CN110283804A

CN110283804A - 酯酶基因及编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN110283804A
Application number: CN201910648324.9A
Authority: CN
Inventors: 万群; 徐文君; 李易芯; 余向阳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-09-27

Abstract

本发明提供了一种具有广谱降解的酯酶基因及其编码蛋白与应用，该酯酶来源于枯草芽孢杆菌的酯酶基因，可应用于降解多种邻苯二甲酸；本发明还构建了能够表达上述酯酶的基因工程菌株及质粒，实现了该酶在大肠杆菌中的异源表达，为其工业化生产打下了良好的基础。

Description

酯酶基因及编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及酯酶基因、酯酶、重组质粒、基因工程菌株及其应用。

背景技术

酯酶和脂肪酶都是羧酸水解酶，被分为8个族。酯酶(Esterases)能够水解少于10个碳原子的短链脂肪酸的酯键，而脂肪酶(Lipases)则能够水解多于10个碳原子的长链脂肪酸的酯键。脂肪酶和酯酶是重要的工业化酶制剂品种，可以催化水解、转酯、酯合等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中，用于有机合成的具有酯化或转酯化功能的酯酶和脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细品化学品和手性化合物有重要意义。

酯酶的关键作用是用于合成药物中间体，目前合成的药物可用于医治结肠癌，高胆固醇血症等。酯酶也可用来生产杀虫剂，除虫菊醋的前提化合物(+)－反式－菊酸在酯酶的参与下合成。工业上，利用酯酶良好的区域专一性和对映选择性生产各种产品，如精细化工品，医药，食品等。酯酶还可参与药物，农药污染物的代谢。降解农药的过程中，酯酶通过水解农药的酯基，破坏农药的结构，从而降低其毒性。

邻苯二甲酸酯(Phthalateester，PAEs)是塑化剂中使用最频繁的一类物质，是邻苯二甲酸与4-15个碳的醇脂化后形成的化合物(如下表1所示)，表1中14种邻苯二甲酸酯的支链碳原子的数目均小于8:

表1 邻苯二甲酸酯化合物

该化合物在常温常压下呈现无色或者淡黄色，质地为油状粘稠液体，且液体温度范围较广，有较大的流动性，气味特殊，难溶于水相，易溶于甲醇、乙腈等有机相，辛醇-水分配系数(K_OW)高，熔点低，沸点高，结构稳定，化学结构式由一个刚性平面基环和两个可塑线性脂肪侧链组成，属于烷基芳香酯。因为其相容性、耐油性、电绝缘性、耐寒性、加工性等性能有益，因此在塑料加工过程中以高分子材料助剂被广泛使用，以增强塑料柔韧性，在橡胶、粘合剂、医疗器械、化妆品、胶水、洗车内饰、家具、农药、香料、保鲜膜、玩具等塑料制品中应用。

然而，PAEs是有毒害作用的，它能够促使机体过氧化而产生细胞毒性，引起机体免疫力低、导致肥胖、过敏、冠心病、肝脏受损等危害。此外PAEs也被人称作是环境荷尔蒙，具有类***作用，严重干扰内分泌，影响生殖***，林琳等发现DEHP暴露可能升高孕早期妇女流产的概率。

目前利用微生物DNA中筛选出降解基因翻译成降解酶用以降解PAEs的研究在逐渐增多，但由于酶具有专一性，所以它对作用的底物是具有选择性的。酯酶也同样如此，目前报道的酯酶只能对少数几种PAEs具有降解能力，如彭政从筛选出的酯酶基因EstZ1能够降解50mg/mlDEP和DiBP，EstZ22对50mg/ml的DEP、DiBP、 DBP和DCHP都具有降解性能，但未明确指出降解率结果(彭政.芽孢杆菌来源的酯酶酶学性质及对邻苯二甲酸酯类降解的初步研究[D].云南师范大学,2016.)； Wu等从不动杆菌属Acinetobactersp.M673中筛选出一个水解酶基因，其表达产物能降解0.1mMDBP(WuJ,LiaoX,YuF,etal.Cloningofadibutylphthalate hydrolasegenefromAcinetobactersp.strainM673andfunctionalanalysis ofitsexpressionproductinEscherichiacoli[J].AppliedMicrobiologyand Biotechnology,2013,97(6):2483-2491.)；方月鉴定的酯酶基因Est-3563翻译产物对1mMDMP、DEP及DBP的降解率为10-30％(方月.塑化剂降解菌Acinetobactersp.LMB-5的性能及其酯酶酶学性质的研究[D].2017.)。

