CN104662001B

CN104662001B - 顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸衍生物的制造方法和顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸的纯化方法

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Publication number: CN104662001B
Application number: CN201380049701.8A
Authority: CN
Inventors: 前田智子; 上原久俊; 齐藤保代; 村井真人
Original assignee: API Corp
Current assignee: API Corp
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2033-12-19
Also published as: JP6370712B2; IN2015DN02424A; EP2889288B1; CN104662001A; SG10201705091YA; WO2014098188A1; EP2889288A4; JP2017105836A; ES2693568T3; US9981984B2; JPWO2014098188A1; SG11201502395XA; EP2889288A1; US20150239906A1

Abstract

本发明的课题在于提供高纯度的顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸的纯化方法及其衍生物的制造方法。本发明提供顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸衍生物的制造方法和顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，该方法包括将顺式‑5‑羟基‑2‑哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)(R¹表示氨基的保护基，R²表示C1～C6的烷基)的化合物的工序。

Description

顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法和顺式-5-羟基- 2-哌啶羧酸的纯化方法

技术领域

本发明涉及制造顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸(也称为顺式-5-羟基-2-哌啶酸)的衍生物的工业方法。另外，涉及将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸纯化的方法。

背景技术

顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸是有用的药物中间体。但是，该化合物具有两个不对称碳原子，因此存在4种异构体，非常难以选择性地合成单一的异构体或者单一的非对映体。因此，需要通过化学转换来分离不需要的异构体、以及通过纯化来提高纯度。

例如，报道了下述方法：通过利用微生物或酶的羟化反应向2-哌啶羧酸导入羟基，得到顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。但是，有报道指出，在生成目标顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的同时，还会副产生3位羟化体等在其他位置取代有羟基的化合物，而对于其分离却并未提及(非专利文献1)。另外，还报道了通过酶反应由5-羟基赖氨酸合成5-羟基-2-哌啶羧酸的方法(专利文献1)，但并未记载所生成的顺式/反式异构体的分离。在利用与专利文献1类似的手法由5-羟基赖氨酸合成5-羟基-2-哌啶羧酸的报道中(专利文献2)，利用离子交换树脂柱分离了异构体。该方法中，需要对底物使用大量过剩的填充剂和洗脱液，从工业生产的观点来看并不现实。

如上所述，尚不知道由利用微生物或酶合成的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸以高纯度仅得到所需要的空间异构体的方法。

另外，在化学合成中，将能够固定两个不对称碳原子中的2位的立体化学的L-氨基酸用作原料的方法是众所周知的。例如，报道了将L-焦谷氨酸作为原料的方法(专利文献3)，但该方法中存在在形成哌啶环时必须使用昂贵的铱催化剂的问题。另外，报道了将L-谷氨酸作为原料的方法(非专利文献2、3)、将脯氨酸衍生物作为原料的方法(非专利文献4)，但这些方法均需要使用危险性高的重氮化合物，此外还要经由多阶段的复杂工序。另外，在(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的分离时，经由5-氧代-2-哌啶羧酸将其还原从而优先会得到(2S,5S)体(非专利文献4)，但为了除去异构体等杂质而需要用硅胶柱进行分离，工序负荷大，因此并不是工业上令人满意的方法。

此外，还已知(2S,5S)-N-苄氧羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸或其酯发生内酯化，形成(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯(非专利文献4、5)，但这些内酯化的示例并未提及异构体等杂质，纯化效果尚不明确。另外，在非专利文献4中，记载了(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯在硅胶柱纯化后以油状物质获得。在非专利文献5中，记载了(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯发生结晶化，但由于是将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸作为原料进行了内酯化，因此异构体等杂质的举动和纯化效果尚不明确。另外，报道了对N-苄氧羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸甲酯的顺式/反式混合物进行酸处理而分离(非专利文献3)，但由于为羧酸酯，因而无法通过溶剂提取等简便方法来分离由顺式体得到的内酯和反式体的酯。此外，在非专利文献3中未记载该工序的收率。本发明人对该方法进行了研究，结果发现，显著发生了由顺式体得到的内酯((1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯)与残存的反式体((2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸酯)反应的副反应，收率降低。

如上所述，为了在工业上以低成本的方法制造高纯度的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸，还残留有课题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4590981号

专利文献2：日本特开2010-88395号

专利文献3：WO2010/126820号

非专利文献

非专利文献1：Adv.Synth.Catal.,2011,353,1375.

非专利文献2：Chem.Commun.,1996,349.

非专利文献3：Tetrahedron Lett.,1988,29,2231.

非专利文献4：Tetrahedron:Asym.,2006,17,2479.

非专利文献5：Rec.Trav.Chim.Pays-Bas,1959,78,648.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于提供作为药物中间体有用的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法及其衍生物的制造方法。

用于解决课题的方案

本发明人为了解决上述课题进行了反复深入的研究。另外，经由使含有杂质的纯度低的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应的工序，而向顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物诱导，从而解决了上述课题。

在一个更具体的方式中，本发明人发现：通过使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应而转换为氨基受到保护的内酯，并进行析晶和/或溶剂提取，从而能够分离异构体等杂质。即，由本发明人的研究可知，仅仅是本发明的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物与酰卤化物和/或酸酐反应，就能够转换为内酯；并且该内酯在特定的条件下结晶化。另外，本发明人开发出了使该内酯结晶化并通过析晶去除结晶性低的异构体等杂质的方法。

另外，在其他具体方式中，本发明人发现：使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应后，在酸催化剂存在下与醇反应，转换为氨基受到保护的酯，从而可以利用溶剂提取去除具有羧基的异构体等杂质。即，通过本发明人的研究开发出了下述方法：在酸催化剂存在下仅使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物转换为内酯，使其与反应体系中存在的醇反应，从而抑制副反应而仅将顺式体有效地转换为酯，并利用溶剂提取去除残存的具有羧基的异构体等杂质。

并且，本发明人发现：将所得到的内酯和/或酯水解而制成顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸后，将氨基的保护基去除，从而可得到高纯度的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸，由此完成了本发明。

即，本发明的要点如下所述。

[1]一种顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其特征在于，该方法包括以下工序：将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)(R¹表示氨基的保护基，R²表示C1～C6的烷基)的化合物。

[2]如[1]所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其特征在于，该方法包括以下工序：使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应而转换为式(1)的化合物。

[3]如[1]所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其特征在于，该方法包括以下工序：使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应后，在酸催化剂存在下与醇反应，从而转换为式(2)的化合物。

[4]一种顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的再生方法，其特征在于，该方法包括以下工序：将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)(R¹表示氨基的保护基，R²表示C1～C6的烷基)的化合物的工序；和将式(1)和/或式(2)的化合物转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的工序。

[5]如[1]～[3]中任一项所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其特征在于，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸是通过细菌反应和/或酶反应合成的。

[6]如[4]所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的再生方法，其特征在于，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸是通过细菌反应和/或酶反应合成的。

[7]一种顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下工序：使包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物与酰卤化物和/或酸酐反应、或者与酰卤化物和/或酸酐以及醇反应，将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)的化合物，接下来将该化合物分离，之后转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

[8]如[7]所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，杂质为2-哌啶羧酸类。

[9]如[8]所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，2-哌啶羧酸类为反式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

[10]如[7]～[9]中任一项所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，该纯化方法中，通过析晶或溶剂提取来进行式(1)和/或式(2)的化合物的分离工序。

[11]如[7]～[10]中任一项所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物是通过细菌反应和/或酶反应合成的。

发明的效果

根据本发明的方法，能够提供纯度高的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸及其衍生物。

附图说明

图1是由可以包含杂质的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸纯化顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的路线的示意图。路线1为下述路线：使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应，直接或经由顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸制成式(1)的化合物，其后转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。路线2为下述路线：使顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸与酸催化剂反应而制成式(1)的化合物，其后通过水解转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。路线3为下述路线：使顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸在酸催化剂存在下与醇反应而制成式(2)的化合物，其后通过水解转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

图2是示出通过重组赖氨酸羟化酶得到的羟基赖氨酸的HPLC分析的结果的图。

图3是示出通过重组赖氨酸羟化酶得到的羟基赖氨酸的HPLC分析的结果的图。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

本发明中，所谓顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸，包括(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸、(2R,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸、或它们的混合物，也可以为外消旋体。另外，也可以与酸或碱形成盐。

本发明的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法包括将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)的化合物的工序。

式(1)和(2)中，R¹表示氨基的保护基，下面举出其具体例。但是并不限于这些。

作为氨基的保护基，可以举出甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基等酰基；甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基等烷氧羰基；苄基、4-甲氧基苄基、4-溴苄基、1-苯乙基等芳烷基；甲烷磺酰基、对甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基等磺酰基。

这些之中，优选能够容易去除的酰基、烷氧羰基，更优选为乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基，进一步优选为工业上成本低的乙酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基。特别优选为苄氧基羰基，其可以通过氢化去除，不残留不挥发性成分，因而可以减轻顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化负荷。

