JP6021218B2 - コラーゲン誘導体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、コラーゲン誘導体の製造方法に関し、特に魚介類のコラーゲン含有組織から得られた粗コラーゲンをアシル化処理した後、哺乳類由来を除く中性またはアルカリ性プロテアーゼを用いて可溶化処理するコラーゲン誘導体の製造方法に関する。

コラーゲンは、哺乳類、魚介類等の生物原料のコラーゲン含有組織から抽出される。従来コラーゲンの抽出には、抽出効率が良く、酸性条件で高い活性を有する豚由来の酵素であるペプシンが多く用いられてきた。しかし近年、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や***等が人畜共通の疾病であると懸念されていることより、牛や豚等の哺乳類由来の原料を用いて製造されたコラーゲンは安全性の面から懸念されるようになってきた。そのため、近年では魚介類由来のコラーゲンが必要とされてきている。

特許文献１には、アルカリ洗浄した魚鱗に含まれるコラーゲンを酸性水溶液中でプロテアーゼを用いて可溶化した後、可溶化されたコラーゲンを回収する方法が開示されている。特許文献１ではプロテアーゼの１種としてパパインが記載されているが、パパインは中性領域に至適ｐＨがあるため、上記酸性水溶液中でパパインを適用してもコラーゲンの回収率が低い。一方、アルカリ水溶液中でパパインを適用してもコラーゲンはアルカリ性領域では不溶のため回収率が低い。

また、上記方法で得られるコラーゲンは酸性溶液には溶解するが、化粧料の最適なｐＨである5〜8の範囲では溶解性が悪く、さらにカルボキシビニルポリマーやキサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の化粧品原料との相溶性が悪いという問題があった。

そこで、化粧品原料に適したコラーゲンを調製するため、可溶化したコラーゲンをアシル化する方法が採られており、例えば、特許文献２では魚皮原料をペプシンで可溶化した後、無水コハク酸や無水マレイン酸を用いてアシル化することによりアシル化アテロコラーゲンを得ている。特許文献２にはペプシンの由来が記載されていないが、魚介類由来のプロテアーゼは工業的に入手し難いという現状がある。

そこで、コラーゲン製造に係る全ての原料において、哺乳動物由来の原料を完全に排除し、かつ化粧品原料にも適したコラーゲンまたはコラーゲン誘導体の効率的な製造方法の開発が望まれていた。

特開２００６−２５７０１４号公報 特開２００３−１２８６９８号公報

本発明は、哺乳動物由来の原料を完全に排除するために、コラーゲンの原料として魚介類のコラーゲン含有組織を用い、且つ、プロテアーゼとして哺乳類由来を除くプロテアーゼを用いて、アシル化された３重らせん構造を維持したコラーゲン、即ち、コラーゲン誘導体を得ることを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、コラーゲン原料を先ずアシル化処理し、次にプロテアーゼを用いて可溶化することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記の通りである。
（１）魚介類のコラーゲン含有組織から得られた粗コラーゲンをアシル化処理した後、哺乳動物由来を除く中性またはアルカリ性プロテアーゼを用いて、可溶化したコラーゲン誘導体を得ることを特徴とするコラーゲン誘導体の製造方法。
（２）前記コラーゲン含有組織が、魚皮または魚鱗である上記（１）記載のコラーゲン誘導体の製造方法。
（３）前記プロテアーゼが、パパインまたはブロメラインである上記（１）又は（２）記載のコラーゲン誘導体の製造方法。
（４）前記アシル化が、サクシニル化またはマレイン化である上記（１）〜（３）のいずれか１項記載のコラーゲン誘導体の製造方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の製造方法によって製造されたコラーゲン誘導体。

