JP5652843B2 - Dna増幅法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、鋳型DNAが直鎖状である、前記のDNA増幅方法に関する。
また、本発明は、RNAプライマーと新規に合成されたDNAとの間にRNase Hによりニックを形成する反応をさらに含む、前記のDNA増幅方法に関する。
さらに、本発明は、DNA合成反応とニック形成反応とを同時に行う、前記のDNA増幅方法に関する。
本発明はまた、一価および二価の陽イオンを含み、該一価および二価の陽イオンがそれぞれ異なる陰イオンと対形成している、前記組成物に関する。
本発明はまた、陽イオンが、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、およびマンガンイオンからなる群より選択される1または2以上を含む、前記組成物に関する。
本発明はまた、pH調製剤をさらに含み、該pH調製剤が塩化物イオンを含まない、前記組成物に関する。
さらに、本発明は、5’末端から少なくとも1塩基がRNAである、前記プライマーに関する。
本発明はまた、5’末端から少なくとも1塩基が非修飾RNAまたは修飾RNA塩基である、前記プライマーに関する。
また、本発明は、ランダムプライマーである、前記プライマーに関する。
または、本発明の方法において、RNase Hは、好ましくは0.1〜10 units/μl、より好ましくは0.5〜1.5 units/μlの範囲において好適に用いられる。
塩化物イオン(Cl-)を含む従来の反応液組成物を用いたMDA反応
MDA法において従来一般に用いられている反応液組成物を用い、直鎖状DNAを鋳型としてDNA増幅を行った。
鋳型としたDNAは、濃度が既知のラムダファージDNA(和光純薬、Klenow treated lambda DNA)から段階希釈により107〜1コピーまでの濃度系列を作成したものを用い、プライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー(つくばオリゴサービス)を使用した。UltraPURE(登録商標)(Invitrogen製)蒸留水に、鋳型DNA(各希釈濃度)、ランダムRNAプライマー1 nmol、Tris-Cl(pH 7.5)30 mM、塩化カリウム50 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し室温(25℃)まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、Tris-Cl(pH 7.5)35 mM、塩化カリウム50 mM、塩化マグネシウム10 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ40 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット/反応、dNTP 1mMとし、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、制限酵素BamHI、EcoRIを用いた二重切断を行い、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図2に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、LCは制限酵素断片のコントロールとしてラムダDNAをBamHI/EcoRIで二重切断したものを、MはDNAサイズマーカーを示している。
MDA法による増幅産物は、鋳型に使用したDNAとほぼ同一の配列順序を示し、元の鋳型と同様にさらなる増幅において利用することが可能であるため、制限酵素断片長解析では元の鋳型と同一のバンドパターンを示すことを確認した(図2(1))。しかしながら、DNAプライマーを用いた場合、鋳型DNAのコピー数が103コピー未満となると、非特異的反応により増幅効率が低下し、また増幅の忠実度も低下することが明らかとなった(図2(2))。一方、RNAプライマーを用いる場合、鋳型DNAのコピー数が106コピー未満(図2(3))となると、増幅の忠実度が低下し、104コピー未満となると増幅が行われなくなることが明らかとなった。
一価および二価の陽イオンの対イオンの効果の分析
(a)一価の陽イオンの対イオンの効果
MDA反応において、一価の陽イオンの対イオンの効果を試験した。ラムダファージDNAサンプル(和光純薬、Klenow treated lambda DNA、106コピー、10μl)、200pmolの6R5Sプライマー、30mMのHEPES-Na(pH 7.5)、8mMのMgCl2および50mMの塩化カリウム(KCl)、グルタミン酸カリウム(KGlu)または酢酸カリウム(KAc)を含む反応液を、95℃で3分間熱変性し、25℃まで30分間かけてゆっくり冷却した。2×のamplification premix(10μl)を添加し、最終濃度が、Tris-HCl(pH7.5) 35mM、MgCl2 14mM、(NH4)2SO4 26mM、dNTPs 1mM、DTT 5mM、phi29 DNAポリメラーゼ40ng、およびピロホスファターゼ0.002 U、ならびにKCl、KGluまたはKAcを、各々3aに示す濃度(50〜300 mM)となるようにした。30℃で16時間反応を行い、その後、65℃で10分間酵素を不活化した。アガロース電気泳動による結果を、図3aに示す。
一価の陽イオンの対イオンとして塩化物イオンを用いた場合、最終濃度が50 mMを超えるとDNA増幅が行われなくなることが明らかとなった(図3a、KCl)。一方、一価の陽イオンを供給する塩としてグルタミン酸カリウム(KGlu)または酢酸カリウム(KAc)を用いた場合、各々200mM、250mMの高濃度において、DNA増幅が行われることが明らかとなった(図3a、KGluおよびKAc)。
また、二価の陽イオンの対イオンとして酢酸を用いた場合、例えば35mMの高濃度においてDNA増幅が行い得、二価の陽イオンの濃度が高くなるにつれて、鋳型に由来しない非特異的な増幅が抑制されることが明らかとなった(図3b)。
RNAプライマーを用いたMDA反応に対するDNA合成反応液組成の効果
方法:
鋳型としたDNAは、濃度が既知のラムダファージDNA(和光純薬、Klenow treated lambda DNA)から段階希釈により107〜1コピーまでの濃度系列を作成したものを用いた。プライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー(つくばオリゴサービス)を使用した。UltraPURE(登録商標)(Invitrogen製)蒸留水に、鋳型DNA(上記各希釈濃度)、ランダムRNAプライマー1 nmol、HEPES-Na(pH 7.5)30 mM、グルタミン酸カリウム50mM、酢酸マグネシウム10 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し、室温(25℃)まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、HEPES-Na(pH 7.5)35 mM、グルタミン酸カリウム125 mM、酢酸マグネシウム27 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ90 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット/反応、dNTP 1mMとし、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、制限酵素BamHI、EcoRIを用いた二重切断を行い、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図4に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、Lは制限酵素断片のコントロールとしてラムダDNAをBamHI/EcoRIで二重切断したものを、MはDNAサイズマーカー、Nは鋳型非添加を示している。