式(2)中，R²表示C1～C6的烷基，具体来说，可以举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等伯烷基；异丙基、异丁基、异戊基、环戊基、环己基等仲烷基；叔丁基等叔烷基等。这些之中，优选为甲基、乙基、异丙基、丁基、叔丁基，进一步优选为乙基、异丙基。

本发明中，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物可以为式(1)和/或式(2)的化合物本身。

作为式(1)的化合物的具体例，可以举出5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯、5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸叔丁酯、5-乙酰基-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷等。

另外，作为式(2)的化合物的具体例，可以举出顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸甲酯、顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯、顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸甲酯、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯等。

另外，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物也可以为对式(1)和/或式(2)的化合物进行化学转换而得到的化合物。

作为这样的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物，具体来说，可以举出顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸等羧酸；顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸苄酯、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸苄酯等酯；顺式-N-(苄氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸酰胺、顺式-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-2-哌啶羧酸酰胺、顺式-5-羟基-2-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸苄酯、顺式-5-羟基-2-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯、顺式-2-(1-叔丁氧基氨基甲酰基吡咯烷-3-基氨基甲酰基)-5-羟基哌啶-1-羧酸苄酯、顺式-2-(1-苄氧基氨基甲酰基吡咯烷-3-基氨基甲酰基)-5-羟基哌啶-1-羧酸叔丁酯、顺式-2-(1-叔丁氧基氨基甲酰基哌啶-4-基氨基甲酰基)-5-羟基哌啶-1-羧酸苄酯、顺式-2-(1-苄氧基氨基甲酰基哌啶-4-基氨基甲酰基)-5-羟基哌啶-1-羧酸叔丁酯等羧酸酰胺；等等。

在本发明的方法的一个方式中，使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应，从而使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的氨基受到保护，进而进行内酯化，由此转换为式(1)的化合物。

作为酰卤化物和/或酸酐，只要是能够保护氨基、进而能够内酯化的物质就没有特别限定。作为酰卤化物，可以举出酰氯、酰溴等，从操作容易性的方面出发，优选酰氯。作为酸酐，可以举出羧酸酐、磺酸酐等，从获得容易性、价格低的方面出发，优选羧酸酐。

作为酰卤化物和/或酸酐，具体例可以举出甲酸-乙酸酐、乙酸酐、乙酰氯、氯乙酰氯、二氯乙酰氯、三氯乙酰氯、三氟乙酸酐、丙酰氯、苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、乙酰溴、丙酰溴、苯甲酰溴等酰基化剂；二碳酸二叔丁酯、苯甲氧基碳酰氯、烯丙氧基碳酰氯、苯甲氧基碳酰溴、烯丙氧基碳酰溴等烷氧羰基化剂；甲烷磺酰氯、对甲苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、甲烷磺酰溴、对甲苯磺酰溴、2-硝基苯磺酰溴等磺酰基化剂等。

这些之中，优选为酰基化剂、烷氧羰基化剂，更优选为在进行了氨基的保护后能够容易去除的乙酸酐、氯乙酰氯、三氯乙酰氯、三氟乙酸酐、二碳酸二叔丁酯、苯甲氧基碳酰氯、烯丙氧基碳酰氯，进一步优选为工业上成本低的乙酸酐、二碳酸二叔丁酯、苯甲氧基碳酰氯。特别优选为苯甲氧基碳酰氯，其可以通过氢化去除，不残留不挥发性成分，因而可以减轻顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化负荷。

本发明中，可以使用两种以上的酰卤化物和/或酸酐。在使用两种以上的酰卤化物和/或酸酐时，也可以同时添加到反应体系中，在氨基的保护和内酯化的工序中优选分别使用不同的酰卤化物和/或酸酐。例如，优选进行下述方法：在氨基的保护中使用苯甲氧基碳酰氯，在内酯化中使用乙酸酐，等等。在同一反应器中进行氨基的保护和内酯化的情况下，可以抑制保护基不同的副产物，因而优选使用单一的酰卤化物和/或酸酐。另一方面，在不同的反应器中进行氨基的保护和内酯化的情况下，从反应的最佳化和成本削减的方面出发，优选使用两种以上的酰卤化物和/或酸酐。这些之中，由于能够减少制造所需要的反应器的数量，有利于成本削减，因而优选在同一反应器中进行氨基的保护和内酯化。

相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和需要进行保护的胺化合物的总量，所使用的酰卤化物和/或酸酐的量通常为1倍摩尔～10倍摩尔、优选为1.2倍摩尔～5倍摩尔、进一步优选为1.5倍摩尔～3倍摩尔。需要说明的是，酰卤化物和/或酸酐也可以分成多次来添加。

在与酰卤化物和/或酸酐的反应时，根据需要可以使用碱。下面举出所使用的碱的具体例，但并不限定于这些。例如，可以举出三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、奎宁环、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷等叔胺；吡啶、4-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶等吡啶类；1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、四甲基胍等有机强碱；二异丙胺锂、六甲基二硅氮钠等金属酰胺；正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂、异丙基溴化镁等烷基金属；氢化钠、氢化钙等金属氢化物；甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等金属醇盐；碳酸氢钠、碳酸钾等碳酸盐；磷酸钾、磷酸氢钠等磷酸盐；氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙等氢氧化物；***、***等氰化物等。

优选的碱根据所使用的保护试剂而不同，在使用作为优选的保护试剂的乙酸酐、二碳酸二叔丁酯、苯甲氧基碳酰氯的情况下，优选为叔胺、吡啶类、碳酸盐、氢氧化物，在使用特别优选的保护试剂苯甲氧基碳酰氯的情况下，特别优选低成本的氢氧化物。

在使用碱的情况下，优选加入反应液的pH达到7～12的量的碱。此处，关于反应液的pH，在将水用作溶剂的情况下，为包含水的层的pH；在使用水以外的溶剂的情况下，为加入与反应液相同体积的水时的包含水的层的pH。在将水用作溶剂的情况下，若反应液的碱性过强，则式(1)的化合物会受到水解，因而pH更优选为7～12、特别优选为7～11。

作为反应溶剂，可以使用水；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类；甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-乙基-1-己醇、2-丁醇等醇类；二***、二正丁醚、二异丙醚、二正丁醚、叔丁基甲醚、四氢呋喃、二氧六环等醚类；丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；二甲基亚砜、环丁砜等砜类；己烷、庚烷、甲苯等烃类；和它们的混合溶剂等。这些之中，优选水、或水与上述溶剂的混合溶剂。特别是，在顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸是通过细菌反应和/或酶反应合成的情况下，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸以水为主要溶剂的溶液的形式获得，因此将溶液直接、或者部分浓缩而以水作为主要溶剂进行反应时可以简化制造工艺，因而是优选的。

反应温度通常为-20℃～100℃、优选为-10℃～50℃。由于高温下的反应有可能引起试剂或产物的分解，因而，进一步优选为0℃～30℃。

需要说明的是，氨基的保护和内酯化优选通过加入酰卤化物和/或酸酐来进行(图1的路线1)。特别是，利用单一的酰卤化物和/或酸酐在同一反应器中进行氨基的保护和内酯化时，可以简化操作，因而是优选的(图1的路线1的上式)。

另外，也可以在不同的反应条件下进行氨基的保护和内酯化(图1的路线2)。即，可以加入酰卤化物和/或酸酐对氨基进行保护，其后，利用酸催化剂使其内酯化。在不同的反应条件下进行氨基的保护和内酯化时，优选在氨基的保护的阶段抑制式(1)的化合物的生成。按照使酰卤化物和/或酸酐的用量相对于氨基为1倍摩尔、或者按照酰卤化物和/或酸酐相对于氨基不过量存在的方式分成多次添加，在作为原料的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸基本上消失后停止反应，从而可以有效地仅进行氨基的保护。另外，在包含水的溶剂中进行氨基的保护时，通过使反应液的pH为强碱性、升温至室温以上、长时间反应等方法或者将这些方法进行组合，即使因内酯化而生成式(1)的化合物，其也被水解，因而可以得到氨基的保护体。接下来，使氨基受到保护的化合物与酸催化剂反应，得到式(1)的化合物。

所生成的式(1)的化合物可以通过后述的析晶等方法进行分离。

在本发明的方法的其他方式中，使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与酰卤化物和/或酸酐反应后，在酸催化剂存在下与醇反应，转换为式(2)的化合物(图1的路线3)。通过在酸催化剂存在下与醇反应，通过与酰卤化物和/或酸酐的反应而生成的式(1)的化合物转换为式(2)的化合物。此时，在含有式(1)的化合物以外的具有羧基的杂质、特别是后述的2-哌啶羧酸类的情况下，该化合物不会如式(1)的化合物那样被转换为内酯，因此可以将来自顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的化合物选择性地转换为作为酯的式(2)的化合物，可以使这以外的化合物以羧酸的状态残留于反应体系中。并且，通过用碱性水溶液进行提取，可以使式(2)的化合物分离到有机层中，使这以外的杂质分离到水层中。

