方法。

（６）該異種タンパク質がクリプトコッカス属菌（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｓ−２）由来のリパーゼ（ＣＳＬＰ）、ボトリティス属菌（例えば、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のクチナーゼ（ＢＣＣｕｔ）、フザリウム属菌（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）由来のクチナーゼ（ＦＳＣｕｔ）、タカアミラーゼの少なくともひとつであること、を特徴とする上記（５）に記載の方法。

本発明によれば、新規分泌シグナル配列としてタカアミラーゼの分泌シグナル配列（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列）を新たに使用することによって、宿主Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ピヒア・パストリス）から、異種タンパク質を高分泌生産させることができるという著効が奏される。例えばＣＳＬＰ、ＢＣＣｕｔでは、ネイティブシグナルと比較して、それぞれ約２．３倍、約８．３倍という高い活性を示し、タカアミラーゼでは、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒの２培以上の活性を示した。また、ＣＳＬＰ、ＢＣＣｕｔ、ＦＳＣｕｔでは、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列はα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒと同程度の活性を有することが示された。

本発明によれば、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列はα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒと同程度の非常に高い分泌能を有することが確認され、その為、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの異種タンパク質生産において高分泌シグナルとして応用が可能である。しかも、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列はＰｒｏ配列無しであるにもかかわらず、Ｐｒｏ配列を有するα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒと同程度の活性を有するという著効も奏するものであり、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列にＰｒｏ配列を付加することにより更なる分泌量の向上も期待される。

本発明を実施するには、新規分泌シグナル配列として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来α−ａｍｙｌａｓｅ（Ｔａｋａ−ａｍｙｌａｓｅ：ＴＡＡ）の分泌シグナル（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）配列を用いることが必要である。ＴＡＡは、麹菌の生産する酵素の中で最も有名な酵素の一つであり、分泌生産量も非常に多く発酵産業において有効利用されている。ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列を利用することにより、分泌タンパク質の生産性の向上が図られる。

Ａ．ｏｒｙｚａｅは１〜３種類のＴＡＡ遺伝子を持っていることが知られているが、ゲノムＤＮＡの解読が終了した株では３種類のＴＡＡ遺伝子を持っていた。いずれのＴＡＡ遺伝子が高発現しているかなどの詳細はわかっていないが、その３種類のＴＡＡに関して、ＯＲＦ部位で１００％の配列一致が見られる。なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来Ｔａｋａアミラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列は、ＥＭＢＬ欧州分子生物学研究所（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＸ１２７２５、Ｘ１２７２６及びＸ１２７２７に記載されている。

ＴＡＡシグナル配列（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来Ｔａｋａアミラーゼシグナル配列（ＥＭＢＬＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＸ１２７２５、Ｘ１２７２６、Ｘ１２７２７に記載））と組み合わせ分泌生産させる目的タンパク質には、どのような分泌タンパク質であってもよく、実施例に示したリパーゼ、クチナーゼに限るものではない。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてｍＲＮＡの合成を開始することができるプロモータの下流にＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列（６３ｂｐ）に対応する塩基配列を配しその下流に分泌させるタンパク質に対応する塩基配列を並べることで、ＴＡＡｓｉｇｎａｌを利用した異種タンパク質の発現カセットを完成することができる。また、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列に対応する塩基配列と分泌させる異種タンパク質に対応する塩基配列の間には、１つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する塩基配列が挿入されてもよい。

発現カセットに関しては、更に詳細には、例えば、プロモーター（例えば、ＡＯＸ１）、ＴＡＡ分泌シグナル配列、異種タンパク質遺伝子を配し、更にマーカー（例えば、ＨＩＳ４）、抗生物質（例えば、ペニシリン）耐性遺伝子を配して、組換え分泌プラスミドを構築する。

このようにして構築した組換え分泌プラスミドでエレクトロポレーション法その他の常法によりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換する。得られた形質転換体を培養することにより、目的とする異種タンパク質を菌体外へ高分泌生産させることができる。そこで、培養液中から異種タンパク質を回収すれば、大量に目的タンパク質を得ることができる。

以下、本発明の実施例について述べるが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）酵母クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｓ−２が生産するリパーゼ（ＣＳＬＰ）は、それ自身のシグナル配列をＮ末端領域に持っており、他の酵素と比較して次のような特徴的な酵素的性質を有している：
Ｃｕｔｉｎａｓｅ−ＬｉｋｅＥｎｚｙｍｅｆｒｏｍｔｈｅＹｅａｓｔＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＳｔｒａｉｎＳ−２ＨｙｄｒｏｌｙｚｅｓＰｏｌｙｌａｃｔｉｃＡｃｉｄａｎｄＯｔｈｅｒＢｉｏｄｅｇｒａｂｌｅＰｌａｓｔｉｃｓ．
ＭａｓａｋｉＫ，ＫａｍｉｎｉＮＲ，ＩｋｅｄａＨ，ＩｅｆｕｊｉＨ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１，７５４８−７５５０（２００５）

