JP5753356B2 - 活性エピトープを有する非変性ｉｉ型コラーゲンの抽出方法 - Google Patents

Description

本発明は、非変性II型コラーゲンのエピトープの活性を保持しつつ抽出する方法に関する。また、当該方法により抽出された、活性が保持されたエピトープを有する非変性II型コラーゲンに関する。

コラーゲンは、皮膚・骨や軟骨などを構成するタンパク質であり、多細胞動物の細胞外基質の主成分である。コラーゲンには複数の種類があり、このうち3本鎖から構成される繊維性コラーゲンであるII型コラーゲンは、関節軟骨に主に含まれており、他には目の硝子体にも含まれている。そのため、II型コラーゲンは、関節に対する構造機能栄養素としての有用性が注目され、高熱処理又は化学処理された上で加工されたものが知られている。また、その抽出方法も開示されている（特許文献１参照）。

しかしながら、近年の研究で、高熱処理又は化学処理を行ってしまうと、コラーゲンの３本鎖の構造が壊れてしまうので、このような変性を受けていない、３本鎖の残った非変形のII型コラーゲンを経口投与することが、慢性関節リウマチ・関節炎に有効であることがわかっている（非特許文献１参照）。

この点については、非変形のII型コラーゲンの摂取によって、免疫系細胞、特にリンパ球が免疫寛容に陥り、異物でなく自己同一として認識することで、自身のコラーゲンを攻撃することがなくなることが原因であることがわかりつつある。そこで、現在は高熱処理をせず、動物由来軟骨を洗浄・乾燥・粉砕して３本鎖の残った非変形のII型コラーゲンを利用したものが知られている。

さらに、最近の研究により、免疫寛容を起こすためには、エピトープの存在が不可欠であることが分かってきている。エピトープ(epitope)とは、抗体が認識して結合する抗原の特定の構造単位である。抗体は病原微生物や高分子物質などと結合する際、その全体を認識するわけではなく、エピトープを認識して結合する。エピトープは抗原性のための最小単位であり、抗原決定基 (antigenic determinant) とも呼ばれる。小腸内の組織として存在するパイエル板に活性エピトープが結合し、免疫（リンパ）細胞が活性化され、サイトカイン、ケモカインといったほかの細胞の増殖、分化、抑制などに関与する情報伝達分子が分泌し、炎症、例えば関節炎を抑制するものと考えられている（非特許文献２参照）。
したがって、非変形II型コラーゲンであっても、エピトープの活性を維持していなければ、抗体が認識できず、免疫寛容が起きず、有用性が低下することになる。

また、非特許文献２では、さらに、生体内での反応を考慮して、II型コラーゲンを、ペプシンを含有させた酸性溶液で抽出すると、より多くの活性エピトープを抽出できることが示唆されている。これは、ペプシン含有の酸性溶液により、３本鎖の立体形状がゆるむなど、その形状に影響を与えた結果、エピトープの露出量が増えたことによるものと推測されている。
そのため、本願では、II型コラーゲンの３本鎖の立体的形状が変形（例えば、緩むこと）し、かつエピトープに関し活性が維持されているものを「非変性II型コラーゲン」として表現する一方、３本鎖の立体的形状がもとのまま維持されている場合には「非変形II型コラーゲン」として表現し、用語上区別するものとする。

これに対し、特許文献１はエピトープについて何ら着目しておらず、その実施例においては、３本鎖のII型コラーゲンの構造を壊してしまう熱水抽出（高熱処理）も行ってしまっている（実施例２）。また、具体的に効率的な抽出方法の検討もなされていない。

一方、前述した３本鎖状の形態が維持された非変形のII型コラーゲンでは、かなり細かく粉状に砕いても、水には懸濁するのみで水に溶解せず、飲料や液状の食品に応用するのに制限がある。

さらに、慢性関節リウマチや変形性膝関節症などの関節疾患に有用であるためには、継続的に摂取する必要があり、現在の経済状況下では、コスト減・製造の効率化の要求が極めて強い。また、増加する高齢者の生活の質（quality of life）を考えた食品形態が求められている。

したがって、II型コラーゲンのエピトープを、活性を保持したまま効率よく大量に抽出できる方法があれば、原料も必要な摂取量も従来より少ないにもかかわらず、従来以上の効果を上げることができることになる。さらに、水溶性であれば経口摂取を容易にすることができる。

特許第３１５５７４６号公報

Trentham, D. E. et al. Autoimmunity to type II collagen: an experimental model of arthritis. J. Exp. Med. 1977, 146, 857-867 Bagchi, D. et al. Effects of orally administered undenatured type II collagen against arthritic inflammatory diseases: a mechanistic exploration. Int. J. Clin. Pharm. Res. 2002; 22(3/4):101-10.