作为此处所使用的醇，只要是C1～C6的醇就没有特别限定，可以举出甲醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇等伯醇；2-丙醇、2-丁醇、环戊醇、环己醇等仲醇；叔丁醇等叔醇等。这些之中，优选为仲醇，更优选成本低且沸点低、容易去除的2-丙醇。在使用伯醇的情况下，会存在在酸催化剂的存在下由羧酸直接转换为酯的副反应，因此杂质去除的效果有可能降低。另外，在使用叔醇的情况下，由于与式(1)的化合物的反应性低，因而作为仲醇的式(2)的化合物与式(1)的化合物反应而部分二聚化，式(2)的化合物的收率有可能会降低。因此，本发明中优选使用仲醇。

需要说明的是，在酸催化剂与水的存在下，可以添加上述醇的酯，通过该酯的水解反应而使醇存在于反应体系中，在酸催化剂存在下，可以使顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸与醇反应。

所加入的醇或生成醇的酯可以过量使用，其用量相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸通常为1倍摩尔～500倍摩尔。若用量少，则发生式(2)的化合物与式(1)的化合物反应而二聚化的副反应；另一方面，若用量多，则可减弱酸催化剂的效果，因而优选2倍摩尔～100倍摩尔、更优选3倍摩尔～50倍摩尔、特别优选5倍摩尔～20倍摩尔。

作为酸催化剂，可以举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、多磷酸等无机酸；对甲苯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸等磺酸类；乙酸、甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸、苯甲酸、草酸等羧酸类等。这些之中，优选为对有机溶剂的溶解度高、在使反应进行方面具有足够强的酸性度的磺酸类，更优选为工业上成本低的对甲苯磺酸、甲磺酸。

所加入的酸催化剂的量相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸通常为0.001倍摩尔～10倍摩尔。若过少则反应缓慢，若过多则后处理的负荷增大，因而优选0.01倍摩尔～5倍摩尔、更优选0.02倍摩尔～1倍摩尔、特别优选0.05倍摩尔～0.5倍摩尔。

作为反应溶剂，可以使用甲酸、乙酸等有机酸类；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类；甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-乙基-1-己醇、2-丁醇等醇类；二***、二正丁醚、二异丙醚、二正丁醚、叔丁基甲醚、四氢呋喃、二氧六环等醚类；丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；二甲基亚砜、环丁砜等砜类；己烷、庚烷、甲苯等烃类；和它们的混合溶剂等。这些之中，质子不发生配位的溶剂不会减弱酸催化剂的活性，因而优选，具体来说，优选烃类。另外，还优选其自身为酸的有机酸类、通过水解而生成酸的酯类。进一步优选成本低且可得到高反应速度、酸催化剂的溶解度也高的甲苯。

反应温度通常为0℃～150℃、优选为20℃～120℃。虽然高温下的反应会引起副反应，但低温时反应缓慢而需要长时间，因此进一步优选为40℃～80℃。

所生成的式(2)的化合物可以通过利用后述的有机溶剂的提取法等方法进行分离。

对于上述式(1)和(2)的化合物，通过用碱进行处理，可以转换为顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸。

作为此处使用的碱，可以举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙等氢氧化物；磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙等磷酸盐；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸钙等碳酸盐；碳酸氢钠、碳酸氢钾等碳酸氢盐等，优选为氢氧化物。

所使用的碱的量相对于上述式(1)和(2)的化合物的总量通常为0.1倍摩尔～10倍摩尔、优选为0.5倍摩尔～5倍摩尔、进一步优选为0.9倍摩尔～3倍摩尔。

另外，通过对顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸进行氨基的脱保护，可以制造顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸(顺式-5-羟基-2-哌啶酸)。特别是，在上述式(1)和(2)的化合物中R¹为苄氧基羰基的情况下，通过氢化反应可以进行氨基的脱保护。氢化反应例如可以通过使用钯碳催化剂来进行。通过以上的反应，可再生顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

本发明的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法是由含有杂质的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸中纯化出纯度高的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的方法。

作为杂质，可以举出2-哌啶羧酸类、氨基酸类、肽类、糖类、脂肪酸类等。这些之中，2-哌啶羧酸类、氨基酸类和肽类具有氨基和羧基，因此，在离子交换树脂纯化等通常的纯化方法中难以与目标顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸分离。特别是，2-哌啶羧酸类具有与顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸共通的骨架，因此其分离非常困难，其去除方法的确立非常重要。

作为2-哌啶羧酸类，可以举出顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的异构体、2-哌啶羧酸与其类似物。作为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的异构体，可以举出包含反式体的空间异构体、羟基的位置等不同的结构异构体等。需要说明的是，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的光学异构体不包括在本发明的杂质中。

作为反式体，可以举出反式-5-羟基-2-哌啶羧酸、即(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸、(2R,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸以及它们的混合物。作为结构异构体，可以举出顺式-2-羟基-2-哌啶羧酸、反式-2-羟基-2-哌啶羧酸、顺式-3-羟基-2-哌啶羧酸、反式-3-羟基-2-哌啶羧酸、反式-4-羟基-2-哌啶羧酸等。需要说明的是，顺式-4-羟基-2-哌啶羧酸不包括在本发明的杂质中。

作为2-哌啶羧酸与其类似物，可以举出2-哌啶羧酸、1,2,3,4-四氢-2-吡啶羧酸等。

作为氨基酸类，可以举出脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等必须氨基酸；3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸等非天然氨基酸等。

作为肽类，可以举出二肽、低聚肽、蛋白质等。

作为糖类，可以举出葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙等。

作为脂肪酸类，可以举出碳原子数为2～4个的低级脂肪酸、碳原子数为5～12个的中链脂肪酸、碳原子数为13个以上的长链脂肪酸、甘油酯类等。

使包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物与酰卤化物和/或酸酐反应、或者与酰卤化物和/或酸酐以及醇反应，将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)的化合物。接下来，利用析晶或溶剂提取等分离该化合物，之后利用碱对其进行处理，从而转换为顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸，进而进行氨基的脱保护，由此可以得到杂质被分离出的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

即，可以利用顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸被特异性内酯化的性质与杂质分离。另外，在混合物中含有上述以外的杂质时，也可以与这些杂质分离。

本说明书中，所谓析晶，除了通过向溶液中添加不良溶剂、酸、碱等或者将水等良溶剂共沸去除而降低目标物的溶解度、以结晶形式取出的通常的析晶外，还包括将暂时得到的粗结晶等溶解于适当的溶剂中后再次使其结晶化的重结晶。另外，也可以在溶液中添加晶种，从而促进结晶化。

在式(1)的化合物的析晶中，优选由与酰卤化物和/或酸酐反应而得到的式(1)的化合物的粗产物进行析晶。认为其原因是，由酰卤化物和/或酸酐生成的酸性成分、或来自其他试剂的成分微量残存，会诱发结晶化。

作为析晶处理中的析晶溶剂，可以使用水；乙酸、丙酸等有机酸；乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯等酯类；甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-乙基-1-己醇、2-丁醇等醇类；二***、二正丁醚、二异丙醚、甲基-叔丁醚、二正丁醚、四氢呋喃、二氧六环等醚类；丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮等酮类；乙腈等腈类；己烷、庚烷等脂肪族烃类；甲苯、二甲苯等芳香族烃类；和它们的混合溶剂等，这些之中，优选对于式(1)和/或式(2)的化合物的溶解度足够低的醇类、脂肪族烃类、芳香族烃类、和它们的混合溶剂，更优选脂肪族烃类、芳香族烃类、和它们的混合溶剂，特别优选己烷、庚烷、甲苯、和它们的混合溶剂。

作为用于提取的有机溶剂，可以举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯等酯类；二***、甲基-叔丁醚、二正丁醚、二异丙醚、二正丁醚、叔丁基甲醚、四氢呋喃等醚类；己烷、庚烷等脂肪族烃类；甲苯、二甲苯等芳香族烃类等非水溶性溶剂。

上述方法尤其在由顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物中纯化顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸时特别有效。

即，在本发明的纯化方法的一个方式(图1的路线1或2)中，使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物与酰卤化物和/或酸酐反应，将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)的化合物。利用析晶或有机溶剂提取对其进行分离，并用碱对该化合物进行处理，从而转换为顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸，进而进行氨基的脱保护，由此可以得到与反式体分离开的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

该情况下，优选使用相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的总量超过1倍摩尔的过量的酰卤化物和/或酸酐。酰卤化物和/或酸酐的量通常为1倍摩尔～10倍摩尔、优选为1.2倍摩尔～5倍摩尔、进一步优选为1.5倍摩尔～3倍摩尔。需要说明的是，在使用酰卤化物与酸酐这两者的情况下，总量相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的总量超过1倍摩尔。

通过与酰卤化物和/或酸酐反应，顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸被转换为式(1)的化合物。另一方面，反式-5-羟基-2-哌啶羧酸未被转换而残存于反应体系中，或者被转换为下述所示的反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合酸酐。该混合酸酐也可以通过后处理恢复为反式-5-羟基-2-哌啶羧酸。由此，可以通过析晶反应将它们分离。