まず１つ目は、非常に高い生分解性プラスチック分解能を有している点である。生分解性プラスチックとは、ＩＳＯでは「バクテリア、カビおよび藻類など自然の微生物により低分子量化合物に分解するプラスチック」、日本の生分解性プラスチック研究会では「自然界において、微生物が関与して、低分子量化合物に分解するプラスチック」と定義されている。生分解は、微生物分解とも言われ、微生物の菌体外酵素により分解し、低分子量化合物へと分解される。主な生分解性プラスチックには、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）などが挙げられるが、いずれも酵素レベルでの分解例は少なく、ＰＬＡを分解できる酵素についての報告例は特に少ない。

これまでＰＬＡ分解に最も広く用いられてきた酵素はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ（プロティナーゼ）Ｋと呼ばれる酵素である。しかしＣＳＬＰは、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと比較して、同酵素濃度当たり、約５００倍ものＰＬＡ分解能を示した。ＣＳＬＰはこのほかにもＰＢＳ、ＰＣＬに対して分解活性を有する事も確認されており、本酵素が様々な生分解性プラスチックに対して分解活性を持つ、つまり幅広い基質特異性を持ち、さらにいずれにも高い活性を示すという特徴を持っている。

２つ目は、高いエステル合成能を有する点である。リパーゼは、脂質を基質として、そのエステル結合を加水分解する酵素であるが、同時に逆反応であるエステル合成を行う酵素としても働く事が知られている。このため、リパーゼは人工的なエステル合成反応にも用いられている。エステル合成は植物性油とメタノールを混ぜ、この反応をリパーゼが触媒するという方法が用いられているが、現在広く用いられているリパーゼは有機溶媒耐性が弱いため、メタノールを段階的に加える手法が用いられている。しかしＣＳＬＰは非常に高い有機溶媒耐性を有している事が確認されており、ワンステップでメタノールを加える事が可能である。そのため、工業的にも非常に有用であると考えられている。

（２）これらの非常に有用な特徴を示すＣＳＬＰであるがＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｓ−２自身における生産量は、これまで培地の検討等により向上を示してきた。しかし、本酵素を工業的に利用しようとした際には、より高い生産力が必要であると考えられた。

そこでメタノール資化酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とした高分泌生産を試みた。ＣＳＬＰは本来分泌タンパク質であるために、そのＮ末端領域には分泌するためのシグナル配列（オリジナルシグナル配列）を保有している。そこで、このシグナル配列領域をＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列に変えたもの、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ配列に変更したものをそれぞれ作成し分泌生産能力を比較した。シグナル領域の異なるＣＳＬＰを分泌生産させるために構築したプラスミドを図１〜３に示す。

これらのプラスミドは、市販のプラスミドｐＰＩＣ３およびｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手可能）をベースとし、プロモーター（ＡＯＸ１）の下流に分泌配列、ＣＳＬＰ遺伝子、マーカー（ＨＩＳ４）、アンピシリン耐性遺伝子を組み込んでなるものである。既述のように、ＣＳＬＰは本来分泌タンパク質であるために自身そのＮ末端領域に分泌シグナル配列（ネイティブシグナル配列）を有している（組換え分泌プラスミドＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ３：図１）。このシグナル配列領域をＳ．セレビシエのα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ配列に変えたものが、組換えプラスミドＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ９である（図２）。また、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列に変えたものが組換えプラスミドＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ３（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）である（図３）。それぞれのプラスミドは、以下の方法にしたがい、Ｐ．パストリスに導入された。

（４）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓへのプラスミドの導入は、ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より市販）記載の方法に従い以下の方法で行った。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ親株を５ｍｌＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％ポリペプトン、２％Ｄ−グルコース）にて３０℃、オーバーナイトで前培養を行った。５０ｍｌＹＰＤ培地に１０μｌの前培養液を植菌し、３０℃でＯＤ₆₀₀＝１．３〜１．５となるまで培養を行った。

培養液を４℃、６０００ｒｐｍで８分間遠心を行い、菌体を回収した。回収した菌体を５０ｍｌの滅菌水に懸濁し、再度４℃、６０００ｒｐｍで８分間遠心を行い、菌体を回収した。この操作を２度行った。その後回収した菌体を４ｍｌのｃｏｌｄ１ＭＳｏｒｂｉｔｏｌに懸濁し、４℃、６０００ｒｐｍで８分間遠心を行い、菌体を回収した。回収した菌体を２００μｌのｃｏｌｄ１ＭＳｏｒｂｉｔｏｌ（ソルビトール）に懸濁した。以上の操作は氷上で行った。