目前能够同时降解表1中14种支链碳个数为1-8的PAEs，且降解效率相对较高的酯酶还未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种广谱降解PAEs的酯酶，该酯酶能降解14 种常见的PAEs，为工业化生产酯酶提供原料来源，本发明是这样实现的：

首先，本发明提供了一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶基因EST-T2，该酯酶基因编码的酯酶蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其次，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酯酶在降解邻苯二甲酸酯中的应用；优选支链碳原子的数目小于8个的邻苯二甲酸，如：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二甲氧基乙酯(DMEP) 邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPRP)、邻苯二甲酸二异丙酯 (DIPRP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸甲苯基丁酯(BBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二己酯(DHP、)邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)等。

第三，本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒包含表达载体和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶基因；该表达载体为本领域常规质粒载体，如载体 pET32b；本发明同时还提供了含有该重组质粒的基因工程菌，该工程菌优选大肠杆菌。

具体而言，上述重组质粒、工程菌株、酯酶粗酶液是通过如下方法获得的： (1)利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶EST-T2基因与pET32b原核表达载体合成重组表达质粒pET32b-EST-T2；将重组表达质粒导入转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素(终浓度)的LB平板，37℃培养过夜，次日，挑取阳性克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素(终浓度)的 LB液体培养基中，37℃培养过夜后，用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行 BamHI和HindIII双酶鉴定，37℃水浴孵育3h，1％琼脂糖电泳，同时用pET32b(+) 空质粒作为对照；酶切后的片段大小与EST-T2基因大小一致的即获得酶切正确的重组质粒；

(2)选择双酶切正确的重组质粒，将重组质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，获得转化菌液；将该转化菌液涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素(终浓度) 的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取阳性克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素 (终浓度)的LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得重组基因工程菌株；

(3)将基因工程菌株接种到含50μg/mL氨苄青霉素(终浓度)的LB液体培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按体积比1:100比例转接至100mLLB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.3时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，30℃诱导24h；然后收集菌体，加入PBS缓冲液，超声波破碎细胞，获得酯酶粗酶液。

上述酯酶在降解邻苯二甲酸酯中的应用，其具体方法如下：将获得的酯酶粗酶液中加入PBS缓冲液(50molL^-1，pH7.5)，然后加入溶解在乙腈里14种PAEs (各PAEs浓度均为10mg/L)，37℃恒温水浴中反应1h，即完成对PAEs的催化。粗酶液与PBS缓冲液体积比优选1:4。

此外，在本申请公开酯酶基因序列、核苷酸序列的基础上，本领域技术人员还可以通过本领域常规方法合成所述酯酶，并在酯酶中加入表1中14种PAEs，即可用于降解邻苯二甲酸酯。

与现有酯酶相比，本发明提供的酯酶基因来源于枯草芽孢杆菌，可应用于同时降解多种邻苯二甲酸；本发明还构建了能够表达上述酯酶的基因工程菌株及质粒，实现了该酶在大肠杆菌中的异源表达，为该酯酶的工业化生产打下了良好的基础。

附图说明

图1为本发明的纯化的酯酶EST-T2的SDS-PAGE图。

A图：泳道M为Marker,泳道1为诱导前菌悬液总蛋白，泳道2为诱导后菌悬液总蛋白；B图：泳道M为Marker,泳道1为诱导前菌悬液离心沉淀总蛋白，泳道2为诱导后菌悬液离心沉淀总蛋白，泳道3为诱导前菌悬液离心后上清液总蛋白，泳道4为诱导后菌悬液离心后上清液总蛋白。