在本发明的纯化方法的其他方式(图1的路线3)中，使顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物与酰卤化物和/或酸酐反应，对氨基进行保护后，使生成的顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸在酸催化剂的存在下与醇(或生成醇的酯)反应，由此经由式(1)的化合物而转换为(2)的化合物。通过利用有机溶剂提取对其进行分离，并用碱对该化合物进行处理，转换为顺式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸，进一步进行氨基的脱保护，由此可以得到与反式体分离开的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

该情况下，优选使用相对于顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的总量为1倍摩尔程度的酰卤化物和/或酸酐。

与酰卤化物和/或酸酐反应而对氨基进行保护后，在酸催化剂的存在下与醇(或生成醇的酯)反应，由此顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸被转换为式(2)的化合物，但反式-5-羟基-2-哌啶羧酸被转换为下述的反式-N-保护-5-羟基-2-哌啶羧酸。因此可以利用有机溶剂提取将它们分离。

需要说明的是，上述“含有杂质的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸”、“顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物”也可以是通过细菌反应和/或酶反应合成的。例如，可以通过日本专利第4590981号的实施例29中记载的方法得到“顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物”。另外，上述“含有杂质的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸”、“顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物”也可以是利用本发明的方法分离顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物后的回收物。

在利用本发明的方法由通过细菌反应和/或酶反应合成的“含有杂质的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸”、“顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸与反式-5-羟基-2-哌啶羧酸的混合物”中纯化顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的情况下，对于所得到的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸，优选进一步进行使用活性炭的吸附纯化和/或使用包含水的溶剂的析晶，将着色物质等杂质除去，从而进一步提高顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯度。

作为活性炭，可以使用煤炭系、木质系、椰壳系、树脂系等任意公知的活性炭。另外，可以使用通过气体活化法、水蒸气活化法、氯化锌或磷酸等化学药品活化法等方法对这些煤炭系、木质系、椰壳系、树脂系等各种原料活性炭进行了活化的活性炭。

具体来说，可以举出三菱化学卡尔冈株式会社制造的Calgon CPG、Calgon CAL、Calgon SGL、DIASORB W、DIAHOPE MS10、DIAHOPE M010、DIAHOPE MS16、DIAHOPE 6MD、DIAHOPE 6MW、DIAHOPE 8ED、DIAHOPE ZGN4、CENTUR、日本NORIT株式会社制造的GAC、GACPLUS、GCN PLUS、C GRAN、RO、ROX、DARCO、CN、SX、SX PLUS、SA、SX、PK、W、KURARAY化学株式会社制造的GW、GWH、GLC、4GC、KW、PW、PK、株式会社TSURUMICOAL社制造的HC-30S、GL-30S、4G-3S、PS、PC、二村化学株式会社制造的P、W、CW、SG、SGP、S、GB、CA、K、日本EnviroChemicals株式会社制造的SHIRASAGI KL、SHIRASAGI W2C、SHIRASAGI WH2C、SHIRASAGI W5C、SHIRASAGIWH5C、SHIRASAGI WH5X、SHIRASAGI XS7100H-3、CARBORAFFIN、SHIRASAGI A、SHIRASAGI C、SHIRASAGI M、AJINOMOTO FINE TECHNO株式会社制造的HOKUETSU CL-K、HOKUETSU HS、HOKUETSU KS等。

通过该操作，可以去除在波长400nm～800nm的范围具有吸收的杂质。

另外，作为用于析晶的包含水的溶剂，可以使用水溶性的有机溶剂。具体来说，可以举出乙酸、丙酸等有机酸类；乙酸乙酯等酯类；甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇等醇类；四氢呋喃、二氧六环等醚类；丙酮、甲基乙基酮、二乙基酮等酮类；乙腈等腈类；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类；二甲基亚砜、环丁砜等砜类；和它们的混合溶剂，还优选利用该溶剂进行顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的析晶，进一步提高顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯度。这些之中，优选为水溶性更高的有机酸类、醇类、酮类，更优选为醇类、酮类，特别优选为乙醇、丙酮。

[实施例]

下面，举出实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限制于这些实施例。

关于本实施例中的定量分析，使用HPLC(高效液相色谱)在以下的条件下进行测定。

<HPLC-1>

柱：SUPELCO制造Astec CLC-D(4.6mm×150mm、5μm)

流动相：2mmol/L硫酸铜水溶液

流速：1.0mL/分钟

柱温：45℃

检测波长：UV254nm

<HPLC-2>

柱：化学物质评价研究机构制造L-column(4.6mm×250mm、5μm)

流动相：

A：0.1重量％三氟乙酸水溶液

B：甲醇

梯度(B浓度)：0分钟20％→2分钟20％→10分钟80％→20分钟80％

流速：1.0mL/分钟

柱温：40℃

检测波长：UV200nm

<HPLC-3>

柱：Agilent社制造ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6mm×150mm、1.8μm)

流动相：

A：0.1重量％磷酸水溶液

B：乙腈

梯度(B浓度)：0分钟55％→6分钟55％→9分钟80％→12分钟80％

流速：1.0mL/分钟

柱温：40℃

检测波长：UV210nm

<HPLC-4>

柱：Nacalai Tesque社制造COSMOSIL 5C₁₈-AR-II(4.6mm×150mm)

流动相：50mmol/L磷酸缓冲液(pH2.7)

流速：1.0mL/分钟

柱温：40℃

检测波长：UV340nm

<HPLC-5>

柱：住化分析中心社制造SUMICHIRAL OA-6100(4.6mm×250mm)

流动相：1mmol/L硫酸铜

流速：1.0mL/分钟

柱温：30℃

检测波长：UV254nm

<HPLC-6>

柱：SUPELCO社制造CLC-D(4.6mm×150mm)

流动相：2mmol/L硫酸铜

流速：1.0mL/分钟

柱温：30℃

检测波长：UV254nm

[参考例1]

[共表达N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(下文中称为DpkA)、L-氨基酸氧化酶(下文中称为AIP)、葡萄糖-1-脱氢酶(下文中称为GDH)以及氨基酸消旋酶(下文中称为KR)的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的制备例]

(1)基因的克隆

基于编码恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的DpkA(基因库登录号BAD89743、序列号2)的基因序列(下文中称为dpkA、序列号1)，设计、合成了用于扩增dpkA基因的全长的引物dpkA_F(序列号9)和dpkA_R(序列号10)。以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的染色体DNA为模板，根据常规方法进行PCR，得到约1.0kbp的DNA片段。

设计并人工合成了编码蛋白质AIP(序列号4)的基因序列(下文中称为aip、序列号3)，该蛋白质AIP是从日本鲭(Scomber japonicus)来源的L-氨基酸氧化酶(基因库登录号CAC00499)除去信号肽而得到的序列的蛋白质AIP。进而设计、合成了用于扩增aip基因的全长的引物aip_F(序列号11)和aip_R(序列号12)。根据常规方法进行PCR，得到约1.5kbp的DNA片段。

基于编码在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的GDH(基因库登录号NP_388275)中将96位的氨基酸残基谷氨酸取代为丙氨酸的蛋白质(序列号6)的基因序列(下文中称为gdh、序列号5)，设计、合成了用于扩增gdh的基因的全长的引物gdh_F(序列号13)和gdh_R(序列号14)。根据常规方法进行PCR，得到约0.8kbp的DNA片段。

基于编码恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的KR(基因库登录号NP_745855、序列号8)的基因序列(下文中称为kr、序列号7)，设计、合成了用于扩增kr基因的全长的引物kr_F(序列号15)和kr_R(序列号16)。以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的染色体DNA为模板，根据常规方法进行PCR，得到约1.2kbp的DNA片段。

(2)表达用质粒的制备

分别利用限制酶EcoRI和XbaI对上述(1)中得到的DNA片段进行消化，在利用MunI和XbaI进行了消化的国际公开公报WO2012/029819号中记载的质粒pKW32中，利用Ligation-Convenience Kit(Nippon Gene社制造)导入至trc启动子的下游，分别得到pKW32dpkA、pKW32aip、pKW32gdh、pKW32kr。

接下来，利用SpeI和NdeI消化pKW32aip，将包含aip的约2.4kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32dpkA所得到的开环质粒约4.2kbp的dpkA的下游，得到pKW32(dpkA,aip)。

此外，利用SpeI和NdeI消化pKW32gdh，将包含gdh的约1.7kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32(dpkA、aip)所得到的开环质粒约5.7kbp的aip的下游，得到pKW32(dpkA,aip,gdh)。

最后，利用SpeI和NdeI消化pKW32kr，将包含kr的约2.1kbp的DNA片段导入至利用XbaI和NdeI消化pKW32(dpkA,aip,gdh)所得到的开环质粒约6.5kbp的gdh的下游，得到pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)。

(3)表达株的制备

利用上述(2)中得到的质粒pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)，根据常规方法转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(宝生物株式会社制造)，得到重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)。

[参考例2]