本発明の製造方法によれば、アシル化処理の後に可溶化するという簡便な方法で効率的にコラーゲン誘導体を得ることができる。また、得られるコラーゲン誘導体が通常のプロテアーゼを用いて可溶化させた後にアシル化処理して得られるものと同等のものであり、さらにコラーゲン製造に係る全ての原料において哺乳動物由来原料を全く含まないため、安全性が格段に高く、特に化粧品原料や医療用材料等として有用である。

本発明のコラーゲン誘導体の製造方法は、魚介類のコラーゲン含有組織から得られた粗コラーゲンをアシル化処理した後、哺乳動物由来を除く中性またはアルカリ性プロテアーゼを用いて可溶化することを特徴とするものである。
ここで、コラーゲン誘導体とは、３重らせん構造を維持したアシル化コラーゲンを指すが、一部にアシル化されていないコラーゲンを含んだものであっても構わない。

魚介類としては、魚類、貝類、クラゲ、イカ、タコ等の軟体動物等を例示できる。魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、イワシ、マグロ、フグ、キンギョ、タラ、カレイ、コイ、サケ等を例示することができ、これらのうち各種用途への適用性の観点から変性温度が比較的高いものが好ましく、例えばオレオクロミス属が挙げられる。オレオクロミス属の中でも中国から東南アジアにかけて食用として主力に養殖されており入手が容易であるテラピアが特に好ましい。

また、コラーゲン含有組織も限定されるものではないが、例えば、魚類では皮、骨又は鱗を挙げることができる。このうち、魚臭の原因となる脂質が少ないことから鱗が好ましい。

本発明では、先ず魚介類のコラーゲン含有組織から得られた粗コラーゲンをアシル化処理する。尚、ここでいう粗コラーゲンとは、魚介類由来のコラーゲン含有組織を、酵素や酸等によるコラーゲンの抽出操作を行わずに、該組織に含有されるコラーゲンをアシル化できる状態にまで処理したものであり、例えば、コラーゲン含有組織を常法により脱灰、脱脂等の処理を行ったものである。

今、魚鱗から粗コラーゲンを得る方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、特開２００６−２５７０１４号公報、特開２０１０−１９３８０８号公報等に記載の方法が挙げられる。具体的には、魚鱗から夾雑物を除いて水洗浄した後、酸脱灰して粗コラーゲンを得る。尚、上記酸脱灰前に、必要に応じて水酸化ナトリウム水溶液等により表面に付着した余剰タンパク質を除去したり、メタノールやアセトン等の有機溶媒により脂質を除去してもよい。
また、魚皮から粗コラーゲンを得る方法についても公知の方法を用いることができ、例えば、特開２００４-１４９４５５号公報には、魚皮から不純タンパク質、血液、色素、脂質等のコラーゲン以外の成分を塩溶液や塩基性溶液を用いて除去することが記載されている。また、必要に応じて、エタノール等による脱脂処理等を行ってもよい。

アシル化とは、コラーゲンの分子側鎖に存在するεアミノ基をアシル化剤を用いてカルボキシル化することである。アシル化の種類としては、アシル化剤として無水コハク酸を用いるサクシニル化、無水マレイン酸を用いるマレイン化、無水ミリスチン酸を用いるミリスチル化等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

アシル化を効率的に行うために、粗コラーゲンは粉砕しておくことが好ましい。粉砕は、粉砕時の発熱によりコラーゲンが変性しない条件であれば特に限定されるものではなく、適宜粉砕方法を選択すればよい。アシル化処理には公知の方法を適用すればよく、例えば、水に分散させた粗コラーゲンにアシル化剤を添加した後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ9〜12に調整し一定時間反応させればよい。

次に、プロテアーゼを用いてアシル化したコラーゲンを可溶化させる。
このとき、可溶化しアシル化したコラーゲンとしては、コラーゲン分子末端のテロペプタイドが除去されたコラーゲン、即ちアテロ化コラーゲンであっても、アテロ化していないものであっても、それらが混合されたものであっても良い。プロテアーゼを用いた可溶化には公知の方法を適用することができ、例えば、アシル化処理後の溶液にプロテアーゼを添加し、一定時間反応させればよい。プロテアーゼの種類により、プロテアーゼ添加時に塩酸水溶液または水酸化ナトリウム水溶液を用いてプロテアーゼの至適ｐＨに調整することが好ましい。

