ES2964592T3 - Circularización y amplificación de ácido nucleico asistida por ligasa - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para la generación y amplificación de un círculo de ADN monocatenario en un único recipiente de reacción a partir de un ADN lineal sin ninguna etapa de purificación intermedia. El círculo de ADN monocatenario se genera mediante una ligación de ADN monocatenario independiente de la plantilla. También se proporciona la amplificación del genoma completo del ADN cromosómico lineal en un solo tubo mediante amplificación del ADN asistida por ligadura. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Circularización y amplificación de ácido nucleico asistida por ligasa

Campo de invención

La invención se refiere generalmente a métodos para amplificar una secuencia de ácido nucleico lineal mediante amplificación de círculo rodante en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa de aislamiento y/o purificación intermedia. Los métodos implican la generación de un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA lineal monocatenario o bicatenario mediante la unión de DNA monocatenario independiente de la plantilla, seguido de una amplificación de círculo rodante utilizando secuencias de cebadores especializados. Los métodos se refieren además a la amplificación del genoma completo de un DNA cromosómico lineal en un único recipiente de reacción mediante amplificación de círculo rodante utilizando una mezcla de cebadores aleatorios seguida de su detección.

Antecedentes

La amplificación del DNA es un proceso de replicación de un DNA bicatenario (dsDNA) objetivo para generar múltiples copias del mismo. Dado que las cadenas individuales de un dsDNA son antiparalelas y complementarias, cada cadena puede servir como una cadena plantilla para la producción de su cadena complementaria. La cadena plantilla se conserva como una porción entera o como una porción truncada y la cadena complementaria se ensambla a partir de trifosfatos de desoxinucleósidos (dNTPs) mediante una DNA polimerasa. La síntesis de la cadena complementaria se desarrolla en la dirección 5 '^ 3 ' comenzando desde el extremo 3' terminal de una secuencia de cebador que se hibrida con la cadena plantilla.

La amplificación del genoma completo (WGA) implica la amplificación no específica de un DNA objetivo. La WGA a menudo se logra mediante técnicas de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) que emplean cebadores de oligonucleótidos aleatorios para cebar la síntesis de DNA en múltiples localizaciones del DNA objetivo junto con una DNA polimerasa de alta fidelidad que tiene una actividad de desplazamiento de cadena (por ejemplo, polimerasa Phi29). Aunque los sistemas de WGA comerciales actualmente disponibles, tales como los kits GenomiPhi (GE Healthcare, USA) y RepliG (Qiagen), proporcionan resultados óptimos con DNA objetivo de alto peso molecular, el rendimiento de estos sistemas es deficiente cuando el DNA objetivo es corto y/o está muy fragmentado. Cuando el DNA objetivo está fragmentado y la longitud de la secuencia es inferior a aproximadamente 1000 nucleótidos, la amplificación del DNA objetivo usando métodos convencionales da como resultado una disminución de la velocidad de amplificación, una pérdida significativa de la secuencia, especialmente cerca de los extremos del DNA objetivo, y una amplificación altamente sesgada en la secuencia. A medida que disminuye la longitud del DNA plantilla, la probabilidad de que esa cadena se cebe varias veces disminuye en la reacción de MDA. Esto disminuye el potencial de amplificación de estos fragmentos más cortos. Por lo tanto, son muy deseables métodos eficaces para amplificar de forma no específica DNA corto y fragmentado.

Se ha utilizado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por unión para amplificar el dsDNA fragmentado. Sin embargo, sólo una pequeña fracción del DNA fragmentado se consigue amplificar en estas reacciones, lo que conduce a una cobertura genómica inadecuada. Para amplificar eficientemente el dsDNA plantilla fragmentado, primero se pueden reparar y después concatemerizar mediante la unión de extremos romos para generar secuencias que tengan más de 1000 pares de bases (bp) de longitud. Sin embargo, a menudo se requiere una concentración relativamente mayor del DNA objetivo para promover la concatamerización y la amplificación posterior. La circularización del DNA objetivo bicatenario también se ha empleado en varios ensayos basados en ácidos nucleicos, incluyendo MDA, WGA, amplificación de círculo rodante hiperramificado (RCA) y secuenciación masiva de DNA en paralelo (véase, por ejemplo, el documento de Patente US20150031086 y Tsaftaris et al 2009 Biotechnol Lett; 32: 157-61). Para circularizar y amplificar eficazmente el dsDNA fragmentado, primero se reparan los extremos bicatenarios del DNA fragmentado, seguido de una unión de extremos romos para formar círculos de DNA bicatenario. Sin embargo, es difícil circularizar fragmentos de DNA bicatenario que tengan menos de 500 bp de longitud.

El DNA bicatenario se desnaturaliza para producir DNA monocatenario (ssDNA), que puede circularse aún más en una reacción de unión intramolecular dependiente de la plantilla utilizando una ligasa. Sin embargo, se requiere información previa de la secuencia del DNA objetivo para realizar una circularización dependiente de la plantilla. También se ha documentado la unión intramolecular del ssDNA independiente de la plantilla.

Por ejemplo, la RNA ligasa TS2126 (disponible comercialmente con las marcas registradas THERMOPHAGE™ RNA ligasa II o THERMOPHAGE™ ssDNA ligasa (Prokaria, Matis, Islandia) o CIRCLIGASE™ ssDNA ligasa (Epicenter Biotechnologies, Wisconsin, USA) se ha utilizado para fabricar bolas de DNA digitales y/o escisión y amplificación de ADN específicas de locus, tal como el DNA genómico. CIRCLIGASE I™ tiene un bajo grado (aproximadamente el 30%) de adenilación mientras que la CIRCLIGASE II™ comprende una forma sustancialmente adenilada de RNA ligasa TS2126. Las moléculas de DNA complementario (cDNA) monocatenario, lineal preparadas a partir de fragmentos de mRNA del extremo 5' también se han amplificado mediante replicación de círculo rodante después de la circularización utilizando RNA ligasa TS2126. Al incorporar apropiadamente una secuencia promotora de RNA polimerasa con sentido en el cDNA, se ha demostrado que la plantilla de cDNA circularizada actúa como un sustrato de transcripción y, por lo tanto, efectúa la amplificación de las moléculas de mRNA en una muestra biológica. Además, la RNA ligasa TS2126 se ha utilizado para amplificar los extremos del cDNA para la amplificación aleatoria de los extremos del cDNA (RACE). A partir de cantidades limitadas de DNA fragmentado, también se ha generado una plantilla de DNA para la amplificación de círculo rodante empleando la RNA ligasa TS2126. El método implicó desnaturalizar el dsDNA lineal y fragmentado para obtener fragmentos de ssDNA lineales, uniendo el ssDNA lineal con CIRCLIGASE™ ssDNA ligasa para obtener un círculo de DNA monocatenario y amplificar después el círculo de DNA monocatenario utilizando cebadores aleatorios y DNA polimerasa Phi29 mediante RCA. Sin embargo, incluso después de optimizar las condiciones de reacción, la cantidad de DNA circular monocatenario generado fue muy variable y dependiente de la secuencia. Por ejemplo, los oligonucleótidos que comprenden un nucleótido 5'G y un 3'T se unieron significativamente mejor que su oligonucleótido complementario que comprende un 5'A y un 3'C en condiciones de unión idénticas. Además, la eficacia de la unión intramolecular varió entre secuencias de ssDNA lineales que tenían tamaños idénticos o muy similares, pero con pequeñas diferencias en la secuencia de nucleótidos. La eficiencia también varió entre secuencias de ssDNA lineales de diferentes tamaños (por ejemplo, longitud de secuencia que varía de 100 bases a kilobases de tamaño). Además, todos los intentos de reacciones de unión-amplificación implicaron etapas intermedias de aislamiento, purificación y/o limpieza, lo que hizo que el flujo de trabajo de unión-amplificación fuera engorroso. Por ejemplo, el análisis de muestras forenses de DNA fragmentado mediante circularización seguida de amplificación de círculo rodante se llevó a cabo en múltiples etapas que comprenden fosforilación de DNA en 5', unión del adaptador, circularización de DNA y amplificación del genoma completo. Las reacciones de cada etapa se sometieron a una limpieza de reacción antes de realizar la siguiente etapa. Además, el proceso de múltiples etapas a menudo resultaba en la pérdida del DNA plantilla y conducía a análisis fallidos. No se observó ninguna ventaja en la amplificación cuando la unión y la amplificación se realizaron en un único recipiente de reacción; además se encontró que los componentes de la reacción de unión que se llevó a cabo a menudo eran inhibidores de la reacción de amplificación posterior. Por lo tanto, son muy deseables métodos eficaces para amplificar de forma no específica secuencias cortas de DNA en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa de limpieza intermedia, especialmente en los casos en donde se desea información representativa y equilibrada del genoma completo. Además, son muy deseables métodos para amplificar una secuencia de ácido nucleico lineal mediante amplificación de círculo rodante en un único recipiente de reacción que supere la inhibición provocada por los reactivos en cada una de las uniones-amplificaciones.

Breve descripción

En algunas realizaciones, se proporciona un método para la amplificación de un DNA cromosómico lineal mediante amplificación de círculo rodante. El método comprende las etapas de proporcionar el DNA cromosómico lineal, realizar una unión intramolecular del DNA cromosómico lineal usando una ligasa que es capaz de la unión intramolecular independiente de la plantilla del DNA monocatenario para generar un círculo de DNA monocatenario y amplificar el círculo de DNA monocatenario mediante amplificación de círculo rodante. La amplificación de círculo rodante emplea una mezcla de cebadores aleatorios que incluye secuencias de oligonucleótidos que tienen al menos un análogo de nucleótido. Todas las etapas del método, incluyendo la reacción de unión y la reacción de amplificación de círculo rodante, se realizan en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de aislamiento o purificación. El DNA cromosómico lineal, si está en forma bicatenaria, se desnaturaliza para generar DNA monocatenario antes de la reacción de unión intramolecular. En algunas realizaciones, el método se usa para la amplificación del genoma completo de un DNA objetivo.

Dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la invención se entenderán mejor cuando se lea la siguiente descripción detallada con referencia a las figuras adjuntas.

La Figura 1 muestra una representación esquemática de una realización de una amplificación del genoma completo asistida por ligasa de un dsDNA fragmentado.

La Figura 2 muestra perfiles de tamaño del DNA circulante aislado del plasma sanguíneo de individuos sanos.

La Figura 3A muestra una amplificación del genoma completo asistida por ligasa del DNA circulante extraído de la fracción no celular de sangre completa, usando CIRCLIGASE II™.

La Figura 3B muestra una amplificación del genoma completo asistida por ligasa del DNA circulante extraído de la fracción no celular de sangre completa, usando DNA ligasa T4.

La Figura 3C muestra una amplificación del genoma completo asistida por ligasa del DNA circulante extraído de la fracción no celular de sangre completa, utilizando DNA ligasa deE. coli.

La Figura 4 muestra la eficacia de la amplificación del genoma completo asistida por ligasa para una amplificación de DNA sensible y equilibrada de cuatro loci CODIS diferentes.

La Figura 5 muestra la eficacia de la amplificación del genoma completo asistida por ligasa para una amplificación de DNA sensible y equilibrada de doce loci CODIS diferentes.

La Figura 6 muestra la eficiencia de la amplificación del genoma completo asistida por ligasa en diferentes condiciones de reacción y tampón.

La Figura 7 muestra la inhibición de la amplificación de DNA genómico de alto peso molecular en la amplificación del genoma completo asistida por ligasa.

La Figura 8 muestra una representación esquemática de la amplificación del genoma completo asistida por ligasa que incluye el procesamiento (por ejemplo, reparación final) de un DNA fragmentado usando una polinucleótido quinasa seguido de una amplificación asistida por ligasa del DNA fragmentado procesado.

La Figura 9 muestra una representación esquemática de una reacción en un solo tubo de la amplificación asistida por ligasa del DNA fragmentado empleando PNK y CIRCLIGASE II™ en presencia de GTP.

La Figura 10 muestra una reacción de amplificación asistida por ligasa en un solo tubo usando plasma/sangre de hombre-mujer, en donde el marcador específico de hombre DYS14 se detecta usando una biblioteca creada a partir del DNA de entrada.

La Figura 11 muestra una representación esquemática de la fosforilación y pre-adenilación del DNA fragmentado seguida de la unión usando una ligasa sustancialmente no adenilada.

La Figura 12 muestra la eficacia mejorada de la circularización de una secuencia de DNA pre-adenilada usando una ligasa sustancialmente no adenilada.

La Figura 13 muestra la eficacia mejorada de la amplificación del genoma completo asistida por ligasa cuando la secuencia de DNA objetivo estaba pre-adenilada y cuando la unión se realizó usando una ligasa no adenilada.

La Figura 14 muestra una amplificación del genoma completo asistida por ligasa del DNA plasmático, usando CIRCLIGASE™ II.

La Figura 15 muestra el análisis cualitativo del DNA amplificado con respecto a la profundidad de cobertura y los niveles de uniformidad.

La Figura 16 muestra la cobertura general y la uniformidad observadas en toda la región de la secuencia objetivo usando los hexámeros AT.

La Figura 17 muestra la profundidad de la cobertura cuando se emplearon uracil DNA glicosilasa (UDG) y formamidopirimidin-DNA glicosilasa (Fpg) para reparar/eliminar el daño del DNA monocatenario antes de la generación del círculo del DNA monocatenario o para reparar/eliminar el daño de los círculos de DNA monocatenario generados, o cuando no se realizó ninguna reparación/eliminación del daño del DNA.

La Figura 18 muestra la profundidad y uniformidad de la cobertura cuando se emplearon uracil DNA glicosilasa (UDG) y formamidopirimidin-DNA glicosilasa (Fpg) para reparar/eliminar el daño del DNA del DNA monocatenario antes de la generación del círculo de DNA monocatenario o para reparar/ eliminar el daño del DNA de los círculos de DNA monocatenario generados, o cuando no se realizó ninguna reparación/eliminación del daño del DNA.

La Figura 19 muestra ese mejor valor predictivo positivo (PPV) y sensibilidad cuando se emplearon uracil DNA glicosilasa (UDG) y formamidopirimidin-DNA glicosilasa (Fpg) para reparar/eliminar el daño del DNA del círculo de DNA monocatenario antes de la amplificación de círculo rodante, o para reparar/eliminar el daño del DNA de los círculos de DNA monocatenario generados, o cuando no se realizó ninguna reparación/eliminación del daño del DNA.

Descripción detallada

La siguiente descripción detallada es ejemplar y no pretende limitar la invención o los usos de la invención. A lo largo de la memoria descriptiva, la ejemplificación de términos específicos debe considerarse como ejemplos no limitantes. Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se puede aplicar un lenguaje aproximado, tal y como se utiliza en la presente memoria a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variar permisiblemente sin dar como resultado un cambio en la función básica con la que está relacionada. En consecuencia, un valor modificado por un término tal como "aproximadamente" no debe limitarse al valor preciso especificado. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc. utilizadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones deben entenderse modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la solicitud de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debería al menos interpretarse a la luz del número de dígitos significativos reportados y aplicando técnicas ordinarias de redondeo. Cuando fue necesario, se han suministrado intervalos, y esos intervalos incluyen todos los subintervalos intermedios. Para describir y señalar de forma más clara y concisa el objetivo de la invención reivindicada, se proporcionan las siguientes definiciones para términos específicos, que se utilizan en la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en la presente memoria, el término "nucleósido" se refiere a un compuesto de glicosilamina en donde una base de ácido nucleico (nucleobase) se une a un resto de azúcar. Un "nucleótido" se refiere a un fosfato de nucleósido. Un nucleótido se puede representar usando letras alfabéticas (designación de letras) que corresponden a su nucleósido como se describe en la Tabla 1. Por ejemplo, A indica adenosina (un nucleósido que contiene la nucleobase, adenina), C indica citidina, G indica guanosina, U indica uridina, y T indica timidina (5-metil uridina). W indica A o T/U, y S indica G o C. N representa un nucleósido aleatorio y dNTP se refiere a trifosfato de desoxirribonucleósido. N puede ser uno cualquiera de A, C, G o T/U.

