JP5657560B2 - 新規加水分解酵素タンパク質 - Google Patents
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Description
[1] 配列番号2〜5のいずれかに示すアミノ酸配列からなり、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
(a)配列番号7から10に記載の塩基配列;
(b)配列番号7から10に記載の塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:又は
(c)配列番号7から10に記載の塩基配列において、1から数個の塩基の置換、欠失、及び/又は付加を有する塩基配列であって、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:
(1)本発明の加水分解酵素タンパク質
本発明の加水分解酵素タンパク質は、配列番号2〜5のいずれかに示すアミノ酸配列、又はそれに変異を施したアミノ酸配列からなり、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有することを特徴とする。ここで、配列番号1は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857株由来のパラニトロベンジルエステラーゼ(PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235)のアミノ酸配列である。
ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を効率的に得るための加水分解酵素タンパク質に求められる選択性としては以下の点が挙げられる。
まず、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸には、(2R)体及び(2S)体の2種類の立体異性体が存在するが、2位での立体反転が起こる特殊な条件で無い限り、基本的には(2S)体のみが目的とする(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の原料となり得る。
ジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解する際、加水分解酵素タンパク質は、1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する選択性を有する必要がある。なお、pro-Rとは、CX2YZ 上にある 2個の X について、それらを区別する表記法であり、概要は以下の通りである。C上の各置換基についてCIP則により優先順位を決める。そのとき、2個の X のうち一方の優先順位を他方よりも高いものと仮定する。Y、Z との優先順位の関係は変えない。仮の優先順位に基づき、RS表記法により中心炭素のキラリティが R か S かを決める。R体の場合は、そのときに優先させた X を pro-R とし、S体の場合はpro-S とする。
本選択性は、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体と(1R,2S)体の比率を指標として比較可能であり、(1S,2S)体の生成量に比して(1R,2S)体の生成量の比率が低いものほど(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の収率が向上し、工業化において有利である。
次に、ラセミ体のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を基質とする際に、(2R)体を加水分解酵素タンパク質により加水分解して、(1S,2R)体及び(1R,2R)体を生成し得るが、目的とする(1S,2S)体のエナンチオマーにあたる(1R,2R)体はその生成量を極力低く抑えることが好ましい。即ち、加水分解酵素タンパク質は、ジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2R)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する選択性、及び/又はジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に比してジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を優先的に加水分解する選択性を有する必要がある。いずれの選択性も、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体の(1R,2R)体に対するエナンチオマー過剰率(% e.e.)により比較可能であり、(1S,2S)体のエナンチオマー過剰率が高いものほど後の製造工程や製造された医薬品の生理活性に悪影響が生じる可能性が低く、工業化において有利である。
また、上記したように、加水分解酵素タンパク質はジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基を加水分解し、目的とする(1S,2S)体のジアステレオマーにあたる(1S,2R)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成し得るが、後段の製造工程への影響を軽減するため、この(1S,2R)体の混入も極力低減させることが好ましい。
本選択性は、生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体の生成量と(1S,2R)体の生成量の比率により比較可能であり、(1S,2S)体の生成量に対する(1S,2R)体の生成量が低いものの方が後の製造工程や製造された医薬品の生理活性に悪影響が生じる可能性が低く、工業化において有利である。
即ち、本発明の「式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性」とは、生成物である1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸における、「1R2S/1S2S比」、「1S2S体光学純度(% e.e.)」、あるいは「1S2R/1S2S比」を指標として決定することができる。
(a)配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号70番、106番、107番、108番、219番、270番、271番、272番、273番、274番、275番、276番、及び313番のアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
(b)配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号188番、190番、193番、215番、216番、217番、314番、358番、362番、及び363番のアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
(c)配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号70番、106番、107番、108番、219番、270番、271番、272番、273番、274番、275番、276番、及び313番のアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されていて、かつアミノ酸番号188番、190番、193番、215番、216番、217番、314番、358番、362番、及び363番のアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
(d)上記(a)又は(c)の加水分解酵素タンパク質であって、少なくとも、アミノ酸番号70番、270番、273番、及び313番のアミノ酸のうち1つ以上のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなり、上記式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