そこで、本発明は、非変性II型コラーゲンのエピトープを、活性を保持したまま効率よく大量に抽出できる方法を提供することを目的とする。
また、当該抽出方法により抽出された水溶性の非変性II型コラーゲンを使用した食品又は飲料を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明者等は鋭意研究の結果、酸性溶液のみでは、水溶性の非変形II型コラーゲンを抽出することが可能であるものの、抽出できる活性エピトープ量は多くないことがわかった。
にもかかわらず、さらなる鋭意研究により、抽出について、酸性溶液抽出による第１抽出と、ペプシン含有酸性溶液抽出による第２抽出とにより、あえて２段階構成とすることで、ペプシン含有の酸性溶液で一度に抽出する場合と比べ、大量に活性エピトープを抽出できるだけでなく、抽出時間を一気に短縮できることを発見した。
これにより、エピトープの増加・活性の維持・抽出の効率化・水可溶性の全てを一度に達成できることになり、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の水溶性の活性エピトープを有する非変性II型コラーゲンの抽出方法は、動物由来軟骨を、酸性溶液により５０℃以下で第１抽出する工程と、酸性溶液にペプシンを加え、４０℃以下で第２抽出する工程とからなる。
また、第１抽出工程の条件が、５℃〜３５℃（好ましくは２５℃）、pH3.4以下、抽出時間が１２時間〜３６時間であることが好適である。
また、第２抽出工程の条件が、５℃〜３５℃、抽出時間が１２時間〜３６時間であることが好適である。
また、第１抽出時間と第２抽出時間の合計が４８時間以下であることが好適である。
また、第２抽出が、第１抽出より低い温度下で行われることが好適である。
また、第２抽出工程において、エラスターゼが更に加えられていることが好適である。
また、酸性溶液が、酢酸溶液又はクエン酸溶液であることが好適である。
また、動物由来軟骨が、鶏軟骨であり、洗浄及び乾燥の後、粉砕されたものであることが好適である。
さらに、上記方法により得られた活性エピトープを有する非変性II型コラーゲン、およびこれを含有する食品又は飲料であることが好適である。

なお、本願において、「活性エピトープ」とは、抗体が認識して、免疫寛容を起こすことができるエピトープを言う。なお、II型コラーゲンのエピトープは、由来する動物によって異なる場合があるが、例えばウシであれば、下記構造式に示される。

本発明において採用できる動物の種類は、鳥類・ほ乳類・魚類、すなわち鶏・ウシ・ブタなど、特に限定されるものではない。II型コラーゲンは、軟骨に主に含まれ、他には鮭の鼻骨などにも含まれる。

動物由来軟骨は、抽出のため粉砕される前に、通常は前処理として洗浄及び乾燥される。洗浄は、過酸化水素水や次亜塩素酸ナトリウムなど、公知の洗浄液を使用可能であり、通常４０℃以下で約１０〜３０分間行う。乾燥についても、凍結乾燥（−４０〜−１０℃）・オーブン乾燥（４０〜５０℃）など公知の方法が使用可能であるが、６０℃以上の高温で行うとII型コラーゲン及び活性エピトープを変性させ収率が下がる可能性があるので適切ではない。粉砕は、公知の粉砕器を使用して行うことができるが、5mm以下、好ましくは3mm以下にまで粉砕することが好ましい。細かくなればなるほど、抽出効率が上がるためである。

エラスターゼとは、タンパク質やペプトンを更に小さなポリペプチドやアミノ酸にするプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）である。ペプシンと併用することにより、II型コラーゲンがさらに細かく分解又は細断される結果、より活性エピトープが露出するため、併用することが好ましい。

