JP5719770B2 - 塩酸イコチニブ、合成物、結晶学的形態、併用薬及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、4-［（3-エチニルフェニル）アミノ］-6-7-ベンゾ-12-クラウン-塩酸キナゾリンとこの新規な結晶形に関し、この化合物の合成法、化合物を含む医薬組成物、癌治療のための化合物の使用や関連中間体に関するものである。

チロシンキナーゼ受容体は、細胞外刺激に応じて細胞拡散、血管形成、アポトーシス、その他細胞の成長に重要な機能を制御するための情報伝達を行う膜貫通型タンパク質である。この受容体の一種である表皮成長因子受容体（EGFR）チロシンキナーゼは、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、***癌、頭頸部癌、食道癌、消化管癌、乳腺癌、卵巣癌、頸部癌、甲状腺を含むヒトの多くの癌において高発現している。

EGFRは多くの癌細胞において発現し、EGF、TGFα（つまり形質転換成長因子-α）およびニューレグリンなどの同種のリガンドの細胞外変換は、家族間のホモ二量体またはヘテロ二量体形成の原因となり、各細胞質内のチロシンキナーゼはチロシン、セリン、スレオニン残基のトランスリン酸化を引き起こすこととなる。形成リン酸化チロシンは、様々なアダプター分子の接合部位として働き、続いてシグナル伝達活動（Ras／***促進活動、PＩ3K／Aｋｔ、Jak／STAT）を活性化する。

様々な分子細胞生物学および臨床研究において、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤が癌細胞増殖、転移、その他EGF関連シグナル伝達反応を阻害することが示され、臨床抗癌治療に効果を発揮することが実証されている。類似化学構造を有する2つの経口EGFRキナーゼ阻害剤は、2003年、進行性非小細胞肺癌について米国FDAによる認可を受けたゲフィチニブ（イレッサ、アストラゼネカ社）（後に回収）、および2004年、進行性非小細胞肺癌と膵臓癌治療について米国FDAによる認可を受けた塩酸エルロチニブ（タルセバ、ロッシュ社およびOSI社）である。

中国特許権公開番号CN1305860C号では、29ページの例15、化合物23において、4-［（3-エチニル-フェニル）アミノ］-6-7-ベンゾ-12-クラウン-キノリン（遊離塩基）を発表している。

発明の記述
本発明の目的は、下記に式Ｉで示すとおり、4-［（3-エチニル-フェニル）アミノ］-6,7-ベンゾ-12-クラウン-キナゾリンの塩酸塩を提供することである。

式Ｉ

本発明者らは、上記式Ｉの化合物が1個以上の結晶体として存在が可能であることを期せずに発見した。これらの結晶体を結晶体Ｉ、II、III、IVと称する。式Ｉとその結晶体の化合物は、溶解性や化学安定性により優れており、臨床適用にふさわしいものである。議論に際し、化学式Ｉの化合物である「4-［（3-エチニルフェニル）アミノ］-6,7-ベンゾ-12-クラウン-キナゾリン塩酸塩」を以下「塩酸イコチニブ」、その遊離塩基である「4-［（3-エチニルフェニル）アミノ］-6,7-ベンゾ-12-クラウン-キナゾリン」を「イコチニブ」と称する。

本発明は、一態様において塩酸イコチニブの結晶体Ｉを提供するものである。図1のように結晶体Ｉの粉末X線回折スペクトルは通常、次の回折ピーク度を示す（図1で「間隔」は「ｄ値」として示される）。

塩酸イコチニブの結晶体Ｉは、平均粒径（D₉₀）約1-10μmの均等配分細粒子からなる安定結晶体で、臨床使用製剤としての製造が容易である。

他の態様では、本発明は、塩酸イコチニブの結晶体IIに関する。図2のように結晶体IIの粉末X線回折スペクトルは通常、次の回折ピーク度を示す（図2で「間隔」は「ｄ値」として示される）。

もうひとつ態様では、本発明は、塩酸イコチニブの結晶体IIIに関する。図3のように結晶体IIIの粉末X線回折スペクトルは通常、次の回折ピーク度を示す（図3で「間隔」は「ｄ値」として示される）。

さらに他の態様では、本発明は、塩酸イコチニブの結晶体IVに関する。図4のように結晶体IVの粉末X線回折スペクトルは通常、次の回折ピーク度を示す（図4で「間隔」は「ｄ値」として示される）。

結晶体Ｉ、II、III、IVでは、主要ピークのみ（つまり、最も特性的で大幅かつ独特な、および／または再現可能なピーク）が概要されているが、この他のピークは従来の方法による回折スペクトルから得ることができる。上記の主要ピークは（最終小数位±2、または表示値±0.2の）誤差内で再現が可能である。

本発明の別の目的は、式Ｉの化合物（塩酸イコチニブ）の製造方法を提供することである。

方法1：

方法2：

方法3：

BPI-02は再結晶化で得られる。

本発明によって明らかにされた塩酸イコチニブの結晶体Ｉ、II、III、IVの製造方法：4-［（3-エチニル-フェニル）アミノ］-6,7-ベンゾ-12-クラウン-キナゾリン塩酸塩が完全に溶けるまで極性溶媒と還流させる。ろ過・冷却・結晶化・ろ過・乾燥の後、対応する様々な結晶体が得られる。具体的な結晶体形成過程は本発明の実施例において詳述する。

上述の結晶化は単一の溶媒、あるいは混合溶媒、または水と有機溶媒の混合物において行うことができる。

結晶化の適切な極性溶媒は、水、低級アルコール、ケトン、エーテル、エステル、ハロゲン化炭化水素、アルカン、ハロゲン化ベンゼン、脂肪族ニトリル、その他の芳香族溶剤から選択することができるが、これに限られるものではない。推奨される溶液には、例えばイソプロパノール、エチルアセテート、50％エタノール、水、N,N-ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、プロパノールが挙げられる。