Tabla 1: Designaciones de letras de varios nucleótidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "análogo de nucleótido" se refiere a compuestos que son estructuralmente análogos a los nucleótidos naturales. El análogo de nucleótido puede tener una cadena principal de fosfato alterada, un resto de azúcar alterado, una nucleobase alterada o combinaciones de los mismos. Los análogos de nucleótidos pueden ser un nucleótido natural, un nucleótido sintético, un nucleótido modificado o un resto de reemplazo sustituto (por ejemplo, inosina). Generalmente, los análogos de nucleótidos con nucleobases alteradas confieren, entre otras cosas, diferentes propiedades de emparejamiento de bases y apilamiento de bases. Como se utiliza en la presente memoria, el término "nucleótido LNA (ácido nucleico bloqueado)" se refiere a un análogo de nucleótido, en donde el resto de azúcar del nucleótido contiene una unidad de furanosa bicíclica bloqueada en una conformación de azúcar que imita el ácido ribonucleico (RNA). El cambio estructural de un desoxirribonucleótido (o un ribonucleótido) al nucleótido LNA está limitado desde una perspectiva química, es decir, la introducción de un enlace adicional entre los átomos de carbono en la posición 2' y la posición 4' (por ejemplo, enlace 2'-C, 4'-C-oximetileno; véase, por ejemplo, Singh, S. K., et. al., Chem. Comm., 4, 455-456, 1998, o Koshkin, A. A., et. al., Tetrahedron, 54, 3607-3630, 1998). Las posiciones 2' y 4' de la unidad de furanosa en el nucleótido LNA pueden estar unidas mediante un O-metileno (por ejemplo, oxi-LNA: nucleótido 2'-O,4'-C-metilen-p-D-ribofuranosilo), un S-metileno (tio-LNA), o un resto NH-metileno (amino-LNA), y similares. Dichos enlaces restringen la libertad conformacional del anillo de furanosa. Los oligonucleótidos de LNA muestran una afinidad de hibridación mejorada hacia el RNA monocatenario complementario y el DNA monocatenario o bicatenario complementario. Los oligonucleótidos de LNA pueden inducir conformaciones dúplex de tipo A (similares a RNA). Los análogos de nucleótidos que tienen una cadena principal de fosfato-azúcar alterada (por ejemplo, PNA, LNA) a menudo modifican, entre otras cosas, las propiedades de la cadena, tales como la formación de estructuras secundarias. Un signo de estrella (*) que precede a la designación de letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido modificado con fosforotioato. Por ejemplo, *N representa un nucleótido aleatorio modificado con fosforotioato. Un signo más (+) que precede a la designación de letra indica que el nucleótido designado por la letra es un nucleótido de LNA. Por ejemplo, A representa un nucleótido de LNA de adenosina y N representa un nucleótido aleatorio bloqueado (es decir, un nucleótido de LNA aleatorio). La designación de letras "(at N)" representa un nucleótido aleatorio que contiene las nucleobases 2-amino dA, 2-tiodT, G o C.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "oligonucleótido" se refiere a oligómeros de nucleótidos. El término "ácido nucleico", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a polímeros de nucleótidos. El término "secuencia", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido o un ácido nucleico. A lo largo de la memoria descriptiva, siempre que un oligonucleótido o ácido nucleico esté representado por una secuencia de letras, los nucleótidos están en orden 5 '^ 3 ' de izquierda a derecha. Por ejemplo, un oligonucleótido representado por una secuencia de letras (W)X(N)y(S)z, en donde x=2, y=3 y z=1, representa una secuencia de oligonucleótidos WWNNNS, en donde W es el nucleótido 5’ terminal y S es el nucleótido 3’ terminal. Los oligonucleótidos o ácidos nucleicos pueden ser un DNA, un RNA o sus análogos (por ejemplo, un análogo de fosforotioato). Los oligonucleótidos o ácidos nucleicos también pueden incluir bases y/o cadenas principales modificadas (por ejemplo, enlace fosfato modificado o resto de azúcar modificado). Los ejemplos no limitantes de cadenas principales sintéticas que confieren estabilidad y/u otras ventajas a los ácidos nucleicos pueden incluir enlaces fosforotioato, ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado, ácido nucleico de xilosa o análogos de los mismos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido lineal corto que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, una plantilla de DNA que se va a amplificar) para cebar una reacción de síntesis de ácido nucleico. El cebador puede ser un oligonucleótido de RNA, un oligonucleótido de DNA o una secuencia quimérica. El cebador puede contener nucleótidos naturales, sintéticos o modificados. Tanto el límite superior como el inferior de la longitud del cebador se determinan empíricamente. El límite inferior de la longitud del cebador es la longitud mínima que se requiere para formar un dúplex estable tras la hibridación con el ácido nucleico objetivo en condiciones de reacción de amplificación del ácido nucleico. Los cebadores muy cortos (normalmente de menos de 3 nucleótidos de longitud) no forman dúplex termodinámicamente estables con el ácido nucleico objetivo en dichas condiciones de hibridación. El límite superior se determina a menudo por la posibilidad de tener una formación dúplex en una región distinta de la secuencia de ácido nucleico predeterminada en el ácido nucleico objetivo. Generalmente, las longitudes de cebador adecuadas están en el intervalo de aproximadamente 3 nucleótidos de longitud a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "cebador aleatorio" se refiere a una mezcla de secuencias de cebadores, generadas aleatorizando un nucleótido en cualquier localización dada en una secuencia de oligonucleótidos de tal manera que la localización dada pueda consistir en uno cualquiera de los posibles nucleótidos o sus análogos (aleatorización completa). Por lo tanto, el cebador aleatorio es una mezcla aleatoria de secuencias de oligonucleótidos, que consiste en todas las combinaciones posibles de nucleótidos dentro de la secuencia. Por ejemplo, un cebador aleatorio hexámero puede estar representado por una secuencia NNNNNN o (N)6. Un cebador de DNA aleatorio hexámero consiste en todas las combinaciones hexámeras posibles de 4 nucleótidos de DNA, A, C, G y T, lo que da como resultado una mezcla aleatoria que comprende 46 (4,096) secuencias únicas de oligonucleótidos de DNA hexámero. Los cebadores aleatorios pueden usarse eficazmente para cebar una reacción de síntesis de ácido nucleico cuando se desconoce la secuencia del ácido nucleico objetivo o para una reacción de amplificación del genoma completo.

Como se describe en la presente memoria, el término "cebador parcialmente restringido" se refiere a una mezcla de secuencias de cebador, generada aleatorizando completamente algunos de los nucleótidos de una secuencia de oligonucleótidos (es decir, el nucleótido puede ser uno cualquiera de A, T/U, C, G, o sus análogos) al tiempo que restringe la aleatorización completa de algunos otros nucleótidos (es decir, la aleatorización de nucleótidos en ciertas localizaciones es en menor medida que las posibles combinaciones A, T/U, C, G o sus análogos). Por ejemplo, un cebador hexámero de DNA parcialmente restringido representado por WNNNNN, representa una mezcla de secuencias de cebador en donde el nucleótido 5’ terminal de todas las secuencias en la mezcla es A o T. Aquí, el nucleótido 5’ terminal está restringido a dos posibles combinaciones (A o T) en contraste con el máximo de cuatro combinaciones posibles (A, T, G o C) de un cebador de DNA completamente aleatorio (NNNNNN). Las longitudes de cebador adecuadas de un cebador parcialmente restringido pueden estar en el intervalo de aproximadamente 3 nucleótidos de longitud a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud.

Tal y como se describe en la presente memoria, el término "cebador parcialmente restringido que tiene una estructura de cebador-dímero de desajuste terminal" se refiere a una secuencia de cebador parcialmente restringido, en donde cuando dos secuencias de cebador individuales en el cebador parcialmente restringido se hibridan entre sí intermolecularmente, con una homología interna de tres o más nucleótidos, para formar una estructura de cebadordímero que no tiene extremos rebajados, o una estructura de cebador-dímero que tiene una base de un solo nucleótido con extremos rebajados en 3', o una estructura de cebador-dímero que tiene una base de dos nucleótidos con extremos rebajados en 3', existe un desajuste de nucleótidos (es decir, los nucleótidos no forman pares de bases) en ambos nucleótidos 3’ terminales en la estructura del cebador-dímero. Por ejemplo, un cebador pentámero parcialmente restringido representado por WNNNS proporciona una desajuste terminal en ambos nucleótidos 3’ terminales cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura cebador-dímero que no tiene extremos rebajados. En la estructura del cebador-dímero, existe una homología interna de tres nucleótidos (es decir, los tres nucleótidos aleatorios en WNNNS pueden emparejarse entre sí cuando la estructura del cebador-dímero que no tiene extremos rebajados se forma mediante hibridación intermolecular). Sin embargo, este ejemplo de cebador no proporciona un desajuste terminal cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura de cebador-dímero de base de un solo nucleótido con extremos rebajados en 3'. De manera similar, un cebador hexámero parcialmente restringido representado por WWNNNS proporciona un desajuste terminal en ambos nucleótidos 3’ terminales cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura de cebador-dímero que no tiene extremos rebajados. Además, este ejemplo de cebador proporciona un desajuste terminal en ambos nucleótidos 3’ terminales incluso cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura de cebador-dímero que tiene una base de un solo nucleótido con extremos rebajados en 3'. Un cebador de heptámero parcialmente restringido representado por WWWNNNS proporciona desajuste terminal en ambos nucleótidos 3’ terminales cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura de cebador-dímero que no tiene extremos rebajados. Además, este ejemplo de cebador proporciona un desajuste terminal en ambos nucleótidos 3’ terminales cuando se hibrida intermolecularmente para formar una estructura de cebador-dímero que tiene una base de un solo nucleótido con extremos rebajados en 3', o para formar una estructura de cebador-dímero que tiene una base de dos nucleótidos con extremos rebajados en 3'.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "amplificación de círculo rodante (RCA)" se refiere a una reacción de amplificación de ácido nucleico que amplifica una plantilla de ácido nucleico circular (por ejemplo, círculos de DNA monocatenario) mediante un mecanismo de círculo rodante. La reacción de amplificación de círculo rodante se inicia mediante la hibridación de un cebador con una plantilla de ácido nucleico circular, a menudo monocatenario. Después, la polimerasa de ácido nucleico extiende el cebador que se hibrida con la plantilla de ácido nucleico circular progresando continuamente alrededor de la plantilla de ácido nucleico circular para replicar la secuencia de la plantilla de ácido nucleico una y otra vez (mecanismo de círculo rodante). La amplificación de círculo rodante normalmente produce concatémeros que comprenden unidades repetidas en tándem de la secuencia de la plantilla de ácido nucleico circular. La amplificación de círculo rodante puede ser un RCA lineal (LRCA), que muestra una cinética de amplificación lineal (por ejemplo, RCA que usa un único cebador específico), o puede ser un RCA exponencial (ERCA) que muestra una cinética de amplificación exponencial. La amplificación de círculo rodante también se puede realizar utilizando cebadores múltiples (amplificación del círculo rodante con cebado múltiple o MPRCA) que conducen a concatémeros hiperramificados. Por ejemplo, en un RCA con doble cebado, un cebador puede ser complementario, como en el RCA lineal, a la plantilla de ácido nucleico circular, mientras que el otro puede ser complementario a las secuencias de ácido nucleico de unidades repetidas en tándem del producto de RCA. En consecuencia, el RCA con doble cebado puede proceder como una reacción en cadena con una cinética de amplificación exponencial (geométrica) que presenta una cascada ramificada de sucesos de hibridación múltiple, extensión de cebador y desplazamiento de cadena que implican a ambos cebadores. Esto genera a menudo un conjunto discreto de productos de amplificación de ácidos nucleicos bicatenarios concateméricos. La amplificación de círculo rodante se puede realizar in vitro en condiciones isotérmicas usando una polimerasa de ácido nucleico adecuada tal como la DNA polimerasa Phi29.