[5-羟基-2-哌啶羧酸反应液的制备例]

在1L发酵罐(ABLE社制造、型号BMJ)中投入5-羟基赖氨酸盐酸盐45g(230mmol、根据Bull.Chem.Soc.Jpn.,1962,35,2006中记载的方法制备)、ADEKANOL LG-1092.27mL、葡萄糖67.34g(374mmol)，用水溶解后，滴加20重量％氢氧化钠水溶液，使pH为8。向该溶液中添加牛肝脏来源的过氧化氢酶(和光纯药社制造)2,000U/L、NADP⁺(Oriental Yeast社制造)0.2mmol/L、参考例1中制备的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的湿菌体25g/L，加入水使溶液量为566mL，在30℃、搅拌数500rpm、通气量约1L/min的条件下反应43小时。反应中滴加20重量％氢氧化钠水溶液，将pH保持为8。进一步实施两次完全相同的操作，将所得到的共计3次(5-羟基赖氨酸盐酸盐135g、690mmol)的反应液混合，向所得到的反应液中滴加浓度6mol/L的硫酸，使pH为2.5。其后，滴加20重量％氢氧化钠水溶液，使pH为4，将该反应液以10,000rpm离心分离20分钟，去除不溶性杂质。进一步，使所得到的上清通过微滤膜(旭化成社制造)，接着通过超滤膜(旭化成社制造)，去除杂质。在<HPLC-1>的条件下对所得到的溶液中含有的5-羟基-2-哌啶羧酸进行了HPLC分析，结果(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的产率为43.9g(302mmol、收率44％)，(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸的产率为29.7g(205mmol、收率30％)。

实施例1

<1-1>(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的制造

向根据参考例2的方法得到的含有(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸20.7g(143mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸18.0g(124mmol)的反应液1153g[(2S,5S)：(2S,5R)＝53.6：46.4(摩尔比)]中添加10mol/L氢氧化钠水溶液(60mL)，将pH由3.65调整为10.81。在减压下进行浓缩，得到422.4g的浆料溶液。将所得到的浆料分别分成211.2g，投入2个烧瓶中，分别将内温冷却至5℃～7℃，对各个烧瓶实施以下的操作。

[下面，对一个烧瓶中的操作进行记载。一个烧瓶中含有(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸10.4g(72mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸9.0g(62mmol)]。

向烧瓶中滴加苯甲氧基碳酰氯18.8mL(133mmol)后，添加10mol/L氢氧化钠水溶液13.3mL(133mmol)，将pH调整为9～10左右，在10℃～20℃的范围内反应10分钟。进而滴加苯甲氧基碳酰氯18.8mL(133mmol)后，添加10mol/L氢氧化钠水溶液13.5mL(135mmol)，调整为pH9～11，在10℃～20℃的范围内反应3小时。添加水19mL后，进而滴加苯甲氧基碳酰氯6.2mL(44mmol)，之后慢慢地升温至室温。添加甲苯200mL，添加10mol/L氢氧化钠水溶液4mL(40mmol)调整为pH11，之后分离有机层。向水层中添加甲苯100mL进行再提取，分离出水层而得到有机层。与之前得到的有机层合并后，用水10mL进行清洗，分离有机层。对于由两个烧瓶分别得到的有机层，在减压下于35℃蒸馏除去溶剂，得到黄色油状物质64.9g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯45重量％(111mmol、相对于(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为78％)、(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸＝苄氧基甲酸＝酸酐15重量％(23mmol、相对于(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为19％)、苯甲醇36重量％、甲苯5重量％的混合物。这样，在原料5-羟基-2-哌啶羧酸中，(2S,5S)：(2S：5R)＝53.6：46.4(摩尔比)，但通过向(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯转换，可以有效地去除具有(2S,5R)的立体化学的化合物，可以将具有(2S,5S)的立体化学的化合物的纯度提高至(2S,5S)：(2S：5R)＝82.8：17.2(摩尔比)。

将该粗产物冷却至10℃～15℃，添加甲苯36mL和己烷36mL，结果析出了白色固体。对所析出的白色固体进行过滤，撒上己烷100mL进行清洗，之后将所得到的白色固体在室温下减压干燥，得到20.7g的白色固体。

¹H-NMR分析的结果，确认到该白色固体是含有(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯92.5重量％(相对于(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为51％)、(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸＝苄氧基甲酸＝酸酐7.5重量％的混合物。析晶的结果，可以将具有(2S,5S)的立体化学的化合物的纯度提高至(2S,5S)：(2S：5R)＝92.5：7.5(摩尔比)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)

δ1.77-1.85(1H,m),2.02-2.25(3H,m),3.52(1H,d,J＝11.9Hz),3.70(1H,dt,J＝12.2,3.3Hz),4.70-4.86(2H,m),5.12-5.21(2H,m),7.32-7.40(5H,m).

<1-1’>(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的制造

向根据参考例2的方法得到的含有(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸1.74g(12.0mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸1.01g(7.0mmol)的反应液80g[(2S,5S)：(2S,5R)＝63.2：36.8(摩尔比)]中添加10mol/L氢氧化钠水溶液，将pH由3.65调整为9.8。在减压下进行浓缩，得到38g的溶液。向该溶液中添加2-丙醇3.1mL。将所得到的溶液的内温设定为25℃附近。滴加苯甲氧基碳酰氯3.2g(18.8mmol)后，添加40重量％氢氧化钠水溶液2.3g(22.6mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。进而滴加苯甲氧基碳酰氯3.2g(18.8mmol)，之后添加40重量％氢氧化钠水溶液2.3g(22.6mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。其后，重复3次下述操作：滴加苯甲氧基碳酰氯1.6g(9.4mmol)，之后滴加40重量％氢氧化钠水溶液1.1g(11.3mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。其后，将反应液冷却至0℃～5℃，过滤体系内生成的结晶。对于所得到的结晶，在40℃～45℃进行减压干燥，得到2g的白色结晶。

¹H-NMR分析的结果，所得到的结晶为(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯(80重量％、相对于(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为56％)。

<1-1”>(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的制造

向根据参考例2的方法得到的含有(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸3.26g(22.5mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸2.24g(15.4mmol)的反应液160g[(2S,5S)：(2S,5R)＝59.4：40.6(摩尔比)]中添加10mol/L氢氧化钠水溶液，将pH由3.65调整为9.5。在减压下进行浓缩，得到74g的溶液。向该溶液中添加2-丙醇6.0mL。将所得到的溶液的内温设定为25℃附近。滴加苯甲氧基碳酰氯6.4g(37.6mmol)后，添加40重量％氢氧化钠水溶液4.5g(45.2mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。滴加苯甲氧基碳酰氯6.4g(37.6mmol)后，添加40重量％氢氧化钠水溶液4.5g(45.2mmol)，在20℃～25℃的范围内进而反应30分钟。其后，滴加苯甲氧基碳酰氯3.2g(18.8mmol)，之后滴加40重量％氢氧化钠水溶液2.3g(22.6mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。其后，滴加苯甲氧基碳酰氯1.9g(11.1mmol)，之后滴加40重量％氢氧化钠水溶液1.4g(14.0mmol)，在20℃～25℃的范围内反应30分钟。向该反应液中添加71mL的甲苯后，实施分液操作。向所提取的有机层中添加13mL的水和40重量％氢氧化钠水溶液6.2g后，进一步实施分液操作。将所得到的水层32g分为两半，进行纯化法A和B。

纯化法A：添加乙酸酐

向<1-1”>中得到的水层16g中添加9.1g(89mmol)的乙酸酐。对所得到的结晶进行过滤，在40℃～45℃进行减压干燥。干燥后的结晶的外观为白色，重量为1.5g。

在<HPLC-3>的条件下对所得到的结晶进行HPLC分析，结果所得到的结晶为(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯(100重量％、相对于(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为50％)。

纯化法B：使其为酸性并进行提取

向<1-1”>中得到的水层16g中添加30mL的水，加入5mol/L盐酸，使体系内的pH为1.07。其后，添加乙酸乙酯55mL，实施分液操作。分液后，向所得到的水层中添加55mL的乙酸乙酯，再次实施分液操作。将所得到的有机层合并，在减压下进行浓缩，直至重量达到一半。在20℃～25℃向所得到的有机层中添加三乙胺2.9g(28.1mmol)和乙酸酐2.9g(28.1mmol)。搅拌30分钟后，在20℃～25℃追加三乙胺0.57g(5.6mmol)和乙酸酐0.57g(5.6mmol)。搅拌30分钟后，将饱和碳酸氢钠水溶液20g添加至反应液中。分液后，向所得到的水层中添加甲苯71mL，再次进行提取操作。

将所得到的有机层合并，在减压下进行浓缩。将所得到的浓缩液冷却至0℃～5℃时，结晶析出。对所得到的结晶进行过滤，在40℃～45℃进行减压干燥。干燥后的结晶为白色，重量为2.4g。在<HPLC-3>的条件下对所得到的结晶进行HPLC分析，结果所得到的结晶为(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯(98重量％、相对于(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸，收率为70％)。