本発明においては、特に(d)の加水分解酵素タンパク質が好ましい。
Arg(アルギニン):14.28
Asp(アスパラギン酸):11.68
Asn(アスパラギン):12.82
Cys(システイン):13.46
Glu(グルタミン酸):13.57
Gln(グルタミン):14.45
Gly(グリシン): 3.40
His(ヒスチジン):13.69
Leu(ロイシン):21.40
Ile(イソロイシン):21.40
Lys(リシン):15.71
Met(メチオニン):16.25
Phe(フェニルアラニン):19.80
Pro(プロリン):17.43
Ser(セリン): 9.47
Thr(スレオニン):15.77
Trp(トリプトファン):21.67
Tyr(チロシン):18.03
Val(バリン):21.57
特に、本発明の加水分解酵素タンパク質としては、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号70番、270番、273番、又は313番のロイシン又はイソロイシンのうちの1つ以上が、これらよりも上記Bulkinessの値が小さいアミノ酸に置換されているものが好ましい。
(e)上記(d)の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくともアミノ酸番号70番のロイシンが、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
(f)上記(d)又は(e)の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号3又は4に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号270番のロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
(g)上記(d)又は(e)の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号1、2又は5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号270番のイソロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
(h)上記(d)から(g)のいずれかの加水分解酵素タンパク質であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号273番のロイシンが、アルギニン、又はヒスチジンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
(i)上記(d)から(h)のいずれかの加水分解酵素タンパク質であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号313番のロイシンが、メチオニン、アラニン、又はプロリンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
本発明によれば、上記した本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするDNAが提供される。
本発明のDNAの具体例としては、以下の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
(a)配列番号7から10に記載の塩基配列;
(b)配列番号7から10に記載の塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであって、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:又は
(c)配列番号7から10に記載の塩基配列において、1から数個の塩基の置換、欠失、及び/又は付加を有する塩基配列であって、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:
本発明によればさらに、本発明のDNAを有する組み換えベクターが提供される。組み換えベクターを調製する際には、通常、本発明のDNAを宿主微生物に適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流に本発明のDNAのコード領域の5'末端側が連結されるようにして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現ベクターを用い、これに本発明のDNAを挿入してもよい。
本発明で用いることができる宿主は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸、あるいは目的物である(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸と接触させ、その結果、得られる化合物を分析することにより選択することができる。
本発明で用いることができる宿主微生物としては、具体的には、エシェリヒア(Escherichia)属細菌(例えば、大腸菌)が挙げられ、また、放線菌(Actinomycetes)属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌、ラクトバチルス(Lactobacillus)属細菌、ストレプトマイセス(Streptomyces)属細菌、サーマス(Thermus)属細菌、ストレプトコッカス(Streptococcus)属細菌等も、上記性質を有するものは、本発明のDNA又は組み換えベクターを導入する宿主として用いることができる。
また、上記微生物において、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸以外に加水分解する活性や生成された(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸をさらに別の化合物に変化させる活性を有するものは、該活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子を既存の方法により破壊することにより、本発明のDNA又は組み換えベクターを導入する宿主として用いることができる。
本発明によれば、上記のようにして得られる形質転換体を培養し、その培養物から本発明の加水分解酵素タンパク質を採取することができる。
本発明によれば、式(2)で表される製造、即ち、本発明の加水分解酵素タンパク質をジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させて(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法が提供される。
Rとしては、好ましくはメチル基、エチル基、tert−ブチル基、及びベンジル基であり、さらに好ましくはエチル基である。
式(4)中、X1は水素原子又はR1を示し、X2は水素原子又はR2を示し、R1及びR2はそれぞれ独立して置換されていてもよい炭素数2〜11のアルキルカルボニル基、炭素数8〜21のアラルキルカルボニル基、又は炭素数7〜13のアリールカルボニル基を示す。但し、X1及びX2が同時に水素原子となる場合を除く。好ましくは、X1がR1で且つX2がR2であり、より好ましくはR1及びR2がアセチル基、エチルカルボニル基、tert−ブチルカルボニル基、ベンゾイル基であり、さらに好ましくはアセチル基である。
(1)遺伝子のクローニング
バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027、及びバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013を各菌株保存機関が指定する液体培地でそれぞれ一晩培養して得られた菌体より、DNeasy Blood & Tissue Kit (キアゲン社製)を用いて、染色体DNAをそれぞれ調製した。