「低級アルコール」には、直鎖あるいは分岐鎖C₂-C₃アルコールのような直鎖または分岐鎖C₁-C₅アルコールが含まれる。具体例にはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。

本発明の結晶体は、溶媒系で過飽和を達成するために、少なくともひとつの溶剤を含む適切な溶媒系において、蒸発や冷却、反溶剤（本発明で記述されたものほど塩酸イコチニブを可溶化することができない溶液）の追加によって結晶化が可能である。

結晶化は、シード結晶の有無に関わらず起こり、それは本発明において記述されている。

本発明によって提供される各結晶体は、結晶化過程の特定の熱力学および平衡特性に抑制される特定の条件の下、結晶化が進められる。このため、この分野のあらゆる技術専門家は、結晶化過程の動的および熱力学特性の結果、結晶体が形成されることを知るのである。例えば、本発明の化合物は、特定の溶解、温度、圧力、濃度などの条件の下では、ある結晶体は別の結晶体よりもより安定している（あるいは実際、他の結晶体よりも安定性がある）場合があるが、特定の結晶体の熱力学的安定性が比較的低い場合、動力学的には有利である場合がある。さらに時間、不純物分布、かくはん、シード結晶の有無などの動的な要因以外の追加要因が結晶体に影響を及ぼすこともある。

別の態様として、本発明は、有効量の塩酸イコチニブや上記の結晶体Ｉ、II、III、IVならびに薬学的に容認できる担体をそれぞれひとつ、または複数含む医薬組成物を提供するものである。有効成分は、配合の1-99重量%とすることができ、70重量%までがより好ましく、10-30重量%が最も好ましいと言える。

医薬組成物は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、持続放出製剤、液剤および／または懸濁液などの経口投与、減菌溶液、懸濁液や乳剤などの非腸内注入、ペースト、クリームまたは軟膏などの局部治療、座薬などの直腸投与で投薬することができる。医薬組成物は正確な投薬量に適切な単位用量の形とし、これは他の有効成分を含むことがある。

適切な薬学的担体には水、様々な有機溶解物質や不活性希釈剤、充填剤が含まれる。必要に応じて、医薬組成物には香味料、粘着剤、賦形剤などの様々な添加物を入れることが許可される。経口投薬については、錠剤にクエン酸などの賦形剤や様々なケイ酸塩やでんぷんやアルギン酸、ケイ酸塩などの崩壊剤、ショ糖やゼラチン、アラビアガムなどの様々な粘着剤が含まれる。さらにステアリン酸マグネシウムやタルク充填剤を含む滑剤が錠剤製剤によく使用され、軟・硬ゼラチンカプセルにも同種の固形成分を使用することができる。経口投与に水性懸濁液が必要とされる場合、有効成分に様々な甘味料や着香料、色素、染料を混合することができる。必要であれば、様々な乳化剤の使用、懸濁液の生成、水やエタノール、プロピレン、グリセリン、その他合成物などの希釈剤を使用してもよい。

上記の医薬組成物はなるべく経口投薬を行う。
上記の医薬組成物はなるべく錠剤やカプセルとする。

別の態様では、本発明は、哺乳動物の非悪性過形成症の治療や予防用の薬剤製造に本発明の化合物（すなわち、塩酸イコチニブおよび上記の結晶体Ｉ、II、III、IV）の使用を提供するものである。非悪性過形成症は、良性皮膚過形成まはた良性前立腺過形成を引き起こすことがある。

また別の態様では、本発明は、哺乳動物の膵炎、腎臓病、癌、血管新生やそれに関する疾患の治療あるいは予防用の薬剤製造に、その化合物（すなわち、塩酸イコチニブ、上記の結晶体Ｉ、II、III、IV）の使用を提供するものである。

さらに他の態様では、本発明は、哺乳動物の胚芽細胞移植用の薬剤製造における本発明の化合物（すなわち、塩酸イコチニブ、上記の結晶体Ｉ、II、III、IV）の使用を提供するものである。

塩酸イコチニブおよび本発明の結晶体Ｉ、II、III、IVは腫瘍の血管新生、リウマチ性関節炎、アテローム動脈硬化症のような慢性炎症性疾患、乾癬や硬皮症などの皮膚疾患、糖尿病に伴う皮膚病や網膜症、早期網膜症、年齢によるしみ、血管腫、神経膠腫、カポジ内腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺、結腸癌、皮膚癌、それらの合併症を含むがこれらに限らない疾患の治療や予防への使用が認められている。

ここで言及する哺乳動物の中でも、ヒトが優先される。

本発明の別の目的として、哺乳動物の悪性組織肥大治療の方法を提供することが挙げられる。この治療では、過形成症の哺乳動物の患者に対する有効量の塩酸イコチニブおよび／あるいはその結晶体および／あるいは上述の医薬組成物の投与が含まれる。治療に、MMP（マトリックメタロプロテイナーゼ）阻害剤、VEGFR（血管内皮増殖因子）キナーゼ阻害剤、HER2阻害剤、VEGFR抗薬医薬、エンドスタチン剤を使用する例のほか、これに細胞***抑制剤、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、酵素阻害剤、生物反応修飾物質、抗ホルモン剤などの抗癌剤をひとつまたは複数使用する例もある。この抗癌剤には、カルボプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、メトトレキサート、5-FU、カンプトセシン、シクロホスファミド、BCNUなどが含まれる。

この発明の別の態様として、チロシンキナーゼの機能不全による疾患の治療方法が挙げられる。この治療では、チロシンキナーゼの機能不全による疾患を伴った患者に対する、有効量の塩酸イコチニブ、および／あるいはその結晶体、および／あるいは本発明の医薬組成物の投薬が行われる。チロシンキナーゼ機能不全関連の疾患は、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、***癌、頭頸部癌、食道癌、消化管癌、乳腺癌、卵巣癌、頸癌または甲状腺癌とその他合併症を含むがこれらに限られるものではない。

