JP5753356B2 - 活性エピトープを有する非変性ii型コラーゲンの抽出方法 - Google Patents
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Description
したがって、非変形II型コラーゲンであっても、エピトープの活性を維持していなければ、抗体が認識できず、免疫寛容が起きず、有用性が低下することになる。
そのため、本願では、II型コラーゲンの3本鎖の立体的形状が変形(例えば、緩むこと)し、かつエピトープに関し活性が維持されているものを「非変性II型コラーゲン」として表現する一方、3本鎖の立体的形状がもとのまま維持されている場合には「非変形II型コラーゲン」として表現し、用語上区別するものとする。
また、当該抽出方法により抽出された水溶性の非変性II型コラーゲンを使用した食品又は飲料を提供することを目的とする。
にもかかわらず、さらなる鋭意研究により、抽出について、酸性溶液抽出による第1抽出と、ペプシン含有酸性溶液抽出による第2抽出とにより、あえて2段階構成とすることで、ペプシン含有の酸性溶液で一度に抽出する場合と比べ、大量に活性エピトープを抽出できるだけでなく、抽出時間を一気に短縮できることを発見した。
これにより、エピトープの増加・活性の維持・抽出の効率化・水可溶性の全てを一度に達成できることになり、本発明を完成させた。
また、第1抽出工程の条件が、5℃〜35℃(好ましくは25℃)、pH3.4以下、抽出時間が12時間〜36時間であることが好適である。
また、第2抽出工程の条件が、5℃〜35℃、抽出時間が12時間〜36時間であることが好適である。
また、第1抽出時間と第2抽出時間の合計が48時間以下であることが好適である。
また、第2抽出が、第1抽出より低い温度下で行われることが好適である。
また、第2抽出工程において、エラスターゼが更に加えられていることが好適である。
また、酸性溶液が、酢酸溶液又はクエン酸溶液であることが好適である。
また、動物由来軟骨が、鶏軟骨であり、洗浄及び乾燥の後、粉砕されたものであることが好適である。
さらに、上記方法により得られた活性エピトープを有する非変性II型コラーゲン、およびこれを含有する食品又は飲料であることが好適である。
第1抽出温度は、II型コラーゲンの構造を壊さないように、50℃以下とし、好ましくは常温である5℃〜35℃程度で行う。特には、室温(およそ25℃)程度で行うと効率が良い。
第2抽出温度は、40℃以下、好ましくは常温である5℃〜35℃程度で行う。なお、タンパク質であるコラーゲンの変性を極力さけるために、5℃〜第1抽出よりも低い温度に設定しても良い。
II型コラーゲンの活性エピトープの定量については、ELISA法(Astarte Biologics社の『Native Type II Collagen Capture ELISA』)を使用した。当該ELISA法では、抗体抗原反応を利用して、活性のあるエピトープに反応したII型コラーゲン量を把握できるため、結果的に活性のあるエピトープ量を比較することが出来るからである。また、下記実験で使用したペプシンは和光純薬工業株式会社製,ブタ胃粘膜由来のもの、エラスターゼは和光純薬工業株式会社製,ブタ膵臓由来のものを使用した。
鶏胸軟骨の乾燥方法の違いにより、最終的に得られる活性エピトープ量に相違があるか、また抽出に際し酵素の有無により差異があるか否か、実験を行った。
工程としては、洗浄した鶏胸軟骨を凍結乾燥又はオーブン乾燥後、粉砕し72時間・5℃・pH3で、酢酸溶液・酢酸溶液+ペプシン・酢酸溶液+ペプシン+エラスターゼの3種類にわけて抽出後(ペプシン濃度は1mg/ml、以下の実験でも同様)、遠心分離(10000×g、20min、4℃、以下の実験でも同様)し、上記ELISA法によって活性エピトープと反応したII型コラーゲン量を定量した(%,w/w、以下の実験でも同様)。特にその結果が下記表1である。
以上の結果から、凍結乾燥でもオーブン乾燥でも、乾燥法により得られる活性エピトープ量に相違はあまりないことがわかった。そのため、方法の容易さ及び費用の観点から、大量に処理するにはオーブン乾燥の方が適していると考えられる(特記がない限り以下の実験では、鶏胸軟骨を洗浄・オーブン乾燥・粉砕したものを使用。)。