图2为本发明的酯酶EST-T2降解14种PAEs的效果示意图。

具体实施方式

实施例涉及培养基的配制方法，下述配方提到的浓度均为终浓度:

LB平板配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，15g/L琼脂粉，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min；10ml倒1个培养皿，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟后备用。

LB液体培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract) 5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min 后备用。

实施例1酯酶EST-T2基因的克隆、表达载体的构建

(a)根据枯草芽孢杆菌内生菌HB-T2的基因组序列，克隆降解PAE酯酶基因 EST-T2，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，两个引物分别带有BamHI和HindIII酶切位点，扩增EST-T2基因的完整序列。

扩增体系:(北京擎科新业生物技术有限公司试剂盒(TSE003)：:2×TSINGKE^TMMasterMix25ul；10uMprimerF/R1ul；DNA<50ng；ddH₂Oupto50ul)；扩增程序：94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s；运行30个循环；72℃延伸10min，4℃稳定1min反应结束。

将纯化后的PCR产物(北京擎科新业生物技术有限公司：PCR纯化试剂盒 TSP301，纯化步骤参照试剂盒说明书进行)和pET32b载体(Invitrogen)同时进行BamHI和HindIII双酶切，然后进行连接，构建的重组质粒命名为 pET32b-EST-T2。

双酶切体系(20μl)：10Xbuffer:2ul；BamHI(Takara:1010S)1ul； HindIII(Takara:1060S)1ul；纯化后的PCR产物(500ng)、pET32b载体(1ug)，以ddH₂O补足至20μl；

双酶切反应：37℃反应2h，获得重组质粒32b-EST-T2。

(b)将重组表达质粒32b-EST-T2导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自天根生化科技有限公司，型号CB104，具体操作步骤按照产品说明书进行)，然后将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中， 37℃培养过夜后，用质粒提取试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)提取重组质粒(具体操作按试剂盒说明进行)并进行BamHI和HindIII双酶鉴定(购自NEB 公司，具体鉴定步骤依照操作说明配制50μl酶切反应体系)，37℃水浴孵育3h， 1％琼脂糖电泳，同时用pET32b(+)空质粒作为对照，分子大小与预期相符(预期大小为EST-T2基因为54kD,加上载体蛋白，二者合计大小为72kD)，表明构建正确。

(c)将双酶切鉴定正确的质粒送交测序公司测序，将测序鉴定正确的质粒命名为pET32b-EST-T2，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞(天根生化有限公司产品，具体按操作说明进行)，将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素(50μ g/ml)的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50 μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养过夜，重组菌命名为BL21(pET32b -EST-T2)

实施例2酯酶EST-T2蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌BL21(pET32b-EST-T2)接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的4mlLB 液体培养基中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L， 30℃诱导24h；将表达的大肠杆菌在4℃下8000rpm离心后，弃去上清液，加入20mL的PBS缓冲液将菌体重悬再离心反复3次，最后加入20mL的PBS缓冲液将菌体重悬，并且在冰水浴下利用超声破碎仪破碎(超声条件为：超声时间2 s，间歇时间8s，工作总时间设定为10min)，完成粗酶液制备。将诱导前和诱导后的粗酶液及粗酶液8000rpm离心10m后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。电泳图如图1所示。图1A中：泳道M为Marker,泳道1为诱导前菌悬液总蛋白，泳道2为诱导后菌悬液总蛋白；图1B中：泳道M为Marker,泳道1为诱导前菌悬液离心沉淀总蛋白，泳道2为诱导后菌悬液离心沉淀总蛋白，泳道3 为诱导前菌悬液离心后上清液总蛋白，泳道4为诱导后菌悬液离心后上清液总蛋白。

电泳结果显示成功诱导出了酯酶EST-T2蛋白，且酯酶EST-T2存在于上清液中，诱导后表达的蛋白大小为73kDa(即为酯酶EST-T2的54kDa+载体蛋白19kDa)。