Tal y como se usa en la presente memoria, la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) se refiere a un método de amplificación de ácido nucleico, en donde la amplificación implica las etapas de hibridar un cebador con un ácido nucleico desnaturalizado seguido de una síntesis de ácido nucleico por desplazamiento de cadena. A medida que el ácido nucleico se sintetiza mediante desplazamiento de cadena, se produce un número gradualmente mayor de sucesos de cebado, formando una red de estructuras de ácido nucleico hiperramificadas. MDA es muy útil para la amplificación del genoma completo para generar DNA de alto peso molecular con sesgo de secuencia limitado a partir de una pequeña cantidad de muestra de DNA genómico. En MDA se puede utilizar cualquier polimerasa de ácido nucleico de desplazamiento de cadenas que tenga una actividad de desplazamiento de cadena aparte de su actividad de síntesis de ácidos nucleicos, tal como una DNA polimerasa Phi29 o un fragmento grande de la DNA polimerasa Bst. La MDA se realiza a menudo en condiciones de reacción isotérmicas, utilizando cebadores aleatorios para lograr la amplificación con un sesgo de secuencia limitado.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "ligasa pre-adenilada" se refiere a una ligasa que está en su forma adenilada. La forma adenilada de una ligasa es capaz de unir intramolecularmente una molécula lineal de ssDNA que tiene un grupo fosforilo en 5' y un grupo hidroxilo en 3' en ausencia de ATP o dATP. Una unión que utiliza una ligasa pre-adenilada se refiere a una reacción de unión en donde una alta proporción de las moléculas de ligasa que se usan en la reacción están en su forma adenilada. Generalmente más del 60% de las moléculas de ligasa pueden estar en su forma adenilada. En algunas realizaciones, cuando se realiza una reacción de unión usando una ligasa pre-adenilada, más del 70 % de las moléculas de ligasa empleadas para la reacción pueden estar en su forma adenilada. En algunas otras realizaciones, cuando se realiza una reacción de unión usando una ligasa pre-adenilada, más del 80 %, 90 % o 95 % de las moléculas de ligasa empleadas para la reacción pueden estar en su forma adenilada.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "enzima adenilante" se refiere a una enzima que es capaz de adenilar una secuencia nucleica para generar un ácido nucleico adenilado en 5'. El ácido nucleico adenilado en 5’ tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de ácido nucleico que tiene un grupo hidroxilo en su extremo 3' y tiene un nucleótido terminal adenilado en su extremo 5'. Por ejemplo, un DNA adenilado en 5' (AppDNA), se refiere a una secuencia de DNA que está adenilada en su extremo 5' y tiene un grupo hidroxilo en su extremo 3'.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "ligasa no adenilada" se refiere a una ligasa que está en su forma no adenilada. La forma no adenilada de la ligasa es capaz de unir intramolecularmente una molécula lineal de ssDNA 5'-adenilada que tiene un grupo hidroxilo en 3’ en ausencia de ATP o dATP. Una unión que utiliza una ligasa no adenilada se refiere a una reacción de unión en donde una alta proporción de las moléculas de ligasa que se usan en la reacción están en su forma no adenilada. Generalmente más del 60% de las moléculas de ligasa pueden estar en su forma no adenilada. En algunas realizaciones, cuando se realiza una reacción de unión usando una ligasa no adenilada, más del 70 % de las moléculas de ligasa empleadas para la reacción pueden estar en su forma no adenilada. En algunas otras realizaciones, cuando se realiza una reacción de unión usando una ligasa no adenilada, más del 80 %, 90 % o 95 % de las moléculas de ligasa empleadas para la reacción pueden estar en su forma no adenilada.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "temperatura de fusión" (Tm) de un dúplex cebador-plantilla de nucleico se refiere a una temperatura a la que la mitad del dúplex se disocia en moléculas monocatenarias. La estabilidad de un dúplex de cebador-plantilla de DNA puede medirse por su Tm. La longitud y la secuencia del cebador son determinantes críticos en el diseño de los parámetros de una amplificación exitosa. La temperatura de fusión del dúplex cebador-plantilla de nucleico aumenta con la longitud del cebador y con el aumento del contenido de GC. La concentración de sales monovalentes y divalentes (por ejemplo, K+, Mg<2>+, K+), la temperatura y la presencia de desnaturalizantes químicos pueden influir en la Tm de un dúplex de cebador-plantilla de ácido nucleico y puede usarse para alterar la estabilidad de los dúplex de cebador-plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo, la estabilidad del dúplex de DNA generalmente aumenta con concentraciones de sal más altas, pero disminuye en función del aumento de temperatura o en presencia de desnaturalizantes. Por ejemplo, altas concentraciones de sal (tal como NaCl) aumentan la Tm de un dúplex de cebador-DNA objetivo, debido a que los iones Na+ pueden proteger las cargas negativas en las cadenas principales de fosfodiéster, reduciendo así la repulsión electrostática de las cadenas de DNA. Por otro lado, las temperaturas más altas (más cercanas o superiores a la Tm del híbrido de cebador-DNA objetivo en las condiciones del tampón utilizadas) disminuye la estabilidad del dúplex y la eficiencia de la hibridación del DNA. La Tm de cualquier secuencia definida depende de los efectos combinados de la longitud del dúplex, el contenido de GC, la concentración de sal, la concentración de desnaturalizante y la composición del tampón, incluyendo el pH. Además, dado que se requiere hibridación durante las reacciones de amplificación del DNA, la compatibilidad del tampón con la actividad enzimática también es una preocupación importante. Para lograr una actividad enzimática óptima, no sólo se deben lograr las condiciones para la hibridación del cebador-plantilla, sino también condiciones para la estabilidad enzimática y la actividad enzimática. En algunos casos, la actividad enzimática óptima puede ocurrir en condiciones donde la hibridación cebador-objetivo no es óptima, y la inclusión de modificaciones en la composición del cebador que afectan la Tm puede usarse para mejorar la hibridación cebador-objetivo modificando la Tm del dúplex bajo esas condiciones utilizadas.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para generar un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA lineal mediante la incubación con una ligasa adecuada que sea capaz de unir intramolecularmente un DNA monocatenario independiente de la plantilla. El DNA lineal puede ser un DNA cromosómico lineal, un DNA circulante libre de células, un DNA antiguo o un DNA degradado por exposición ambiental, o un DNA fijado con formalina. En algunas realizaciones, el DNA lineal puede ser un DNA lineal fragmentado. La longitud de un DNA lineal fragmentado puede variar entre 15 nucleótidos y 21000 nucleótidos. El DNA lineal puede comprender secuencias que ya tienen extremos terminales unibles o puede comprender secuencias que tienen extremos terminales no unibles. En una realización, el DNA lineal puede comprender secuencias que ya tienen extremos terminales unibles. Por ejemplo, el DNA lineal puede tener ya un grupo fosfato en el extremo 5'-terminal y un grupo hidroxilo en el extremo 3'-terminal. Dichas secuencias de DNA son susceptibles de unión intramolecular tras la incubación con una ligasa adecuada. En algunas realizaciones, se proporciona un método para generar un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA cromosómico lineal, en donde el método incluye incubar el DNA cromosómico lineal con una ligasa que es capaz de unir de forma intramolecular independiente de la plantilla un DNA monocatenario para generar el círculo de DNA monocatenario. En algunas realizaciones, se usa una ligasa pre-adenilada para la reacción de unión. Puede emplearse cualquier ligasa pre-adenilada que sea capaz de unir secuencias de DNA monocatenario de manera independiente de la plantilla. En algunas realizaciones, se usa una forma sustancialmente adenilada de la RNA ligasa TS2126 para la reacción de unión intramolecular independiente de la plantilla. El DNA cromosómico lineal, si está en forma bicatenaria, debe desnaturalizarse antes de la reacción de unión intramolecular. La reacción de unión se puede realizar en ausencia de ATP y/o dATP.

En algunas realizaciones, el DNA lineal puede comprender secuencias que tienen extremos terminales no unibles. Por ejemplo, el DNA lineal puede tener un grupo hidroxilo en 5' o un grupo fosforilo en 3’ o ambos. En algunas realizaciones, el método comprende las etapas de proporcionar un DNA lineal, reparar el extremo del DNA lineal incubándolo con una polinucleótido quinasa (PNK) en presencia de un donante de fosfato para generar una secuencia de DNA unible que tiene un grupo fosfato en un extremo 5'-terminal y un grupo hidroxilo en un extremo 3'-terminal, y realizar una unión intramolecular de la secuencia de DNA unible con una ligasa para generar el círculo de DNA monocatenario. La reparación final puede incluir la fosforilación de un nucleótido 5' terminal, la desfosforilación de un nucleótido 3' terminal o ambas para generar la secuencia de DNA unible. El DNA unible y reparado en el extremo, si está en forma bicatenaria, debe desnaturalizarse antes de la reacción de unión intramolecular. En algunas realizaciones, el DNA se desnaturaliza antes de la reacción con PNK. La fosforilación o desfosforilación del DNA monocatenario es generalmente más eficaz que la de extremos romos o rebajados en 5' de doble cadena. El donante de fosfato y su concentración en la mezcla de reacción se seleccionan de manera que no inhiba la posterior reacción de unión intramolecular. Por ejemplo, se puede usar cualquier donante de fosfato adecuado distinto del trifosfato de adenosina (ATP) o trifosfato de desoxiadenosina (dATP) para la reacción de reparación final usando PNK. Los donantes de fosfato adecuados incluyen, pero no se limitan a, trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP) o trifosfato de dexoitimina (dTTP). En algunas realizaciones, se usa una ligasa preadenilada para la reacción de unión. Puede emplearse cualquier ligasa pre-adenilada que sea capaz de generar secuencias de DNA monocatenario independientes de la plantilla. En algunas realizaciones, se usa una forma sustancialmente adenilada de la RNA ligasa TS2126 para la reacción de unión intramolecular independiente de la plantilla. La reacción de quinasa y la reacción de unión se realizan en ausencia de ATP y/o dATP. Todas la etapas del método se realizan en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de aislamiento o purificación. Las etapas individuales de los métodos se pueden realizar simultáneamente o de manera secuencial sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento. Por ejemplo, se puede añadir PNK junto con GTP a un recipiente de reacción (por ejemplo, tubo Eppendorf) que contiene una solución de ácido nucleico que comprende el DNA objetivo lineal para facilitar la reparación final del DNA objetivo lineal. Cualquier PNK que tenga una fosforilación en 5' y una actividad de fosfatasa en 3' (por ejemplo, PNK T4) puede usarse para la reacción de reparación final. También se puede usar una combinación de PNKs, cada una de las cuales tiene fosforilación en 5' o una fosfatasa en 3' para la reacción de reparación final. Una vez que se completa la reacción de la quinasa, se puede añadir una ligasa pre-adenilada al mismo recipiente de reacción para facilitar la reacción de unión intramolecular.

El DNA lineal puede ser un DNA bicatenario o monocatenario de origen tanto natural como sintético. El DNA puede obtenerse de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra obtenida de un sujeto biológico) o descubrirse a partir de objetos desconocidos (por ejemplo, DNA obtenido durante una investigación forense)in vivooin vitro.Por ejemplo, se puede obtener de, pero no se limita a, fluidos corporales (por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero, orina, leche, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, linfa, lágrimas, esputo, saliva, heces, aspirado pulmonar, garganta o hisopos genitales), órganos, tejidos, cultivos celulares, fracciones celulares, secciones (por ejemplo, porciones seccionales de un órgano o tejido) o células aisladas del sujeto biológico o de una región particular (por ejemplo, una región que contiene células enfermas o células circulantes tumorales) del sujeto biológico. La muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene el DNA lineal objetivo (es decir, DNA lineal de interés) puede ser de origen eucariota, origen procariótico, origen viral u origen bacteriófago. Por ejemplo, el DNA lineal objetivo puede obtenerse de un insecto, un protozoo, un pájaro, un pez, un reptil, un mamífero (por ejemplo, rata, ratón, vaca, perro, cobaya o conejo), o un primate (por ejemplo, chimpancé o humano). El DNA lineal puede ser un DNA genómico (por ejemplo, un DNA cromosómico lineal) o un cDNA (DNA complementario). El cDNA puede generarse a partir de una plantilla de RNA (por ejemplo, mRNA, RNA ribosómico) usando una enzima transcriptasa inversa. El DNA lineal puede ser un DNA fragmentado y puede tener nucleótidos terminales no unibles. Por ejemplo, el DNA lineal puede comprender un grupo hidroxilo en 5' y/o un grupo fosfato en 3' de modo que una DNA ligasa no pueda realizar una reacción de unión intramolecular. El DNA lineal puede dispersarse en solución o puede inmovilizarse sobre un soporte sólido, tal como en transferencias, ensayos, matrices, portaobjetos de vidrio, placas de microtitulación o placas de ELISA. Por ejemplo, el DNA lineal puede inmovilizarse sobre un sustrato a través de un cebador y después puede circularizarse y amplificarse.

Cuando el DNA lineal está en forma bicatenaria, es necesario desnaturalizarlo a una forma monocatenaria antes de la reacción de unión intramolecular. Esto se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos reconocidos en la técnica para la conversión de secuencias de dsDNA a ssDNA. Por ejemplo, el dsDNA puede desnaturalizarse térmicamente, desnaturalizarse químicamente o desnaturalizarse tanto térmica como químicamente. El dsDNA se puede desnaturalizar químicamente usando un desnaturalizante (por ejemplo, glicerol, etilenglicol, formamida, urea o una combinación de los mismos) que reduce la temperatura de fusión del dsDNA. El desnaturalizante puede reducir la temperatura de fusión entre 5°C y 6°C por cada 10% (vol./vol.) del desnaturalizante añadido a la mezcla de reacción. El desnaturalizante o combinación de desnaturalizantes (por ejemplo, 10% de glicerol y 6-7% de etilenglicol) puede comprender 1 %, 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la mezcla de reacción (vol./vol.). Se pueden incluir sales que reducen la rigurosidad de la hibridación en los tampones de reacción a concentraciones bajas para desnaturalizar químicamente el dsDNA a bajas temperaturas. El dsDNA se puede desnaturalizar térmicamente calentando el dsDNA, por ejemplo, a 95°C.

Después de la etapa de desnaturalización, el ssDNA generado se puede tratar con una DNA o RNA ligasa que sea capaz de unir intramolecularmente sustratos de ssDNA en ausencia de una plantilla para formar los círculos de DNA monocatenario. Las ligasas adecuadas que pueden usarse para la reacción de unión incluyen, pero no se limitan a, RNA ligasa TS2126, una RNA ligasa T4, d Na ligasa T4, DNA ligasa T3 o DNA ligasa deE. coli.La conversión de moléculas de DNA monocatenarias lineales a círculos de DNA monocatenario se realiza convencionalmente mediante una reacción de unión intramolecular dependiente de la plantilla utilizando una enzima de unión tal como la RNA ligasa T4. Sin embargo, la unión intramolecular dependiente de la plantilla de DNA monocatenario o RNA monocatenario sólo ha tenido un éxito limitado, particularmente cuando la circularización de moléculas de ssDNA se va a realizar en una población de moléculas de ssDNA de secuencia y/o tamaño desconocidos. Aunque el bacteriófago RNA ligasa I T4 muestra una actividad de unión intramolecular independiente de la plantilla, esta actividad es demasiado baja e ineficaz para el uso práctico en la generación de moléculas de ssDNA circulares a partir de moléculas de ssDNA lineales.

En algunas realizaciones, la conversión del ssDNA en un círculo de DNA monocatenario se realiza con una RNA ligasa termoestable que tiene buena actividad de unión intramolecular independiente de la plantilla para sustratos de ssDNA y/o ssRNA que tienen un grupo fosforilo en 5' y un grupo hidroxilo en 3'. La ligasa puede estar en una forma sustancialmente pre-adenilada. Por ejemplo, la RNA ligasa TS2126 derivada del bacteriófago Thermus TS2126 que infecta la bacteria termófila,Thermus scotoductuspuede emplearse para la circularización independiente de la plantilla del ssDNA lineal y fragmentado a ssDNA circular. La RNA ligasa TS2126 es más termoestable (estable hasta aproximadamente 75°C) que muchas de las RNA ligasas mesófilas, tal como la RNA ligasa T4. El intervalo de temperatura para la actividad de la RNA ligasa TS2126 puede ser superior a aproximadamente 40°C, por ejemplo, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 75°C. Debido a esto, la RNA ligasa TS2126 se puede utilizar a temperaturas más altas, lo que reduce aún más las estructuras secundarias no deseadas del ssDNA. La circularización del ssDNA lineal también se puede lograr mediante una ligasa distinta de la RNA ligasa TS2126 o empleando cualquier otra enzima que tenga actividad de unión al DNA, tal como la topoisomerasa. En algunas realizaciones, la circularización de una molécula de DNA monocatenaria y fragmentada se logra mediante una RNA ligasa 1 derivada de arqueobacterias termófilas,Methanobacterium thermoautotrophicum(RNA ligasa Mth) que tiene una alta actividad de ligasa independiente de la plantilla para circularizar las moléculas de ssDNA lineales y fragmentadas.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para mejorar la eficacia de la circularización del ssDNA mediante la RNA ligasa TS2126. El uso de tampón HEPES que tiene un pH de 8,0 para la reacción de unión aumentó la eficacia de la unión. La unión de ssDNA independiente de la plantilla fue ineficaz cuando la reacción se realizó en tampón TRIS (por ejemplo, para CIRCLIGASE II™, el tampón de reacción 10x sugerido por EpiCenter comprende TRIS-acetato 0,33 M (pH 7,5), acetato de potasio 0,66 M y DTT 5 mM). Además, el manganeso, un cofactor esencial para la reacción de unión, se oxida rápidamente en condiciones alcalinas y forma un precipitado en presencia de TRIS. La oxidación al aire de Mn2+ a Mn3+ puede ser facilitada por los aniones que pueden complejar fuertemente los iones Mn3+. Por ejemplo, cuando se utilizan volúmenes iguales de TRIS de 0,2 mol/litro con pH ajustado apropiadamente con HCl y MnCl<2>2 mmol/litro se mezclaron, el cambio de color fue inmediato a pH 9,3 (el pH de la base TRIS sola); tuvo un retraso inicial de aproximadamente 3 minutos a pH 8,5; y no fue detectable en 1 hora a valores de pH inferiores a 8,3. Aunque la reacción no ocurrió a un pH más bajo, los cambios observados a un pH más alto no se revirtieron al añadir ácido. Debido a la rápida oxidación del manganeso en el tampón TRIS, es esencial una mayor concentración de manganeso para la reacción de unión (por ejemplo, adición de MnCl<2>hasta una concentración final de 2,5 mM) cuando la unión intramolecular se realiza en tampón TRIS. Además, resulta difícil predecir con precisión la concentración de trabajo de manganeso en la reacción ya que la concentración de manganeso continúa disminuyendo con el tiempo. Concentraciones más altas de manganeso pueden conducir a una mayor tasa de error de la polimerasa durante la amplificación cuando la unión y la amplificación se realizan en un único recipiente de reacción. Al sustituir el tampón TRIS por tampón HEPES en la reacción de unión, se puede lograr una unión intramolecular eficaz con una concentración de iones de manganeso inferior a 0,5 mM. Aparte de HEPES, cualquiera de los otros tampones de Good (véase, por ejemplo, Good, Norman et al. Biochemistry, 5 (2): 467-477, 1966; y Good, Norman et al., Methods Enzymol., 24: 53-68, 1972.) se puede emplear para la reacción de unión intramolecular. En una realización, la reacción de unión intramolecular se realiza en tampón HEPES 35 mM (pH = 8,0) que contiene aproximadamente MnCl<2>2,5 mM, KOAc aproximadamente 66 mM, DTT aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 0,003 % (p/p) de Tween-20 y betaína aproximadamente 0,5 M.