本発明においては、酸性溶液抽出による第１抽出と、ペプシン含有酸性溶液抽出による第２抽出の２段階構成とする。第１抽出と第２抽出の時間は、酸の濃度や抽出温度、抽出したい活性エピトープ量により適宜設定すれば良いが、効率を高めるためには、第１抽出及び第２抽出を、それぞれ１２時間以上、好ましくは２４時間程度行うことが好適である。このような構成により、ペプシン含有酸性溶液で一度に抽出を行う場合と比べ、少なくとも３０％以上の抽出時間の効率化を図ることができるものである。
第１抽出温度は、II型コラーゲンの構造を壊さないように、５０℃以下とし、好ましくは常温である５℃〜３５℃程度で行う。特には、室温（およそ２５℃）程度で行うと効率が良い。
第２抽出温度は、４０℃以下、好ましくは常温である５℃〜３５℃程度で行う。なお、タンパク質であるコラーゲンの変性を極力さけるために、５℃〜第１抽出よりも低い温度に設定しても良い。

本発明の方法により抽出された活性エピトープを有する非変性II型コラーゲンは水溶液のまま、あるいは遠心分離又はろ過を行い、オーブン又は凍結乾燥させて粉末化して使用することができる。また、得られた粉末は水溶性である。したがって、それらは容易に食品・飲料に含有させることができるものである。

本発明によれば、エピトープの活性が維持された非変性II型コラーゲンを抽出できるだけでなく、３本鎖の立体構造がそのまま維持された非変形II型コラーゲンよりも、抗体が認識可能な活性エピトープを増加させることが可能である。さらには、抽出時間を飛躍的に短縮させることができ、かつ水溶性であるため、工業的量産に特に適しており、食品・飲料に様々な形で適用が可能な素材を提供することが出来るものである。

本発明の活性エピトープ抽出法について、様々な点から検証を行った。
II型コラーゲンの活性エピトープの定量については、ELISA法（Astarte Biologics社の『Native Type II Collagen Capture ELISA』）を使用した。当該ELISA法では、抗体抗原反応を利用して、活性のあるエピトープに反応したII型コラーゲン量を把握できるため、結果的に活性のあるエピトープ量を比較することが出来るからである。また、下記実験で使用したペプシンは和光純薬工業株式会社製，ブタ胃粘膜由来のもの、エラスターゼは和光純薬工業株式会社製，ブタ膵臓由来のものを使用した。

実験例１ 乾燥方法・酵素の有無についての検討
鶏胸軟骨の乾燥方法の違いにより、最終的に得られる活性エピトープ量に相違があるか、また抽出に際し酵素の有無により差異があるか否か、実験を行った。
工程としては、洗浄した鶏胸軟骨を凍結乾燥又はオーブン乾燥後、粉砕し７２時間・５℃・pH3で、酢酸溶液・酢酸溶液＋ペプシン・酢酸溶液＋ペプシン＋エラスターゼの３種類にわけて抽出後（ペプシン濃度は1mg／ml、以下の実験でも同様）、遠心分離(10000×g、20min、4℃、以下の実験でも同様)し、上記ELISA法によって活性エピトープと反応したII型コラーゲン量を定量した（％，w/w、以下の実験でも同様）。特にその結果が下記表１である。

表１

以上の結果から、凍結乾燥でもオーブン乾燥でも、乾燥法により得られる活性エピトープ量に相違はあまりないことがわかった。そのため、方法の容易さ及び費用の観点から、大量に処理するにはオーブン乾燥の方が適していると考えられる（特記がない限り以下の実験では、鶏胸軟骨を洗浄・オーブン乾燥・粉砕したものを使用。）。
また、酢酸溶液だけでは値が低く、ペプシンを添加した方が、さらにはペプシンとエラスターゼを添加した方が、より高い値であることがわかった。これは、ペプシン添加により３本鎖の立体構造がゆるみ、かつエラスターゼの添加により細断され、活性エピトープがより多く露出したことによるものと推測される。
すなわち、動物由来軟骨を洗浄・乾燥・粉砕した非変形II型コラーゲンよりも、ペプシンを含有した酸性溶液で抽出を行った抽出液中に、より多くの活性エピトープを有するII型コラーゲンが存在しており、より少量の原料で高い効果をあげることが可能である。さらに、この非変性II型コラーゲンは酸性溶液に溶解しており、水溶性の非変性II型コラーゲンとして、より応用性が高い。