<1-2>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入<1-1>中得到的(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯20.0g(92.5重量％、71mmol)、乙醇60mL，在室温添加1mol/L氢氧化钠水溶液76.5mL，搅拌1小时。在减压下于35℃～40℃蒸馏除去溶剂，得到黄色油状物质61.2g。向其中添加乙酸乙酯100mL，分离出有机层。向所得到的水层中添加5mol/L盐酸14mL，调整为pH1.2。使用乙酸乙酯200mL对水层进行2次提取，用水2mL对所得到的有机层进行清洗。分离有机层后，在减压下于35℃～40℃蒸馏除去溶剂，得到浅黄色油状物质24.0g。

¹H-NMR分析的结果，确认到该浅黄色油状物质为(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸(纯度76重量％、65mmol、收率92％)。需要说明的是，¹H-NMR中完全未观测到(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的峰。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,旋转异构体混合物)

δ1.27-1.39(1H,m),1.70-1.85(1H,m),1.98-2.06(1H,m),2.27-2.39(1H,m),2.80(0.4H,t,J＝11.8Hz),2.87(0.6H,t,J＝11.6Hz),3.61-3.72(1H,m)4.18-4.33(1H,m),4.81-4.88(0.4H,m),4.93-4.98(0.6H,m),5.12-5.21(2H,m),7.28-7.40(5H,m).

<1-3>(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入<1-2>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸18.0g(64.5mmol)、乙醇90mL、10％钯碳2.5g(N.E.CHEMCAT CORPORATION制造、PE型、55.3％含水物)，在常温、常压的条件下进行氢化。3小时后，添加水22mL，在常温、常压的条件下进行氢化，8.5小时后确认到原料的消失。通过过滤去除钯碳，撒上水100mL进行清洗。对于所得到的滤液，在减压下于45℃～55℃蒸馏除去溶剂，得到11.6g的白色浆料。

在<HPLC-1>的条件下对所得到的浆料进行HPLC分析，结果浆料中含有的5-羟基-2-哌啶羧酸的纯度为65重量％、为64.5mmol、收率为81％。异构体比为(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸：(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸＝98.8：1.2。<1-1>中使用的原料的纯度低，为(2S,5S)：(2S,5R)＝53.7：46.3(摩尔比)，但通过本发明的方法，被纯化至(2S,5S)：(2S,5R)＝98.8：1.2(摩尔比)。

<1-4>活性炭处理、结晶化

向烧瓶中加入<1-3>中得到的浆料0.38g(纯度65重量％、1.7mmol)、水2.5mL、三菱卡尔冈社制造的活性炭CAL 0.025g、三菱卡尔冈社制造的活性炭6ED 0.025g，在室温搅拌1小时后，通过过滤除去活性炭，将水溶液浓缩至0.5mL。一边搅拌浓缩液，一边滴加乙醇5.0mL，冷却至5℃。结晶慢慢地析出。一边保持5℃一边继续搅拌1小时，在5℃滴加丙酮2.0mL，进而搅拌0.5小时。其后，对所析出的结晶进行过滤，向结晶撒上冰冷的乙醇/丙酮溶液(＝5/2容量比)1.0mL，进行清洗。在60℃对结晶进行减压干燥，得到0.25g(纯度98重量％、收率99.2％)的结晶。

在<HPLC-1>的条件下对所得到的结晶进行HPLC分析，结果所得到的结晶中含有的5-羟基-2-哌啶羧酸的异构体比为(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸：(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸＝99.5：0.5。

实施例2

<2-1>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向根据参考例2的方法得到的含有(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸0.723g(4.98mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸0.830g(5.72mmol)的反应液124mL[(2S,5S)：(2S,5R)＝46.5：53.5(摩尔比)]中添加50重量％氢氧化钠水溶液2.88mL(36mmol)后，在浴温40℃、50hPa条件下在减压下进行浓缩，得到132g的溶液。在水浴下，分次向所得到的溶液中添加苯甲氧基碳酰氯3.1mL(22mmol)和50重量％氢氧化钠水溶液0.44mL(5.5mmol)，调整为pH9左右。放置一晩后，添加乙酸乙酯60mL、50重量％氢氧化钠水溶液0.88mL(11mmol)，之后，进行硅藻土过滤。分离有机层，用乙酸乙酯清洗水层。向水层中添加浓盐酸2.9mL(33mmol)，调整为pH3后，用乙酸乙酯提取3次。对于所得到的有机层，在减压下于35℃蒸馏除去溶剂，得到黄色油状物质2.44g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸80重量％(6.91mmol、收率65％、(2S,5S)：(2S,5R)＝4：6(摩尔比))、乙酸乙酯12重量％、乙酸8重量％的混合物。

<2-2>(2S,5S)-3-氧代-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的制造

向烧瓶中添加<2-1>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸2.35g[6.72mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝4：6(摩尔比)]、甲苯10mL、对甲苯磺酸一水合物116mg(0.67mmol)，在60℃反应2小时。冷却至室温后，添加乙酸乙酯30mL、水5mL、1mol/L氢氧化钠溶液7mL，结果水层的pH为9。分离水层后，用乙酸乙酯再提取，将所得到的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水进行清洗。对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.44g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(2S,5S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯75重量％(1.27mmol、收率19％)、乙酸乙酯17重量％、甲苯9重量％的混合物。

在原料N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸中为(2S,5S)：(2S,5R)＝4：6(摩尔比)，但通过向(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯转换，可以有效去除具有(2S,5R)的立体化学的化合物。

但是，(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的收率为19％，因而(2S,5S)体的收率为约50％，为中等程度。确认到反应中生成的(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯与未反应而残存于体系内的(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸反应，发生酯化的副反应，因此认为收率为中等程度。

<2-3>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中添加<2-2>中得到的(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯0.44g(纯度75重量％、1.27mmol)、甲醇2.6mL、1mol/L氢氧化钠水溶液2.6mL，放置一晩。向反应液中添加2mol/L盐酸1.3mL，调整到pH4后，用乙酸乙酯进行提取。对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.33g。用硅胶柱色谱法进行纯化，作为无色油状物质得到(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.25g(0.88mmol、收率69％)。

实施例3

<3-1>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸0.76g[5.24mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝7：3(摩尔比)]、1mol/L氢氧化钠水溶液6.3mL，在冰冷条件下添加苯甲氧基碳酰氯0.93mL(5.3mmol)。慢慢地升温至室温，分次添加四氢呋喃2mL和1mol/L氢氧化钠水溶液5.2mL，调整为pH9左右。放置一晩后，分离出有机层，用乙酸乙酯清洗水层。向水层中添加2mol/L盐酸3.2mL调整为pH3后，用乙酸乙酯提取3次。对所得到的有机层进行浓缩，得到黄色油状物质0.79g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸76重量％(2.15mmol、收率41％、(2S,5S)：(2S,5R)＝7：3(摩尔比))、乙酸乙酯24重量％的混合物。

<3-2>(2S,5S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯的制造

向烧瓶中添加<3-1>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.79g(纯度76重量％、2.15mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝7：3(摩尔比))、甲苯5mL、对甲苯磺酸一水合物49mg(0.28mmol)，在60℃反应2小时。冷却至室温后，添加乙酸乙酯10mL、水3mL、1mol/L氢氧化钠溶液1.2mL，结果水层的pH为7。分离出水层后，用乙酸乙酯进行再提取，将所得到的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水进行清洗。对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.34g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯62重量％(0.80mmol、收率37％)、(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸21重量％(0.25mmol、收率12％)、甲苯17重量％的混合物。

在原料N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸中为(2S,5S)：(2S,5R)＝7：3(摩尔比)，但通过向(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯转换，可以有效去除具有(2S,5R)的立体化学的化合物。另外，(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯与(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的总收率为49％，(2S,5S)体的收率为约70％，为中等程度。

与<2-1>同样地，反应中生成的(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯与未反应而残存于体系内的(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸反应，发生酯化的副反应，但由于起始原料中的(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的量少，因而可以比较有效地仅回收(2S,5S)体。

<3-3>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中添加<3-2>中得到的油状物质0.34g[包含(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯0.80mmol和(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.25mmol)、甲醇2mL、1mol/L氢氧化钠水溶液1.9mL，静置一晩。向反应液中添加2mol/L盐酸2mL，调整为pH4后，用乙酸乙酯进行提取。对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.39g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸76重量％(1.05mmol、收率100％、(2S,5S)：(2S,5R)＝87：13(摩尔比))、乙酸乙酯23重量％、乙酸1重量％的混合物。

<3-4>(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入<3-3>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.39g(纯度77重量％、1.06mmol)、甲醇2mL、10％钯碳61mg(N.E.CHEMCAT CORPORATION制造、PE型、55.3％含水物)，在常温、常压的条件下进行3小时氢化。通过硅藻土过滤去除钯碳，用甲醇-水进行清洗。对所得到的滤液进行浓缩，得到浅黄色油状物质形式的(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸0.21g。

