JP2002071687A - 変異遺伝子のスクリーニング方法 - Google Patents
変異遺伝子のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、遺
伝子の変異の有無のみを迅速に決定するマススクリーニ
ングに適した方法を提供すること。 【解決手段】 以下の工程：検体核酸の被部検出部に対
し完全に相補的である完全対合プローブと、該被検出部
に対して不対合な塩基を少なくともひとつ備える複数種
の不対合プローブとを含む複数種のプローブを、ＤＮＡ
アレイ基板上の所定の複数の区分領域中に分配配置して
固定する工程と、該ＤＮＡアレイ基板上のプローブと、
前記検体の核酸とを、ハイブリダイゼーション用の反応
系内で反応させる工程と、前記プローブのいずれかと前
記検体の核酸とのハイブリッド体の形成に基づくシグナ
ルを、前記複数の区分領域ごとの全シグナルとして測定
する工程と、前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変
化のパターンから前記検体の核酸中の変異を判定する工
程とを有する方法により検体核酸における変異の可能性
の判定を行なう。
伝子の変異の有無のみを迅速に決定するマススクリーニ
ングに適した方法を提供すること。 【解決手段】 以下の工程：検体核酸の被部検出部に対
し完全に相補的である完全対合プローブと、該被検出部
に対して不対合な塩基を少なくともひとつ備える複数種
の不対合プローブとを含む複数種のプローブを、ＤＮＡ
アレイ基板上の所定の複数の区分領域中に分配配置して
固定する工程と、該ＤＮＡアレイ基板上のプローブと、
前記検体の核酸とを、ハイブリダイゼーション用の反応
系内で反応させる工程と、前記プローブのいずれかと前
記検体の核酸とのハイブリッド体の形成に基づくシグナ
ルを、前記複数の区分領域ごとの全シグナルとして測定
する工程と、前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変
化のパターンから前記検体の核酸中の変異を判定する工
程とを有する方法により検体核酸における変異の可能性
の判定を行なう。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の変異のス
クリーニングなどに有用な変異検出方法及び変異検出シ
ステムに関する。
クリーニングなどに有用な変異検出方法及び変異検出シ
ステムに関する。
【０００２】
【従来技術】核酸等の物質の配列を決定し、或いはその
配列をチェックする手法のひとつにＤＮＡアレイを利用
する方法がある。ＵＳＰ５４４５９３４には、１インチ
角に１０万個以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合
したＤＮＡアレイの開示がある。このようなＤＮＡアレ
イは、少量の検体で一度に多項目を検査できるという利
点がある。チップ上に配置したこのようなＤＮＡアレイ
に対して蛍光標識した調べたい試料を流すと、チップ上
のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプロー
ブと結合してハイブリッド体を形成し、このハイブリッ
ド体が形成された部分だけを蛍光により識別できるよう
にしておくことでＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の配列を解
明することができる。
配列をチェックする手法のひとつにＤＮＡアレイを利用
する方法がある。ＵＳＰ５４４５９３４には、１インチ
角に１０万個以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合
したＤＮＡアレイの開示がある。このようなＤＮＡアレ
イは、少量の検体で一度に多項目を検査できるという利
点がある。チップ上に配置したこのようなＤＮＡアレイ
に対して蛍光標識した調べたい試料を流すと、チップ上
のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプロー
ブと結合してハイブリッド体を形成し、このハイブリッ
ド体が形成された部分だけを蛍光により識別できるよう
にしておくことでＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の配列を解
明することができる。
【０００３】Sequencing by Hybridization(SBH)法は、
このようなＤＮＡアレイを利用し塩基配列を調べる方法
で、ＵＳＰ５２０２２３１にその詳細が記載されてい
る。ＳＢＨ法では、ある長さについて可能なオリゴヌク
レオチドの全配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補
的なハイブリッドを検出するもので、完全に相補的なハ
イブリッド体のセットを得れば、そのセットは、ある配
列について１塩基ずつずれた配列の集合になるはずであ
り、それらを抽出して判定を行うものである。
このようなＤＮＡアレイを利用し塩基配列を調べる方法
で、ＵＳＰ５２０２２３１にその詳細が記載されてい
る。ＳＢＨ法では、ある長さについて可能なオリゴヌク
レオチドの全配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補
的なハイブリッドを検出するもので、完全に相補的なハ
イブリッド体のセットを得れば、そのセットは、ある配
列について１塩基ずつずれた配列の集合になるはずであ
り、それらを抽出して判定を行うものである。
【０００４】ＳＢＨに限らず、オリゴヌクレオチドと検
体ＤＮＡの相補性を調べるときには、ひとつの検査項目
について１種類のプローブでハイブリッドの有無を判定
することは非常に難しい。それは、ハイブリッドの安定
性がそれぞれの配列により異なり、完全に相補的である
と判定できるシグナルの絶対値というものが存在しない
からである。そこで、完全マッチのものと、完全マッチ
のものより幾分強度が弱くなる１塩基のミスマッチを含
むハイブリッド体のシグナル強度を比較して判定する方
法がＳｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２７４ ｐ６１０−６１
４，１９９６に記載されている。この方法では、１５ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の真ん中に１
塩基ミスマッチを配した配列を用意し、完全マッチと１
塩基ミスマッチとのハイブリッド由来の蛍光強度を比較
し、完全マッチの方が強度がある割合以上強いときにポ
ジティブと判定する。
体ＤＮＡの相補性を調べるときには、ひとつの検査項目
について１種類のプローブでハイブリッドの有無を判定
することは非常に難しい。それは、ハイブリッドの安定
性がそれぞれの配列により異なり、完全に相補的である
と判定できるシグナルの絶対値というものが存在しない
からである。そこで、完全マッチのものと、完全マッチ
のものより幾分強度が弱くなる１塩基のミスマッチを含
むハイブリッド体のシグナル強度を比較して判定する方
法がＳｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２７４ ｐ６１０−６１
４，１９９６に記載されている。この方法では、１５ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の真ん中に１
塩基ミスマッチを配した配列を用意し、完全マッチと１
塩基ミスマッチとのハイブリッド由来の蛍光強度を比較
し、完全マッチの方が強度がある割合以上強いときにポ
ジティブと判定する。
【０００５】さらに、ＵＳＰ５７３３７２９にはより正
確な判定を行うために、得られたハイブリッド体の蛍光
強度の比較から検体の塩基配列を知るためのコンピュー
ターを用いた方法に関する記載がある。
確な判定を行うために、得られたハイブリッド体の蛍光
強度の比較から検体の塩基配列を知るためのコンピュー
ターを用いた方法に関する記載がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、実際には各ハ
イブリッドにおける結合の強さは、それぞれの塩基配列
中のＧＣ含量等によっても異なり、完全マッチ配列と１
塩基ミスマッチ配列との強度差も配列によってかなり幅
がある。そのため、上述のような１５ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドを用い、真ん中に１塩基ミスマッチを有する
他の３種類のプローブとの比較を行って完全マッチか否
かを判定するという方法は、それぞれの安定性を、理論
的に或いは経験的に評価し、それとの比較を行うことに
よってより精度を得ることができる。
イブリッドにおける結合の強さは、それぞれの塩基配列
中のＧＣ含量等によっても異なり、完全マッチ配列と１
塩基ミスマッチ配列との強度差も配列によってかなり幅
がある。そのため、上述のような１５ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドを用い、真ん中に１塩基ミスマッチを有する
他の３種類のプローブとの比較を行って完全マッチか否
かを判定するという方法は、それぞれの安定性を、理論
的に或いは経験的に評価し、それとの比較を行うことに
よってより精度を得ることができる。
【０００７】また、これらの正確な判定のためには、シ
グナルの高精度定量が必要になり、通常、共焦点レーザ
ー顕微鏡のような精密な装置が必要である。さらに、ひ
とつひとつのプローブに関してそのハイブリッド体の強
度を計測し、その値を解析して遺伝子配列を決定、判定
するためには、アレイを読みとる検出装置の他に、更に
大がかりなコンピューター装置を必要とし、誰もが容易
にＤＮＡアレイを利用する場合の障害になる。
グナルの高精度定量が必要になり、通常、共焦点レーザ
ー顕微鏡のような精密な装置が必要である。さらに、ひ
とつひとつのプローブに関してそのハイブリッド体の強
度を計測し、その値を解析して遺伝子配列を決定、判定
するためには、アレイを読みとる検出装置の他に、更に
大がかりなコンピューター装置を必要とし、誰もが容易
にＤＮＡアレイを利用する場合の障害になる。
【０００８】一方、このようなＤＮＡアレイを用いた遺
伝子診断は、集団検診や個々人の遺伝子検査、或いは、
遺伝子多系の研究にも利用しうるが、このような特定項
目について大部分が正常な中から変異している検体を探
し出すといった大量の検体を迅速に安価に処理するとい
う用途には、必ずしも上述のような精密な測定及び解析
は必要ない。しかも、上記のような精密な装置および解
析はコストがかかる。そこで、先ずは変異の有無をスク
リーニングし、スクリーニングの結果変異が疑われる場
合にのみ、詳細な検査を行うという考え方がコスト上で
も、時間の上でも節約になる。