本発明で用いるプロテアーゼは、哺乳動物由来を除く中性またはアルカリ性プロテアーゼである。プロテアーゼの由来は、哺乳動物を除くものであれば特に限定はなく、植物、微生物、魚介類由来のものが好例として挙げられる。

一般的に、アシル化していないアテロ化コラーゲンの等電点が中性付近（例えば、テラピアの魚鱗由来の場合は8〜9）にあるのに対し、アテロ化の後にアシル化させたコラーゲンの等電点は酸性（例えば、テラピアの魚鱗由来の場合は4〜5）にある。ここで、等電点とは、電離後の物質全体の電荷平均が0となるｐＨ、即ち、コラーゲンが析出するｐＨである。本発明においても、粗コラーゲンをアシル化処理して得られたコラーゲンは上記同様に等電点が酸性にあるため、中性付近以上のｐＨで溶解するという特性を有する。従って、至適ｐＨが中性付近（例えば、ｐＨ5.0〜8.5、好ましくは6.0〜8.0）の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを用いることによって、効率的にコラーゲン誘導体を得ることができる。

プロテアーゼの具体例として、植物由来のプロテアーゼとしてはパパイン、ブロメライン、フィシン、ショウガプロテアーゼ、ククミシン、洋梨由来プロテアーゼ等が挙げられ、微生物由来のプロテアーゼとしては、Bacillus属、例えばBacillus subtilis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bachillus licheniformis、Bacillus clausii、Baccilus sphaericus、又はAspergillus属、例えばAspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus melleus等の中性またはアルカリ性プロテアーゼが挙げられ、魚介類由来のプロテアーゼとしてはトリプシン、キモトリプシン等が挙げられる。上記のうち入手の容易性の観点から植物又は微生物由来のプロテアーゼが好ましく、さらに好ましくはパパインとブロメラインである。尚、プロテアーゼを２種類以上使用する場合は、最適な酵素分解条件が得られるように使用条件を適宜設定することが望ましい。

以上により、本発明のコラーゲン誘導体を得ることができるが、３重らせん構造を維持させるために上記各処理をコラーゲンの変性温度以下で行うことが望ましい。また、プロテアーゼによる可溶化処理の後、コラーゲン誘導体の純度を高めるために公知の方法で精製処理を行ってもよい。

本発明の製造方法によって製造されたコラーゲン誘導体は、カルボキシビニルポリマーやキサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等の化粧品原料との相溶性が優れている。また、中性付近からアルカリ性の領域において溶解性が高いため、化粧品原料や医療用材料等に適したものである。

以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。尚、実施例において％は、特に断らない限り全て質量％を示す。また、特に断らない限り化合物はすべて試薬を用いた。

[プロテアーゼ]
・パパイン：ナガセケムテックス社製 「食品用精製パパイン」
・ブロメライン：天野エンザイム社製 「ブロメラインF」
・ペプシン：日本バイオコン社製 「Pepsibio 1:10,000」（豚由来）

[粗コラーゲン分散液の調製]
テラピアの脱灰うろこ400g（含水率17.5％)を0.1MのNaOH水溶液で2時間洗浄し、表面の夾雑物を除去した。これをザルにあげ、水洗した後、粉砕処理した。粉砕物の総重量が6.4kgとなるように水を添加し、粗コラーゲン分散液を得た。この粗コラーゲン分散液を下記の実施例及び比較例に供した。