Los círculos de ssDNA en la mezcla de reacción de unión se pueden amplificar en condiciones isotérmicas mediante métodos de amplificación de círculo rodante (RCA). Los reactivos de amplificación, incluyendo la DNA polimerasa, los cebadores y los dNTPs, se pueden añadir al mismo recipiente de reacción para producir una mezcla de reacción de amplificación e iniciar una reacción RCA. Los reactivos individuales que se utilizan para la reacción de amplificación pueden tratarse previamente para eliminar cualquier ácido nucleico contaminante. La descontaminación de los reactivos de amplificación se puede realizar empleando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para la reacción de RCA se puede utilizar una DNA polimerasa a prueba de descontaminación, tal como la DNA polimerasa phi29 descontaminada. La descontaminación de un DNA de corrección de prueba se puede realizar incubándolo con un catión divalente en ausencia de cualquier dNTPs para eliminar los ácidos nucleicos contaminantes. La DNA polimerasa que carece de capacidades de corrección de pruebas, tal como la DNA polimerasa Bst, se puede usar después de incubarla con una DNA polimerasa de corrección de pruebas en presencia de un catión divalente y en ausencia de dNTPs para eliminar los ácidos nucleicos contaminantes. La descontaminación también puede realizarse incubando los reactivos de amplificación con nucleasas tales como una DNasa. Si la descontaminación se realiza empleando una nucleasa, es necesario eliminarla o digerirla antes de la reacción de amplificación. La mezcla de reacción de amplificación puede incluir además reactivos tales como proteínas de unión a DNA monocatenario y/o tampones de reacción de amplificación adecuados. La amplificación de los círculos de ssDNA se realiza en el mismo recipiente de reacción en donde se realiza la unión. No es necesario el aislamiento o la purificación de los círculos de ssDNA y/o la eliminación de la ligasa antes de la reacción de amplificación. El DNA amplificado puede detectarse mediante cualquiera de los métodos actualmente conocidos para la detección de DNA.

La RCA se puede realizar usando cualquiera de las DNA polimerasas que se conocen en la técnica (por ejemplo, una DNA polimerasa Phi29, una DNA polimerasa Bst). Se puede realizar utilizando una mezcla de cebadores aleatorios o utilizando un cebador específico. En algunas realizaciones, se usan cebadores aleatorios para la reacción de RCA. También se pueden usar secuencias de cebadores que comprenden uno o más análogos de nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos LNA, modificación de 2-Amino-dA o 2-Tio dT). En algunas realizaciones, se emplean cebadores resistentes a nucleasas (por ejemplo, secuencias de cebadores que comprenden grupos fosforotioato en posiciones apropiadas) para las reacciones de amplificación (por ejemplo, NNNN*N*N). En algunas realizaciones, RCA se puede realizar poniendo en contacto los círculos de ssDNA con una solución de cebador que comprende una mezcla de cebadores aleatorios para formar un complejo plantilla de ácido nucleico-cebador; poniendo en contacto el complejo plantilla de ácido nucleico-cebador con una DNA polimerasa y trifosfatos de desoxirribonucleótidos; y amplificando la plantilla de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la solución de cebador comprende un cebador parcialmente restringido tal como WWNNS. El cebador parcialmente restringido puede tener una estructura de cebador-dímero de desajuste terminal. En algunas realizaciones, un cebador parcialmente restringido que consiste en una secuencia de nucleótidos (W)x(N)y(S)z, en donde x, y y z son valores enteros independientes entre sí, y en donde el valor de x es 2 o 3, el valor de y es 2, 3 o 4 y el valor de z es 1 o 2 se utilizan para la reacción de RCA. El cebador parcialmente restringido puede comprender uno o más análogos de nucleótidos. En algunas realizaciones, para la reacción de RCA se emplea un cebador parcialmente restringido, resistente a nucleasas, que comprende un nucleótido modificado y que tiene una estructura de cebador-dímero de desajuste terminal. Las secuencias de cebadores adecuadas incluyen, pero no se limitan a, W+WNNS, W+W+NNS, W+WNNNS, W+W+NNNS, W+W+NN-S, W+WNN-S, W+W+NNN-S, W+WNNN*S, W+W+N*N*S, W+WN*N*S, W+W+NN*N*S o W+WNN*N*S. En algunas realizaciones, la reacción RCA se realiza poniendo en contacto el círculo de ssDNA con una solución de cebador que consiste esencialmente en una mezcla de cebador parcialmente restringida que comprende una estructura de cebador-dímero de desajuste terminal y amplificando el círculo de ssDNA. En algunas otras realizaciones, la reacción RCA se realiza poniendo en contacto el círculo de ssDNA con una solución de cebador que consiste esencialmente en una mezcla de cebadores parcialmente restringida que comprende un análogo de nucleótido y amplificando el círculo de ssDNA. La RCA de círculos de ssDNA produce grandes cantidades de DNA con una pérdida de secuencia reducida y un sesgo de amplificación reducido. Todo el proceso de unión y amplificación de ssDNA se puede realizar en un solo tubo sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento. Para evitar una amplificación sin objetivo, los reactivos utilizados en la unión y/o amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, solución de cebador, tampones de unión, DNA polimerasa) pueden procesarse previamente para eliminar cualquier ácido nucleico contaminante.

En algunas realizaciones, se proporciona un método de amplificación de un DNA cromosómico lineal. El método puede usarse para la amplificación del genoma completo de un DNA cromosómico. El DNA cromosómico lineal puede ser un DNA circulante libre de células, un DNA aislado a partir de una muestra incorporada en parafina y fijada con formalina, una muestra de DNA forense o una muestra de DNA antigua. El DNA cromosómico lineal puede haber estado expuesto a condiciones ambientales y puede ser DNA fragmentado. El método incluye las etapas de (a) proporcionar el DNA cromosómico lineal, (b) incubar el DNA cromosómico lineal con una ligasa que es capaz de la unión intramolecular independiente de la plantilla de una secuencia de DNA monocatenario para generar un círculo de DNA monocatenario, y (c) amplificar el círculo de DNA monocatenario mediante amplificación de círculo rodante usando una mezcla de cebadores aleatorios para formar un producto de DNA amplificado. Todas las etapas del método se realizan en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa de aislamiento o purificación intermedia. Los reactivos individuales que se utilizan para la reacción de amplificación pueden tratarse previamente para eliminar cualquier ácido nucleico contaminante. La descontaminación de los reactivos de amplificación se puede realizar empleando uno cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para la reacción de RCA se puede utilizar una ADN polimerasa a prueba de descontaminación, tal como la DNA polimerasa phi29 descontaminada. La descontaminación de un DNA de corrección de errores se puede realizar incubándolo con un catión divalente en ausencia de cualquier dNTPs para eliminar los ácidos nucleicos contaminantes. La ligasa puede ser una RNA ligasa TS2126, una RNA ligasa T4, una DNA ligasa T4, una DNA ligasa T3, una DNA ligasa deE. Colio una combinación de ellas. En una realización ejemplar, se emplea una RNA ligasa TS2126 pre-adenilada para la unión intramolecular independiente de la plantilla de una secuencia de DNA monocatenario. La presencia de exceso de sales, reactivos de unión y/u otros subproductos puede inhibir la amplificación de círculo rodante de los círculos de DNA monocatenario generados cuando se utiliza una mezcla de cebadores aleatorios estándar para la reacción RCA. La mezcla de cebadores aleatorios utilizada en el método de amplificación del genoma completo asistido por unión en un único recipiente de reacción comprende secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos un análogo de nucleótido. Los análogos de nucleótidos en la mezcla de cebadores aleatorios se seleccionan de modo que aumente la temperatura de fusión (Tm) del cebador, evite la formación de cebador-dímero y/o haga que un cebador sea resistente a las nucleasas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método incorpora análogos de nucleótidos que comprenden nucleobases modificada (por ejemplo, 2-amino-dA) y LNAs que aumentan la temperatura de fusión de la mezcla de cebadores aleatorios utilizada para la amplificación del genoma completo asistida por ligasa dentro de un único recipiente de reacción. La inclusión de cada base 2-amino-dA en una mezcla de cebador hexámero aleatorio aumenta la Tm hasta aproximadamente 3°C y la inclusión de cada nucleótido LNA aumenta la Tm entre 2 y 8 °C. La mezcla de cebadores aleatorios modificados puede comprender además el análogo de nucleótido que comprende la nucleobase, 2-tio-desoxitimidina (2-tio-dT), en donde la incorporación de los análogos de nucleótidos que comprenden 2-amino-dA y 2-tio-dT evita la formación de cebadordímero. Además, la inclusión de análogos de nucleótidos que comprenden 2-amino-dA y 2-tio-dT mejora la capacidad del cebador para hibridarse con el ácido nucleico objetivo debido a que el 2-amino-dA forma tres enlaces de hidrógeno con una desoxitimidina (dT) no modificada y el 2-tio-dT forma un par estable normal con su pareja no modificada (es decir, desoxiadenosina (dA)). El uso de bases de análogos de nucleótidos modificados y nucleótidos LNA en la mezcla de cebadores aleatorios permite el uso de tampones de hibridación más estrictos, reduciendo así significativamente la formación de dúplex de ácidos nucleicos no deseados y disminuyendo la aparición de amplificaciones de ácidos nucleicos no objetivo no deseadas. Además, también se pueden usar altas concentraciones de sal en la reacción de amplificación de ácidos nucleicos cuando el cebador es un cebador aleatorio modificado. La mezcla de cebadores aleatorios generalmente se usa en exceso en comparación con el DNA cromosómico lineal objetivo. La mezcla de cebadores aleatorios se puede tratar previamente con una nucleasa tal como una DNasa para eliminar cualquier ácido nucleico contaminante. En algunas realizaciones, el DNA cromosómico lineal se trata con una enzima reparadora del DNA antes de la reacción de unión y amplificación. El DNA cromosómico lineal se trata con una enzima reparadora del DNA antes de la reacción de amplificación. El tratamiento con enzima reparadora del DNA se realiza después de la reacción de unión pero antes de la reacción de amplificación incubando la mezcla de unión con una uracil DNA glicosilasa, una formamidopirimidin-DNA glicosilasa o combinaciones de las mismas. Un mayor tiempo de incubación a temperaturas más altas, tal como las condiciones utilizadas para la unión con RNA ligasa TS2126, corre el riesgo de mayores incidentes de cambios espontáneos de bases de DNA (por ejemplo, transiciones de bases de DNA que conducen a mutaciones C-T y G-A). En particular, el DNA monocatenario muestra una cinética de desaminación espontánea 140 veces más rápida que el DNA bicatenario. Por ejemplo, la secuenciación del círculo mediada por la RNA ligasa TS2126 mostró que el tratamiento con enzimas modificadoras del DNA, tales como las uracil DNA glicosilasas (UDG) y/o la formamidopirimidin-DNA glicosilasa (Fpg), suprimieron eficazmente las mutaciones C-T y G-A. En algunas realizaciones, las etapas individuales de los métodos se realizan de manera secuencial sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento. Las etapas del método generalmente se realizan en ausencia de trifosfato de adenosina o trifosfato de desoxiadenosina en un tampón HEPES. En una realización, la reacción de amplificación se realiza en un tampón que comprende HEPES aproximadamente 38 mM (pH 8,0), MgCl<2>aproximadamente 18 mM, TCEP aproximadamente 1 mM, KOAc aproximadamente 2,5 mM, aproximadamente ~2,5 % de PEG-8000, aproximadamente 0,007 % de Tween-20 y aproximadamente 40 uM de una mezcla de cebadores aleatorios que comprende secuencias de oligonucleótidos que tienen al menos un análogo de nucleótido. En algunas realizaciones, todas las etapas de los métodos se realizan simultáneamente sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento. Mientras se realiza la amplificación del genoma completo asistida por la unión en un único recipiente de reacción, el exceso de reactivos de unión, el exceso de DNA, el exceso de sales y/u otras impurezas (por ejemplo, productos de unión no deseados) de la reacción de unión pueden estar presentes en el recipiente de la reacción después de la reacción de unión, y la reacción de amplificación se realiza en el mismo recipiente de reacción sin eliminar ninguno de estos reactivos, sales, DNA y/u otras impurezas. En una realización adicional, el DNA cromosómico lineal se fragmenta y se puede tratar con una polinucleótido quinasa para generar un DNA unible antes de la etapa de ligación. La reacción con PNK se realiza en presencia de un donante de fosfato distinto del trifosfato de adenosina o del trifosfato de desoxiadenosina, de modo que todas las etapas, incluyendo la reacción con PNK, la unión intramolecular y la amplificación de RCA, se pueden realizar en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de aislamiento o purificación.

En algunas realizaciones, la mezcla de cebadores aleatorios comprende secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos una base modificada. En algunas realizaciones, la base modificada es 2-aminodesoxiadenosina (2-amino-dA) o 2-tio-desoxitimidina (2-tio-dT). En algunas otras realizaciones, la mezcla de cebadores aleatorios comprende secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos una 2-tio-desoxitimidina y al menos una 2-tio-desoxitimidina. En una realización ejemplar, la mezcla de cebadores aleatorios que se emplea en la amplificación del genoma completo comprende oligonucleótidos que forman oligonucleótidos complementarios de unión selectiva (oligonucleótidos SBC). Los oligonucleótidos SBC son pares complementarios de oligonucleótidos que contienen uno o más pares de bases modificados (es decir, cada oligonucleótido miembro que forma el par complementario está modificado con una base modificada). Cada base individual modificada no forma un par de bases estable con su pareja modificada, pero sí forma un par de bases particularmente estable con su contraparte natural (no modificada). Por lo tanto, dos oligonucleótidos SBC complementarios no forman un dúplex estable entre sí, pero cada oligonucleótido SBC individual forma un dúplex muy estable con una secuencia no modificada tal como un objetivo complementario. Esta propiedad permite que un dúplex de SBC se una eficazmente tanto a las cadenas sentido como antisentido de un objetivo dúplex de DNA o RNA.

En una realización específica, la mezcla de cebadores aleatorios utilizada en la amplificación del genoma completo consiste esencialmente en oligonucleótidos SBC. Por ejemplo, una o más desoxiadenosina en las secuencias de oligonucleótidos en la mezcla de cebadores aleatorios se pueden sustituir con 2-amino-desoxiadenosina y una o más desoxitimidina en las secuencias de oligonucleótidos en la mezcla de cebadores aleatorios se pueden sustituir con 2-tio-desoxitimidina para generar una mezcla de cebadores que consiste esencialmente en pares complementarios de unión selectiva. La incorporación de 2-amino-dA mejora la capacidad de un oligonucleótido para hibridarse con su objetivo. La base de nucleótidos 2-amino-dA forma tres enlaces de hidrógeno (enlaces H) con timina (T), en comparación con sólo dos enlaces de H entre A y T no modificadas. Por lo tanto, los pares de bases 2-amino A:T tienen el mismo número de enlaces de H como lo hacen los pares de bases G:C. En consecuencia, cuando un oligonucleótido 2-amino-dA se une a su objetivo no modificado, la temperatura de fusión (Tm) del dúplex aumenta hasta aproximadamente 3°C por resto de 2-amino-dA añadido, en comparación con el caso no modificado. Además, el 2-amino-dA también desestabiliza los desajustes de oscilación de A-G, presumiblemente debido a un choque estérico entre el 2-amino en A y el 2-amino en G. Por lo tanto, los oligonucleótidos modificados con 2-amino-dA muestran una mejor especificidad para un objetivo que sus homólogos no modificados. Se puede preparar un par excelente de oligonucleótidos SBC sustituyendo A por 2-amino-dA y T por 2-tio-dT (denominado en la presente memoria como cebador aleatorio AT). Dado que el 2-amino-dA sólo forma un enlace de hidrógeno con el 2-tio-dT, estos pares de bases modificados son muy débiles y el dúplex correspondiente es inestable. Sin embargo, tanto el 2-amino-dA como el 2-tio-dT se unen eficazmente con las bases T y A, respectivamente. En general, SBC de 20 unidades hibridados con un objetivo de DNA de 20 unidades muestran valores de Tm 10°C más altos que el correspondiente híbrido DNA-DNa , mientras que el híbrido SBC-SBC muestra valores de Tm 3°C inferiores. Los oligonucleótidos en la mezcla de cebadores aleatorios AT también pueden comprender un nucleótido modificado con fosforotioato o un nucleótido LNA además de 2-amino-dA y 2-tio-dT, que pueden mejorar aún más la temperatura de fusión (Tm) del dúplex cebador-objetivo, prevenir la formación de estructuras cebador-dímero y/o hacer que la mezcla de cebadores aleatorios sea resistente a exonucleasas.