伝子診断は、集団検診や個々人の遺伝子検査、或いは、
遺伝子多系の研究にも利用しうるが、このような特定項
目について大部分が正常な中から変異している検体を探
し出すといった大量の検体を迅速に安価に処理するとい
う用途には、必ずしも上述のような精密な測定及び解析
は必要ない。しかも、上記のような精密な装置および解
析はコストがかかる。そこで、先ずは変異の有無をスク
リーニングし、スクリーニングの結果変異が疑われる場
合にのみ、詳細な検査を行うという考え方がコスト上で
も、時間の上でも節約になる。
【０００９】本発明はこのような問題点に鑑みなされた
ものであり、本発明の目的は高価な装置及び複雑な解析
を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決定す
るマススクリーニングに適した方法を提供することにあ
る。
ものであり、本発明の目的は高価な装置及び複雑な解析
を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決定す
るマススクリーニングに適した方法を提供することにあ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝子に関す
る情報により既に正常な遺伝子と変異している遺伝子の
塩基配列が確定されている場合について、正常な遺伝子
とハイブリッドを形成した場合に強いシグナルを与える
プローブ配列群と、変異している遺伝子とハイブリッド
を形成すると予想される配列を持つプローブ群とを別々
の領域に配置したＤＮＡアレイを提供する。また、この
ようなアレイを用いた検出方法を提供することで上記の
目的を達成するものである。
る情報により既に正常な遺伝子と変異している遺伝子の
塩基配列が確定されている場合について、正常な遺伝子
とハイブリッドを形成した場合に強いシグナルを与える
プローブ配列群と、変異している遺伝子とハイブリッド
を形成すると予想される配列を持つプローブ群とを別々
の領域に配置したＤＮＡアレイを提供する。また、この
ようなアレイを用いた検出方法を提供することで上記の
目的を達成するものである。
【００１１】本発明にかかる検体核酸中における変異を
監視するために変異を判定する方法の一態様は、検体核
酸中における変異を監視するための変異判定方法であっ
て、検体核酸の被部検出部に対し完全に相補的である完
全対合プローブと、該被検出部に対して不対合な塩基を
少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとを含
む複数種のプローブを、基板上の所定の複数の区分領域
中に分配配置して固定したＤＮＡアレイ基板を用意する
工程と、該ＤＮＡアレイ基板上のプローブに対して検体
核酸を反応させる工程と、前記プローブのいずれかと前
記検体核酸とのハイブリッド体の形成に基づくシグナル
を、前記複数の区分領域ごとの全シグナルとして測定す
る工程と、前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変化
のパターンから前記検体の核酸中の変異を判定する工程
とを有することを特徴とする。
監視するために変異を判定する方法の一態様は、検体核
酸中における変異を監視するための変異判定方法であっ
て、検体核酸の被部検出部に対し完全に相補的である完
全対合プローブと、該被検出部に対して不対合な塩基を
少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとを含
む複数種のプローブを、基板上の所定の複数の区分領域
中に分配配置して固定したＤＮＡアレイ基板を用意する
工程と、該ＤＮＡアレイ基板上のプローブに対して検体
核酸を反応させる工程と、前記プローブのいずれかと前
記検体核酸とのハイブリッド体の形成に基づくシグナル
を、前記複数の区分領域ごとの全シグナルとして測定す
る工程と、前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変化
のパターンから前記検体の核酸中の変異を判定する工程
とを有することを特徴とする。
【００１２】本発明にかかる検体核酸中における変異を
監視するために変異を判定する方法の他の態様は、前記
複数種のプローブを用いて、正常検体核酸と反応した場
合に強いシグナルを与え得る少なくとも１種のプローブ
を含む区分領域と、正常検体核酸と反応した場合に弱い
シグナルを与える得る少なくとも１種のプローブを含む
区分領域と、正常検体核酸と反応した場合にハイブリッ
ドを形成しない少なくとも１種のプローブを含む区分領
域とをそれぞれを独立して所定の配列で配置した区分領
域群を基板上に用意し、該区分領域群に対して正常検体
核酸を反応させて、該区分領域群中の測定対象区分領域
毎の全シグナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に
応じた全シグナルの第１の変化パターンを予め得る工程
と、該ＤＮＡ基板の区分領域群に対して検体核酸を反応
させて、該区分領域群中の測定対象区分領域毎の全シグ
ナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に応じた全シ
グナルの第２の変化パターンを得る工程と、前記第１の
変化パターンと前記第２の変化パターンとを比較して、
前記検体核酸中の変異の有無を判定する工程と、を有す
る。
監視するために変異を判定する方法の他の態様は、前記
複数種のプローブを用いて、正常検体核酸と反応した場
合に強いシグナルを与え得る少なくとも１種のプローブ
を含む区分領域と、正常検体核酸と反応した場合に弱い
シグナルを与える得る少なくとも１種のプローブを含む
区分領域と、正常検体核酸と反応した場合にハイブリッ
ドを形成しない少なくとも１種のプローブを含む区分領
域とをそれぞれを独立して所定の配列で配置した区分領
域群を基板上に用意し、該区分領域群に対して正常検体
核酸を反応させて、該区分領域群中の測定対象区分領域
毎の全シグナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に
応じた全シグナルの第１の変化パターンを予め得る工程
と、該ＤＮＡ基板の区分領域群に対して検体核酸を反応
させて、該区分領域群中の測定対象区分領域毎の全シグ
ナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に応じた全シ
グナルの第２の変化パターンを得る工程と、前記第１の
変化パターンと前記第２の変化パターンとを比較して、
前記検体核酸中の変異の有無を判定する工程と、を有す
る。
【００１３】本発明にかかるＤＮＡアレイ基板は、検体
の核酸中における変異を監視するためのＤＮＡアレイ基
板であって、基板上に、検体核酸に対し完全に相補的で
ある完全対合プローブと、該検体に対して不対合な塩基
を少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとか
らなる複数種のプローブが配置されており、正常な塩基
配列と反応した場合において、強いシグナルを与える少
なくとも１種のプローブが配置された区分領域と、弱い
シグナルを与える少なくとも１種のプローブが配置され
た区分領域及びシグナルを与えない少なくとも１種のプ
ローブが配置された区分領域の少なくとも一方がそれぞ
れが独立して配置されていることを特徴とする。
の核酸中における変異を監視するためのＤＮＡアレイ基
板であって、基板上に、検体核酸に対し完全に相補的で
ある完全対合プローブと、該検体に対して不対合な塩基
を少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとか
らなる複数種のプローブが配置されており、正常な塩基
配列と反応した場合において、強いシグナルを与える少
なくとも１種のプローブが配置された区分領域と、弱い
シグナルを与える少なくとも１種のプローブが配置され
た区分領域及びシグナルを与えない少なくとも１種のプ
ローブが配置された区分領域の少なくとも一方がそれぞ
れが独立して配置されていることを特徴とする。
【００１４】また、本発明にかかる変異検出システム
は、上記構成のＤＮＡアレイ基板と、該ＤＮＡアレイ基
板の区分領域からのシグナルを測定するシグナル測定装
置とを有することを特徴とする。
は、上記構成のＤＮＡアレイ基板と、該ＤＮＡアレイ基
板の区分領域からのシグナルを測定するシグナル測定装
置とを有することを特徴とする。
【００１５】本発明によれば、本発明の目的は高価な装
置及び複雑な解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無の
みを迅速に決定するマススクリーニングに適した方法を
提供することができる。
置及び複雑な解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無の
みを迅速に決定するマススクリーニングに適した方法を
提供することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明について、区分領域からの
シグナルが蛍光である場合を例として以下に説明を行う
が、本発明におけるシグナルは蛍光に限定されたもので
はなく、他の光学発光によるシグナルでも良く、更に電
気的なものでも良い。
シグナルが蛍光である場合を例として以下に説明を行う
が、本発明におけるシグナルは蛍光に限定されたもので
はなく、他の光学発光によるシグナルでも良く、更に電
気的なものでも良い。
【００１７】まず、ハイブリッド体を構成する核酸鎖間
の結合に関しては、その強度は種々の要因によって支配
されており、１５ｍｅｒから２０ｍｅｒ程度の長さのプ
ローブを用いた場合に、１塩基ミスマッチを有するハイ
ブリッド体を完全に除くことは実用上困難である。
の結合に関しては、その強度は種々の要因によって支配
されており、１５ｍｅｒから２０ｍｅｒ程度の長さのプ
ローブを用いた場合に、１塩基ミスマッチを有するハイ
ブリッド体を完全に除くことは実用上困難である。
【００１８】蛍光といった光による検出においてハイブ
リッド体がシグナルを発する場合を例に取ると、２塩基
ミスマッチを有する配列では、２塩基ミスマッチの位
置、連続、不連続にかかわらず、１塩基ミスマッチ体よ
りは急激に安定性が低くなり、３塩基ミスマッチ体では
ほとんどシグナルが観測されない。しかし、１塩基ミス
マッチ体では強度が完全マッチの５０％程度有すること
もあり得る。正常な核酸の場合には、完全対合プローブ
（完全マッチプローブ）及び不対合の塩基が１つである
不対合プローブ（１塩基ミスマッチプロープ）が配置さ
れた領域で際だった光量を示し、一方、ハイブリッドの
安定性が低い領域では総光量は限りなくゼロに近い。そ
れに対し、変異を持つ核酸が完全に相補的であるプロー
ブは、正常核酸に対応するプローブとはミスマッチを示