調製した各菌株由来の染色体DNAを鋳型とし、pnbA F、pnbA Rをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、それぞれ約1.5kbpのDNA断片を増幅した。
このときのPCRは、Easy-AハイフィデリティPCRクローニング酵素(アジレント・テクノロジー社製)を使用し、添付の取り扱い説明書の条件に従って反応を実施した。温度条件については、94℃で2分間保持の後、(94℃、30秒;50℃、30秒;72℃、90秒)を35サイクル繰り返し、72℃で5分間保持して終了した。
特開2005-34025号公報記載の方法に準じて調製したプラスミドpKV32をテンプレートとし、配列番号19に示すプライマー(pKVXmaIFW)と配列番号20に示すプライマー(pKVXmaIRV)を用いて、PCRにより約4kbpの断片を増幅した。増幅された断片を制限酵素XmaIにより消化した後、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)により自己閉環させてプラスミドを得た。得られたプラスミドをpKW32と命名した。
このときのPCRは、KOD -plus- Ver.2(東洋紡社製)を使用し、添付の取り扱い説明書の条件に従って反応を実施した。温度条件については、94℃で2分間保持の後、(94℃、15秒;58℃、30秒;68℃、4分)を30サイクル繰り返し、68℃で5分間保持して終了した。
上記(1)で得られたDNA断片はそれぞれ、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いて、(2)で調製したクローニングベクターpKW32に導入した。以下、得られた各プラスミドをそれぞれppnbA23857、ppnbA3026、ppnbA3108、ppnbA3027、及びppnbA3013とする。
実施例1で得られた5種のプラスミドを用い、大腸菌(Escherichia coli) JM109(タカラバイオ株式会社製) を常法に従い形質転換した。得られた組換え大腸菌それぞれをカナマイシン 20 mg/l、IPTG 0.2mMを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。
得られた菌体を用いて、5 g/lのラセミ体1,1−ジエトキシカルボニル−2−ビニルシクロプロパン(以下、「VCPDE」と称する。)及び5%のジメチルスルホキシドを含む100mM リン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。
カラム: CHIRALPAK AD-3(4.6 x 250 mm、ダイセル化学社製)
溶離液: ヘキサン : エタノール : トリフルオロ酢酸 = 95 : 5 : 0.1
流速: 0.8 ml/min
温度: 30℃
検出: UV 210 nm
また、PNBE3013は「1S2R/1S2S比」において、配列既知の酵素PNBE23857に比べて低い値を示した。
実施例1で使用したVCPDEは以下のようにして合成した。
2L4口フラスコに、マロン酸ジエチルエステル93.4g(583mmol)、トルエン1000mLを仕込み、塩基として20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液223mL(569mmol)を加えた。室温下、1.5時間撹拌後、trans−1,4−ジブロモ−2―ブテン59.4g(278mmol、アルドリッチ社製試薬)を加えた。室温下、2時間撹拌後、さらに20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液109mL(278mmol)を加えた。室温下、1時間撹拌後、trans−1,4−ジブロモ−2―ブテン29.1g(136mmol、アルドリッチ社製試薬)を加えた。室温下、4時間撹拌後、1M水酸化ナトリウム水溶液347mLを添加して14時間撹拌後、有機層を分離した。次いで有機層を水132mLで2回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後に濾過し、得られた濾液を40℃にて減圧濃縮し、淡黄色油状物の粗生成物として1,1−ジ−エトキシカルボニル−2−ビニルシクロプロパン99.3gを得た。この粗生成物の中に1,1−ジ−エトキシカルボニル−2−ビニルシクロプロパンは83.2g(収率94.9%)含まれていた。また、マロン酸ジエチルエステルは含まれていなかった。
PNBE3027のアミノ酸配列について、Protein Data Bank (PDB)に対してBLAST検索を行い、以下の3種の結晶構造を参照構造として選択した。なお、以下においてA56Vという表記は、56番目のアミノ酸残基アラニン(A)がバリン(V)に置換していることを示す。
・para-nitrobenzyl esterase Mutation: A56V, I60V, T73K, L144M, L313F, H322Y, A343V, M358V, Y370F, A400T, G412E, I437T, T459S(PDB id: 1C7J) 配列一致度89%
・para-nitrobenzyl esterase Mutation: I60V, L144M, P317S, H322R, L334S, M358V, Y370F (PDB id: 1C7I) 配列一致度90%
・para-nitrobenzyl esterase (PDB id: 1QE3) 配列一致度91%
・活性部位Ser189のアルコール酸素原子と加水分解されるエステル結合のカルボニル炭素の距離を2.0Å以上3.0Å以内とする。
以上の処理により得られた構造を「1S2Sモデル」及び「1R2Rモデル」とした。
まず、実施例3で得られた「1S2Sモデル」及び「1R2Rモデル」それぞれにおいて、VCPDEのビニル基の2位の炭素原子から8Å以内に一部もしくは全部が存在するアミノ酸残基を全て抽出した。距離の計算にはDiscovery Studio Visualizer v2.5.5.9350を使用し、抽出された各アミノ酸残基の中でそれぞれのモデルのVCPDEのビニル基の2位の炭素原子からの距離が最も近い水素原子以外の原子との距離を各アミノ酸残基との距離と規定した。抽出された各アミノ酸残基について、規定した距離を「1S2Sモデル」における距離と「1R2Rモデル」における距離とで比較した結果、「1R2Rモデル」に比べて「1S2Sモデル」における距離が近いアミノ酸残基を表2に、「1S2Sモデル」に比べて「1R2Rモデル」における距離が近いアミノ酸残基を表3に示した。
CA = Carbon, Alpha
CB = Carbon, Beta
CG = Oxygen, Gamma
CD = Carbon, Delta
CE = Carbon, Epsilon
CZ = Carbon, Zeta
OE = Oxygen, Epsilon
実施例1で得たプラスミドppnbA3027を鋳型として、配列表の配列番号13に示すプライマー(L70FW)と配列番号14に示すプライマー(L70RV)を用いて、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社製)によりアミノ酸番号70番のロイシンをコードする塩基にランダムな変異を導入した。得られた約200個のコロニーをそれぞれカナマイシン 20 mg/l、IPTG 0.2mMを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。
得られた菌体を用いて、5 g/lもしくは30 g/lのラセミ体VCPDE、5%のジメチルスルホキシドを含む100mM リン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。
また、上記と同様にして、配列表の配列番号15に示すプライマー(L313FW)と配列番号16に示すプライマー(L313RV)を用いて、アミノ酸番号313番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、約200個のコロニーを上記と同様の方法で反応させた。