La amplificación en un solo tubo del DNA cromosómico lineal mediante unión seguida de RCA en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de aislamiento y purificación fue ineficaz cuando se emplearon hexámeros aleatorios resistentes a nucleasas estándar (Figura 14). La presencia de exceso de sales, reactivos de unión y/u otros subproductos inhibió la amplificación de círculo rodante de los círculos de DNA generados. Sin embargo, el uso de una mezcla de cebadores aleatorios AT que contiene secuencias de oligonucleótidos que comprenden 2-amino-dA, 2-tio-dT, nucleótidos modificados con fosforotioato y nucleótidos LNA permite sorprendentemente que la reacción de unión-amplificación se desarrolle en un único recipiente de reacción sin que ninguna etapa intermedia de aislamiento o purificación. Este cebador permite que la reacción de amplificación funcione mejor en estas condiciones de tampón, mientras que los hexámeros aleatorios resistentes a nucleasas estándar no funcionan al mismo nivel. La posición del nucleótido LNA en la secuencia del cebador se elige de manera que no ocupe el extremo 3' terminal de la secuencia del cebador. En algunas realizaciones, cada secuencia de oligonucleótidos individual en la mezcla de cebadores aleatorios comprende al menos un 2-amino-dA o 2-tio-dT. En una realización ejemplar, la amplificación del genoma completo asistida por ligasa mediante RCA en un único recipiente de reacción se realiza usando una mezcla de cebadores aleatorios que comprende secuencias de oligonucleótidos hexámeros que tienen una estructura general, N+N(atN)(atN)(atN)*N. La concentración de la mezcla de cebadores aleatorios generalmente se mantiene más alta que la concentración del círculo de DNA monocatenario durante los métodos de amplificación del genoma completo descritos anteriormente para promover la amplificación de múltiples círculos rodantes cebados aleatoriamente.

El producto de DNA amplificado de la amplificación del genoma completo asistida por unión se puede utilizar para generar una biblioteca de DNA genómico. La biblioteca genómica puede generarse mediante fragmentación del producto de DNA amplificado. En algunas realizaciones, el producto fragmentado incluye una única secuencia monomérica del producto de DNA amplificado concatamérico. En algunas otras realizaciones, el producto fragmentado incluye más de una secuencia monomérica del producto de DNA amplificado concatamérico. El producto de DNA amplificado puede secuenciarse además. La secuenciación se puede realizar empleando una cualquiera de las técnicas establecidas en la técnica para la secuenciación de DNA, incluyendo las técnicas de secuenciación NextGen. Dado que el producto de DNA amplificado es una secuencia repetida en tándem del círculo de DNA, la secuenciación del producto de DNA amplificado puede usarse para eliminar los errores de secuenciación asociados con las técnicas de secuenciación NextGen. Una limitación importante de la secuenciación de DNA de alto rendimiento es la alta tasa de llamadas de bases erróneas producidas. La generación de la biblioteca de DNA genómico mediante la amplificación del genoma completo mediante amplificación RCA asistida por unión permite una posterior corrección computacional sólida de los errores de secuenciación de la biblioteca de DNA genómico generada. Dado que las plantillas de DNA cromosómico lineal se circularizan, se copian varias veces en tándem con una polimerasa de círculo rodante y después se secuencian en cualquier máquina de secuenciación de alto rendimiento, cada lectura producida se puede procesar computacionalmente para obtener una secuencia de consenso de todas las copias vinculadas de la secuencia original. La vinculación física de las copias garantiza que cada copia se derive independientemente de la secuencia original y permite la formación eficiente de secuencias consenso en dichos protocolos de secuenciación circular. Los métodos de amplificación del genoma completo descritos en la presente memoria permiten, por lo tanto, un protocolo conveniente para la amplificación del genoma completo en un solo tubo seguida de una secuenciación sin errores de la biblioteca de DNA genómico generada. La biblioteca de DNA genómico también puede usarse para la captura basada en la hibridación de un DNA genómico objetivo. La captura basada en la hibridación puede realizarse en solución o en una superficie (por ejemplo, una captura basada en micromatrices). La captura de objetivos basada en soluciones es generalmente más escalable y económica, especialmente cuando están implicadas una gran cantidad de muestras. Además, la captura basada en soluciones de un DNA objetivo ofrece una uniformidad de cobertura mejorada. El DNA objetivo capturado puede secuenciarse además mediante re-secuenciación dirigida. La secuencia de DNA objetivo puede seleccionarse para que sea una región de exoma de un DNA genómico para permitir la secuenciación del exoma.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para la amplificación de cantidades limitantes de DNA fragmentado lineal mediante amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). Los métodos convencionales de MDA, cuando se intentan en un DNA fragmentado lineal, dan como resultado una velocidad de amplificación disminuida y una amplificación altamente sesgada de la secuencia. Además, a menudo se observa una importante pérdida de secuencia, especialmente cerca de los extremos del DNA fragmentado. Para superar estas limitaciones, el dsDNA fragmentado se convierte primero en ssDNA. Después, el ssDNA se convierte en DNA circular monocatenario (es decir, círculo de DNA) mediante una reacción de unión intramolecular independiente de la plantilla, eliminando así los extremos problemáticos del DNA. Incluso las secuencias de ssDNA que tienen menos de 500 bp pueden circularizarse utilizando la unión intramolecular de ssDNA independiente de la plantilla. Además, no se necesita conocimiento previo de la secuencia objetivo para crear círculos de DNA cuando la unión del ssDNA se realiza de una manera independiente de la plantilla. Antes de la circularización, el DNA fragmentado se puede tratar con una PNK para reparar los extremos terminales no unibles. Después de la circularización del ssDNA fragmentado, se realiza una MDA en el DNA circularizado. La reacción de amplificación se puede realizar en condiciones isotérmicas mediante el empleo de métodos de amplificación de círculo rodante (RCA). El RCA se puede realizar utilizando kits de amplificación de RCA disponibles comercialmente, tal como el Kit TempliPhi™ RCA Kit (GE Healthcare). La amplificación de circulo rodante del TempliPhi™ emplea cebadores aleatorios que contienen ácido nucleico bloqueado, que proporcionan mayor sensibilidad y equilibrio de amplificación. En algunas realizaciones, se usan cebadores resistentes a nucleasas para la reacción de RCA. Los métodos descritos en la presente memoria mejoran la sensibilidad de la amplificación, reducen la pérdida de secuencia y permiten una amplificación más equilibrada. Dado que la circularización independiente de la plantilla de DNA fragmentado monocatenario se puede lograr en secuencias más cortas incluso a concentraciones más bajas, se puede lograr una amplificación de DNA más equilibrada con una cinética más rápida y una cobertura de secuencia mejorada cuando se emplea la amplificación del genoma completo asistida por ligasa para la amplificación del DNA altamente fragmentado (por ejemplo, DNA circulante en el plasma sanguíneo). Por ejemplo, la longitud de persistencia del ssDNA puede ser tan baja como 15 nucleótidos para la circularización del ssDNA independiente de la plantilla. Cuando se emplea CIRCLIGASE™ para la reacción de unión, en condiciones estándar, prácticamente no se producen concatémeros lineales o concatémeros circulares. Además, tanto la reacción de circularización como la de amplificación se pueden realizar en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento, reduciendo así las posibilidades de contaminación y simplificando el flujo de trabajo de amplificación. Los métodos de amplificación del genoma completo asistidos por ligasa se pueden emplear para, pero no limitarse a, analizar el DNA libre de células plasmáticas circulantes, DNA fragmentado aislado de muestras incorporadas en parafina y fijadas con formalina (FFPE), muestras forenses de DNA que han sido dañadas por la exposición a condiciones ambientales o muestras de DNA antiguas. La biblioteca amplificada se puede utilizar además para la detección dirigida de secuencias amplificadas mediante qPCR o secuenciación.

Varios métodos de amplificación del genoma completo asistida por unión descritos en la presente memoria que comprenden la unión previa de fragmentos de ssDNA a círculos de DNA seguidos de amplificación de círculo rodante, proporcionan una amplificación preferencial de un DNA fragmentado sobre un DNA genómico de alto peso molecular. Por ejemplo, las preparaciones de plasma que comprenden DNA circulante a menudo pueden estar contaminadas con DNA genómico que se libera de las células sanguíneas durante el proceso de purificación. Los métodos convencionales de amplificación del genoma completo mediante MDA amplifican tanto el DNA circulante como el DNA genómico. Por el contrario, cuando las moléculas de DNA circulantes, fragmentadas se circularizan primero con RNA TS2126 seguido de la amplificación de las moléculas de DNA circularizadas mediante RCA empleando una DNA polimerasa Phi29, el DNA circulante se amplificó preferentemente sobre el DNA genómico de alto peso molecular. Dicha amplificación preferencial del DNA fragmentado sobre el DNA genómico es particularmente adecuada para aplicaciones de diagnóstico ya que el DNA diagnósticamente relevante puede amplificarse preferentemente para análisis posteriores (véase, Ejemplo 4). Además, la amplificación del genoma completo asistida por ligasa permite una amplificación más sólida del DNA fragmentado en comparación con la amplificación del genoma completo basada en MDA convencional.

La Figura 1 representa una representación esquemática de una realización de amplificación del genoma completo asistida por ligasa de un dsDNA fragmentado. La longitud de persistencia del DNA bicatenario es mucho mayor (~150 bp) y su rigidez innata hace que la circularización de fragmentos de menos de 500 pb sea altamente ineficaz. Además, con pequeñas moléculas de DNA fragmentadas bicatenarias de un rango de aproximadamente 250 bp, la circularización es ineficaz a menos que los extremos estén alineados correctamente (~ 10,5 bp/vuelta). Por el contrario, la longitud de persistencia de la circularización del DNA fragmentado monocatenario es muy pequeña, aproximadamente 15 nucleótidos, en comparación con el DNA fragmentado bicatenario. Como se representa en la Figura 1, en la amplificación del genoma completo asistida por ligasa, el dsDNA fragmentado se convierte primero en círculos de DNA monocatenario. Esto se puede lograr incubando el DNA bicatenario fragmentado a 95°C durante un período suficiente para desnaturalizar el dsDNA en cadenas simples. Después, el ssDNA fragmentado se trata con una DNA o RNA ligasa que es capaz de unir de manera intramolecular, independiente de la plantilla, sustratos de DNA monocatenario para generar los círculos de DNA monocatenario. Los ejemplos no limitantes de ligasas que pueden usarse para la unión intramolecular incluyen CIRCLIGASE™, DNA ligasa T3, RNA ligasa T4, RNA ligasa Mth (MthRnl1), o ligasa deE. coli. Después se añaden reactivos de amplificación, incluyendo la DNA polimerasa, cebadores aleatorios y dNTPs para iniciar una reacción RCA en los círculos de DNA monocatenario. Esta amplificación del genoma completo asistida por ligasa que emplea RCA produce grandes cantidades de DNA con una pérdida de secuencia y el sesgo de amplificación reducidos en contraste con los métodos convencionales de amplificación del genoma completo. Por lo tanto, puede utilizarse para amplificar y detectar incluso DNA altamente fragmentado. Todo el proceso de generación de los círculos de DNA monocatenario y su posterior amplificación por RCA se realiza en un único tubo sin ninguna etapa de purificación intermedia.

En algunas realizaciones, se proporciona un flujo de trabajo de un solo tubo para la amplificación del genoma completo asistida por ligasa del DNA fragmentado que incluye el procesamiento de un DNA fragmentado para reparar los extremos del DNA no unible. Por ejemplo, si un DNA monocatenario fragmentado no contiene un grupo fosforilo en 5' y un grupo hidroxilo en 3', es posible que no se una en una reacción de unión intramolecular. La presencia de dichas secuencias de DNA no unibles puede provocar un sesgo de amplificación en la amplificación del genoma completo asistida por ligasa. Por ejemplo, como se representa esquemáticamente en la Figura 8, los fragmentos de DNA que se generan mediante la digestión con DNasa II durante la muerte celular pueden contener un grupo hidroxilo en 5' y un grupo fosforilo en 3'. Los fragmentos de DNA monocatenario que se originan a partir de fragmentos de DNA bicatenario que contienen un grupo hidroxilo en 5' y un grupo fosforilo en 3' no se circularizarán en una reacción de unión intramolecular. Por lo tanto, es probable que las roturas del tipo DNasa II estén subrepresentadas en la amplificación del genoma completo. En algunas realizaciones, el DNA fragmentado se trata con una quinasa (por ejemplo, una polinucleótido quinasa T4, TPK) para fosforilar los grupos hidroxilo en 5' y/o desfosforilar el grupo fosforilo en 3' del DNA fragmentado. La inclusión de quinasa en la reacción permite la circularización eficiente de fragmentos en un conjunto que no contiene fosfato en 5'. La fosforilación de los extremos 5' del DNA fragmentado con una quinasa seguida de la amplificación del DNA fragmentado crea una biblioteca más representativa.

En algunas realizaciones, la reparación por fosforilación del dsDNA fragmentado se puede realizar utilizando una PNK quinasa T4. La reparación por fosforilación puede realizarse en el dsDNA fragmentado o en el dsDNA fragmentado desnaturalizado. Si la reparación por fosforilación se realiza en el dsDNA, el dsDNA reparado se puede desnaturalizar a ssDNA lineal, que posteriormente se puede circularizar utilizando una CIRCLIGASE II™ (abreviado como CLII). La CIRCLIGASA II™ comprende una forma sustancialmente adenilada de RNA ligasa TS2126. La unión intramolecular independiente de la plantilla de la ssDNA mediante CIRCLIGASE II™ es inhibida por concentraciones más altas de ATP o dATP. Sin embargo, la reparación por fosforilación por la quinasa a menudo requiere la presencia de ATP. Además, puede que no sea fácil eliminar el ATP de la mezcla de reacción sin dañar el DNA. Por ejemplo, un tratamiento con fosfatasa de la mezcla de reacción para eliminar el ATP también dará como resultado la desfosforilación del DNA (a menos que el DNA esté protegido, por ejemplo, mediante pre-adenilación), lo que hará que las cadenas de DNA no se puedan unir. Como resultado, a menudo resulta difícil realizar una reparación por fosforilación del DNA fragmentado y la generación de círculos de ssDNA en un solo tubo sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento. Los métodos proporcionados en la presente memoria emplean GTP, CTP, UTP o dTTP en lugar de ATP durante la reacción de la quinasa. Ya que CIRCLIGASE II™ es más tolerante a GTP o a un donante de fosfato alternativo (por ejemplo, CTP o UTP), la etapa de reparación de quinasa y la etapa de unión pueden realizarse en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa de purificación y/o aislamiento intermedia. La mezcla de reacción de quinasa puede comprender además reactivos adicionales tales como sales de manganeso y betaína (trimetilglicina zwitteriónica). Una vez unidos, los círculos de ssDNA pueden amplificarse. Al realizar la reacción de unión y amplificación a una concentración relativamente baja de GTP, el flujo de trabajo de un solo tubo descrito en la presente memoria evita las etapas de limpieza intermitentes entre tratamientos enzimáticos y minimiza la pérdida de plantilla de DNA (véase la Figura 9 para una representación esquemática del flujo de trabajo de un solo tubo, que implica reparación, unión y amplificación de quinasas).