し、正常核酸において高い蛍光が期待される区分領域の
蛍光強度は弱くなる。また、正常核酸との反応ではシグ
ナルが低いと予想されている区分領域に完全マッチ或い
は１塩基ミスマッチに由来する蛍光が出現する。従っ
て、区分された領域毎の蛍光分布を比較することにより
正常核酸と変異核酸とを区別することが可能になる。
リッド体がシグナルを発する場合を例に取ると、２塩基
ミスマッチを有する配列では、２塩基ミスマッチの位
置、連続、不連続にかかわらず、１塩基ミスマッチ体よ
りは急激に安定性が低くなり、３塩基ミスマッチ体では
ほとんどシグナルが観測されない。しかし、１塩基ミス
マッチ体では強度が完全マッチの５０％程度有すること
もあり得る。正常な核酸の場合には、完全対合プローブ
（完全マッチプローブ）及び不対合の塩基が１つである
不対合プローブ（１塩基ミスマッチプロープ）が配置さ
れた領域で際だった光量を示し、一方、ハイブリッドの
安定性が低い領域では総光量は限りなくゼロに近い。そ
れに対し、変異を持つ核酸が完全に相補的であるプロー
ブは、正常核酸に対応するプローブとはミスマッチを示
し、正常核酸において高い蛍光が期待される区分領域の
蛍光強度は弱くなる。また、正常核酸との反応ではシグ
ナルが低いと予想されている区分領域に完全マッチ或い
は１塩基ミスマッチに由来する蛍光が出現する。従っ
て、区分された領域毎の蛍光分布を比較することにより
正常核酸と変異核酸とを区別することが可能になる。
【００１９】このような判定をより精度良く行うための
ひとつの手段として、本発明では、正常核酸で各プロー
ブとのハイブリダイゼーション反応を行い、その結果得
られる各区分領域毎の蛍光強度を基に、強い強度を与え
るプローブ群を有する区分領域と、蛍光を与えないプロ
ーブ群を有する区分領域と、弱い蛍光を発する中間的な
蛍光強度のプローブ群を有する区分領域に区分けし、こ
れらを基板上に所定の配列で配置したＤＮＡ基板を用い
る。
ひとつの手段として、本発明では、正常核酸で各プロー
ブとのハイブリダイゼーション反応を行い、その結果得
られる各区分領域毎の蛍光強度を基に、強い強度を与え
るプローブ群を有する区分領域と、蛍光を与えないプロ
ーブ群を有する区分領域と、弱い蛍光を発する中間的な
蛍光強度のプローブ群を有する区分領域に区分けし、こ
れらを基板上に所定の配列で配置したＤＮＡ基板を用い
る。
【００２０】検査を同時多項目行おうとする場合には、
それぞれの項目のプローブに対して完全マッチ、ミスマ
ッチの蛍光強度を評価し、全て統合してその強度に順番
付けを行い、上記グループに分別し並べることが重要に
なる。このように区分領域を所定に配列で並べること
で、この配列に応じた全シグナルの変化のパターンを得
ることができ、正常核酸で得られた変化のパターンを予
め特定しておき、検出対象である核酸で得られた変化の
パターンをこれと比較して変異を検出することができ
る。
それぞれの項目のプローブに対して完全マッチ、ミスマ
ッチの蛍光強度を評価し、全て統合してその強度に順番
付けを行い、上記グループに分別し並べることが重要に
なる。このように区分領域を所定に配列で並べること
で、この配列に応じた全シグナルの変化のパターンを得
ることができ、正常核酸で得られた変化のパターンを予
め特定しておき、検出対象である核酸で得られた変化の
パターンをこれと比較して変異を検出することができ
る。
【００２１】その並べ方はセンサーの種類によって決め
ることができる。例えば、仮に、各区分領域が、正常核
酸と反応した場合に蛍光強度の強い順に基板の左端から
並べられている場合には、ラインセンサーを用いて検出
すると、蛍光強度は左端で最大で、徐々に減少し、基板
の右端に近づくに連れてゼロの領域が続く。また、領域
をエリアセンサーで評価する場合には、最大蛍光を与え
るプローブ群を有する区分領域と蛍光を与えないプロー
ブ群を有する検出対象としての区分領域の最低２カ所の
蛍光光量評価が必要となる。
ることができる。例えば、仮に、各区分領域が、正常核
酸と反応した場合に蛍光強度の強い順に基板の左端から
並べられている場合には、ラインセンサーを用いて検出
すると、蛍光強度は左端で最大で、徐々に減少し、基板
の右端に近づくに連れてゼロの領域が続く。また、領域
をエリアセンサーで評価する場合には、最大蛍光を与え
るプローブ群を有する区分領域と蛍光を与えないプロー
ブ群を有する検出対象としての区分領域の最低２カ所の
蛍光光量評価が必要となる。
【００２２】さらに具体的に説明する。
【００２３】本発明では、例えば、ＤＮＡアレイ上に正
常核酸とハイブリッドを形成するプローブを含む区分領
域と、変異遺伝子とハイブリッドを形成するプローブを
含む区分領域とを独立して設定し、正常核酸に対応する
プローブ群とのハイブリッド体からのシグナルと、変異
遺伝子とのハイブリッド体からのシグナルとの比をとる
ことにより、正常か否かを判定する方法が利用される。
常核酸とハイブリッドを形成するプローブを含む区分領
域と、変異遺伝子とハイブリッドを形成するプローブを
含む区分領域とを独立して設定し、正常核酸に対応する
プローブ群とのハイブリッド体からのシグナルと、変異
遺伝子とのハイブリッド体からのシグナルとの比をとる
ことにより、正常か否かを判定する方法が利用される。
【００２４】しかし、実際には変異核酸として正常核酸
と１塩基のみ異なるプローブのみを選択したのではその
比は２倍程度にしかならず、一部に変異遺伝子を含んで
も総光量としての変化は少なく判定が困難である。
と１塩基のみ異なるプローブのみを選択したのではその
比は２倍程度にしかならず、一部に変異遺伝子を含んで
も総光量としての変化は少なく判定が困難である。
【００２５】そこで、より正確な判定を行うために、本
発明では、マススクリーニングにおいて大部分の検体が
示す正常な核酸配列に対して、完全マッチ配列および１
塩基ミスマッチ配列であるプローブをＤＮＡアレイ基板
上の特定の領域に集めて配置する。さらに、２塩基ミス
マッチ、３塩基ミスマッチのような低い安定性を示すプ
ローブを、上記高い安定性を示す領域とは異なる領域に
配置する方法が好ましい。そして、このように配置され
たＤＮＡアレイ基板を用いてハイブリダイゼーション反
応を行ない、各区分領域についてシグナルの総量を測定
し、検出対象としての核酸からの測定パターンを正常核
酸で得られる測定パターンと対比させて、変異の有無を
検定することができる。
発明では、マススクリーニングにおいて大部分の検体が
示す正常な核酸配列に対して、完全マッチ配列および１
塩基ミスマッチ配列であるプローブをＤＮＡアレイ基板
上の特定の領域に集めて配置する。さらに、２塩基ミス
マッチ、３塩基ミスマッチのような低い安定性を示すプ
ローブを、上記高い安定性を示す領域とは異なる領域に
配置する方法が好ましい。そして、このように配置され
たＤＮＡアレイ基板を用いてハイブリダイゼーション反
応を行ない、各区分領域についてシグナルの総量を測定
し、検出対象としての核酸からの測定パターンを正常核
酸で得られる測定パターンと対比させて、変異の有無を
検定することができる。
【００２６】例えば１８塩基長のプローブ中に３カ所に
異なる塩基を配置した配列６４種（４×４×４＝６４）
の場合（表１：各配列は左側が５’末端で右側が３’末
端である）には、どのようなサンプルを用いても完全に
一致する配列は１種類存在するはずであり、さらに９種
が１塩基ミスマッチ、２７種が２塩基ミスマッチ、残り
２７種が３塩基ミスマッチとなるはずである。そして、
完全マッチ配列と１塩基ミスマッチ配列では蛍光が観察
され、３塩基ミスマッチでは蛍光は観察されないような
ハイブリダイゼーション反応の条件を設定することは比
較的容易である。２塩基ミスマッチに関しては、配列に
よりハイブリッド体を形成するものとしないものとがあ
る。
異なる塩基を配置した配列６４種（４×４×４＝６４）
の場合（表１：各配列は左側が５’末端で右側が３’末
端である）には、どのようなサンプルを用いても完全に
一致する配列は１種類存在するはずであり、さらに９種
が１塩基ミスマッチ、２７種が２塩基ミスマッチ、残り
２７種が３塩基ミスマッチとなるはずである。そして、
完全マッチ配列と１塩基ミスマッチ配列では蛍光が観察
され、３塩基ミスマッチでは蛍光は観察されないような
ハイブリダイゼーション反応の条件を設定することは比
較的容易である。２塩基ミスマッチに関しては、配列に
よりハイブリッド体を形成するものとしないものとがあ
る。
【００２７】
【表１】
【００２８】これらの６４種のプローブを強度の強い方
から８プローブ毎にグループ分けを行なうと、第１グル
ープの蛍光強度は極めて強く、第６、７、８番目のグル
ープの総蛍光量はゼロになるはずである。このような蛍
光強度による分類は、経験的に行っても、計算により理
論的に行っても良い。
から８プローブ毎にグループ分けを行なうと、第１グル
ープの蛍光強度は極めて強く、第６、７、８番目のグル
ープの総蛍光量はゼロになるはずである。このような蛍
光強度による分類は、経験的に行っても、計算により理
論的に行っても良い。
【００２９】次に、実際の系についてハイブリダイゼー
ション反応を行い、分類されたグループ毎の蛍光量の総
量を測定する。特に第６、７、８番目のグループの蛍光
量は重要な意味を持つ。これらのグループは蛍光量が検
出されないことが予想されるが、期待に反し蛍光が検出
された場合には、検体は正常ではなくその配列の一部に
変異を有することがわかる。蛍光が検出されない場合、
その多くは正常な配列の場合である。
ション反応を行い、分類されたグループ毎の蛍光量の総
量を測定する。特に第６、７、８番目のグループの蛍光
量は重要な意味を持つ。これらのグループは蛍光量が検
出されないことが予想されるが、期待に反し蛍光が検出
された場合には、検体は正常ではなくその配列の一部に
変異を有することがわかる。蛍光が検出されない場合、
その多くは正常な配列の場合である。
【００３０】しかし、より正確さを期するために第１グ
ループの蛍光量を正常な場合と比較することが必要であ
る。正常な配列のハイブリダイゼーション反応から期待
される値より明らかに低い場合には、塩基の変異が疑わ
れる。さらに中間の蛍光強度を持つ領域、つまり第２、
３、４グループの蛍光強度分布（蛍光の変化のパター
ン）を正常なものと比べなければならない。
ループの蛍光量を正常な場合と比較することが必要であ
る。正常な配列のハイブリダイゼーション反応から期待
される値より明らかに低い場合には、塩基の変異が疑わ
れる。さらに中間の蛍光強度を持つ領域、つまり第２、
３、４グループの蛍光強度分布（蛍光の変化のパター
ン）を正常なものと比べなければならない。
【００３１】上記方法のさらに効果的な変異の検出方法
として、プローブを片方の端からの完全マッチ、１塩基
ミスマッチ、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチとい
う具合に、シグナル強度が高い方から低い方へ順番に並