また、酢酸溶液だけでは値が低く、ペプシンを添加した方が、さらにはペプシンとエラスターゼを添加した方が、より高い値であることがわかった。これは、ペプシン添加により3本鎖の立体構造がゆるみ、かつエラスターゼの添加により細断され、活性エピトープがより多く露出したことによるものと推測される。
すなわち、動物由来軟骨を洗浄・乾燥・粉砕した非変形II型コラーゲンよりも、ペプシンを含有した酸性溶液で抽出を行った抽出液中に、より多くの活性エピトープを有するII型コラーゲンが存在しており、より少量の原料で高い効果をあげることが可能である。さらに、この非変性II型コラーゲンは酸性溶液に溶解しており、水溶性の非変性II型コラーゲンとして、より応用性が高い。
抽出における酸の種類による効果の相違について
抽出する酸の種類を変え、それぞれペプシン及びエラスターゼを添加し、72時間・5℃・pH3で抽出を行った。また、酢酸とクエン酸については、乾燥方法につき凍結乾燥とオーブン乾燥の両方について行った。その結果が下記表2である。
以上の結果から、抽出する酸の違いにより、多少の相違がみられた。特に、食品や飲料への適用の可能性や、入手の容易さ、値段などの事情を考慮すれば、酢酸又はクエン酸が好適である。また、時間的には、24時間経過時点で、72時間経過後に対し30%程、48時間経過後時点で72時間経過後に対し70%程の抽出量であった。
抽出後の高熱処理の有無について
同じ条件で抽出し、高熱処理(100℃,30min)の有無によりわけて定量を行った。その結果が下記表3である。
pHによる抽出効果の相違について
抽出に際し、酢酸溶液とクエン酸溶液のpH値をそれぞれ変え、その他の条件を同じにして、活性エピトープ量を定量した。結果が下記表4である。
以上の結果から、pH値が低いほど、高い値を示すことがわかった。一方、pH値が3.4程度あれば、一定量の抽出を行うことができることもわかった。あまり強い強酸だと、容器、製造機器の維持や耐久性の問題が生じるため、経済性も含め全体的な効率を考慮すると、2.5〜3.0程度が最も好適である。
本発明による2段階抽出の効果、及び抽出温度との関係について
第1抽出を24時間、第2抽出を24時間として、第1抽出の温度を変えて活性エピトープ量を定量した。その結果が下記表5である。
以上の結果から、ペプシン含有酸性溶液のみで72時間抽出した場合(17.2%,実験例1参照)に比べ、わずか48時間で20.3%という抽出量を実現することができた。これにより、抽出効率は飛躍的に向上し、わずかな原料で、かつ短期間に大量の活性エピトープを有する非変性II型コラーゲンを抽出することができるものである。また、抽出された活性エピトープを有する非変性II型コラーゲン溶液は水溶性となっており、食品や飲料への適用がより容易になるものである。
また、第1抽出は40℃では問題ないが、60℃以上で行うと、明らかに抽出量が下がる。このため、抽出温度は50℃以下とすべきであり、常温(15℃〜35℃程度)とするのが好適である(特には25℃程度が好ましい)。なお、第2抽出はコラーゲンの変性を極力さけるため5℃としたが、第2抽出は常温かつ5℃より高い温度であれば、ペプシンがより活性化しさらに抽出効率は上がる可能性があり、本発明の効果の高さがわかる。
さらに、前述の実験から明らかなように、第2抽出時にエラスターゼを投入することにより、さらに抽出効率をあげることも可能である。
Claims (4)
- 60℃以下で洗浄及び乾燥の後、粉砕された動物由来軟骨を、
酢酸溶液又はクエン酸溶液により、
(1)温度 5℃〜35℃
(2)pH 3.4以下
(3)抽出時間 12時間〜36時間
の条件下で第1抽出する工程と、
酸性溶液にペプシンを加え、
(1)温度 5℃〜35℃(ただし、第1抽出より低い温度下)
(2)pH 3.4以下
(3)抽出時間 12時間〜36時間
の条件下で第2抽出する工程とからなることを特徴とする、
抽出される水溶性の非変性II型コラーゲンにおけるエピトープを、活性を保持したまま大量に効率的に維持する抽出方法。 - 第1抽出時間と第2抽出時間の合計が、48時間以下であることを特徴とする請求項1に記載の抽出方法。
- 第2抽出工程において、エラスターゼが更に加えられていることを特徴とする請求項2に記載の抽出方法。
- 動物由来軟骨が、鶏軟骨であることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の抽出方法。
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