〔実施例１〕（アシル化剤：無水コハク酸、プロテアーゼ：パパイン）
粗コラーゲン分散液800gに無水コハク酸20gを添加し、1MのNaOH水溶液でpHを9〜10に調整しながら3時間反応させた。次いで、塩酸水溶液にてパパインの至適pHであるpH6.0に調整した。次に、パパイン32gを添加し、48時間穏やかに撹拌してコラーゲン誘導体含有液を得た。プロテアーゼ添加1日後と2日後のコラーゲン誘導体含有液中のコラーゲン誘導体濃度を下記の方法で測定した。

[コラーゲン誘導体濃度の測定法]
コラーゲン誘導体含有液を9400Gで45分間遠心分離して残渣を除去した。次に、pH4.0〜4.5となるようにHCl溶液を添加し、コラーゲン誘導体を等電点沈殿させた。これを9400Gで30分間遠心分離し、沈殿物を回収した。沈殿物をpH7のりん酸緩衝液に溶解し、ケルダール法により窒素成分量を測定した。コラーゲン誘導体濃度は、医薬部外品原料規格２００６に掲載されている水溶性コラーゲン液（３）の確認試験（２）に記載のコラーゲン量の算出法に則り、窒素成分量に換算係数5.6を乗じて算出した。

〔実施例２〕（アシル化剤：無水コハク酸、プロテアーゼ：ブロメライン）
粗コラーゲン分散液800gに無水コハク酸20gを添加し、1MのNaOH水溶液でpHを9〜10に調整しながら3時間反応させた。次に、ブロメライン32gを添加し、48時間穏やかに撹拌してコラーゲン誘導体含有液を得、これについてコラーゲン誘導体濃度を測定した。尚、ブロメライン添加時のpHを測定したところ9.4であった。

〔比較例１〕（アシル化剤：無し、プロテアーゼ：パパイン）
粗コラーゲン分散液中のコラーゲンが析出しないpH領域内において、粗コラーゲン分散液のpHをパパインの活性が高い中性領域に近い範囲に調整した後、パパインを添加して、アテロ化コラーゲン含有液を得た。
即ち、粗コラーゲン分散液800gを水酸化ナトリウム水溶液でpH4.1に調整し、コラーゲンの析出が見られないことを確認した後、パパイン32gを添加し、48時間穏やかに撹拌してアテロ化コラーゲン含有液を得た。プロテアーゼ添加1日後と2日後の上記液中のコラーゲン濃度を下記の方法で測定した。

[コラーゲン濃度の測定法]
アテロ化コラーゲン含有液を9400Gで45分間遠心分離して残渣を除去した。次に、溶液中の塩化ナトリウム濃度が5.77％になるように塩化ナトリウムを添加してコラーゲンを線維化させた。これを9400Gで30分間遠心分離し、線維化した沈殿物を回収した。沈殿物をpH2の塩酸水溶液に溶解し、ケルダール法により窒素成分量を測定した。コラーゲン濃度は、医薬部外品原料規格２００６に掲載されている水溶性コラーゲン液（３）の確認試験（２）に記載のコラーゲン量の算出法に則り、窒素成分量に換算係数5.6を乗じて算出した。

実施例１、２、及び比較例１の結果を表１に示した。表１より、本発明の方法を適用した実施例１及び２は、コラーゲン誘導体を効率的に得られることが分かった。

Claims (4)

1. 魚介類のコラーゲン含有組織から得られた粗コラーゲンをアシル化処理した後、哺乳動物由来を除く中性またはアルカリ性プロテアーゼを用いて、可溶化したコラーゲン誘導体を得ることを特徴とするコラーゲン誘導体の製造方法。
2. 前記コラーゲン含有組織が、魚皮または魚鱗である請求項１記載のコラーゲン誘導体の製造方法。
3. 前記プロテアーゼが、パパインまたはブロメラインである請求項１又は２記載のコラーゲン誘導体の製造方法。
4. 前記アシル化が、サクシニル化またはマレイン化である請求項１〜３のいずれか１項記載のコラーゲン誘導体の製造方法。