この詳述された治療法の標的疾患には、脳腫瘍、肺癌（非小細胞肺癌（NSCLC））、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、胸癌、頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、卵巣癌、黒色腫、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、リンパ腫、甲状腺腫、これらの合併症が推奨として挙げられる。

上記の方法は、化学療法、生物療法、放射線治療を組み合わせて行うことが可能である。

上記の治療では、抗EGFR抗体、抗EGF抗体、またはこの両方を同じ治療に使用することができる。

投与時の有効成分の投薬量は、治療を受ける患者のニーズ、投与ルート、病気、疾患の重症度、服薬スケジュール、主治医の評価や判断によって決定される。しかし、有効成分に基づく効果的な服用量とは、1日およそ0.01-120 mg／体重kgが適切で、一度に、または何度かに分けて1日に1-50 mg／体重kgを服用するのが望ましい。上記の服用量の最小値が適切である場合もあるが、服用量が多くとも副作用で悩まされることがない場合もある。

本発明の別の態様として、4-［（3-エチニル-フェニル）アミノ］-6-7-ベンゾ-12-クラウン-キナゾリン塩酸塩を臨床応用に提供する。本発明は、特に、次の癌患者治療に伴う塩酸イコチニブを使用した臨床治療に関するものである。塩酸イコチニブ、および／または結晶体Ｉ、II、III、IVの1日あたりの投薬量は25-2100 mgで投与回数は1〜3回、より適切な1日あたりの投薬量は75-1200 mgで回数は1〜3回、なおより適切な1日あたりの投薬量は75-1200 mgで回数は2〜3回、さらに適切な1日あたりの投薬量は100-1200 mgで回数は2〜3回である。

図1は塩酸イコチニブ結晶体Ｉ（イソプロパノールからの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図1(続き)は塩酸イコチニブ結晶体Ｉ（イソプロパノールの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図2は塩酸イコチニブ結晶体II（エタノール50％の結晶体）のX線回折パターンを示す。 図2(続き)は塩酸イコチニブ結晶体II（50％エタノールの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図3は塩酸イコチニブ結晶体III（水性溶剤からの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図3(続き)は塩酸イコチニブ結晶体III（水性溶剤からの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図4は塩酸イコチニブ結晶体III（N,Nジメチルホルムアミドの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図4(続き)は塩酸イコチニブ結晶体III（N,Nジメチルホルムアミドの結晶体）のX線回折パターンを示す。 図5は塩酸イコチニブの1H-NMRスペクトルである。 図6は塩酸イコチニブの13C-NMRスペクトルである。

次の実施例と有効性試験は、さらに詳しく本発明を説明するものであるが、これは、本発明の範囲に制限または限定を与えるものではない。

手順1

調製：400 Lの反応容器で水酸化ナトリウム16 kg（400 mol）を80 Lの水に溶解させ、トリエチレングリコール 18.8 L（140 mol）とTHF32 Lを加える。5 ℃以下に冷却した後、塩化トシル47.84 kg（260 mol）とTHF50 Lの液剤を滴下する。続いて、その反応混合物をこの温度で2時間保管し、氷水240 Lに注ぐ。沈殿物が形成したら、ろ過し、少量の水で洗って乾燥する。白色粉末結晶のBPI-01、58.64 kgが、収率91.4%、mp: 77-80 ℃、HPLC: 97%、TLC（石油エーテル：エチルアセテート＝1：1）Rf＝0.87で生成された。

NMRデータ： 1H-NMR（CDCl3）：δ ppm：7.78（d, 4H, J＝10.4 Hzスルホニル基のベンゼンプロトン）、7.34（メチル基のd, 4H, J＝11.6 Hzベンゼンプロトン）、4.129（dd, 4H, J＝5.6 Hzスルホニル基のエチレンプロトン）、3.64（ス dd, 4H, J＝5.6 Hzルホニル基外のエチレンプロトン）、3.517（s, 4H、中間のエチレンプロトン）、2.438（s, 6H、ベンゼンのメチルプロトン）

手順2

調製：3,4-ジヒドロキシ安息香酸エチル3.64 kg（20 mol）、炭酸カリウム12.4 kg（89.6 mol）を含むN,N-ジメチルホルムアミド300 Lを撹拌し、およそ30分間85〜90℃に熱する。1時間半から2時間の間、40 LのN,N-ジメチルホルムアミドに9.17 kg（20 mol）のBPI-01溶液を滴下する。滴下の終了後、化学反応を30分間保持し、TLCによって反応完了を確認する（展開溶媒：石油エーテル：エチルアセテート＝1：1、Rf＝0.58）。反応容器から反応混合物を取り除き、ろ過し、ろ液を蒸発させてN、N-ジメチルホルムアミドを取り除き、残留物にエチルアセテート240 Lを加えて溶解させる。ろ過および真空蒸発の後、残った液剤が石油エーテル300 Lと共に抽出される。石油エーテルの蒸発後、1:2.5（W／V）の割合で残留した固体がイソプロパノールと共に再結晶化され、白色粉末のBPI-02（1.68 kg）が28%の収率、mp：73-76 ℃, HPLC：96.4%で得られた。

NMRデータ： 1H-NMR（CDCl3）：δ ppm：7.701（d, 1H, J＝2.4 Hz, ポジション6のベンゼンプロトン）; 7.68（s, 1H, ポジション2のベンゼンプロトン）; 6.966（d, 1H, J＝10.8 Hz, ポジション5のベンゼンプロトン）; 4.374-3.81（q, 2H, J＝9.6 Hz, エチルのメチレンプロトン）; 3.78-4.23（dd, 12H, J＝4.8 Hz, クラウンエーテルプロトン）; 1.394（t, 3H, J＝9.6 Hz, エチルのメチルプロトン）.
MS：m／z 296.