べ、完全マッチのプローブが配置されている領域とは反
対の領域ではシグナルがゼロになるように配置する方法
が考えられる。この場合には全体の蛍光強度分布パター
ンが判定の基準となる。例えば、図１（ａ）に示す区分
領域（縦一列が一つの区分領域となる）の配置を用いた
場合、正常な場合には図１（ｂ）に示すような単調減少
のパターンを示し、変異がある場合には中間部分にピー
クを持つようなパターンに変化する。
として、プローブを片方の端からの完全マッチ、１塩基
ミスマッチ、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチとい
う具合に、シグナル強度が高い方から低い方へ順番に並
べ、完全マッチのプローブが配置されている領域とは反
対の領域ではシグナルがゼロになるように配置する方法
が考えられる。この場合には全体の蛍光強度分布パター
ンが判定の基準となる。例えば、図１（ａ）に示す区分
領域（縦一列が一つの区分領域となる）の配置を用いた
場合、正常な場合には図１（ｂ）に示すような単調減少
のパターンを示し、変異がある場合には中間部分にピー
クを持つようなパターンに変化する。
【００３２】上記配置方法は多項目検査用プローブが同
一基板上に配置された場合でも同様である。すべての項
目について、先ず完全にマッチするプローブ配列、１塩
基ミスマッチ配列、２塩基ミスマッチ配列といった具合
に、蛍光強度が強いと予想される順に並べる。
一基板上に配置された場合でも同様である。すべての項
目について、先ず完全にマッチするプローブ配列、１塩
基ミスマッチ配列、２塩基ミスマッチ配列といった具合
に、蛍光強度が強いと予想される順に並べる。
【００３３】このような考え方は、単に３塩基について
の変異を評価する上記方法に限らず、変異の数に制限な
く普遍的に適応できる。
の変異を評価する上記方法に限らず、変異の数に制限な
く普遍的に適応できる。
【００３４】なお、正常核酸とプローブとがハイブリッ
ド体が形成された場合にシグナルが得られる場合につい
て説明したが、シグナルを発生させる方式によっては、
ハイブリッド体が形成された場合にシグナルが得られ
ず、ハイブリッド体が形成されない場合にシグナルが得
られるようにしてもよい。
ド体が形成された場合にシグナルが得られる場合につい
て説明したが、シグナルを発生させる方式によっては、
ハイブリッド体が形成された場合にシグナルが得られ
ず、ハイブリッド体が形成されない場合にシグナルが得
られるようにしてもよい。
【００３５】検体としての核酸としては、検査対象とし
ての遺伝子から、必要に応じて検出に必要な部分を取出
して用いることができる。更に、対照として用いる正常
核酸は、既知の配列から合成して用いることができる。
ての遺伝子から、必要に応じて検出に必要な部分を取出
して用いることができる。更に、対照として用いる正常
核酸は、既知の配列から合成して用いることができる。
【００３６】基板上に固定するプローブの長さは、検出
に適合した長さとすればよく、例えば８ｍｅｒ〜３０ｍ
ｅｒの範囲が好ましく、１２ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの範囲
がより好ましい。
に適合した長さとすればよく、例えば８ｍｅｒ〜３０ｍ
ｅｒの範囲が好ましく、１２ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの範囲
がより好ましい。
【００３７】基板へのプローブの固定は、種々の方法で
行なうことができるが、プローブが固定したスポットを
高密度で効率良く、高速で配置するためには、インクジ
ェット方式による液滴付与を利用することが好ましい。
また、区分領域内に付与するプローブの量は、各スポッ
トは、７０〜１００μｍが好ましく、間隔は各スポット
が連結しない程度にすることが好ましい。
行なうことができるが、プローブが固定したスポットを
高密度で効率良く、高速で配置するためには、インクジ
ェット方式による液滴付与を利用することが好ましい。
また、区分領域内に付与するプローブの量は、各スポッ
トは、７０〜１００μｍが好ましく、間隔は各スポット
が連結しない程度にすることが好ましい。
【００３８】スポット数は、蛍光強度が強いと予想され
るスポットのみが、まとめて測定でき、蛍光が全く期待
されないスポットが、まとめて一度に測定できるように
センサの構成を考えて設定する。
るスポットのみが、まとめて測定でき、蛍光が全く期待
されないスポットが、まとめて一度に測定できるように
センサの構成を考えて設定する。
【００３９】本発明の変異検出システムは、複数の区分
領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイ基板と、測
定対象区分領域でのシグナルの測定装置とを有する。な
お、複数の区分領域を設けたＤＮＡアレイ基板を用いた
変異の有無の判定においては、全部の区分領域からのシ
グナルを検出し、その結果を変異の有無の判定に利用す
る方法、あるいは変異の有無を検出できるように選択し
た一部の区分領域からのシグナルを検出する簡便法を用
いることができる。
領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイ基板と、測
定対象区分領域でのシグナルの測定装置とを有する。な
お、複数の区分領域を設けたＤＮＡアレイ基板を用いた
変異の有無の判定においては、全部の区分領域からのシ
グナルを検出し、その結果を変異の有無の判定に利用す
る方法、あるいは変異の有無を検出できるように選択し
た一部の区分領域からのシグナルを検出する簡便法を用
いることができる。
【００４０】この検出システムでは、コンピュータと接
続させて、区分領域の配列に応じた各区分領域からの全
シグナルの測定値をコンピュータで解析して全シグナル
の変化のパターンを作成させて記憶させて、基準となる
正常核酸からの変化のパターンと検体からの変化のパタ
ーンを比較させて、変異の可能性の有無の判定を出力さ
せることができる。
続させて、区分領域の配列に応じた各区分領域からの全
シグナルの測定値をコンピュータで解析して全シグナル
の変化のパターンを作成させて記憶させて、基準となる
正常核酸からの変化のパターンと検体からの変化のパタ
ーンを比較させて、変異の可能性の有無の判定を出力さ
せることができる。
【００４１】シグナル検知用のセンサーとしては、各種
フォトダイオード（例えば、浜松ホトニクス社製等）、
例えば分割型シリコンフォトダイオードアレイでは、各
種ラインセンサ及びエリアセンサとして使用することが
可能なものがあり、特に受光面サイズが１ないし２ｍｍ
×（２〜３）ｍｍのものが好適に用いられる。などが用
いられる。
フォトダイオード（例えば、浜松ホトニクス社製等）、
例えば分割型シリコンフォトダイオードアレイでは、各
種ラインセンサ及びエリアセンサとして使用することが
可能なものがあり、特に受光面サイズが１ないし２ｍｍ
×（２〜３）ｍｍのものが好適に用いられる。などが用
いられる。
【００４２】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。なお、以下における「％」は「質量％」を示す。 実施例１ 変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイ作製（ラインセンサー
用） １）６４種のプローブが結合したＤＮＡアレイ作製 （１）プローブの設計 癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の２４８番目、２４９
番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列ＣＧＧＡＧＧの
中での変異の中で頻度が高いのは、１番目のＣがＴに、
２番目のＡがＧに、そして２４９番目のアミノ酸３番目
のＧがＴに変異している場合であることが知られてい
る。そこで、この３カ所の塩基配列に着目して６４種の
プローブを設計した。
する。なお、以下における「％」は「質量％」を示す。 実施例１ 変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイ作製（ラインセンサー
用） １）６４種のプローブが結合したＤＮＡアレイ作製 （１）プローブの設計 癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の２４８番目、２４９
番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列ＣＧＧＡＧＧの
中での変異の中で頻度が高いのは、１番目のＣがＴに、
２番目のＡがＧに、そして２４９番目のアミノ酸３番目
のＧがＴに変異している場合であることが知られてい
る。そこで、この３カ所の塩基配列に着目して６４種の
プローブを設計した。
【００４３】つまり、プローブ全長を１８ｍｅｒとし、
その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前
後を共通配列で挟んだ構造で、５’−ＡＴＧＡＡＣＮＮ
ＧＡＧＮＣＣＣＡＴＣ−３’である。ここで、Ｎと表し
た部分が４種の核酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応す
る。プローブＤＮＡは、検出したい配列（上記配列）と
相補的な配列であるので、実際には、５’−ＧＡＴＧＧ
ＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ−３’となる。
その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前
後を共通配列で挟んだ構造で、５’−ＡＴＧＡＡＣＮＮ
ＧＡＧＮＣＣＣＡＴＣ−３’である。ここで、Ｎと表し
た部分が４種の核酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応す
る。プローブＤＮＡは、検出したい配列（上記配列）と
相補的な配列であるので、実際には、５’−ＧＡＴＧＧ
ＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ−３’となる。
【００４４】図２には６４種ＤＮＡプローブのＤＮＡア
レイ上での配置図を示した。正常な遺伝子に相当する配
列である５’−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ
−３’は、右から３列目、上から３行目の位置にある４
２番のプローブＤＮＡ５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧ
ＧＴＴＣＡＴ−３’とハイブリッドを形成することが期
待される。 （２）マレイミド基導入基板の作製 （基板洗浄）１インチ角のガラス板をラックに入れ、超