实施例4

<4-1>(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯和(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯的制造

向烧瓶中添加根据<2-1>的方法得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.26g(纯度82重量％、0.76mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝5：5(摩尔比))、乙酸乙酯1mL、甲磺酸5μL(0.08mmol)，在60℃反应3小时。冷却至室温后，添加乙酸乙酯10mL、1mol/L氢氧化钠溶液1mL，结果水层的pH为约10。分离水层后，用乙酸乙酯进行再提取，将所得到的有机层用硫酸镁干燥。对所得到的有机层进行浓缩，得到浅褐色油状物质0.12g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯26重量％(0.11mmol、收率15％)、(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯52重量％(0.20mmol、收率26％)、乙酸乙酯13重量％、甲苯8重量％的混合物。

本实施例中，由乙酸乙酯生成的少量的乙醇与(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯反应，生成(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯。在原料N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸中为(2S,5S)：(2S,5R)＝5：5(摩尔比)，但根据¹H-NMR分析和HPLC分析(<HPLC-2>的条件)的结果，在N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯中为(2S,5S)：(2S,5R)>10：1(摩尔比)，有效地去除了具有(2S,5R)的立体化学的化合物。另外，将(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯和(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯合并，收率为41％，因而(2S,5S)体的收率为约80％，有效地仅回收了(2S,5S)体。

<4-2>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中添加<4-1>中得到的油状物质0.12g(包含(1S,4S)-5-氮杂-2-氧杂-3-氧代双环[2.2.2]辛烷-5-羧酸苄酯0.11mmol和(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯0.20mmol)、乙醇1mL、1mol/L氢氧化钠水溶液0.66mL，放置一晩。浓缩反应液后，添加1mol/L盐酸0.7mL，调整为pH3后，用乙酸乙酯进行提取。在减压下对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.11g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸84重量％(0.33mmol、定量地(2S,5S)：(2S,5R)＝10：1(摩尔比))、乙酸乙酯11重量％、甲苯5重量％的混合物。

<4-3>(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入<4-2>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.11g(纯度82重量％、0.33mmol)、甲醇1mL、10％钯碳18mg(N.E.CHEMCAT CORPORATION制造、PE型、55.3％含水物)，在常温、常压的条件下进行9小时氢化。通过硅藻土过滤去除钯碳，用甲醇-水进行清洗。对所得到的滤液进行浓缩，得到浅黄色油状物质形式的(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸58mg((2S,5S)：(2S,5R)＝10：1(摩尔比)、¹H-NMR分析)。

实施例5

<5-1>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯的制造

向烧瓶中添加根据<2-1>的方法得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.55g(纯度78重量％、1.52mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝3：7(摩尔比))、甲苯2mL、乙醇0.5mL、甲磺酸10μL(0.15mmol)，在40℃反应5小时。

在<HPLC-2>的条件下对反应液进行HPLC分析，结果(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯：(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸乙酯：(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸：(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸＝24：8：7：57。

若假定原料与产物各自的吸光系数同等，则(2S,5S)体的转化率约为77％，(2S,5R)体的转化率约为12％，(2S,5S)体进一步被酯化。

<5-1’>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯的制造

向烧瓶中添加根据<2-1>的方法得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸和(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.62g(纯度78重量％、1.72mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝3：7(摩尔比))、甲苯2mL、2-丙醇0.5mL、甲磺酸11μL(0.17mmol)，在50℃反应5小时。冷却至室温后，添加甲苯3mL、1mol/L氢氧化钠溶液1.2mL，结果水层的pH为约9。分离水层后，用甲苯进行再提取，对所得到的有机层进行浓缩，得到浅褐色油状物质0.17g。

¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯91重量％(0.47mmol、收率27％、(2S,5S)：(2S,5R)＝10：1(摩尔比))、甲苯9重量％的混合物。

本实施例中作为原料的N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸为(2S,5S)：(2S,5R)＝3：7(摩尔比)，但根据¹H-NMR分析的结果，在N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯中为(2S,5S)：(2S,5R)＝10：1(摩尔比)，有效地去除了具有(2S,5R)的立体化学的化合物。另外，(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯的收率为27％，因而(2S,5S)体的收率为约80％，有效地选择性地回收了(2S,5S)体。

<5-2>(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中添加<5-1’>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸异丙酯0.17g(纯度91重量％、0.47mmol)、甲醇0.7mL、1mol/L氢氧化钠水溶液0.71mL，在60℃反应4小时。用甲苯清洗反应液后，添加2mol/L盐酸0.45mL，调整为pH3后，用乙酸乙酯进行提取。对所得到的有机层进行浓缩，得到褐色油状物质0.17g。¹H-NMR分析的结果，该油状物质是含有N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸70重量％(0.41mmol、收率88％、(2S,5S)：(2S,5R)＝7：1(摩尔比))、乙酸乙酯26重量％、甲苯4重量％的混合物。

<5-3>(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入<5-2>中得到的(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸0.17g(纯度70重量％、0.41mmol、(2S,5S)：(2S,5R)＝7：1(摩尔比))、甲醇1mL、10％钯碳22mg(N.E.CHEMCAT CORPORATION制造、PE型、55.3％含水物)，在常温、常压的条件下进行3小时氢化。通过硅藻土过滤去除钯碳，用甲醇-水进行清洗。对所得到的滤液进行浓缩，得到浅黄色油状物质形式的(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸89mg。

[参考例3]

<3-1>赖氨酸羟化酶基因的克隆化

基于编码约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)NBRC14942株来源的L-精氨酸β羟化酶VioC同源物Hyl-1(基因库登录号ABQ06186、序列号18)的基因序列(hyl-1、序列号17)，设计、合成了用于扩增hyl-1基因的全长的引物hyl1_F(序列号29)和hyl1_R(序列号30)。以约氏黄杆菌的染色体DNA为模板，根据常规方法进行PCR反应，得到约1.0kbp的DNA片段。

同样地，对于耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)NBRC101839株、松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC15968株、粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)NBRC15054株、朝鲜农研所丝杆菌(Niastella koreensis)NBRC106392株来源的VioC同源物，分别为Hyl-2(基因库登录号ABS05421、序列号20)、Hyl-3(基因库登录号ACU60313、序列号22)、Hyl-4(基因库登录号EFK34737、序列号24)、Hyl-5(基因库登录号AEV99100、序列号26)。基于编码各酶的基因序列(hyl-2(序列号19)、hyl-3(序列号21)、hyl-4(序列号23)、hyl-5(序列号25))，设计、合成了用于扩增各基因的全长的引物。对于hyl-2，合成引物hyl2_f(序列号31)和hyl2_r(序列号32)，对于hyl-3，合成引物hyl3_f(序列号33)和hyl3_r(序列号34)，对于hyl-4，合成引物hyl4_f(序列号35)和hyl4_r(序列号36)，对于hyl-5，合成引物hyl5_f(序列号37)和hyl5_r(序列号38)，以各株的染色体DNA为模板并根据常规方法进行了PCR反应。分别得到约1.0kbp的DNA片段。

分别利用限制酶NdeI、XhoI对所得到的5种DNA片段进行消化，根据常规方法连接至利用NdeI、XhoI进行了消化的pET21a(Novagen)，从而分别得到pEHYL1、pEHYL2、pEHYL3、pEHYL4、pEHYL5。

另外，人工合成编码海洋放线菌marine actinobacterium PHSC20C1来源的Hyl-6(基因库登录号ABS05421、序列号28)的基因序列(hyl-6、序列号27)，制作***于pJExpress401(DNA2.0)的质粒pJHYL6。

接着，使用所得到的各质粒，根据常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(Invitrogen制造)进行转化，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pEHYL1、BL21(DE3)/pEHYL2、BL21(DE3)/pEHYL3、BL21(DE3)/pEHYL4、BL21(DE3)/pEHYL5、BL21(DE3)/pJHYL6。为了得到表达该基因的菌体，对于各重组大肠杆菌，利用含有氨苄青霉素和lac启动子诱导物质的液体LB培养基在30℃进行培养，培养约20小时后收集菌体。

<3-2>基于静止细胞反应的赖氨酸羟化酶的活性确认

在塑料管内混合5mmol/L L-赖氨酸、10mmol/L 2-酮戊二酸、1mmol/L L-抗坏血酸、0.1mmol/L硫酸铁、以及利用根据参考例<3-1>的方法得到的重组大肠杆菌，按照浊度OD₆₀₀＝10的方式来混合反应液。使所制备的混合液0.5mL在30℃、pH7.0的条件下反应3小时。利用1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(FDAA)使反应产物衍生物化，之后在<HPLC-4>的条件下对羟基赖氨酸进行HPLC分析。其结果，如图2和图3所示，确认到BL21(DE3)/pEHYL2、BL21(DE3)/pJHYL6在3-羟基赖氨酸标准物品的保持时间为8.04分钟时生成一致的化合物。另外，确认到BL21(DE3)/pEHYL1、BL21(DE3)/pEHYL3、BL21(DE3)/pEHYL4、BL21(DE3)/pEHYL5在4-羟基赖氨酸标准物品的保持时间为8.16分钟时生成一致的化合物。

