JP5729904B2 - 細胞から蛋白質、dna、rnaを調製する方法 - Google Patents
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Description
ゲノムの対象はゲノムDNAである。ゲノム解析により、DNAの多型、遺伝子疾患の保因子が発見され、疾病と多型、変異、あるいは保因子との関連が解明される。
トランスクリプトームの対象は転写されたRNAである。トランスクリプトーム解析により、遺伝子発現量と疾患や生体現象等との相関が解明される。
さらには、プロテオームの対象は蛋白質である。プロテオーム解析により、特定の蛋白質の同定・定量することで、蛋白質の発現量と疾患や生体現象等の関連の知見が得られる。
これら、すべてのゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、そして血漿中の代謝物によるメタボロームなどの生体情報を総合的に解析して研究を効率的に進め、さらに得られた知見を利用すれば、基礎研究、疾患の診断、治療において非常に有効であると考えられ、オミックス研究の飛躍が期待される。
また、近年、体内の様々な組織に生じる生理的病理的変容が、末梢血の血球細胞の分子プロファイルに反映されているという報告がなされている。これに伴い、血液等の細胞の蛋白質、代謝物、及び遺伝子発現の解析による診断が試みられている。
また、特許文献3には、1%Tween20を含む10mM重炭酸アンモニウム(pH9.0)溶液が核の分離に有効であることを開示する。
mRNAは環境中に存在するRNA分解酵素により容易に分解されるために発現解析が困難であった。しかし、本発明によれば、mRNAを数分で抽出できるため、例えば血液であれば、採血直後に前処理が可能となり、分解のない再現性の高いサンプルを入手することが可能となる。また、本発明によれば、核内の遺伝子発現を、核と細胞質画分に分離して評価することが可能となり、詳細な発現解析による精度の高い診断が可能となる。
上記分離のためのフィルターの素材及び孔径は、特に限定はされないが、核は通過しないが細胞質に存在するリボソーム等の器官は通過させるような孔径サイズを有することが好ましい。食細胞の径が好中球で7μm以上、リンパ球、マクロファージでも6μm以上で、その中にある核は6μm以下であるから、核を回収し細胞質を通過させるフィルター孔径は5μm以下であれば十分である。また、細胞質中に含まれるリボソーム自体は直径20nm程度であるが、mRNAにつながれたポリゾームとして10−20個の集合体として存在することが多いため、フィルターを通過するには最低0.1−0.2μm以上であることが望ましい。すなわち、フィルターの孔径は0.2μm〜5μmが好ましく、より好ましくは、0.2〜1μmである。フィルターの材質は親水性のものであれば問題はなく、例えば、ポリビニリデンフルオライド、ポリエーテルスルホン酸、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、セルロース混合エステル等が利用できる。
細胞処理溶液を均質にする工程は、細胞処理溶液を注射針を複数回通過させることにより行うことができる。この場合、注射針の径は、特に限定されないが、21G(内径0.57mm)、ツベルクリン用25G(内径0.32mm)などが好適に使用できる。
また、細胞処理溶液を均質にする工程は、細胞は通さないが、核を通す径の孔をもつ流路を通して行うこともできる。そのような流路として、マイクロ流路または、フィルターを挙げることができ、例として孔径1.0−8.0μm、好ましくは、孔径1.0-5.0μmのフィルターを挙げることができる。このように、界面活性剤で処理された細胞の処理溶液を、核と細胞質溶液とにフィルター分離を行う前に、細胞のサイズより小さく、細胞内の核よりも大きな径の流路を通すことにより、核と細胞質溶液との分離が良好になるように均質にすることが可能となる。なお、細胞は通さないが、核を通す径の孔をもつ流路は、核は通過しないが、細胞質に存在するリボソームは通過させるような径の孔を有する膜を備えたフィルターに連結してもよい。
実施例7で得られたRNA画分からキアゲン社 Fast TrackTM MAG Micro mRNA Isolation Kitを用いてmRNAの抽出を行った。つまり、RNeasyで抽出されたRNA30μlに蒸留水170μlを加え、バインディング緩衝液200μl、及びMAG Beads 30μlを加えてMAG Beadsに結合されたオリゴdTとmRNAとを結合させた。添付の洗浄液にてビーズを洗浄後、30μlのRnase-free waterによりmRNAを回収した。さらに抽出されたmRNA 4μlを元に、インビトロジェン社 SuperScriptTM First-Strand Synthesis SuperMixを用いてその手順に従いcDNA合成を行った。
Claims (12)
- 同一の細胞から蛋白質、DNA、およびRNAからなる群より選ばれる少なくとも2つを調製する方法であって、
細胞を、細胞膜は破壊するが核膜は破壊しない界面活性剤溶液で処理する工程、
前記工程で得られた細胞処理溶液を、核は通過しないが、細胞質に存在するリボソームは通過させるような孔径を有する膜を備えたフィルターを加圧注入により通過させることにより前記核と前記細胞質を分離する工程、
前記工程により分離された蛋白質、DNAおよびRNAの少なくとも2つをそれぞれ抽出する工程、を有することを特徴とする調製方法。 - 該界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、その濃度がそれぞれの臨界ミセル濃度(CMC)以上であり、臨界ミセル濃度の10倍以内であることを特徴とする請求項1記載の調製方法。
- 該界面活性剤の濃度がそれぞれの臨界ミセル濃度(CMC)の1−5倍であることを特徴とする請求項2記載の調製方法。
- 該孔径が0.2−5.0μmであることを特徴とする請求項1記載の調製方法。
- 前記細胞処理溶液を均質にする工程を更に有する請求項1記載の調製方法。
- 前記細胞処理溶液を均質にする工程が、細胞は通さないが、核を通す径の孔をもつ流路を通すことを特徴とする請求項5記載の調製方法。
- 前記細胞処理溶液を均質にする工程において、細胞処理溶液を孔径1.0−8.0μmのフィルターを通過させることを特徴とする請求項5記載の調製方法。
- 前記細胞処理溶液を均質にする工程において、細胞処理溶液を孔径1.0−5.0μmのフィルターを通過させることを特徴とする請求項5記載の調製方法。
- 細胞は通さないが、核を通す径の孔をもつ流路を、核は通過しないが、細胞質に存在するリボソームは通過させるような径の孔を有する膜を備えたフィルターに連結することを特徴とする請求項1記載の調製方法。
- 細胞を含む溶液を、細胞は通さないが、核を通す径の孔を有する第1のフィルターを用いて該第1のフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
該第1のフィルター上に界面活性剤を含む溶液を注入し、該フィルター上に捕捉された細胞の細胞膜を破壊する工程と、
核が通過しない孔径を有する第2のフィルターを該第1のフィルターの先に連結する工程と、
液体を該第1のフィルターおよび該第2のフィルターを通過するように加圧注入することにより、該第2のフィルターに核を捕捉させ、細胞質画分を通過させることにより前記核と前記細胞質を分離する工程、
前記工程により分離された蛋白質、DNAおよびRNAの少なくとも2つをそれぞれ抽出する工程、を有する細胞の調製方法。 - さらに、該2つのフィルターを通過した細胞質画分をオリゴdT結合支持体と反応させることにより、mRNAを回収する工程を有する請求項10記載の細胞の調製方法。
- 該2つのフィルターを通過した細胞質画分を用いて蛋白質の分析を行うことを特徴とする請求項10記載の細胞の調製方法。
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