音波洗浄用洗剤に一晩漫した。その後、洗剤中で２０分
間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去し
た。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさ
らに超音波処理を２０分間行った。次に、あらかじめ加
温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間漫し
た。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。 （表面処理）１％シランカップリング剤水溶液（信越化
学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸
し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ば
し、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間
ベークしシランカップリング処理を完結させた。続い
て、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒ
ｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社
製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：
１溶液に溶解した（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シラ
ンカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣ
Ｓ溶液こ２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基
とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状
態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面
に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラ
ス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡと
の結合反応に用いられる。 （３）ＤＮＡの基板への結合反応 （６４種ＤＮＡプローブの合成）５’末端にＳＨ基（チ
オール基）を有する６４種のプローブ一本鎖ＤＮＡ（先
の表１に記載）を定法により合成した。 （ＤＮＡプローブの吐出）各プローブＤＮＡをそれぞれ
水に溶解し、ＳＧクリア（グリセリン７．５％、尿素
７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノール
ＥＨ １％を含む水溶液）を用いて最終濃度８μＭにな
るよう希釈した。
レイ上での配置図を示した。正常な遺伝子に相当する配
列である５’−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ
−３’は、右から３列目、上から３行目の位置にある４
２番のプローブＤＮＡ５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧ
ＧＴＴＣＡＴ−３’とハイブリッドを形成することが期
待される。 （２）マレイミド基導入基板の作製 （基板洗浄）１インチ角のガラス板をラックに入れ、超
音波洗浄用洗剤に一晩漫した。その後、洗剤中で２０分
間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去し
た。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさ
らに超音波処理を２０分間行った。次に、あらかじめ加
温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間漫し
た。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。 （表面処理）１％シランカップリング剤水溶液（信越化
学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸
し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ば
し、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間
ベークしシランカップリング処理を完結させた。続い
て、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒ
ｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社
製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：
１溶液に溶解した（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シラ
ンカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣ
Ｓ溶液こ２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基
とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状
態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面
に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラ
ス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡと
の結合反応に用いられる。 （３）ＤＮＡの基板への結合反応 （６４種ＤＮＡプローブの合成）５’末端にＳＨ基（チ
オール基）を有する６４種のプローブ一本鎖ＤＮＡ（先
の表１に記載）を定法により合成した。 （ＤＮＡプローブの吐出）各プローブＤＮＡをそれぞれ
水に溶解し、ＳＧクリア（グリセリン７．５％、尿素
７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノール
ＥＨ １％を含む水溶液）を用いて最終濃度８μＭにな
るよう希釈した。
【００４５】少量のサンプルが吐出できるように改造し
たＢＪプリンター用ヘツドＢＣ６２（キヤノン社製）の
ノズルにプローブＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。
各ヘッドあたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２
つヘッドを用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッ
ドを６回交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポッ
トが独立して形成されるように吐出させた。こうして所
定の区分領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイを
得た。この時のプローブアレイを含む各スポットのピッ
チは２００μｍであった。また８×８のスポットが形成
する領域は、約２ｍｍ×２ｍｍであった。
たＢＪプリンター用ヘツドＢＣ６２（キヤノン社製）の
ノズルにプローブＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。
各ヘッドあたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２
つヘッドを用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッ
ドを６回交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポッ
トが独立して形成されるように吐出させた。こうして所
定の区分領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイを
得た。この時のプローブアレイを含む各スポットのピッ
チは２００μｍであった。また８×８のスポットが形成
する領域は、約２ｍｍ×２ｍｍであった。
【００４６】その後、基板を３０分加湿チャンバー中に
放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させて固定する反
応を行い、ＤＮＡアレイ基板を得た。 ２．正常なｐ５３配列を用いたときの６４種のハイブリ
ッド体の蛍光強度測定 （１）ハイブリダイゼーション反応 （ブロッキング反応）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にてＤＮＡアレイ基板を洗
い、ガラス表面の固定されてないＤＮＡ溶液を完全に洗
い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に
浸し、２時間放置し、ブロツキング反応を行った。 （モデル検体ＤＮＡの合成）ｐ５３遺伝子の正常な配列
（Ｎｏ．４２と相補的）を持ち、プローブＤＮＡと同じ
領域で同じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６５（一本鎖）を
作製した。配列は下に示す通りで、５’未端にはローダ
ミン（Ｒｈｏ）を結合してある。 Ｎｏ．６５：５’−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応条件）ＤＮＡアレイ基板
の入ったハイブリダイゼーション反応用の容器に１００
ｍＭＮａＣｌを含む５０ｎＭモデル検体ＤＮＡ溶液を２
ｍｌ入れ、最初に７０℃で３０分加熱後、インキュベー
ターの温度を４０℃に下げ、そのまま３時間反応させ
た。 （２）検出 （方法）検出は、蛍光顕微鏡（ニコン社製）に画像解析
処理装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）を接続して
行った。 （３）結果 得られた蛍光量の基板上の分布を図３に示す。
放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させて固定する反
応を行い、ＤＮＡアレイ基板を得た。 ２．正常なｐ５３配列を用いたときの６４種のハイブリ
ッド体の蛍光強度測定 （１）ハイブリダイゼーション反応 （ブロッキング反応）１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にてＤＮＡアレイ基板を洗