<3-3>(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的合成

在1L发酵罐中混合1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)35mL、去离子水304mL、L-赖氨酸盐酸盐1.28g、2-酮戊二酸2.05g、L-抗坏血酸钠0.14g、硫酸铁0.02g、ADEKANOL LG1090.35g以及利用根据参考例<3-1>的方法得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pEHYL2的湿菌体8g，在30℃、pH7.0、搅拌数500rpm、空气的通气量2.0vvm的条件下反应17小时。在<HPLC-5>的条件下进行HPLC分析来确认L-赖氨酸的峰消失，由此判断反应结束。通过离心分离和微滤，从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣，得到390g的滤液。

使滤液390g通过离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)60.0g)，用水清洗后，用含有150mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液，得到(2S,3S)-3-羟基赖氨酸1.0g(6.17mmol、收率88％)。

¹H-NMR(400MHz,D₂O)δ,1.45-1.58(2H,m),1.63-1.73(1H,m),1.74-1.88(1H,m),2.93-3.04(2H,m),3.47(1H,d,J＝4.3Hz),3.89(1H,dt,J＝8.4,4.5Hz)

<3-4>(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的立体化学确定

向烧瓶中添加利用根据参考例<3-3>的方法得到的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸8.3mg(0.051mmol)、1mol/L氢氧化钠水溶液0.26ml、苯甲氧基碳酰氯18μL(0.13mmol)，在室温搅拌1小时。进而添加1mol/L氢氧化钠水溶液0.26ml、苯甲氧基碳酰氯18μL(0.13mmol)，在室温反应一晩后，添加四氢呋喃0.5mL，在60℃进而反应2小时。冷却至室温后，添加氢氧化钠95mg，在室温反应一晚。将反应液用甲苯-四氢呋喃(1：1)清洗2次后，添加浓盐酸250μL使其为强酸性，进而用乙酸乙酯清洗3次后，用1-丁醇对水层进行4次提取。用无水硫酸镁将1-丁醇层干燥后，进行浓缩，得到白色固体形式的(4S,5S)-5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸14.6mg(0.045mmol、收率89％)。

所得到的(4S,5S)-5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸的立体化学通过NOESY测定来确定。NOESY测定中使用Bruker社制造的AVANCE DRX500分光计(带有冷冻探针)，在25℃、混合时间＝0.8msec的条件下实施。关于化学位移的基准，设甲醇为3.31ppm。NOESY测定结果如下所示。

在4位氢原子(H⁴)与5位氢原子(H⁵)之间观测到交叉峰，在4位与1’位间未观测到交叉峰，因而可以确定4位和5位的取代基为顺式构型。由于酶反应中使用的赖氨酸的绝对构型为S，因而可以确定：本参考例中得到的5-(3-苄氧羰基氨基丙基)-2-氧基-4-噁唑烷羧酸具有(4S,5S)的立体化学，作为其原料的3-羟基赖氨酸具有(2S,3S)的立体化学。

¹H-NMR(400MHz,MeOH-d₄)δ,1.39-1.53(3H,m,H^1',H^2'x2),1.59-1.68(1H,m,H^1'),3.02-3.08(2H,m,H^3'),3.60-3.64(1H,m,H⁴),3.93-4.00(1H,m,H⁵),4.90-5.02(2H,m,Bn),7.18-7.28(5H,m,Bn).

[参考例4]

(2S,3S)-3-羟基-2-哌啶酸[(2S,3S)-3-羟基-2-哌啶羧酸]的制造

在塑料管中混合1mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)0.75mL、去离子水9.21mL、参考例<3-3>中得到的(2S,3S)-3-羟基赖氨酸86mg、50mmol/L NADPH0.083mL、1.0mol/L葡萄糖0.7mL以及参考例1中得到的重组大肠杆菌JM109/pKW32(dpkA,aip,gdh,kr)的100g/L悬浮液1.25mL，在30℃、pH8.0、搅拌数1000rpm的条件下反应20小时。在<HPLC-6>的条件下进行HPLC分析来确认(2S,3S)-3-羟基赖氨酸的峰消失，由此判断反应结束。通过离心分离从反应结束后的液体中除去菌体和菌体残渣，得到10.5g的上清。

使上清10.5g通过离子交换树脂柱(Diaion(注册商标)SK-1B(H型)4.0g)，用水清洗后，用含有16.4mmol的氨的水溶液洗脱。浓缩氨洗脱液，得到褐色固态物质255mg。NMR分析的结果，该固态物质是含有(2S,3R)-3-羟基2-哌啶酸20重量％(0.35mmol、收率66.3％)、三羟甲基氨基甲烷80重量％的混合物。

¹H-NMR(400MHz,D₂O)δ,1.38-1.56(2H,m),1.73-1.85(2H,m),2.71-2.79(1H,m),3.04-3.11(1H,m),3.23(1H,d,J＝7.6Hz),3.79-3.86(1H,m).

实施例6

(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸的制造

向烧瓶中投入根据实施例1的方法得到的(2S,5S)-5-羟基-2-哌啶羧酸78.7mg(0.542mmol)和(2S,5R)-5-羟基-2-哌啶羧酸2.8mg(0.019mmol)及根据参考例4的方法得到的(2S,3S)-3-羟基-2-哌啶羧酸98.5mg(纯度20重量％、0.136mmol、包含三羟甲基氨基甲烷78.8mg)，在室温下添加水0.200mL、2mol/L氢氧化钠水溶液0.674mL。滴加苯甲氧基碳酰氯0.190mL(1.35mmol)后，添加2mol/L氢氧化钠水溶液0.500mL，将pH由9调整为10。在室温反应25分钟后，滴加苯甲氧基碳酰氯0.098mL(0.697mmol)，之后添加2mol/L氢氧化钠水溶液0.400mL，将pH由10调整为11。进而在室温反应40分钟，之后滴加苯甲氧基碳酰氯0.098mL(0.697mmol)，在室温反应2小时。在该反应液中添加甲苯3mL后，实施分液操作。向所提取的有机层中添加水0.500mL后，进一步实施分液操作。对所得到的有机层进行浓缩，得到330mg的浅黄色油状物质。向该油状物质中添加乙醇2mL、1mol/L氢氧化钠水溶液1.1mL、水0.3mL，在室温反应约1小时。浓缩反应液并将乙醇蒸馏除去后，添加乙醇1mL、水0.3mL、1mol/L氢氧化钠水溶液0.1mL、2mol/L氢氧化钠水溶液0.1mL，在室温反应2小时。浓缩反应液并将乙醇蒸馏除去后，利用甲苯3mL实施分液操作。向所得到的水层中添加水1mL、1mol/L盐酸0.75mL，将水溶液的pH调整为1。利用乙酸乙酯4mL将水层提取2次，对所得到的有机层进行浓缩，得到92.0mg的浅黄色油状物质。

¹H-NMR分析的结果，该浅黄色油状物质含有(2S,5S)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸80.5重量％(0.265mmol、收率49％)、乙酸乙酯19.5重量％。需要说明的是，在¹H-NMR中完全未观测到(2S,5R)-N-苄氧基羰基-5-羟基-2-哌啶羧酸、(2S,3S)-N-苄氧基羰基-3-羟基-2-哌啶羧酸的峰。

工业实用性

本发明能够用作作为药物中间体有用的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法及其衍生物的制造方法。

Claims

1.一种顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其特征在于，该方法包括以下工序：将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)的化合物，

R¹表示氨基的保护基，R²表示C1～C6的烷基，

使通过细菌反应和/或酶反应合成的包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物与苯甲氧基碳酰氯反应，从而使所述顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)的化合物，或者，

使通过细菌反应和/或酶反应合成的包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物与苯甲氧基碳酰氯反应后，在酸催化剂存在下与醇反应，从而使所述顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(2)的化合物。

2.如权利要求1所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其中，所述杂质为2-哌啶羧酸类。

3.如权利要求2所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其中，所述2-哌啶羧酸类为反式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

4.如权利要求2所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸衍生物的制造方法，其中，所述醇为仲醇。

5.一种顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下工序：使通过细菌反应和/或酶反应合成的包含顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸和杂质的混合物与酰卤化物和/或酸酐反应、或者与酰卤化物和/或酸酐以及醇反应，将顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸转换为式(1)和/或式(2)的化合物，接下来将该化合物分离，之后转换为顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸，

6.如权利要求5所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，杂质为2-哌啶羧酸类。

7.如权利要求6所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，2-哌啶羧酸类为反式-5-羟基-2-哌啶羧酸。

8.如权利要求5～7中任一项所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其特征在于，该纯化方法中，通过析晶或溶剂提取来进行式(1)和/或式(2)的化合物的分离工序。

9.如权利要求5所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，所述醇为仲醇。

10.如权利要求5所述的顺式-5-羟基-2-哌啶羧酸的纯化方法，其中，式(1)和(2)中，R¹为苄氧基羰基。