手順3

調製：5 Lの反応用フラスコ内でBPI-02液剤 592 g（2 mol）と酢酸600 mL を0℃に冷却し、濃硫酸 1640 mL（25.4 mol）を少しずつ加える。内部の温度は 10 ℃を超えないようにする。0℃以下に冷却する間、濃硫酸1 Lを滴下する。内部の温度は 5 ℃を超えないようにする。滴下後、0-5 ℃で反応を1〜2時間保持する。反応完了後、プラスチックのバケツの氷水15 L に反応液剤を注ぐ。混合、ろ過、エタノール内での再結晶化の後、薄い黄色〜黄色の結晶粉末のBPI-03（449 g）が65.7%の収率、mp：92-95 ℃、HPLC：98.2%、TLC（石油エタール：エチルアセテート＝1：1）で得られた。

NMRデータ： 1H-NMR（CDCl₃）：δ ppm：7.56（ｓ、1Ｈ、ポジション5のベンゼンプロトン）；7.20（ｓ、1Ｈ、ポジション2のベンゼンプロトン）；4.402（ｑ、2Ｈ、J＝9.2 Hz、エチルのメチレンプロトン）；4.294（ｄｄ、12Ｈ、J＝4.8 Hz、クラウンエーテルプロトン）；1.368（ｔ、3Ｈ、J＝9.2 Hz、エチルのメチルプロトン）

手順4

調製：3 Lの水素化反応器の中にメタノール2 LとBPI-03（195 g（0.57 mol））を加えた後、塩化アセチル63 mLを少しずつ加える。少し撹拌した後、40％の水分を含むPd／C33ｇを加える。水素吸蔵が止まるまで、4 ATM水素のもとで反応が起こり、1〜2時間続く。反応完了後、反応混合物を5 Lの反応容器に移す。ろ過、結晶化、ろ過の後、生成物が得られる。母液が真空下で濃縮され、さらに生成物が得られる。白色からピンク色の粉末結晶のBPI-04、168ｇが収率85％、mp：198-201 ℃、HPLC：99.1%、TLC（石油エーテル：エチルアセテート＝1:1）Rf＝0.33で生成された。

NMRデータ： 1H-NMR（DMSO-d6）：δ ppm：8-9（br.、3H、アミノ基のプロトン2および塩酸のプロトン）；7.37（ｓ、1Ｈ、ポジション5のベンゼンプロトン）；6.55（ｓ、1Ｈ、ポジション2のベンゼンプロトン）；4.25（ｑ、2Ｈ、J＝7.06 Hz、エチルのメチレンプロトン）；4.05（ｄｄ、12H、J＝4.04 Hz、クラウンエーテルプロトン）；1.31（ｔ、3Ｈ、J＝7.06 Hz、エチルのメチルプロトン）

手順5

調製：BPI-04（1105 g（3.175 mol））、ホルムアミド（4810 g（106.9 mol））、ギ酸アンモニウム（540 g（8.55 mol））を10 Lの3ネックボトルに加える。反応混合物を還流下、4時間165℃に温める。室温に冷却し、水3 Lを加え、混合物を10分間撹拌する。ろ過、洗浄、乾燥した後、白色粉末結晶のBPI-05（742 g）が収率80％、mp：248-251 ℃、HPLC：99.78%、TLC（クロロホルム：メタノール＝8:1）Rf＝0.55で得られた。

NMRデータ： 1H-NMR（DMSO-d6）：δ ppm：12.06（ｓ、1Ｈ、キナゾリンのＮＨ）；8.0（ｄ、1Ｈ、J＝3.28 Hz、ポジション3のキナゾリンのプロトン）；7.62（ｓ、1Ｈ、ポジション6のキナゾリンのプロトン）；7.22（ｓ、1Ｈ、ポジション9のキナゾリンのプロトン）；4.25（ｄｄ、12Ｈ、J＝4.08 Hz、クラウンエーテルプロトン）

手順6

調製：BPI-05（337 g（1.13 mol））、クロロホルム7.1 L、POCl₃（1.83 L（19.58mol））、132 mlのN,N-ジメチルホルムアミドを10 Lの3ネックボトルに加える。還流温度で反応混合物を撹拌する。溶解後、TLC（展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝15:1、Rf＝0.56）によって反応が完了したことを確認する。完了するまで約8時間かかる。その後、反応液を冷却し、真空下で蒸発乾固させる。残渣をクロロホルム4 Lに溶解し、砕氷水4 kgに加え、30分間撹拌する。分離後、水相を2度クロロホルム2 Lで抽出する。有機相を混合し、氷水4 Lを加え、温度を30℃以下に保ちながら、6 NのNaOHでpHをpH 8-9に調整する。分離後、有機相を飽和塩化ナトリウムで洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶剤を真空蒸発で取り除く。残留固形物をアセトンで洗浄、ろ過する。白色粉末結晶のBPI-06（268 g）が収率77％、mp：164-167℃およびHPLC99%で得られた。

NMRデータ： 1H-NMR（CDCl₃）：δ ppm：8.89（ｓ、1Ｈ、ポジション2のキナゾリンのプロトン）；7.68（ｓ、1Ｈ、ポジション9のキナゾリンのプロトン）；7.42（ｓ、1Ｈ、ポジション6のキナゾリンのプロトン）；4.38-3.81（ｄｄ、12Ｈ、J＝3.88 Hz、クラウンエーテルプロトン）