En algunas realizaciones, se proporciona un método alternativo para generar un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA lineal, en donde el método emplea una etapa de pre-adenilación del DNA antes de la etapa de unión intramolecular. En primer lugar, el DNA lineal puede incubarse con una polinucleótido quinasa en presencia de ATP para generar una secuencia de DNA unible que comprende un grupo fosfato en el extremo 5' terminal y un grupo hidroxilo en el extremo 3' terminal. La secuencia de DNA unible se incuba después con una enzima adenilante en presencia de trifosfato de adenosina para generar una secuencia de DNA adenilada en 5'. La secuencia de DNA adenilada en 5' tiene un grupo hidroxilo libre en 3'. La concentración de ATP en la reacción de unión se selecciona de manera que no se produzca adenilación en el extremo 3' de la secuencia de DNA unible. La secuencia de DNA adenilada en 5' se incuba después con una ligasa no adenilada, que es capaz de realizar la unión de manera intramolecular independiente de la plantilla de la secuencia de DNA adenilada en 5', para generar el círculo de DNA monocatenario. Si se emplea una ligasa no adenilada dependiente de ATP para la reacción de unión intramolecular, es posible que sea necesario eliminar el ATP de la mezcla de reacción tratando la mezcla de reacción con una fosfatasa antes de la reacción de unión intramolecular. El 5' fosfato en el nucleótido terminal del DNA, que normalmente sería eliminado por una fosfatasa, está protegido del tratamiento con fosfatasa debido a la pre-adenilación. Si el DNA está en forma bicatenaria, es necesario desnaturalizarlo antes de la reacción de unión intramolecular. Todas las etapas del método se realizan en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa intermedia de aislamiento o purificación.

En algunas realizaciones, una RNA ligasa tal como RNA ligasa I derivada de arqueobacterias termófilas,Methanobacterium thermoautotrophicum(RNA ligasa 1 Mth) se utiliza en presencia de ATP para generar la forma adenilada del DNA lineal. Se puede usar una ligasa independiente de ATP mutante o diseñada adecuadamente que sea defectuosa en la auto-adenilación, des-adenilación y/o transferencia de adenilato para la reacción de unión intramolecular del DNA lineal adenilado para generar el círculo de DNA monocatenario. Por ejemplo, se puede emplear un mutante de lisina del motivo V (K246A) de la RNA ligasa Mth. Este mutante tiene actividad de unión completa con sustratos pre-adenilados. También se puede emplear el mutante de RNA ligasa Mth que tiene una sustitución de alanina por la lisina catalítica en el motivo I (K97A). La actividad del mutante K97A es similar con RNA pre-adenilado o DNA monocatenario (ssDNA) como sustratos donantes, pero tiene una preferencia doble por el RNA como sustrato aceptor en comparación con el ssDNA con una secuencia idéntica. Si se emplean ligasas dependientes del ATP tales como la RNA ligasa TS2126 para la reacción de unión intramolecular de las secuencias de DNA adeniladas en 5', es posible que sea necesario eliminar el ATP en la reacción antes de la reacción de unión.

En algunas realizaciones, se proporciona la amplificación del genoma completo asistida por ligasa empleando el flujo de trabajo alternativo. Una representación esquemática de este flujo de trabajo se proporciona en la Figura 11. El método comprende la reparación del DNA fragmentado con una quinasa y la pre-adenilación del DNA fragmentado en el extremo 5' con una RNA ligasa o DNA ligasa en presencia de ATP antes de la unión y amplificación. El DNA fragmentado que comprende secuencias que tienen extremos no unibles (por ejemplo, secuencias que comprenden grupos hidroxilo en 5' y/o fosforilo en 3') se fosforilan en los extremos 5' y se desfosforilan en los extremos 3' mediante tratamiento con una quinasa para generar una secuencia de DNA unible. La secuencia de DNA unible puede después adenilarse utilizando una RNA ligasa tal como la RNA ligasa Mth (MthRnl 1), en presencia de ATP para generar una forma adenilada del DNA fragmentado. Posteriormente, el ATP se elimina de la mezcla de reacción mediante tratamiento de la mezcla de reacción con una fosfatasa (por ejemplo, fosfatasa alcalina de camarón (SAP)). Se puede emplear cualquier método que esté disponible en la técnica para la adenilación en 5' de un DNA (por ejemplo, RNA ligasa, DNA ligasa o métodos sintéticos). El DNA lineal monocatenario pre-adenilado se trata después con una RNA ligasa que tiene un bajo grado de adenilación, tal como la CIRCLIGASE I™ para generar círculos de DNA mediante unión intramolecular. Después, los círculos de DNA se amplifican mediante RCA. En realizaciones donde CIRCLIGASE I™ genera círculos de DNA mediante unión intramolecular, la unión de DNA intramolecular y la posterior reacción de amplificación se realizan en ausencia de ATP. La eliminación del ATP de la mezcla de reacción después del tratamiento con quinasa y la reacción de pre-adenilación es esencial ya que la circularización del ssDNA preadenilado por la CIRCLIGASE I™ es inhibido por el ATP. En algunas realizaciones, el ATP se convierte en adenosina y fosfato mediante tratamiento con una fosfatasa. Incluso aunque la adenosina no inhibe la reacción de circularización, el fosfato resultante puede inhibir la reacción de unión intramolecular. El fosfato generado se puede eliminar aún más tratando la mezcla de reacción con enzimas secuestradoras de fosfato o con reactivos que precipitan o eliminan el fosfato (por ejemplo, resina de unión a fosfato tal como la resina LayneRT) de la solución. La eliminación de fosfato también se puede lograr tratando la mezcla de reacción con una enzima tal como maltosa fosforilasa que cataliza la conversión de maltosa a glucosa y glucosa-1-fosfato, eliminando así el fosfato de la solución. La inclusión de quinasa en la reacción permite la circularización y amplificación de fragmentos de DNA en un conjunto que no contiene grupos fosfato en 5' y/o hidroxilo en 3', creando así una biblioteca más representativa mediante amplificación asistida por ligasa. La pre-adenilación del DNA objetivo facilita el uso de ligasas que tienen un bajo grado de adenilación (por ejemplo, CIRCLIGASE I™, que está adenilado aproximadamente en un 30 %) para la reacción de unión intramolecular. Esto puede ser de interés ya que las ligasas que tienen un alto grado de adenilación (por ejemplo, CIRCLIGASE II™) unen DNA no adenilado solo una vez. Por lo tanto, a menudo se requiere una cantidad estequiométrica de ligasa para completar una reacción de unión intramolecular. Por el contrario, las ligasas que tienen un bajo grado de adenilación (tal como la CIRCLIGASE I™) tienen una alta rotación y pueden actuar de manera reversible y catalítica o repetida sobre múltiples moléculas de DNA pre-adeniladas. Esto aumenta la cinética de unión, reduce la cantidad de ligasa necesaria y potencialmente permite una mayor circularización de plantillas de DNA más difíciles o complejas.

En algunas realizaciones, se usan métodos para la amplificación del genoma completo asistida por ligasa para la amplificación y posterior detección de ácidos nucleicos circulantes (por ejemplo, DNA circulante de la fracción no celular de una muestra biológica) en una muestra biológica tal como sangre completa u orina. Los ácidos nucleicos circulantes pueden originarse a partir de células apoptóticas o necróticas, o pueden liberarse activamente de las células. Dado que las nucleasas celulares descomponen el DNA genómico de alto peso molecular en pequeños fragmentos del tamaño de un nucleosoma, los ácidos nucleicos circulantes están naturalmente muy fragmentados. El ácido nucleico circulante altamente fragmentado a menudo no es compatible con los métodos convencionales de amplificación de ácidos nucleicos. Además, los ácidos nucleicos circulantes están presentes en cantidades muy bajas en el torrente sanguíneo. La amplificación de círculo rodante estándar (RCA) de ácidos nucleicos lineales circulantes bicatenarios es ineficaz y está muy sesgada. Separar los ácidos nucleicos circulantes en cadenas sencillas y circularizarlos con una ligasa antes de la amplificación de círculo rodante mejora la eficiencia y genera menos sesgos. Para permitir una buena cinética de RCA y una alta sensibilidad con dicha plantilla de DNA diluida, en presencia de exceso de reactivos de unión, sales y otros subproductos de la reacción de unión, se emplean métodos de RCA que emplean cebadores que comprenden análogos de nucleótidos y/o LNAs. Este RCA mejorado se ha optimizado para trazas de DNA y amplificación unicelular.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para amplificar el DNA circulante de la sangre completa. El DNA circulante se amplifica a partir de la fracción no celular de la sangre total (por ejemplo, plasma o suero). Este método comprende las etapas de recolectar la fracción no celular de la sangre completa, recolectar el DNA circulante (presentado principalmente en su forma bicatenaria nativa) de la fracción no celular, desnaturalizar el DNA bicatenario para generar DNA lineal monocatenario, circularizar la molécula de DNA monocatenario circulante para generar círculos de DNA monocatenario y amplificar los círculos de DNA monocatenario mediante amplificación de círculo rodante. Debido a la longitud de la persistencia, generalmente no es posible circularizar el dsDNA que tiene una longitud de secuencia menor que 150 bp, y es muy difícil circularizar el dsDNA hasta que el DNA sea más largo de 200 bp. Por el contrario, las moléculas de ssDNA lineales que tienen una longitud de secuencia de 15 nucleótidos (nt) o más se circularizan de manera muy eficiente mediante una ligasa adecuada siempre que el extremo 5' esté fosforilado y el extremo 3' esté hidroxilado. La circularización del DNA monocatenario para generar un círculo de DNA monocatenario se logra empleando una ligasa que es capaz de la unión intramolecular del DNA monocatenario independiente de la plantilla. En algunas realizaciones, la circularización de las moléculas de DNA monocatenario se realiza tratando el DNA lineal monocatenario con una RNA ligasa tal como CIRCLIGASE II™.

En algunas realizaciones, la sensibilidad de la detección del DNA circulante aumenta aún más fosforilando los ácidos nucleicos circulantes con polinucleótido quinasa (PNK) antes de la etapa de unión del ssDNA y RCA. Al incorporar la etapa del PNK en el flujo de trabajo, los métodos de amplificación del genoma completo asistido por ligasa presentados en la presente memoria podrían detectar DNA circulante masculino en sangre completa femenina cuando se añade a niveles del 1% (repeticiones por triplicado). La unión intramolecular independiente de la plantilla no se puede lograr a menos que la plantilla de ssDNA tenga un grupo fosfato en 5' y un grupo hidroxilo en 3'. Una variedad de condiciones producen hidroxilos en 5' en el DNA (incluyendo la escisión enzimática con DNasa II y la actividad de la fosfatasa en la sangre). El tratamiento con PNK elimina este problema y mejora la diversidad de la biblioteca de CNA amplificada por círculo rodante.

En algunas realizaciones, se proporcionan kits para la generación de un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA lineal. En una realización, el kit comprende una polinucleótido quinasa, un donante de fosfato y una ligasa preadenilada que es capaz de la unión intramolecular de la secuencia de ssDNA, independiente de la plantilla, empaquetados juntos. La polinucleótido quinasa puede ser una PNK T4. El donante de fosfato puede elegirse entre GTP, UTP, CTP o dTTP. En una realización, el kit puede incluir una ligasa TS2126. Más del 60% de la ligasa TS2126 puede estar pre-adenilada. El kit puede comprender además tampones (por ejemplo, HEPES), reactivos de amplificación de DNA (por ejemplo, DNA polimerasa, cebadores, dNTPs) y otros reactivos (por ejemplo, MnCh, betaína) que se emplean para la generación de círculos de DNA monocatenario mediante los métodos proporcionados. En algunas realizaciones, el kit puede incluir una DNA polimerasa Phi29 y cebadores aleatorios/parcialmente restringidos. En otra realización, el kit comprende una enzima adenilante, una fosfatasa y una ligasa no adenilada empaquetadas juntas. El kit puede comprender además una polinucleótido quinasa y/o un donante de fosfato. La enzima adenilante puede ser una RNA ligasa I derivada deMethanobacterium thermoautotrophicum(RNA ligasa Mth). La ligasa no adenilada puede ser una composición de ligasa TS2126, en donde más del 60% de la ligasa está en forma no adenilada. Los kits pueden incluir además instrucciones para la generación de un círculo de DNA monocatenario a partir de un DNA lineal.

La práctica de la invención se comprenderá aún mejor a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan en la presente memoria sólo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas. Algunas abreviaturas utilizadas en la sección de ejemplos se amplían de la siguiente manera: "mg": miligramos; "ng": nanogramos; "pg": picogramos; "fg": femtogramos; "mL": mililitros; "mg/mL": miligramos por mililitro; "mM": milimolar; "mmol": milimoles; "pM": picomolar; "pmol": picomoles; "pL": microlitros; "min.": minutos y "h.": horas.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Amplificación del genoma completo de ácido nucleico circulante a partir de plasma sanguíneo:

El DNA circulante se aisló a partir de citrato-fosfato-dextrosa (CPD) - plasma sanguíneo estabilizado de individuos aparentemente sanos, utilizando el kit Wako DNA extractor SP (Wako Pure Chemical Industries). Se analizaron aproximadamente 1,3 ng mediante electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% usando tampón TBE, se tiñeron con SYBR Gold y se visualizaron usando un generador de imágenes Typhoon imager. Como se representa en la Figura 2, la mayor parte del DNA circulante tenía aproximadamente 180 bp de longitud, con una cantidad adicional más pequeña de secuencias que tenían aproximadamente 370 bp de longitud y una cantidad sustancialmente menor de secuencias de mayor peso molecular.

350 pg de DNA circulante procedente del plasma se calentaron a 95°C para desnaturalizar la plantilla. Después, la plantilla de DNA monocatenario desnaturalizada se trató con una RNA o DNA ligasa para generar círculos de DNA monocatenario. La DNA ligasa T4 dependiente de ATP, la DNA ligasa deE. colidependiente de NAD codificada por células o una RNA ligasa termoestable (CIRCLIGASE II™) se utilizó para la reacción de unión. Después se sometieron 100 pg de DNA unidos a círculos de DNA monocatenario a amplificación del genoma completo utilizando el kit GenomiPhi (GE Healthcare) que emplea una DNA polimerasa Phi29. La amplificación se realizó utilizando la mezcla de cebadores N+N(at N)(at N)(at N)*N donde "(at N)" representa una mezcla aleatoria que contiene 2-amino dA, 2-tio-dT, G normal y C normal. La amplificación en tiempo real se realizó añadiendo una pequeña cantidad de SYBR green I a la mezcla de amplificación y monitoreando el aumento de la señal de fluorescencia con el tiempo en un lector de placas Tecan (Tecan SNiPer, Amersham-Pharmacia Biotech). A modo de comparación, se incluyeron una concentración equivalente de DNA genómico no tratado, DNA plasmático no tratado y una muestra sin plantilla de DNA (sin amplificación de plantilla).

Como se representa en la Figura 3, la cinética de amplificación del DNA plasmático fragmentado y no tratado fue mucho menor en comparación con una cantidad equivalente de DNA genómico de alto peso molecular, lo que indica un defecto en la amplificación. Sin embargo, cuando el DNA plasmático fragmentado se pretrató y se convirtió en círculos de DNA monocatenario utilizando CIRCLIGASE II™, se logró una cinética de amplificación rápida (Figura 3A). Las ligasas, incluyendo la DNA ligasa T4 dependiente de ATP (Figura 3B) y la DNA ligasa deE. colidependiente de NAD codificada por células (Figura 3C) también fueron eficaces, pero con menos eficacia, para restaurar la cinética de amplificación del DNA plasmático fragmentado. En estos ejemplos, el aumento relativo en la cinética de amplificación indica la eficacia de cada una de las ligasas para promover la unión intramolecular de la plantilla de DNA monocatenario.