０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に菌体懸濁液８０μｌと制限酵素処理を行いリニア状にしたＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ１０μｌ（約５〜２０ μｇ）を加えて氷上で５分間インキュベートした。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社商標）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にキュベットをセットし、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、すぐにｃｏｌｄ１ＭＳｏｒｂｉｔｏｌを加えピペッティングにより混合し、ＢＤＦＡＬＣＯＮ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ社登録商標）１４ｍｌポリプロピレンラウンドチューブ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に全量を移して、３０℃で２時間、静置でインキュベートを行った。セレクションマーカーがＨＩＳ４遺伝子の場合はＭＤＰｌａｔｅ（ＭＤプレート：１．３４％ＹＮＢ，４×１０−５％Ｂｉｏｔｉｎ，２％Ｇｌｕｃｏｓｅ，２％Ａｇａｒ）に塗布し、３０℃でコロニーが形成されるまでインキュベートを行い、得られたコロニーは、ＭＤＰｌａｔｅに植え継いだ。それぞれの菌株は、最小培地ＢＭＭ培地（組成：１００ｍＭｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０），１．３４％ＹＮＢ，４×１０−５％Ｂｉｏｔｉｎ，０．５％Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に植え継がれ、経時的に分泌生産された培地中のリパーゼ活性を測定した（図４）。ＣＳＬＰオリジナルシグナルから、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列に変えることで分泌生産量は向上した。また、その効果は、これまで有効だと考えられてきたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ配列と同等のものであった。

（実施例２）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主としたＴＡＡの分泌生産について、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ配列の比較を行った。シグナル領域の異なるＴＡＡを分泌生産させるために構築したプラスミドを図５〜６に示す。

これらのプラスミドは、実施例１で述べた組換え分泌プラスミド（図１、図２）において、ＣＳＬＰ（ネイティブシグナル配列含有）領域、及び、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ、ＣＳＬＰ領域を、それぞれ、ＴＡＡ（本来、ネイティブシグナル配列含有）領域、及び、α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ、ＴＡＡ領域にかえた組換え分泌プラスミドＴＡＡ／ｐＰＩＣ３（Ｎａｉｔｉｖｅｓｉｇｎａｌ）、及び、ＴＡＡ／ｐＰＩＣ９である（図５、図６）。

これらのプラスミドを実施例１の記載にしたがって、それぞれ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに導入し、得られた形質転換体を最小培地ＢＭＭで培養した。しかしながら、経時的に活性の減少が見られたため、ＢＭＭ培地に更に１％イーストエキストラクト及び２％ペプトンを加えたＢＭＭＹ培地で発現誘導を行った。

経時的に分泌生産された培地中のＴＡＡ活性を測定した（図７）。ＴＡＡの分泌生産についてのシグナル配列の効果は、これまで有効だと考えられてきたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ配列よりもＴＡＡｓｉｇｎａｌ配列のほうが効果が高いことが実験データにより実証された。

ＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ３の作製を示す。ＣＳＬＰはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｓ−２で分泌生産されており、そのためＣＳＬＰ遺伝子は、自身の分泌シグナル配列（ネイティブシグナル配列）を有している。ＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ９の作製を示す。ＣＳＬＰネイティブシグナル配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来α−ｆａｃｔｏｒフェロモンの分泌配列であるα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒに置き換えた、ＣＳＬＰシングルコピー株作製用のＰｌａｓｍｉｄを作製した。ＣＳＬＰ／ｐＰＩＣ３（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）の作製を示す。ＣＳＬＰネイティブシグナル配列を、ＴＡＡの分泌シグナル（ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）に置き換えたＣＳＬＰシングルコピー株作成用のＰｌａｓｍｉｄを作製した。ＣＳＬＰ形質転換体ＢＭＭ培養時ＣＳＬＰ活性経時変化を示す。ＴＡＡ／ｐＰＩＣ３（Ｎａｔｉｖｅｓｉｇｎａｌ、ＴＡＡｓｉｇｎａｌ）の作製を示す。分泌シグナルとしてネイティブ分泌シグナル、即ちＴＡＡｓｉｇｎａｌを用いたＴＡＡシングルコピー株作成用Ｐｌａｓｍｉｄを作製した。ＴＡＡ／ｐＰＩＣ９（α−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒ）の作製を示す。ＴＡＡネイティブシグナル配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来α−ｆａｃｔｏｒフェロモンの分泌配列であるα−ｆａｃｔｏｒｐｒｅ−ｐｒｏｌｅａｄｅｒに置き換えた、ＴＡＡシングルコピー株作製用のＰｌａｓｍｉｄを作製した。ＴＡＡ形質転換体ＢＭＭＹ培養時ＴＡＡ活性経時変化を示す。

Claims

アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来タカ（Ｔａｋａ）アミラーゼシグナル配列（ＴＡＡシグナル配列）に対応する塩基配列の直下に異種タンパク質に対応する塩基配列を配した組換え分泌プラスミドを使用すること、を特徴とするピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において異種タンパク質を高分泌させる方法。
アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来タカ（Ｔａｋａ）アミラーゼシグナル配列（ＴＡＡシグナル配列）に対応する塩基配列の直下に異種タンパク質に対応する塩基配列を配してなる組換え分泌プラスミドによってピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）を形質転換してなる形質転換体。
請求項２に記載の形質転換体を培養し、培養液から異種タンパク質を回収すること、を特徴とする異種タンパク質を製造する方法。
該異種タンパク質がクリプトコッカス属菌由来のリパーゼ、ボトリティス属菌由来のクチナーゼ、フザリウム属菌由来のクチナーゼ、タカアミラーゼの少なくともひとつであること、を特徴とする請求項３に記載の方法。