手順7

本発明の化合物の製造：エタノール500 mL中のBPI-06の20.8 gの懸濁液に、25 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、イソプロパノール200 mL中のナトリウムと8.98 gのm-アセチレン・アニリンの溶液を加える。反応混合物が完全に溶解するまで室温で5分間撹拌し、3時間還流で温める。濃縮、乾燥後、エチルアセテートに溶解し、水洗浄し、無水硫酸で乾燥させ、式Ｉの白色粉末結晶の化合物27.1 gが得られた。
NMRデータ：¹H-NMR（Bruker APX-400、溶剤：DMSO-d6、内部基準TMS）：δ ppm：3.58（ｄｄ、2Ｈ、ポジション12のクラウンのプロトン2個）；3.60（ｄｄ、2Ｈ、ポジション13のクラウンのプロトン2個）；3.73（ｄｄ、2Ｈ、ポジション10のクラウンのプロトン2個）；3.80（ｄｄ、2Ｈ、ポジション15のクラウンのプロトン2個）；4.30（ｓ、1Ｈ、アルキニルのプロトン）；4.34（ｄｄ、2Ｈ、ポジション16のクラウンのプロトン2個）；4.40（ｄｄ、2Ｈ、ポジション9のクラウンのプロトン2個）；7.39（ｄ、1Ｈ、ポジション25のベンゼンプロトン）；7.46（ｄｄ、1Ｈ、ポジション26のベンゼンプロトン）；7.49（ｓ、1Ｈ、ポジション6のキナゾリンプロトン）；7.82（ｄ、1Ｈ、ポジション27のベンゼンプロトン）；7.94（t due dd、1Ｈ、ポジション19のキナゾリンプロトン）；8.85（ｓ、1Ｈ、ポジション23のベンゼンプロトン）；8.87（ｓ、1Ｈ、ポジション2のキナゾリンのプロトン）；11.70（ｓ、1Ｈ、塩としての芳香族アミンのプロトン）；14-16（ｂｓ、1Ｈ、塩酸）、図5参照。

NMRデータ：33 13C-NMR（DMSO-d6）図6参照。
質量分析（ＭＳ）： 計器： ZAB-HS、試験条件：ＥI，200℃、700ev、ＭＳ測定分子重量：m／z 427
最終生成物の元素分析：

（1）C、H、N測定
計器：エレメンタール社―バリオ ＥＬ
表1 元素分析結果と計算値の比較（％）

Ｃ、Ｈ、Ｎの測定結果と計算値の誤差は0．3％以下であり、最終生成物の仕様を満たす。

（2）Ｃｌ測定
計器： カルロ社-Erba1112元素分析計、塩素定量：酸素フラスコ方式、硝酸水銀標準液剤：0.01079 mol／L
表2 塩素試験結果と計算値の比較（％）

塩酸イコチニブ結晶体Ｉの生成
250 mLの丸底フラスコで塩酸イコチニブ0.1 gをイソプロパノール200 mLに温めて溶解させる。ろ過後、結晶化するまで冷却する。結晶をろ過し、少量のアセトンで洗浄し、60 ℃以下の真空下で乾燥させる。mp 225-228℃で白色結晶粉末が得られた。
結晶体Ｉの構造を特性化するために粉末X線回折パターン方式を使用する。図1参照。（ＴＧＡ計器：DSC204（NETZSCH 社））ＴＧＡ結果では、塩酸イコチニブ結晶体Ｉに結晶溶剤は見られなかった。

塩酸イコチニブ結晶体IIの生成
25 mLの丸底フラスコで塩酸イコチニブ0．5ｇを50％エタノール15ｍｌに温めて溶解させる。ろ過後、結晶化するまで冷却する。固形物をろ過し、アセトン5 mLで洗浄し、60 ℃以下の真空下で乾燥させる。mp 224-227℃の白色結晶粉末が得られた。
結晶体IIの構造を特性化するために粉末X線回折パターン方式を使用する。図2参照。（ＴＧＡ計器：DSC204（NETZSCH 社））ＴＧＡ結果では、塩酸イコチニブ結晶体IIの各分子には、結晶水分子2.11が含まれることがわかった。

塩酸イコチニブ結晶体IIIの生成
25 mLの丸底フラスコで塩酸イコチニブ0．5ｇを水15 mLに温めて溶解させる。ろ過後、結晶化するまで冷却、固形物をろ過し、アセトン5 mLで洗浄し、60 ℃以下の真空下で乾燥させる。mp 224-227℃の白色結晶粉末が得られた。
結晶体IIIの構造を特性化するために粉末X線回折パターン方式を使用する。図3参照。（ＴＧＡ計器：DSC204（NETZSCH 社））ＴＧＡ結果では、塩酸イコチニブ結晶体IIIの各分子には、結晶水分子が1.90含まれることがわかった。

塩酸イコチニブ結晶体IVの生成
25 mLの丸底フラスコで塩酸イコチニブ0．5ｇをN,N-ジメチルホルムアミド10 mL中に温めて溶解し、ろ過後、結晶化するまで冷却する。固形物をろ過し、アセトン5 mLで洗浄し、60 ℃以下の真空下で乾燥させる。mp 223-226℃の薄黄色の結晶粉末が得られる。
結晶体IVの構造を特性化するために粉末X線回折パターン方式を使用する。図4参照。（ＴＧＡ計器：DSC204（NETZSCH 社））ＴＧＡ結果では、塩酸イコチニブ結晶体IVの各分子には結晶N,N-ジメチルホルムアミド分子が0.158含まれることがわかった。

有効性試験
試験1：ポリアクリアミドゲル電気泳動による塩酸イコチニブ結晶体ＩのＥＧＦＲチロシンキナーゼの抑制と選択性

方法：タンパク質キナーゼが基質リン酸化を解媒する能力に基づき、タンパク性基質を32Pで放射活性物質で標識するために反応系で放射性元素32P標識ATP（32P-γ-ATP）を使用する。ポリアクリアミドゲル電気泳動法によるタンパク性基質の分離、単離の後、放射性32P標識タンパク性基質の強度が記録される。