い、ガラス表面の固定されてないＤＮＡ溶液を完全に洗
い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に
浸し、２時間放置し、ブロツキング反応を行った。 （モデル検体ＤＮＡの合成）ｐ５３遺伝子の正常な配列
（Ｎｏ．４２と相補的）を持ち、プローブＤＮＡと同じ
領域で同じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６５（一本鎖）を
作製した。配列は下に示す通りで、５’未端にはローダ
ミン（Ｒｈｏ）を結合してある。 Ｎｏ．６５：５’−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応条件）ＤＮＡアレイ基板
の入ったハイブリダイゼーション反応用の容器に１００
ｍＭＮａＣｌを含む５０ｎＭモデル検体ＤＮＡ溶液を２
ｍｌ入れ、最初に７０℃で３０分加熱後、インキュベー
ターの温度を４０℃に下げ、そのまま３時間反応させ
た。 （２）検出 （方法）検出は、蛍光顕微鏡（ニコン社製）に画像解析
処理装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）を接続して
行った。 （３）結果 得られた蛍光量の基板上の分布を図３に示す。
【００４７】実施例２ 変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイ作製（ラインセンサー
用） （１）変異検出用ＤＮＡアレイの作製 上記結果を基に、これらの６４種のプローブを強度の強
い方から８プローブ毎にグループ分けを行ったのが表２
及び３である。第１グループの蛍光強度は極めて強く、
第６、７、８番目のグループの総蛍光量はゼロになるは
ずである。
用） （１）変異検出用ＤＮＡアレイの作製 上記結果を基に、これらの６４種のプローブを強度の強
い方から８プローブ毎にグループ分けを行ったのが表２
及び３である。第１グループの蛍光強度は極めて強く、
第６、７、８番目のグループの総蛍光量はゼロになるは
ずである。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】次に、基板上をライン状に８分割し、左側
から強度の高い順に、第１グループ、第２グループとい
う具合に並べ、右端に第８グループが並ぶように設定し
た。次に対応するプローブ番号の位置へ実施例１と同
様、インクジェット法を用いて図４のようにプローブを
並べ、変異検出用ＤＮＡアレイを作製した。各グループ
が構成するラインは２００μｍの幅である。 （２）変異検出用ＤＮＡアレイを用いた正常遺伝子での
検討 実施例１と同様な条件でハイブリダイゼーション反応を
行った。その後、ラインセンサー（Ｓ272102；浜松ホト
ニクス社製）を用いて各グループ毎の総光量を検出し
た。
から強度の高い順に、第１グループ、第２グループとい
う具合に並べ、右端に第８グループが並ぶように設定し
た。次に対応するプローブ番号の位置へ実施例１と同
様、インクジェット法を用いて図４のようにプローブを
並べ、変異検出用ＤＮＡアレイを作製した。各グループ
が構成するラインは２００μｍの幅である。 （２）変異検出用ＤＮＡアレイを用いた正常遺伝子での
検討 実施例１と同様な条件でハイブリダイゼーション反応を
行った。その後、ラインセンサー（Ｓ272102；浜松ホト
ニクス社製）を用いて各グループ毎の総光量を検出し
た。
【００５１】結果を図４及び５に示す。第１グループで
の光量が最大で、第２グループではその強度は半分以下
に減少する。第６、７、８グループでは蛍光はほとんど
観測されない。 （実施例３） （変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子
の検出（１）） １．変異モデル検体ＤＮＡの合成 ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異
なる配列（Ｎｏ．４６と相補的）を持ち、プローブと同
じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６６を作製した。配列は下
に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してあ
る。アンダーラインを施したところが変異箇所である。 Ｎｏ．６６：５’−Ｒｂｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応）実施例１と同様にハイ
ブリダイゼーション反応を行った。モデル検体ＤＮＡの
濃度は５０ｎＭである。 （ラインセンサーによる検出）実施例２と同様ハイブリ
ダイゼーション反応後のアレイ基板をラインセンサーに
より評価した。図６に示す通り、正常遺伝子の時には蛍
光が観察されなかった第６、７、８グループに蛍光が観
察され、この検体遺伝子が正常ではないことが容易に判
断された。また、第１グループと第４グループ（プロー
ブ番号３５−４８）での蛍光強度が高いことから、正常
遺伝子と極めて近い配列で図２における右上の領域に変
異を有していることが推察される。
の光量が最大で、第２グループではその強度は半分以下
に減少する。第６、７、８グループでは蛍光はほとんど
観測されない。 （実施例３） （変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子
の検出（１）） １．変異モデル検体ＤＮＡの合成 ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異
なる配列（Ｎｏ．４６と相補的）を持ち、プローブと同
じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６６を作製した。配列は下
に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してあ
る。アンダーラインを施したところが変異箇所である。 Ｎｏ．６６：５’−Ｒｂｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応）実施例１と同様にハイ
ブリダイゼーション反応を行った。モデル検体ＤＮＡの
濃度は５０ｎＭである。 （ラインセンサーによる検出）実施例２と同様ハイブリ
ダイゼーション反応後のアレイ基板をラインセンサーに
より評価した。図６に示す通り、正常遺伝子の時には蛍
光が観察されなかった第６、７、８グループに蛍光が観
察され、この検体遺伝子が正常ではないことが容易に判
断された。また、第１グループと第４グループ（プロー
ブ番号３５−４８）での蛍光強度が高いことから、正常
遺伝子と極めて近い配列で図２における右上の領域に変
異を有していることが推察される。
【００５２】この結果から、本発明の変異遺伝子スクリ
ーニング方法が極めて有効であることが示された。
ーニング方法が極めて有効であることが示された。
【００５３】実施例４ （変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子
の検出（２））ハイブリダイゼーション反応に用いるモ
デル標的遺伝子の濃度を５ｎＭに変化させ、実施例３と
同様の条件によりハイブリダイゼーション反応を行っ
た。結果を図７に示す。
の検出（２））ハイブリダイゼーション反応に用いるモ
デル標的遺伝子の濃度を５ｎＭに変化させ、実施例３と
同様の条件によりハイブリダイゼーション反応を行っ
た。結果を図７に示す。
【００５４】実施例３と同様な結果が得られ、本発明の
方法がハイブリダイゼーション反応の条件によらず成り
立つことが示された。
方法がハイブリダイゼーション反応の条件によらず成り
立つことが示された。
【００５５】実施例５ （変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子
の検出（３）） 変異モデル検体ＤＮＡの合成 ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異
なる配列（Ｎｏ．１０と相補的）を持ち、プローブと同
じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６７を作製した。配列は下
に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してあ
る。アンダーラインを施したところが変異箇所である。 Ｎｏ．６７：５’−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応）上記変異モデル検体Ｄ
ＮＡを用いて実施例１と同様ハイブリダイゼーション反
応を行った。検体濃度は５０ｎＭである。その結果を図
８に示す。
の検出（３）） 変異モデル検体ＤＮＡの合成 ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異
なる配列（Ｎｏ．１０と相補的）を持ち、プローブと同
じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６７を作製した。配列は下
に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してあ
る。アンダーラインを施したところが変異箇所である。 Ｎｏ．６７：５’−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴ
ＣＣＣＡＴＣ−３’ （ハイブリダイゼーション反応）上記変異モデル検体Ｄ
ＮＡを用いて実施例１と同様ハイブリダイゼーション反
応を行った。検体濃度は５０ｎＭである。その結果を図
８に示す。
【００５６】正常遺伝子では蛍光が観察されない第６、
７グループで蛍光が見られ、正常遺伝子ではないことが
判明した。蛍光は正常遺伝子で高い値を示す第１グルー
プよりも第２グループで最大値を示し、第２グループに
含まれるプローブ配列領域（図２における左上領域）に
変異を有することが推定される。
７グループで蛍光が見られ、正常遺伝子ではないことが
判明した。蛍光は正常遺伝子で高い値を示す第１グルー
プよりも第２グループで最大値を示し、第２グループに
含まれるプローブ配列領域（図２における左上領域）に
変異を有することが推定される。
【００５７】この結果は、本発明の変異遺伝子のスクリ
ーニング方法が変異の種類によらず可能であることを示
している。
ーニング方法が変異の種類によらず可能であることを示
している。
【００５８】実施例６ （変異遺伝子検出用のエリアセンサー用ＤＮＡアレイの
作製）実施例２に示したグループに分けられたプローブ
をライン状ではなく基板上の区分けされた領域に配置
し、図９に示す配置でプローブ溶液を吐出してＤＮＡア
レイを作製した。
作製）実施例２に示したグループに分けられたプローブ
をライン状ではなく基板上の区分けされた領域に配置
し、図９に示す配置でプローブ溶液を吐出してＤＮＡア