さらに、上記と同様にして、配列表の配列番号17に示すプライマー(L270L273FW)と配列番号18に示すプライマー(L270L273RV)を用いて、アミノ酸番号270と273番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、約400個のコロニーを上記と同様の方法で反応させた。
P:プロリン
G:グリシン
T:スレオニン
S:セリン
N:アスパラギン
A:アラニン
M:メチオニン
D:アスパラギン酸
F:フェニルアラニン
H:ヒスチジン
R:アルギニン
E:グルタミン酸
Q:グルタミン
配列番号1:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ(PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235)のアミノ酸配列
配列番号2:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3026
配列番号3:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3108
配列番号4:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3027
配列番号5:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3013
配列番号6:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ(PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235、配列番号1)をコードする遺伝子配列(pnbA23857)
配列番号7:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3026
配列番号8:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3108
配列番号9:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3027
配列番号10:バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3013
配列番号11:パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーpnbA F
配列番号12:パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーpnbA R
配列番号13:プライマー(L70FW)
配列番号14:プライマー(L70RV)
配列番号15:プライマー(L313FW)
配列番号16:プライマー(L313RV)
配列番号17:プライマー(L270L273FW)
配列番号18:プライマー(L270L273RV)
配列番号19:プライマー(pKVXmaIFW)
配列番号20:プライマー(pKVXmaIRV)
Claims (12)
- 配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくともアミノ酸番号70番のロイシンが、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項2に記載の加水分解酵素タンパク質。
- 配列番号3又は4に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号270番のロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項3に記載の加水分解酵素タンパク質。
- 配列番号1、2又は5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号270番のイソロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項3に記載の加水分解酵素タンパク質。
- 配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号273番のロイシンが、アルギニン、又はヒスチジンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項3から5のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質。
- 配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号313番のロイシンが、メチオニン、アラニン、又はプロリンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項3から6のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質。
- 請求項1から8のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は請求項1から8のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列に対して1から数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は付加を有するアミノ酸配列であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号70番、270番、273番、及び313番に対応するアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質をコードするDNA。
- 以下の塩基配列からなる、請求項10に記載のDNA。
(a)配列番号7から10に記載の塩基配列;
(b)配列番号7から10に記載の塩基配列の相補鎖からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAの塩基配列であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号70番、270番、273番、及び313番に対応するアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードし、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:又は
(c)配列番号7から10に記載の塩基配列において、1から数個の塩基の置換、欠失、及び/又は付加を有する塩基配列であって、配列番号1〜5のいずれかに示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号70番、270番、273番、及び313番に対応するアミノ酸のうち1つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードし、式(1)に示す反応を、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列:
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の加水分解酵素タンパク質をジアルキル 2−ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させて(1S,2S)−1−アルコキシカルボニル−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)−1−アルコキシカルボニル−2−ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
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