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（2.4 μg／μl, 14.5 単位／μg, シグマ）および Crk（ＥＧＦＲ基質、32 ng／μl）をキナーゼ反応バッファー25 μlに混合する。キナーゼ反応バッファーは非同位元素標識ATPを1 μMを含む。上述の混合物には様々な濃度の塩酸イコチニブ結晶体Ｉ（0、0.5、2.5、12.5、62.5 nM）を含む。混合物を10分間氷で冷却し、32P-γ-ATP を1 μCi加える。20分間30℃で放置した後、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）サンプルバッファーを加え、その混合物を4分間100℃の水浴で沸騰させる。サンプルをSDS-PAGE10％によって分離させる。ポリアクリアミドゲルの真空乾燥後、放射能で標識されたタンパク質の強度を測り、ホスフォイメージャー（モレキュラー・ダイナミクス株式会社）を使用し、記録を取る。ImageQuantを使ってシグナルを定量的に分析する。Crk 基質リン酸化の度合いをキナーゼの活性を予測するのに使用する。

抑制（％）＝（1-試験グループのキナーゼ活性／制御グループのキナーゼ活性）×100％

結果：
（1）塩酸イコチニブ結晶体Ｉは、用量反応に従属する関係でＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を抑制する。塩酸イコチニブ結晶体Ｉの濃度が0.5、2.5、12.5、62.5 nMのとき、ＥＧＦＲキナーゼ活性の抑制率はそれぞれ20.5、36.6、63、87.6%であった。用量反応曲線から、ＥＧＦＲキナーゼ活性を抑制する塩酸イコチニブ結晶体ＩのIC50（活性の50％が抑制されるときの阻害剤の濃度）は、海外製品と同様に5 nMである。

（2）ＥＧＦＲキナーゼ抑制に対する塩酸イコチニブ結晶体IIの選択性を研究するため、ＥＧＦＲやArg（abl関連遺伝子）チロシンキナーゼ活性とCrk基質リン酸化を抑制する塩酸イコチニブ結晶体Ｉの能力を同様に平行利用して比較する。塩酸イコチニブ結晶体Ｉ62.5 nMの濃度はArgキナーゼを抑制しないが、ＥＧＦＲキナーゼを抑制し、ＥＧＦＲキナーゼに対して97％の塩酸イコチニブ結晶体Ｉの選択性が示された。
上述の結果、塩酸イコチニブ結晶体Ｉが敏感で選択的なＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であることが示される。

試験2：細胞レベルの塩酸イコチニブ結晶体ＩによるＥＧＦＲ媒介タンパク質リン酸化の抑制
方法：試験には、高ＥＧＦＲ発現細胞株、A431（ヒトの扁平上皮癌）を使用する。対数増殖期のA431細胞を12ウェル細胞培養用プレート（5x105細胞／ウェル）に播種し、これを18時間CO25％に37℃でウシ胎仔血清（FCS）10％を含むDMEM細胞培養基（ギブコ社）で増殖させた。ＰＢＳバッファーでその細胞を2度洗浄した後、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭを加え、18時間の培養後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内の塩酸イコチニブ結晶体Ｉを最終濃度0、10、50、250、1000 nMで各ウェルに加えた。37℃で2時間半培養させた後、5分間その細胞に刺激を与えるためにＥＧＦ100 ng／mlを加え、細胞内の全タンパク質を収集するために、細胞をバナジン酸1 mM（脱リン酸化を抑制）内で抽出し、タンパク質をSDS- PAGE10％によって分解し、ニトロセルロースへ送られた。以下の抗ホスホチロシン抗体（PY99および 4G10、アップステートバイオテック社）とリン酸化タンパクの検出、およびわさびペルオキシダーゼ標識の二次抗体（（トランスダクションラボラトリー株式会社）、ECL化学発光（アマシャム社）での視覚化の後、帯が濃度測定によって定量化された。内部制御として様々な濃度の塩酸イコチニブ結晶体Ｉに露出する細胞にあるＥＧＦＲを比較するため、組織膜を抗ＥＧＦＲ抗体で取り除き、培養した。
抑制（％）＝（1-試験グループのキナーゼ活性／制御グループのキナーゼ活性）×100％

結果：A431細胞中の塩酸イコチニブ結晶体Ｉは、10、50、250、1000 nMの濃度でそれぞれ5.4、52.9、61.9、63.7%、ＥＧＦ誘導、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ仲介細胞内タンパク質チロシンリン酸化を抑制した。半有効濃度（EC₅₀）は約50 nMであった。この結果では、ＥＧＦＲ発現が様々な濃度の塩酸イコチニブ結晶体Ｉに露出した細胞間においてそれほど違いがなく、薬剤がＥＧＦＲ発現を変えはしないが、ＥＧＦＲキナーゼ活性のみを抑制することが示された。