僅か100コピーのラムダDNA(約5フェムトグラム、4.5Mbp)を鋳型とした反応液から、元のラムダDNAとほぼ同じ制限酵素断片を確認できた。このDNA量はほぼ一般的な微生物のゲノム1個の量に等しい。また、鋳型DNAを含まない反応液からは増幅産物が確認できなかった。以上の結果から、塩化物イオンを排除した反応液組成物を用いることにより、RNAプライマーを用いたMDA反応において、極めて少量の直鎖状の鋳型DNAから十分なDNA増幅効率を得、かつプライマーダイマーに起因する非特異的増幅を完全に抑えることができることが明らかとなった。また、制限酵素断片解析の結果から、元の鋳型DNAとほぼ同一の配列を示すことが明らかとなった。
MDA反応における、RNase Hの添加の効果
MDA反応において修飾RNAプライマーを使用した場合と、修飾プライマーを用いてさらにRNase Hを添加した場合とにおける増幅効率の違いを、1〜105コピーの間で変化させた鋳型λDNAを用いて確認した。
鋳型DNAは、ラムダファージDNA(和光純薬、商品名Lambda DNA (Klenow fragment treated))から段階希釈により1〜105コピーまでの濃度系列を作成したものを用いた。修飾RNAプライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー(つくばオリゴサービス、6R5S)を用いた。UltraPURE(登録商標)(Invitrogen製)蒸留水に、鋳型DNA(各希釈濃度)、ランダムRNAプライマー1 nmol、HEPES-Na(pH 7.5)30 mM、グルタミン酸カリウム50mM、酢酸マグネシウム10 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し、室温(25℃)まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、HEPES-Na(pH 7.5)35 mM、グルタミン酸カリウム125 mM、酢酸マグネシウム27 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ90 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット/反応、dNTP 1mMとし、さらにRNase H(和光純薬)を30 U加え、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図5に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、MはDNAサイズマーカー、Nは鋳型非添加を示している。
RNase H非添加では1000コピーのλDNA(約50フェムトグラム)から明らかな増幅産物が確認された。RNase Hの添加は増幅効率をさらに改善し、僅か10コピーのλDNA(約500アトグラム)を増幅することを可能にすることが明らかとなった。この量は、現時点で確認されている最小のゲノムを持つ微生物カルソネラ(約160kbp)のゲノム3分子とほぼ等量である。
Claims (16)
- 一価および/または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる反応液組成物中での、phi29 DNAポリメラーゼを用いる鎖置換型DNA合成反応によるDNA増幅方法であって、
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される1または2以上の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供され、
前記鎖置換型DNA合成反応に配列の全てまたは一部にRNAを含むプライマーを用い、
前記RNAプライマーと新規に合成されたDNAとの間にRNase Hによりニックを形成する反応を含む、前記DNA増幅方法。 - DNA増幅方法が、マルチプリープライムローリングサークル増幅法(MPRCA)、またはマルチプルディスプレースメント増幅法(MDA)である、請求項1に記載のDNA増幅方法。
- 鋳型DNAが直鎖状である、請求項1または2に記載のDNA増幅方法。
- DNA合成反応とニック形成反応とを同時に行う、請求項1〜3のいずれか一項に記載のDNA増幅方法。
- 一価および/または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法に用いるための反応液組成物であって、
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される1または2以上の陰イオンである、前記反応液組成物。 - 一価および/または二価の陽イオンの濃度が5 mM以上である、請求項5に記載の反応液組成物。
- 一価および二価の陽イオンを含み、該一価および二価の陽イオンがそれぞれ異なる陰イオンと対形成している、請求項5または6に記載の反応液組成物。
- 陽イオンが、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、およびマンガンイオンからなる群より選択される1または2以上を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の反応液組成物。
- 鎖置換型DNA合成酵素およびRNase Hの双方の活性を促進する、請求項5〜8のいずれか一項に記載の反応液組成物。
- pH調製剤をさらに含み、該pH調製剤が塩化物イオンを含まない、請求項5〜9のいずれか一項に記載の反応液組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法に用いるRNAプライマーであって、塩基の全てまたは一部がチオリン酸エステル結合により結合されている、前記プライマー。
- 5’末端から少なくとも1塩基がRNAである、請求項11に記載のプライマー。
- 3’末端から少なくとも3塩基が非修飾RNA塩基である、請求項11または12に記載のプライマー。
- 5’末端から少なくとも1塩基が非修飾RNAまたは修飾RNA塩基である、請求項13に記載のプライマー。
- ランダムプライマーである、請求項11〜14のいずれか一項に記載のプライマー。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法のためのキットであって、
請求項5〜10のいずれか一項に記載の組成物、および/または
請求項11〜15のいずれか一項に記載のプライマー
を含む、前記キット。
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