Ejemplo 2: Análisis de ácidos nucleicos circulantes amplificados a partir de plasma sanguíneo mediante amplificación del genoma completo asistida por ligasa.

El DNA amplificado generado en el Ejemplo 1 se analizó adicionalmente mediante PCR cuantitativa utilizando cebadores dirigidos a cuatro loci CODIS diferentes (vWA, TPOX, D8S1129 y D13S317) para muestrear la eficacia del método de amplificación del genoma completo asistido por ligasa para promover la amplificación de un DNA sensible y equilibrado. Estos niveles de DNA se compararon con los valores del DNA no amplificado para determinar los niveles de representación relativos después de la amplificación. Como se muestra en la Figura 4, en ambos ejemplos, la amplificación de DNA plasmático no tratado condujo a una pérdida de secuencia o produjo DNA que estaba muy poco representado en los loci analizados. Por el contrario, incluyendo tanto CIRCLIGASE II™ como la DNA ligasa<t>4 en el método evitó la pérdida de secuencia de los cuatro loci y produjo DNA que era más similar en representación al DNA genómico de alto peso molecular amplificado. En el ejemplo usando CIRCLIGASE II™ como DNA ligasa monocatenaria, de 12 loci CODIS diferentes probados mediante PCR cuantitativa (qPCR) usando cebadores dirigidos a 12 loci CODIS diferentes, 11 se recuperaron después de la amplificación, mientras que solo 4 estaban presentes en el DNA plasmático amplificado no tratado (Figura 5). En la Figura 5, los valores de Ct reportados son un promedio de dos réplicas. Las reacciones de PCR donde el valor de Ct no se determinó están marcadas con una "X".

Ejemplo 3: Optimización de las condiciones de reacción para la amplificación del genoma completo asistida por ligasa.

La reacción de amplificación del DNA asistida por ligasa se optimizó aún más optimizando la eficiencia de la reacción de unión de una molécula de DNA monocatenaria mediante la RNA ligasa TS2126. La presencia de iones metálicos fue esencial para la reacción de unión, ya que la eliminación del manganeso del tampón estándar recomendado por el fabricante redujo las tasas de amplificación a niveles iniciales. Se compararon el DNA genómico no tratado y el DNA plasmático no tratado con CIRCLIGASE II™ - muestras de DNA plasmático tratadas usando condiciones de tampón modificadas (Figura 6). Todas las condiciones del tampón contenían KOAc 33 mM, DTT 0,5 mM y betaína 1 M. Cuando se indica, los tampones contenían Tris-acetato 33 mM (pH 7,5) o HEPES-KOH 33 mM (pH 8,0) y además contenían MgCl<2>2,5 mM o MnCl<2>2,5 mM. La amplificación en tiempo real se realizó añadiendo una pequeña cantidad de SYBR green I a la mezcla de amplificación y monitoreando el aumento de la fluorescencia con el tiempo en un lector de placas Tecan. El umbral de amplificación es el momento en el que la fluorescencia se eleva por encima de los niveles iniciales (2000 RFU).

La comparación de las cinéticas de amplificación de las reacciones de amplificación del genoma completo asistido por ligasa (muestras de 100 pg) se representan en la Figura 6. Tanto el magnesio como el manganeso promovieron efectos similares en presencia del tampón TRIS estándar, pero se observó que la combinación de manganeso y magnesio en presencia del tampón HEPES, pH 8,0 fue más efectiva para promover altas tasas de amplificación. El aumento de la eficiencia de circularización del DNA plasmático en el tampón HEPES en esta condición de reacción puede deberse a una oxidación reducida del catión de manganeso en el tampón HEPES.

Ejemplo 4: Inhibición de la amplificación del DNA genómico de alto peso molecular en la amplificación del genoma completo asistida por ligasa.

La cinética de la amplificación de las reacciones de amplificación del genoma completo del DNA genómico no tratado se comparó con las muestras de DNA genómico tratadas con CIRCLIGASE I™ y CIRCLIGASE II™ (muestras de 100 pg). Los resultados se muestran en la Figura 7. Como se representa en la Figura 7, el tratamiento con CIRCLIGASE™ del DNA genómico produjo un efecto inhibidor sobre la tasa de amplificación del DNA genómico de alto peso molecular (a diferencia de los efectos positivos sobre el DNA plasmático). La inhibición fue evidente tanto para CIRCLIGASE I™ como CIRCLIGASE II™.

Para investigar si la amplificación basada en Phi29 era inhibida por la ligasa, se amplificó el DNA genómico no tratado en presencia de ligasa activa. La amplificación en tiempo real se realizó añadiendo una pequeña cantidad de SYBR green I a la mezcla de amplificación y monitoreando el aumento de la fluorescencia con el tiempo en un lector de placas Tecan. El umbral de amplificación es el tiempo en el que la fluorescencia se eleva por encima de los niveles iniciales (2000 RFU). Se observó que la inhibición de la amplificación del DNA genómico no era un efecto de la presencia de la ligasa activa durante la amplificación.

Una preferencia para la amplificación del DNA genómico circulante sobre el de alto peso molecular podría ser una ventaja para determinadas aplicaciones, ya que el DNA genómico de las células sanguíneas a menudo contamina las preparaciones de ácidos nucleicos circulantes y tiene menos valor de diagnóstico.

Ejemplo 5: Amplificación en un solo tubo de DNA fragmentado empleando la amplificación del genoma completo asistida por ligasa. Efecto de la fosforilación de fragmentos de DNA circulantes con quinasa antes de la unión intramolecular.

La fosforilación de fragmentos de DNA circulantes con quinasa permitió una detección más sensible del DNA circulante en el plasma sanguíneo. Se realizó un experimento de mezcla de plasma/sangre de hombre y mujer para establecer que la biblioteca creada a partir del DNA de entrada tratado con quinasa era más representativa, permitiendo una detección más sensible del marcador específico de hombre DYS14 (Figura 10, 3/3 réplicas, mientras que sólo se detectó 1/3 si no se realizó la fosforilación). Se prepararon 100 pL de mezclas de sangre/plasma de la siguiente manera: 100A: 100% plasma masculino; 5A-C: plasma masculino se añadió a sangre completa femenina al 5 % v/v; 1A-C: plasma masculino se añadió a sangre completa femenina al 1% v/v; y 0A: 100% sangre femenina. El plasma se separó de las células sanguíneas mediante flujo lateral a través de una membrana MF1 (Whatman) seguido de recolección en una almohadilla de celulosa que se secó y almacenó durante la noche. Después se aisló el DNA circulante de la almohadilla de celulosa mediante una modificación del kit Wako extractor SP (Wako Pure Chemical Industries), un método estándar basado en yoduro de sodio/detergente. Después se trataron aproximadamente 1,8 ng de DNA con o sin polinucleótido quinasa T4 en presencia de GTP, manganeso y betaína y después se trataron con CIRCLIGASE II™ para circularizar los fragmentos de DNA monocatenario. Después, el DNA se sometió a la amplificación del genoma completo por GenomiPhi (GE Healthcare) y los productos se analizaron mediante PCR cuantitativa para evaluar la detección de dos marcadores: Dys14, que es un gen de copias múltiples localizado en el cromosoma Y y debería ser detectable desde el fracción masculina únicamente, y D16S539, que es un locus STR localizado en el cromosoma 16 y debe ser detectable tanto en la fracción masculina como en la femenina. La reacción se realizó en un único recipiente de reacción, sin ninguna etapa intermedia de purificación o aislamiento en el flujo de trabajo. Esto se logró realizando la reacción de fosforilación a una concentración relativamente baja de GTP.

La Figura 10 muestra que la inclusión de una quinasa en la reacción permite la circularización y amplificación de fragmentos de DNA en un conjunto que no contiene un fosfato en 5', creando así una biblioteca más representativa. Esto incluiría fragmentos de DNA que contienen un hidroxilo en 5', que se generan específicamente mediante la digestión con DNasa II durante la muerte celular. Utilizando un experimento de mezcla de plasma/sangre de hombre y mujer, se demuestra que la biblioteca creada a partir del DNA de entrada tratado con quinasa era más representativa, lo que permitía una detección más sensible del marcador específico de hombre DYS14 (3/3 réplicas, mientras que sólo se detectó 1 /3 si no se realizaba la fosforilación).

Ejemplo 6: Efecto de la pre-adenilación del DNA fragmentado antes de la reacción de circularización.

La eficacia de la circularización de un pequeño fragmento de DNA fosforilado o pre-adenilado en 40 minutos se evalúa con diferentes cantidades de la enzima CIRCLIGASE™. Se trataron 2,5 pmol de un oligonucleótido de 64 unidades que contenía un grupo fosfato o una adenilación en la posición 5' con cantidades crecientes de CIRCLIGASE I™ o CIRCLIGASE II™ durante 40 minutos a 60°C. El porcentaje de circularización se determinó escaneando la intensidad de las bandas en las posiciones lineal y circular. Como se representa en la Figura 12, la pre-adelinización del DNA fragmentado mejoró la cinética de unión y amplificación. En la Figura 12, P-64unidades representa un oligonucleótido de 64-nt 5'-fosforilado; y ad-64 representa un oligonucleótido de 64-nt pre-adenilado. El DNA pre-adenilado se circularizó más rápidamente que el DNA fosforilado estándar. Además, la enzima de unión, que tiene un bajo grado de adenilación, catalizó la unión de un exceso molar de sustrato, lo que indica que la ligasa tiene múltiples oportunidades para unir la molécula de DNA pre-adenilada, lo que aumenta la cinética de unión y potencialmente permite una mayor circularización de plantillas más difíciles.

Ejemplo 7: Circularización de oligonucleótidos que contienen 5'-fosfato y 5'-hidroxilo utilizando el flujo de trabajo de pre-adenilación.

Las reacciones que contenían 5 pmol de un oligonucleótido de 64 unidades con un grupo fosfato o un grupo hidroxilo en la posición 5' se trataron con 1,25 U de polinucleótido quinasa T4 a 37°C donde esté indicado. Después de la incubación con 25 pmol de RNA ligasa Mth a 65°C, las reacciones se trataron con 0,25 unidades de fosfatasa alcalina de camarón. Dado que la RNA ligasa Mth es muy sensible a la concentración de ATP, a una concentración estándar de ATP de 100 gM, la RNA ligasa Mth adenila casi exclusivamente los extremos del DNA. No se produce ninguna unión intramolecular mediante la RNA ligasa Mth a esta concentración de ATP. Las enzimas se inactivaron térmicamente después de cada incubación. Finalmente las reacciones se trataron con 50 unidades de CIRCLIGASE I™ donde esté indicado y se incubaron durante 60 minutos a 60°C. El porcentaje de circularización se determinó barriendo la intensidad de las bandas en las posiciones lineal y circular (Figura 13). P-64unidades representa un oligonucleótido de 64-nt 5'-fosforilado y ad-64unidades representa un oligonucleótido de 64-nt pre-adenilado.

La Figura 11 muestra un flujo de trabajo de pre-adenilación de "tubo único" en el que los oligonucleótidos lineales que contienen un grupo 5'-fosfato o un grupo 5'-hidroxilo se convierten en formas circulares. En este proceso de "tubo único", los sustratos se tratan sucesivamente con polinucleótido quinasa, RNA ligasa Mth, fosfatasa alcalina de camarón y CIRCLIGASE I™ sin ninguna etapa intermedia de purificación.

Ejemplo 8: Cinética de amplificación del genoma completo del ácido nucleico fragmentado a partir de plasma sanguíneo:

Se aisló DNA plasmático de un individuo aparentemente sano utilizando el kit Wako DNA extractor SP (Wako Pure Chemical Industries). Se calentó 1 ng de DNA plasmático purificado a 95°C para desnaturalizar la plantilla. Después, la plantilla de DNA monocatenario desnaturalizada se trató con una RNA ligasa (CIRCLIGASE II™, Epicentro) para generar círculos de DNA monocatenario. Para la reacción de unión, el DNA plasmático se incubó con una mezcla de reacción de unión (6 gl) que contenía HEPES 50 mM, pH 8,0, KOAc 66 mM, DTT 0,5 mM, betaína 1 M y 30 U de CIRCLIGASE II™ (Epicentro) a 60°C durante 2 horas. Posteriormente, la ligasa se inactivó térmicamente incubando la mezcla de reacción a 80°C durante 10 minutos. Después, los círculos de DNA monocatenario se sometieron a amplificación del genoma completo utilizando una amplificación del genoma completo de círculo rodante cebado aleatoriamente empleando una DNA polimerasa phi29. Los círculos de DNA monocatenario se amplificaron en el mismo recipiente de reacción, sin purificación intermedia del DNA ajustando la mezcla de reacción de unión a las siguientes condiciones: MgCl<2>20 mM, TCEP 1 mM, Tween-20 al 0,01 %, PEG-8000 al 2,5 %, mezcla de cebador hexámero aleatorio AT 40 gM, polimerasa Phi29 de 20 ng/gL y HEPES 50 mM (pH 8,0) hasta un volumen final de 20 gL. La mezcla de reacción de amplificación se incubó a 30°C durante 10 horas, seguido de la inactivación térmica de la polimerasa a 65°C durante 20 minutos. La amplificación en tiempo real se realizó añadiendo una pequeña cantidad de SYBR green I a la mezcla de amplificación y monitoreando el aumento de la señal de fluorescencia con el tiempo en un lector de placas Tecan (Tecan SNiPer, Amersham-Pharmacia Biotech). La amplificación se realizó utilizando la mezcla de cebadores aleatorios que tiene una secuencia N+N(at N)(at N)(at N)*N (hexámero aleatorio AT) donde "at N" representa una mezcla aleatoria que contiene 2-amino dA, 2-tio-dT, G normal y C normal.

A modo de comparación, se utilizó una concentración equivalente de DNA plasmático amplificado con hexámero aleatorio estándar (NNNN*N*N) y una muestra sin plantilla de DNA (control sin plantilla) utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente. Las reacciones de amplificación realizadas con la mezcla de cebadores de hexámero aleatorio AT sorprendentemente mostraron una cinética más rápida y produjeron un rendimiento de DNA del producto amplificado significativamente mayor en comparación con el hexámero aleatorio estándar, como se muestra en la Figura 14. El rendimiento de DNA para la amplificación utilizando el hexámero aleatorio AT es de 2,25 pg en comparación con el rendimiento de DNA de 0,84 pg utilizando el hexámero aleatorio estándar. El rendimiento de DNA es cero para la reacción "control sin plantilla" (NTC). Como se representa en la Figura 14, cuando el DNA plasmático se unió y se convirtió en círculos de DNA monocatenario usando CIRCLIGASE II™, se logró una cinética de amplificación rápida cuando se utiliza un cebador aleatorio que comprende un nucleótido modificado tal como el hexámero aleatorio AT. (Figura 3). Las reacciones de amplificación y unión de un solo tubo contienen componentes remanentes de la reacción de unión del DNA, incluyendo betaína, acetato de potasio y manganeso, que normalmente se sabe que tienen un efecto inhibidor sobre la amplificación. Sin embargo, cuando la reacción se realizó en presencia del hexámero aleatorio AT, que comprende nucleótidos modificados, este efecto inhibidor sobre la amplificación fue sorprendentemente mínimo. El aumento relativo en la cinética de amplificación como se muestra en la Figura 14 indica la eficacia de una mezcla de cebadores aleatorios que comprende al menos un nucleótido modificado para promover la reacción de amplificación de círculo rodante posterior a la unión intramolecular de la plantilla de DNA monocatenario en el mismo recipiente de reacción sin ninguna etapa de aislamiento o purificación intermedia.

Ejemplo 9: Análisis de secuencia de ácidos nucleicos amplificados a partir de plasma sanguíneo mediante amplificación del genoma completo asistida por ligasa.