实施例3酯酶EST-T2降解PAEs谱的分析

取实施例2制成的粗酶液1mL加入4mLPBS缓冲液中形成5mL反应体系，加入溶解在乙腈里的表1中14种PAEs的混合溶液使反应体系里的各种PAEs浓度均为10mg/L，然后在37℃恒温水浴中反应1h，利用GC-MS验证PAEs含量。以pET32b空载的粗酶液为空白对照，每个处理重复3次。

14种PAEs的提取分析方法:向待测反应体系中加入等量的乙腈，于150 r/min摇床震荡萃取40min，取出加入15gNaCl，涡旋2min使分层，吸取1mL 上清液于10mL玻璃离心管中，氮气吹干后用色谱纯乙腈定容至1mL后稀释10 倍，过0.22μm有机相滤膜，待GC-MS测定。利用GC-MS检测14种PAEs含量，检测条件见表2和表3。

表2 14种PAEs气相色谱检测条件

表3 14种PAEs的质谱参数

注：“*”表示定量离子

降解率计算公式为：

本实施例中，PAEs的提取分析方法为本领域的常规方法，其具体步骤也可以参见文献“献：Wang H,Liang H,Gao D W.Occurrence and risk assessment of phthalateesters(PAEs)in agricultural soils of the Sanjiang Plain, northeast China[J].Environmental Science and Pollution Research,2017, 24(24):1-10.)”中的报道。

检测结果如图2所示，发现酯酶EST-T2对10ppmmg/L的PAEs降解率为 87-99％，其中DMP:97％；DEP: 97％；DAP:97％；DIPRP:98％；DMEP:99％；DPRP:95％；DBP:97％；DIBP:96％；DPP:98％；BBP: 98％；DCHP：91％；DHP：98％；DEHP：88％；DNOP：92％。本实施例说明酯酶EST-T2 对表1列明的14中PAEs均具有降解效果，拓展了酯酶的应用领域。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 酯酶基因及编码蛋白与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactcatc aaatagtaac gactcaatac ggcaaagtaa aaggcacaac ggaaaacggc 60

gtacataagt ggaaaggcat cccctatgcc aagccgcctg tcggacaatg gcgttttaaa 120

gcacctgagc cgcctgaagt gtgggaagat gtgcttgatg ccacagcgta cggctctatt 180

tgcccgcagc cgtctgattt gctgtcactt tcgtatactg agctgccccg ccagtccgag 240

gattgcttgt atgtcaatgt atttgcgcct gacaccccaa gtaaaaatct tcctgtcatg 300

gtgtggattc acggaggcgc tttttatcta ggagcgggca gtgagccatt gtatgacgga 360

tcaaaacttg cggcacaggg agaagtcatt gtcgttacat tgaactatcg gctggggccg 420

tttggctttt tgcacttgtc ttcatttaat gaggcgtatt ctgataacct tgggctttta 480

gaccaagccg ccgcgctgaa atgggtgcga gagaatattt cagcgtttgg cggtgatccc 540

gataacgtaa cagtatttgg agaatccgcc ggcgggatga gcattgccgc gctgcttgct 600

atgcctgcgg caaaaggcct gttccagaaa gcaatcatgg aaagcggcgc ttctcgaacg 660

atgacgaaag aacaagcggc gagcacctcg gcagcctttt tacaggtcct tgggattaac 720

gagggccaac tggataaatt gcatacggtt tctgcggaag atttgctaaa agcggctgat 780

cagcttcgga ttgcagaaaa agaaaatatc tttcagctgt tcttccagcc cgcccttgat 840

ccgaaaacgc tgcctgaaga accagaaaaa gcgatcgcag aaggggctgc ttccggtatt 900

ccgctattaa ttggaacaac ccgtgatgaa ggatatttat ttttcacccc ggattcagac 960

gttcattctc aggaaacgct tgatgcagcg ctcgagtatt tactagggaa gccgctggca 1020

gagaaagttg ccgatttgta tccgcgttct ctggaaagcc aaattcatat gatgactgat 1080

ttattatttt ggcgccctgc cgtcgcctat gcatccgcac agtctcatta cgcccctgtc 1140

tggatgtaca ggttcgattg gcacccgaag aagccgccgt acaataaagc gtttcacgca 1200

ttagagcttc cttttgtctt tggaaatctg gacggattgg aacgaatggc aaaagcggag 1260

attacggatg aggtgaaaca gctttctcac acgatacaat cagcgtggat cacgttcgcc 1320

aaaacaggaa acccaagcac cgaagctgtg aattggcctg cgtatcatga agaaacgaga 1380

gagacgctga ttctagactc agagattacg atcgaaaacg atcccgaatc tgaaaaaagg 1440

cagaagctat tcccttcaaa aggagaa 1467

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr His Gln Ile Val Thr Thr Gln Tyr Gly Lys Val Lys Gly Thr