実験例２
抽出における酸の種類による効果の相違について
抽出する酸の種類を変え、それぞれペプシン及びエラスターゼを添加し、７２時間・５℃・pH3で抽出を行った。また、酢酸とクエン酸については、乾燥方法につき凍結乾燥とオーブン乾燥の両方について行った。その結果が下記表２である。

表２

以上の結果から、抽出する酸の違いにより、多少の相違がみられた。特に、食品や飲料への適用の可能性や、入手の容易さ、値段などの事情を考慮すれば、酢酸又はクエン酸が好適である。また、時間的には、２４時間経過時点で、７２時間経過後に対し３０％程、４８時間経過後時点で７２時間経過後に対し７０％程の抽出量であった。

実験例３
抽出後の高熱処理の有無について
同じ条件で抽出し、高熱処理（100℃，30min）の有無によりわけて定量を行った。その結果が下記表３である。

表３

以上の結果から、高熱処理を行うと、エピトープの活性を失わせてしまうことがわかった。そのため、抽出についても、少なくとも５０℃以下で行うことが好適であると思われる。

実験例４
pHによる抽出効果の相違について
抽出に際し、酢酸溶液とクエン酸溶液のpH値をそれぞれ変え、その他の条件を同じにして、活性エピトープ量を定量した。結果が下記表４である。

表４

以上の結果から、pH値が低いほど、高い値を示すことがわかった。一方、pH値が3.4程度あれば、一定量の抽出を行うことができることもわかった。あまり強い強酸だと、容器、製造機器の維持や耐久性の問題が生じるため、経済性も含め全体的な効率を考慮すると、2.5〜3.0程度が最も好適である。

実験例５
本発明による２段階抽出の効果、及び抽出温度との関係について
第１抽出を２４時間、第２抽出を２４時間として、第１抽出の温度を変えて活性エピトープ量を定量した。その結果が下記表５である。

表５

以上の結果から、ペプシン含有酸性溶液のみで７２時間抽出した場合（１７．２％，実験例１参照）に比べ、わずか４８時間で20.3％という抽出量を実現することができた。これにより、抽出効率は飛躍的に向上し、わずかな原料で、かつ短期間に大量の活性エピトープを有する非変性II型コラーゲンを抽出することができるものである。また、抽出された活性エピトープを有する非変性II型コラーゲン溶液は水溶性となっており、食品や飲料への適用がより容易になるものである。
また、第１抽出は４０℃では問題ないが、６０℃以上で行うと、明らかに抽出量が下がる。このため、抽出温度は５０℃以下とすべきであり、常温（１５℃〜３５℃程度）とするのが好適である（特には２５℃程度が好ましい）。なお、第２抽出はコラーゲンの変性を極力さけるため５℃としたが、第２抽出は常温かつ５℃より高い温度であれば、ペプシンがより活性化しさらに抽出効率は上がる可能性があり、本発明の効果の高さがわかる。
さらに、前述の実験から明らかなように、第２抽出時にエラスターゼを投入することにより、さらに抽出効率をあげることも可能である。

以上の実験結果から、本発明の方法により、短期間で、少ない原料で、大量の活性エピトープを抽出することができ、かつ水溶性で応用性の高いII型コラーゲンを得ることができることがわかる。このように、本発明によれば、従来と比べ、抽出時間・抽出効率・抽出物の応用性のすべてに渡り優れていることがわかる。

Claims (4)

1. ６０℃以下で洗浄及び乾燥の後、粉砕された動物由来軟骨を、
   酢酸溶液又はクエン酸溶液により、
   （１）温度 ５℃〜３５℃
   （２）pH ３．４以下
   （３）抽出時間 １２時間〜３６時間
   の条件下で第１抽出する工程と、
   酸性溶液にペプシンを加え、
   （１）温度 ５℃〜３５℃（ただし、第１抽出より低い温度下）
   （２）pH ３．４以下
   （３）抽出時間 １２時間〜３６時間
   の条件下で第２抽出する工程とからなることを特徴とする、
   抽出される水溶性の非変性II型コラーゲンにおけるエピトープを、活性を保持したまま大量に効率的に維持する抽出方法。
2. 第１抽出時間と第２抽出時間の合計が、４８時間以下であることを特徴とする請求項１に記載の抽出方法。
3. 第２抽出工程において、エラスターゼが更に加えられていることを特徴とする請求項２に記載の抽出方法。
4. 動物由来軟骨が、鶏軟骨であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の抽出方法。