試験3：塩酸イコチニブ結晶体Ｉによるヒトの癌化細胞株の試験管内における増殖抑制
実験の目的：塩酸イコチニブの結晶体Ｉの生体外で培養されたヒト腫瘍細胞株への成長阻害効果を観察すること。
実験材料
被験薬：塩酸イコチニブの結晶体Ｉ、ロット番号 ０５０１０６、浙江貝達薬業有限会社から提供され、現場で調製する。
癌細胞株： A431ヒト扁平上皮癌、A549ヒト非小細胞肺癌、BEL-7402ヒト肝臓癌、BGC-823ヒト胃腺癌、HCT8ヒト結腸癌、H460ヒト肺腺癌、KBヒト扁平上皮癌。
中国語のＭＴＴ法（ｍｅｔｈｙｌ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ａｓｓａｙ）を採用して、塩酸イコチニブの結晶体Ｉの生体外で培養されたヒト腫瘍細胞のＡ４３１、Ａ５４９、Ｂｅｌ７４０２、ＢＧＣ８２３、ＨＣＴ８、Ｈ４６０、ＫＢへの成長阻害効果を観察する。
ＭＴＴ試験：腫瘍細胞をトリプシンで消化して、１０％仔牛血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液で濃度１０ ^４ ｃｅｌｌｓ/ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製し、９６ウェルプレートにおいて各ウェルに１００μｌ（１０００ｃｅｌｌｓ/ウェル）ずつ接種して、２４時間培養した後、薬物を加え、各ウェルに試料を１００μlずつ加えて、1つの群に3つの平行ウェルを設置した。塩酸イコチニブの結晶体Ｉは、濃度０.１％未満のＤＭＳＯで溶解された後で培地によって５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６μｍｏｌ/Lとなるように希釈されたものであり、対照ウェルとしては、０.１％ＤＭＳＯ含有培地が加えられた。３７℃、５％ＣＯ _２ のインキュベータに入れて９６時間培養した後、培養液を廃棄し、各ウェルに０.５％ＭＴＴ溶液（ＲＰＭＩ １６４０で調製）を１００μlずつ加えた。３７℃で４時間保温し、上澄みを捨て、各ウェルにＤＭＳＯ２００μlに溶解された中国語のＦｏｒｍａｚａｎ粒子を加え、振とうして均一に混合し、マイクロプレートリーダーを使用して検出（参照波長４５０ｎｍ、検出波長５７０ｎｍ）し、薬物の細胞成長に対する阻害率を算出した。薬物濃度対数値で阻害率に対して線形回帰を行い、線形方程式を得て、薬物の半阻害濃度（ＩＣ _５０ ）を求めた。

結果：表3に見られるように、高ＥＧＦＲ発現A431細胞を含むヒト癌化細胞株の塩酸イコチニブ結晶体Ｉによる試験管内の増殖抑制は、用量依存的であった。A431細胞線は、ＩC50が1 μmol／Lと非常に繊細で、続いて胃癌細胞BGC823、ヒト非小細胞肺癌細胞株A549、ヒト肺腺癌細胞株H460となり、ＩC50がそれぞれ4、12、16μmol／Lである。塩酸イコチニブ結晶体ＩのHCT8、BEL-7402、KB癌細胞に対する活性は低いものであった。

表3 塩酸イコチニブ結晶体Ｉの癌細胞増殖抑制

試験4：ヌードマウスへのヒト腫瘍異種移植片における塩酸イコチニブ結晶体Ｉによる腫瘍阻止
これは、ヒトA431（ヒト扁平上皮癌）異種移植腫瘍の抑制においてのエルロチニブ塩酸塩と塩酸イコチニブ結晶体Ｉを比較するための予備研究である。
方法：異種移植片の研究について、高ＥＧＦＲ発現ヒトA431（ヒト扁平上皮癌細胞株）細胞株を選択した。

腫瘍移植方法：腫瘍小結節を作るために、BALB／Cヌードマウスの右脇の下にヒト扁平上皮癌細胞A431 を植え付けた。これらの小結節を摘出し、定期移植のため6 mm³のブロックに切り、研究のために各マウスに移植し、腫瘍が約20 mm³の大きさになったら（6〜7日）、無作為にマウスを6〜9匹のグループ4つに分け、体重を記録した。このグループは、制御グループ（薬剤治療なし）、エルロチニブ塩酸塩治療グループ（200 mg／kg）、塩酸イコチニブ結晶体Ｉ投薬治療の高投与量および低投与量グループ（200および50 mg／kg）がある。薬剤は、一日一回経口にて投与され、この頻度は腫瘍増殖についての個別ケースによるものであった。室温２０〜２２℃、相対湿度４０〜６０％でヌードマウスを飼育した。腫瘍容積［腫瘍容積（V）＝腫瘍サイズ（L）× 腫瘍の短直径（S）2／2］ を3日に一度測径器で測定した。最後の薬剤投薬と体重測定の24時間後に、マウスは屠殺し、正確に腫瘍のサイズを測るために、腫瘍を取り除き、重さを測った。試験結果についてＯｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌのソフトウェアで統計的分析を行った。全てのグループのデータを、Ｘ±で表示し、t検定を使って分析する。p値が0.05以下の場合、それは統計的に有意であったと考えられる。

有効性測定：腫瘍抑制率＝［1-治療グループ平均腫瘍重量（T）／ 制御グループ平均腫瘍重量（C）］ × 100%

その結果から、試験用の塩酸イコチニブの結晶体Ｉは経口投与によってヌードマウスのＡ４３１移植腫瘍に対して著しい抗腫瘍効果を有し、且つ投与量依存関係を示していることが表明された。

試験5：ヌードマウスへのヒト腫瘍異種移植モデルの抑制におけるイレッサTM錠と塩酸イコチニブ結晶体Ｉの比較
方法：試験4で詳述された方法を使用し、H460ヒト肺腺腫瘍異種移植片に対する塩酸イコチニブ結晶体ＩとイレッサTM錠剤の抗腫瘍活性を比較するこの研究を行った。
この結果、塩酸イコチニブ結晶体Ｉの粉末とイレッサTM錠が14日間毎日1回経口投与されたとき、塩酸イコチニブの投薬量の多い、ふつうの、少ないグループ（120、60、30 mg／kg）のH460腫瘍抑制率は、52.0、49.3 および 37.53%で、イレッサTMグループ（120 mg／kg）の腫瘍抑制率は38.29%であった。塩酸イコチニブ結晶体Ｉの30 mg／kgのグループでは、H460ヒト腫瘍異種移植片に対し、イレッサTMグループ120 mg／kgと同様の阻害活性を示し、一方ではより投与量の多い2つのグループが120 mg／kgのイレッサTM投薬レベルより優れた阻害活性を示した。塩酸イコチニブ結晶体ＩよりイレッサTMのほうが、有毒性が高く、マウスの体重が減少し、活発でなくなった。