1 5 10 15

Thr Glu Asn Gly Val His Lys Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro

20 25 30

Pro Val Gly Gln Trp Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Glu Val Trp

35 40 45

Glu Asp Val Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Ile Cys Pro Gln Pro

50 55 60

Ser Asp Leu Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Glu Leu Pro Arg Gln Ser Glu

65 70 75 80

Asp Cys Leu Tyr Val Asn Val Phe Ala Pro Asp Thr Pro Ser Lys Asn

85 90 95

Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly Ala

100 105 110

Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Ala Ala Gln Gly Glu

115 120 125

Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe Leu

130 135 140

His Leu Ser Ser Phe Asn Glu Ala Tyr Ser Asp Asn Leu Gly Leu Leu

145 150 155 160

Asp Gln Ala Ala Ala Leu Lys Trp Val Arg Glu Asn Ile Ser Ala Phe

165 170 175

Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly

180 185 190

Met Ser Ile Ala Ala Leu Leu Ala Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu Phe

195 200 205

Gln Lys Ala Ile Met Glu Ser Gly Ala Ser Arg Thr Met Thr Lys Glu

210 215 220

Gln Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Phe Leu Gln Val Leu Gly Ile Asn

225 230 235 240

Glu Gly Gln Leu Asp Lys Leu His Thr Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu

245 250 255

Lys Ala Ala Asp Gln Leu Arg Ile Ala Glu Lys Glu Asn Ile Phe Gln

260 265 270

Leu Phe Phe Gln Pro Ala Leu Asp Pro Lys Thr Leu Pro Glu Glu Pro

275 280 285

Glu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly Ile Pro Leu Leu Ile

290 295 300

Gly Thr Thr Arg Asp Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Thr Pro Asp Ser Asp

305 310 315 320

Val His Ser Gln Glu Thr Leu Asp Ala Ala Leu Glu Tyr Leu Leu Gly

325 330 335

Lys Pro Leu Ala Glu Lys Val Ala Asp Leu Tyr Pro Arg Ser Leu Glu

340 345 350

Ser Gln Ile His Met Met Thr Asp Leu Leu Phe Trp Arg Pro Ala Val

355 360 365

Ala Tyr Ala Ser Ala Gln Ser His Tyr Ala Pro Val Trp Met Tyr Arg

370 375 380

Phe Asp Trp His Pro Lys Lys Pro Pro Tyr Asn Lys Ala Phe His Ala

385 390 395 400

Leu Glu Leu Pro Phe Val Phe Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Arg Met

405 410 415

Ala Lys Ala Glu Ile Thr Asp Glu Val Lys Gln Leu Ser His Thr Ile

420 425 430

Gln Ser Ala Trp Ile Thr Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Ser Thr Glu

435 440 445

Ala Val Asn Trp Pro Ala Tyr His Glu Glu Thr Arg Glu Thr Leu Ile

450 455 460

Leu Asp Ser Glu Ile Thr Ile Glu Asn Asp Pro Glu Ser Glu Lys Arg

465 470 475 480

Gln Lys Leu Phe Pro Ser Lys Gly Glu

485

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatccc atgactcatc aaatagtaac gac 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttc ttctcctttt gaagggaata gc 32

Claims

1.一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的酯酶基因。

2.如权利要求1所述酯酶基因编码的酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述酯酶在降解邻苯二甲酸酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯的支链碳原子的数目小于8。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含表达载体和权利要求1所述的酯酶基因。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pET32b。

7.一种含有权利要求5所述重组质粒的工程菌。