El producto de DNA amplificado generado en el Ejemplo 8 se purificó mediante precipitación con etanol y se sometió a una reacción de secuenciación para determinar la calidad del método de amplificación del genoma completo asistido por ligasa usando un cebador hexámero aleatorio AT. La secuenciación se realizó empleando la secuenciación dirigida de extremo único del Ion Ampliseq Comprehensive Cancer Panel utilizando el Ion Torrent PGM con 318 chips y longitudes de lectura de 200 bp. Como se muestra en la Figura 15, el producto de DNA amplificado usando hexámeros aleatorios AT es de mayor calidad que el DNA amplificado usando hexámeros aleatorios estándar. El porcentaje de bases recuperadas para el DNA amplificado utilizando los hexámeros AT es más cercano al del DNA plasmático no amplificado bruto. La profundidad de cobertura y los niveles de uniformidad del DNA amplificado utilizando los hexámeros AT son más cercanos a los del DNA plasmático no amplificado bruto, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 1: Caracterización del DNA amplificado utilizando hexámero AT en comparación con el control de hexámero aleatorio estándar

La mayor cobertura general y uniformidad observadas en toda la región de la secuencia objetivo usando los hexámeros aleatorios AT también proporcionaron una mayor profundidad de cobertura en regiones con polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) clínicamente relevantes, medidos en sitios de mutación ClinVar conocidos (Figura 16, en donde el etiquetado indica la profundidad de cobertura promedio, 1 x profundidad, 15x profundidad, etc.). La figura muestra que, en todos los niveles de corte, los cebadores AT cubren un mayor porcentaje de regiones de mutación ClinVar que los cebadores aleatorios. Por el contrario, en reacciones de una sola etapa en donde el DNA plasmático se amplifica directamente sin una etapa de circularización, la cobertura de secuencia fue extremadamente pobre, con profundidades de cobertura variables en estas regiones y cobertura deficiente en los sitios de mutación de ClinVar.

Ejemplo 10: Extracción de tejido FFPE de tubo único, circularización de DNA, reparación y amplificación del genoma completo para re-secuenciación dirigida.

La desparafinización de portaobjetos de tejido FFPE se realizó incubando los portaobjetos de tejido FFPE en un horno a 65°C durante una hora. Los portaobjetos desparafinados se lavaron dos veces usando el agente de limpieza HISTOCHOICE™ Clean Agent (AMRESCO, cat#H103) durante 5 minutos. Los portaobjetos se lavaron sucesivamente con etanol al 100% (dos veces, 5 minutos cada vez), etanol al 75% (una vez, 5 minutos) y etanol al 50% (una vez, 5 minutos). Después se enjuagaron los portaobjetos con agua libre de nucleasas y se secaron al aire. Los antígenos se recuperaron de los portaobjetos utilizando tampones de recuperación de antígeno (AR) Citrato-TRIS. El tampón citratoAR (pH 6,0) y el TRIS-AR (pH 8,5) se precalentaron a 70°C durante 20 minutos. Los portaobjetos se colocaron en un frasco que contenía Citrato-AR precalentado y el frasco se colocó en una olla a presión a 110°C durante 4 minutos seguido de 75°C durante 20 minutos. Después se transfirieron los portaobjetos a un tampón TRIS-AR precalentado y se mantuvieron durante 20 minutos. El frasco se enfrió a temperatura ambiente durante 10 minutos y los portaobjetos se lavaron brevemente con agua y después se secaron al aire. Después, el tejido FFTE se digirió usando proteinasa K. Para la digestión, se usaron 0,6 pl de solución de digestión de proteinasa K de 2 mg/mL para áreas de tejido de 1 mm2 (por ejemplo, para una sección de tejido de 4 mm x 6 mm, se usaron aproximadamente 15 pl de solución de digestión de proteinasa K). La solución de digestión de proteinasa K se preparó mezclando 5 pl de proteinasa de 20 mg/mL (Invitrogen # AM2548) con 5 pl de tampón de digestión de tejido (h Ep ES 30 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, SDS al 0,5 % y Tween- 20 al 0,01 %). Primero, se añadieron al portaobjetos 0,5 pl de la solución de digestión de proteinasa K para humedecer el tejido. Usando una hoja de afeitar limpiada con etanol; el tejido se raspó y se transfirió a un tubo de 0,2 ml. Después se añadió al tubo el resto de la solución de digestión de Proteinasa K de 2 mg/mL y se incubó a 50°C durante 2 horas o más hasta que la suspensión se volvió transparente. La suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se reservaron 2 pl de extracción bruta para medir la concentración de DNA (Kit de ensayo Quant-iT™ DNA Assay Kit, alta sensibilidad (Invitrogen# Q-33120))

Para inactivar la mezcla de digestión, se tratan 5 pL de crudo extraído (que contiene 40 ng de DNA) con un inhibidor de la proteinasa K (0,6 pL de inhibidor de la Proteinasa K 5 mM (EMD Millipore # 539470), 3,3 pL de alfa-ciclodextrina al 9,1%, (Sigma#C4680)). Después, la muestra se procesa en 3 combinaciones diferentes.

Protocolo REV10: al extracto se le añadieron 1,1 pL de betaína 5 M, 1,1 pL de tampón de circularización 10x (HEPES 350 mM (pH 8,0), MnCl<2>25 mM, KOAc 660 mM, DTT 5 mM y Tween-20 al 0,03 %) y hasta 10,56 pl de agua libre de nucleasas (volumen total de 11 pL). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, la mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 95°C durante 3 minutos seguido de un enfriamiento rápido sobre hielo. A esto se le añadieron 0,44 pL de CIRCLIGASE II™ (Epicentro # CL9025K) hasta un volumen de reacción final de 11 pL. La mezcla de reacción se incubó en un termociclador a 60°C durante 8 horas seguido de 80°C durante 10 minutos para inactivar la enzima.

Protocolo REV11: al extracto se le añadieron los componentes de la reacción de reparación añadiendo 1,1 pL de tampón de reparación 10x (Tween-20 al 0,03 %, MgCl<2>100 mM, DTT 6 mM), 0,77 pL de mezcla de reparación/eliminación de daños (0,6 pL de UDG (5 U/ pL), 0,3 pL de Fpg (8 U/ pL), 0,15 pL de Endo IV (10 U/ pL) (New England Biolabs)) y agua libre de nucleasas para tener un volumen final de 11 pL. La mezcla de reacción se incubó en un termociclador a 37°C durante 30 minutos seguido de 85°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas. A esto se le añadieron 1,5 pL de betaína 5 M, 1,5 pL de tampón de circularización 10x (HEPES 350 mM (pH 8,0), MnCl<2>25 mM, KOAc 660 mM, DTT 5 mM y Tween-20 al 0,03 %) y agua libre de nucleasas (volumen total de 14,4 pL). La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 95°C durante 3 minutos seguido de enfriamiento rápido sobre hielo. A esto se le añadieron 0,6 pL de CIRCLIGASE II™ (Epicentro # CL9025K) hasta un volumen de reacción final de 15 pL. La mezcla de reacción se incubó en un bloque térmico a 60°C durante 8 horas seguido de 80°C durante 10 minutos para inactivar la enzima.

Protocolo REV12: al extracto se le añadieron 1,1 pL de betaína 5 M, 1,1 pL de tampón de circularización 10x (HEPES 350 mM (pH 8,0), MnCl<2>25 mM, KOAc 660 mM, D<t>T 5 mM y Tween-20 al 0,03 %) y agua libre de nucleasas (volumen total de 10,56 pL). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, la mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 95°C durante 3 minutos seguido de un enfriamiento rápido sobre hielo. A esto se le añadieron 0,44 pL de CIRCLIGASE II™ (Epicentro # CL9025K) hasta un volumen de reacción final de 11 pL. La mezcla de reacción se incubó en un termociclador a 60°C durante 8 horas seguido de 80°C durante 10 minutos para inactivar la enzima. Se usó toda la mezcla de circularización (11 pL) para la reacción de reparación/eliminación de daños añadiendo 1,5 pL de tampón de reparación 10x (Tween-20 al 0,03%, MgCl<2>100 mM, DTT 6 mM), 1,05 pL de mezcla de reparación (0,6 pL de UDG (5 U/ pL), 0,3 pL de Fpg (8 U/ pL), 0,15 pL de Endo IV (10 U/ pL) (New England Biolabs)) y 1,45 pL de agua libre de nucleasas para tener un volumen final de 15 pL. La mezcla de reacción se incubó en un termociclador a 37°C durante 30 minutos seguido de 85°C durante 15 minutos para inactivar las enzimas.

Para la amplificación del DNA, se preparó una mezcla maestra de reacción de limpieza mezclando 20 pL de tampón Phi293X (HEPES 114 mM (pH 8,0), mezcla de cebador AT 120 pM, Tween-20 al 0,021 %, MgCl<2>54,6 mM, TCEP 3 mM, KOAc 7,5 mM y PEG-8000 al 7,5 %), 0,3 pL de SYBR Green I 1:100*(Life Tech S-7563), 1,2 pL de polimerasa Phi29 (1 mg/mL, GE Healthcare), 21,1 pL de agua libre de nucleasa hasta un volumen final de 42,6 pL. La mezcla maestra de reacción de limpieza se incubó a 30°C durante 1 hora y se mantuvo a 4°C hasta que estuvo lista para su uso. La reacción de amplificación se inició añadiendo 2,4 pL de solución de dNTPs 10 mM a la reacción de limpieza. Inmediatamente se añadió toda la mezcla de reacción limpia a los 15 pL de la mezcla de reparación para un volumen de reacción final de 60 pL. Esta se incubó a 30°C durante 8 - 16 horas seguido de inactivación térmica de la polimerasa a 65°C durante 15 minutos. En una configuración en tiempo real, los datos se recogieron cada 10 minutos.

Los productos de amplificación del genoma completo se purificaron según las instrucciones de purificación del fabricante (SURECLeAn PLUS™, Bioline). Brevemente, 60 pL de SURECLEAN PLUS™ se añadieron a 60 pL de producto WGA y se mezcló bien. Este se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a velocidad máxima en una centrífuga de mesa durante 30 minutos. El sobrenadante se eliminó por aspiración. Se añadieron 120 pL de etanol al 70% recién preparado y se agitaron en vortex durante 10 segundos y se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 minutos. El sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Las etapas de lavado se repitieron una vez y después se secaron al aire para asegurar la eliminación completa del etanol. Los sedimentos secos se re suspendieron en 30 pL de Tris-HCl 10 mM (pH 8). Se utilizaron 2 pL de productos WGA purificados para medir la concentración de DNA (Quant-iT™ dsDNA Broad-Range Assay Kit, Invitrogen# Q-33130). El rendimiento esperado fue de aproximadamente 3 pg.

Las muestras de DNA se analizaron utilizando secuenciación de próxima generación en la plataforma MiSeq (Illumina). Según las recomendaciones del fabricante, se utilizó el TruSeq Amplicon-Cancer Panel (TSACP) (Illumina), que es un ensayo de re-secuenciación dirigida altamente multiplexado para detectar mutaciones somáticas. Se usaron 250 ng de DNA de tejido recién congelado como control positivo, y en el experimento se usaron 1000 ng de DNA del genoma completo amplificado en círculo rodante a partir de 40 ng de DNA de FFPE resultante del protocolo REV10, REV11 y REV12, todos por duplicado en el flujo de trabajo de secuenciación. A partir de estas reacciones de secuenciación, se determinaron la profundidad de la cobertura, la uniformidad del objetivo de secuencia y las estadísticas de mutación. Como se muestra en la Figura 17, Figura 18, y la Figura 19, los protocolos REV10, 11 y 12 proporcionan una excelente profundidad de cobertura y uniformidad de cobertura. Sin embargo, el protocolo REV12 en el que la etapa de reparación del DNA/eliminación de daños en el DNA se realizó después de la etapa larga de circularización del DNA tuvo un valor predictivo positivo mejorado y una mayor sensibilidad en comparación con los protocolos REV10 y REV11 (Figura 19).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un DNA cromosómico lineal;

(b) desnaturalizar el DNA cromosómico lineal a un DNA monocatenario, si el DNA cromosómico lineal está en forma bicatenaria;

(c) incubar el DNA cromosómico lineal con una ligasa que es capaz de unir de manera intramolecular, independiente de la plantilla, una secuencia de DNA monocatenario para generar un círculo de DNA monocatenario en una mezcla de unión;

(d) tratar el círculo de DNA monocatenario para modificar cualquier nucleobase dañada incubando dicha mezcla de unión con una uracil DNA glicosilasa, una formamidopirimidin-DNA glicosilasa o combinaciones de las mismas; y

(e) amplificar el círculo de DNA monocatenario mediante amplificación de círculo rodante usando una mezcla de cebadores aleatorios para formar un producto de DNA amplificado,

en donde la mezcla de cebadores aleatorios comprende secuencias de oligonucleótidos que comprenden al menos un análogo de nucleótido, y

en donde todos las etapas del método se realizan en un único recipiente de reacción sin ninguna etapa de aislamiento o purificación intermedia.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un análogo de nucleótido comprende 2-aminodesoxiadenosina y/o 2-tiodesoxitimidina.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de cebadores aleatorios comprende oligonucleótidos complementarios de unión selectiva, en donde cada miembro de los oligonucleótidos complementarios de unión selectiva comprende al menos un nucleótido que comprende una 2-amino-desoxiadenosina o al menos un nucleótido que comprende una 2-tio-desoxitimidina.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de cebadores aleatorios comprende secuencias de oligonucleótidos que comprenden un nucleótido modificado con fosforotioato, un nucleótido LNA, un nucleótido que comprende una 2-amino-desoxiadenosina, un nucleótido que comprende una 2-tio-desoxitimidina, o combinaciones de los mismos.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la mezcla de cebadores aleatorios es un hexámero que comprende secuencias de oligonucleótidos que tienen una estructura general N+N(at N)(at N)(at N)*N, en donde

N representa nucleótidos aleatorios que contienen nucleobases seleccionadas de una cualquiera de A, C, G, T y U;

(+N) representa un ácido nucleico bloqueado aleatoriamente (LNA) que contiene nucleótidos;

(at N) representa un nucleótido aleatorio que contiene nucleobases seleccionadas entre 2-amino dA, 2-tio-dT, G o C; y

*N representa un nucleótido aleatorio modificado con fosforotioato.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de la mezcla de cebadores aleatorios es mayor que la concentración del círculo de DNA monocatenario para promover la amplificación de múltiples círculos rodantes cebados aleatoriamente.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el DNA cromosómico lineal se selecciona del grupo que consiste en un DNA circulante libre de células, un DNA aislado de una muestra incorporada en parafina y fijada con formalina, una muestra de DNA forense que se ha expuesto a condiciones ambientales, un muestra de DNA antigua y combinaciones de las mismas.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el DNA cromosómico lineal es un DNA fragmentado.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la ligasa se selecciona del grupo que consiste en una RNA ligasa TS2126, una RNA ligasa T4, una DNA ligasa T4, una DNA ligasa T3, una DNA ligasa deE. Coliy combinaciones de las mismas.

10. El método de la reivindicación 1, en donde todas las etapas del método se realizan en un tampón HEPES.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende además tratar el DNA cromosómico lineal con una polinucleótido quinasa en presencia de un donante de fosfato distinto de trifosfato de adenosina o trifosfato de desoxiadenosina para generar una secuencia de DNA unible que tiene un grupo fosfato en un extremo 5' terminal y un grupo hidroxilo en un extremo 3' terminal antes de incubar el DNA cromosómico lineal con la ligasa.

12. El método de la reivindicación 1, que comprende además secuenciar el producto de DNA amplificado.

13. El método de la reivindicación 1, que comprende además fragmentar el producto de DNA amplificado para generar una biblioteca de DNA genómico.

14. El método de la reivindicación 1, en donde la amplificación es una amplificación del genoma completo.

15. El método de la reivindicación 1, en donde la amplificación de círculo rodante se realiza usando una DNA polimerasa descontaminada.