塩酸イコチニブ結晶体Ｉを使ったビーグル犬、マウス、ラットでの薬理学および毒物学実験も行われた。この結果、塩酸イコチニブ結晶体Ｉは経口有毒性が低く、骨髄毒性や可逆的な肝臓毒性がないことが分かった。安全性薬理試験では、塩酸イコチニブ結晶体Ｉは、呼吸、血圧、循環器機能、自律神経や中央神経の活動に全く影響を及ぼさないという結果が得られた。追加の毒性試験にて、催奇性、変異原性、生殖毒性がないことも示された。

さらに、ビーグル犬やラットの塩酸イコチニブ結晶体Ｉの非臨床薬物動態研究が行われた。経口投与される塩酸イコチニブ結晶体Ｉは、ラットや犬における絶対的バイオアベイラビリティが27-62%と吸収率が高いことが示された。薬剤は約1時間でピーク血漿濃度（Tmax）に達し、主に糞便中排せつを通じて、少量が尿により排せつされる。塩酸イコチニブは、様々な組織へ広く行きわたるが、脳組織には広がらず、薬剤が簡単に血液脳関門を通らないことが示された。ラットの肝臓内のP450酵素への誘導作用は見られず、塩酸イコチニブ結晶体Ｉについて薬物代謝酵素への阻害活性も見られなかった。

試験6：臨床試験
1）錠剤の製造に塩酸イコチニブ 結晶体 Ｉ を使用し、25、50、100、150、225、325、425、575、1025 mgの単回投与を行った76名の被験者について第1相臨床的安全性試験を行った結果、25-1025 mgの単回投与は安全であることが示された。

2）少なくとも一度はプラチナ製剤を中心とした併用レジメンに失敗した進行性非小細胞肺癌（NSCLC）患者104名に、食事抜きで塩酸イコチニブ結晶体Ｉの経口投薬を行うＰＫ、安全性、有効性の第2相臨床試験を行った。治療における有効性評価を表4に示す。使用される用語の定義：ＰＲ：部分寛解、ＣＲ：完了寛解、ＳＤ：安定、ＰＤ：病気の進行、ＯＲＲ：客観的奏功率、ＤＣＲ：病勢コントロール率。

表4 様々な塩酸イコチニブ結晶体Ｉの投薬量での治療後の進行性NSCLC患者における有効性評価

上記のデータは、塩酸イコチニブ結晶体Ｉが非小細胞肺癌の治療に有効であることを示している。

試験7：塩酸イコチニブの様々な結晶体およびイコチニブ遊離塩基形における薬物動態学的研究
薬剤および試薬：イコチニブ（遊離塩基）および塩酸イコチニブ結晶体Ｉ、II、III、IVを細粒子にした。物質含有量（純度）は少なくとも99.0％で、カルボキシルメチルセルロースナトリウムは医療用クラスであった。
実験動物：雄および雌の各150-220 gのウイスター系ラット
調剤調製：各薬剤の適正量の重量を測り、カルボキシルメチルセルロースナトリウムの0.5%まで加える。水の中で最終濃度3.5 mg／mLの懸濁液を準備した。

投与およびサンプル採集：10 ml／kgの投薬量の塩酸イコチニブ35mg／kgに等しい投薬量にて、各懸濁液を絶食したウイスターラットに対し経口投与した。約0.5-1.0 mLの血液を薬剤投与後、1分、2分、3分、6分、10分、24分の間隔でヘパリン化チューブに集め、これを遠心分離、血漿を集め、-20℃で保管した。

精製後、サンプルを高速液体クロマトグラフィーで分析した。クロマトグラフィー条件には、静止相としてC18シラン結合シリカを、移動相としてアセトニトリル内リン酸二水素ナトリウム0.02 mol／L（40:60、水酸化ナトリウムを使ってpHを5.0まで調節する）、検出波長334 nmを利用した。各化合物の濃度‐時間曲線下面積を、下の表に示す。

上記の試験では、塩酸イコチニブ結晶Ｉ、II、III、IVの濃度‐時間曲線下面積（0-t）と濃度‐時間曲線下面積（0-∞）が遊離塩基のものより約3倍大きいことを示している。つまり、塩酸イコチニブ結晶体Ｉ、II、III、IVの相対的バイオアベイラビリティは、イコチニブの遊離塩基よりも優れている。

Claims (4)

1. 以下のステップ：
   (a)式BPI-02で示される化合物をニトロ化剤と反応させて、式BPI-03で示される化合物を形成する；
   (b)式BPI-03で示される化合物を還元剤で還元して、式BPI-04で示される化合物を形成する；
   (c)式BPI-04で示される化合物をホルムアミドおよびギ酸アンモニウムと反応させて、式BPI-05で示される化合物を形成する；
   (d)式BPI-05で示される化合物をPOCl3と反応させて、式BPI-06で示される化合物を形成する；
   (e)式BPI-06で示される化合物をm-アセチレンアニリンとカップリングさせて、式Ｉで示される化合物を形成する；
   ここで、BPI-02、BPI-03、BPI-04、BPI-05、BPI-06および式Ｉは、以下の通りである：
   

   

   
   

   

   を含む、式Ｉで示される化合物の製造方法。
2. 次の手順：
   

   

   から成る、請求項１に記載の方法。
3. 次の手順：
   

   

   から成る、請求項１に記載の方法。
4. 以下の式：
   

   

   BPI-03 BPI-04
   

   

   BPI-05 BPI-06
   で示される化合物。

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