レイを作製した。
【００５９】次に実施例４で用いた変異モデル検体を用
いてハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、
正常遺伝子では蛍光の観察されない第６、７、８グルー
プで蛍光が観察され、この遺伝子が変異遺伝子であるこ
とが容易に判断された。
いてハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、
正常遺伝子では蛍光の観察されない第６、７、８グルー
プで蛍光が観察され、この遺伝子が変異遺伝子であるこ
とが容易に判断された。
【００６０】
【発明の効果】本発明によれば、高価な装置及び複雑な
解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決
定するマススクリーニングに適した方法を提供すること
ができる。
解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決
定するマススクリーニングに適した方法を提供すること
ができる。
【００６１】
SEQUENCE LISTING <110>Canon INC. <120>A method of screening a mutant gene <130>3912042 <160>64 <210>1 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>1 gatgggactc aagtt cat <210>2 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>2 gatgggactc aggtt cat <210>3 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>3 gatgggactc acgtt cat <210>4 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>4 gatgggactc atgtt cat <210>5 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>5 gatgggactc gagtt cat <210>6 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>6 gatgg gactc gggtt cat <210>7 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>7 gatgggactc gcgttcat <210>8 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>8 gatgggactc gtgttcat <210>9 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>9 gatgggactc cagttcat <210>10 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>10 gatgggactc cggttcat <210>11 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>11 gatgggactc ccgttcat <210>12 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>12 gatgggactc ctgttcat <210>13 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>13 gatgggactc tagttcat <210>14 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>14 gatgggactc tggttcat <210>15 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>15 gatgggactc tcgttcat <210>16 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>16 gatgggactct tgttcat <210>17 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>17 gatggggctc aagttcat <210>18 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>18 gatggggctc aggttcat <210>19 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>19 gatggggctca cgttcat <210>20 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>20 gatggggctc atgttcat <210>21 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>21 gatggggctcg agttcat <210>22 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>22 gatggggctc gggttcat <210>23 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>23 gatggggctc gcgttcat <210>24 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>24 gatggggctc gtgttcat <210>25 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>25 gatggggctc cagttcat <210>26 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>26 gatggggctc cggttcat <210>27 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>27 gatggggctc ccgttcat <210>28 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>28 gatggggctc ctgttcat <210>29 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>29 gatggggctct agttcat <210>30 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>30 gatggggctc tggttcat <210>31 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>31 gatggggctc tcgttcat <210>32 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>32 gatggggctc ttgttcat <210>33 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>33 gatgggcctc aagttcat <210>34 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>34 gatgggcctc aggttcat <210>35 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>35 gatgggcctc acgttcat <210>36 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>36 gatgggcctc atgttcat <210>37 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>37 gatgggcctc gagttcat <210>38 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>38 gatgggcctc gggttcat <210>39 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>39 gatgggcctc gcgttcat <210>40 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>40 gatgggcctc gtgttcat <210>41 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>41 gatgggcctc cagttcat <210>42 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>42 gatgggcctc cggttcat <210>43 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>43 gatgggcctc ccgttcat <210>44 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>44 gatgggcctc ctgttcat <210>45 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>45 gatgggcctc tagttcat <210>46 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>46 gatgggcctc tggttcat <210>47 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>47 gatgggcctc tcgttcat <210>48 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>48 gatgggcctc ttgttcat <210>49 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>49 gatgggtctc aagttcat <210>50 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>50 gatgggtctc aggttcat <210>51 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>51 gatgggtctc acgttcat <210>52 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>52 gatgggtctc atgttcat <210>53 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>53 gatgggtctc gagttcat <210>54 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>54 gatgggtctc gggttcat <210>55 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>55 gatgggtctc gcgttcat <210>56 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>56 gatgggtctc gtgttcat <210>57 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>57 gatgggtctc cagttcat <210>58 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>58 gatgggtctc cggttcat <210>59 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>59 gatgggtctc ccgttcat <210>60 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>60 gatgggtctc ctgttcat <210>61 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample origonucleotide <400>61 gatgggtctc tagttcat <210>62 <211>18 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Sample 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【図１】（ａ）はＤＮＡアレイ基板上の区分領域の配置
の一例を示す図であり、（ｂ）は、この基板を用いた測
定においてラインセンサーを用いた場合に得られる区分
領域の配置に対応した蛍光強度分布（パターン）を示す
図である。
の一例を示す図であり、（ｂ）は、この基板を用いた測
定においてラインセンサーを用いた場合に得られる区分
領域の配置に対応した蛍光強度分布（パターン）を示す
図である。
【図２】６４種のＤＮＡプローブの配置図である。
【図３】蛍光強度の結果を示す図である。
【図４】蛍光強度の結果を示す図であり、Ｇｒ．Ｎｏ．
はグループ番号を表わす。
はグループ番号を表わす。
【図５】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
【図６】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
【図７】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
【図８】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パター
ン）を示す図である。
【図９】蛍光強度の結果を示す図であり、Ｇｒ．Ｎｏ．
はグループ番号を表わす。
はグループ番号を表わす。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 鈴木 智博 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 田中 信也 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 FA11 4B024 AA11 BA80 CA09 HA13 4B029 AA07 BB20 CC03 CC08 FA12 4B063 QA01 QA17 QA19 QQ42 QR32 QR56 QR82 QS15 QS34 QS36 QS39 QX01
Claims (21)
- 【請求項１】 検体核酸中における変異を監視するため
の変異判定方法であって、 検体核酸の被部検出部に対し完全に相補的である完全対
合プローブと、該被検出部に対して不対合な塩基を少な
くともひとつ備える複数種の不対合プローブとを含む複
数種のプローブを、基板上の所定の複数の区分領域中に
分配配置して固定したＤＮＡアレイ基板を用意する工程
と、 該ＤＮＡアレイ基板上のプローブに対して検体核酸を反
応させる工程と、 前記プローブのいずれかと前記検体核酸とのハイブリッ
ド体の形成に基づくシグナルを、前記複数の区分領域ご
との全シグナルとして測定する工程と、 前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変化のパターン
から前記検体の核酸中の変異を判定する工程とを有する
ことを特徴とする変異判定のための方法。 - 【請求項２】 前記区分領域毎の全シグナルが、前記ハ
イブリッド体の形成に基づく発光による１つの区分領域
全体からの総光量である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記発光が蛍光の発光である請求項２記
載の方法。 - 【請求項４】 前記発光が化学発光である請求項２記載
の方法。 - 【請求項５】 前記複数種のプローブを用いて、正常検
体核酸と反応した場合に強いシグナルを与え得る少なく
とも１種のプローブを含む区分領域と、正常検体核酸と
反応した場合に弱いシグナルを与える得る少なくとも１
種のプローブを含む区分領域と、正常検体核酸と反応し
た場合にハイブリッドを形成しない少なくとも１種のプ
ローブを含む区分領域とをそれぞれを独立して所定の配
列で配置した区分領域群を基板上に用意し、該区分領域
群に対して正常検体核酸を反応させて、該区分領域群中
の測定対象区分領域毎の全シグナルを測定し、該測定対
象区分領域の配列に応じた全シグナルの第１の変化パタ
ーンを予め得る工程と、 該ＤＮＡ基板の区分領域群に対して検体核酸を反応させ
て、該区分領域群中の測定対象区分領域毎の全シグナル
を測定し、該測定対象区分領域の配列に応じた全シグナ
ルの第２の変化パターンを得る工程と、 前記第１の変化パターンと前記第２の変化パターンとを
比較して、前記検体核酸中の変異の有無を判定する工程
と、を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記測定対象区分領域が、正常検体核酸
と反応した場合に全シグナルが最も強い区分領域と、全
シグナルが最も弱い（シグナルがない場合を含む）区分
領域である請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記区分領域群を構成する各区分領域
が、シグナル測定装置の検出部の前記基板に対する相対
的な移動方向において、正常検体核酸と反応した場合に
全シグナルの最も強い領域から、全シグナルの強度が順
に弱くなるように並べてある請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記区分領域群に正常検体核酸と反応し
た場合に全シグナルがゼロである区分領域を設け、該区
分領域に検体核酸との反応で測定される全シグナルを測
定し、シグナルが検出された場合に変異があるとする請
求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 前記正常検体核酸と反応した場合に全シ
グナルが最も強い区分領域が、正常検体核酸との完全対
合プローブと、正常検体核酸と不対合な塩基が１塩基で
あるプローブを含む請求項５または６記載の方法。 - 【請求項１０】 全シグナルの検出がエリアセンサーで
行われる請求項５または６に記載の方法。 - 【請求項１１】 全シグナルの検出がラインセンサーで
行われる請求項７記載の方法。 - 【請求項１２】 前記複数種のプローブの長さが８ｍｅ
ｒから３０ｍｅｒの長さである請求項１〜１１のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１３】 該複数種のプローブの長さが１２ｍｅ
ｒから２５ｍｅｒの長さである請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 検体の核酸中における変異を監視する
ためのＤＮＡアレイ基板であって、 基板上に、検体核酸に対し完全に相補的である完全対合
プローブと、該検体に対して不対合な塩基を少なくとも
ひとつ備える複数種の不対合プローブとからなる複数種
のプローブが配置されており、 正常な塩基配列と反応した場合において、強いシグナル
を与える少なくとも１種のプローブが配置された区分領
域と、弱いシグナルを与える少なくとも１種のプローブ
が配置された区分領域及びシグナルを与えない少なくと
も１種のプローブが配置された区分領域の少なくとも一
方がそれぞれが独立して配置されていることを特徴とす
るＤＮＡアレイ基板。 - 【請求項１５】 前記シグナルが蛍光である請求項１４
に記載のＤＮＡアレイ基板。 - 【請求項１６】 前記シグナルが化学発光である請求項
１４記載のＤＮＡアレイ基板。 - 【請求項１７】 該強いシグナルを与える区分領域が完
全対合プローブと、該検体に対して不対合な塩基を１つ
備える不対合プローブと、含む請求項１４に記載のＤＮ
Ａアレイ基板。 - 【請求項１８】 前記複数の区分領域がシグナル測定装
置での測定方向において、正常検体核酸と反応した場合
に全シグナルの最も強い領域から、全シグナルの強度が
順に弱くなるように並べてある請求項１４に記載のＤＮ
Ａアレイ基板。 - 【請求項１９】 前記複数種のプローブの長さが８ｍｅ
ｒから３０ｍｅｒの長さである請求項１４〜１８のいず
れかに記載のＤＮＡアレイ基板。 - 【請求項２０】 該複数種のプローブの長さが１２ｍｅ
ｒから２５ｍｅｒの長さである請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 請求項１４〜２０のいずれかに記載の
ＤＮＡアレイ基板と、該ＤＮＡアレイ基板の区分領域か
らのシグナルを測定するシグナル測定装置とを有するこ
とを特徴とする変異検出システム。
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