JP5798917B2 - 等温核酸増幅 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸の増幅、特に、二本鎖核酸標的分子を増幅するための等温法に関する。
核酸技術および遺伝物質技術において、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が、生体、この生体の細胞抽出物、または生体試料中に存在するかどうかを判断することがしばしば必要である。遺伝子または遺伝子の一部のいずれもヌクレオチド塩基の特異的配列によって特性決定されるので、ポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の当該特異的配列のすべてまたは一部の存在を直接検索することのみ必要である。
(ii)一本鎖DNAにプライマーオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程(図1B);および
(iii)関心のあるDNAの領域をコピーするためにプライマーから相補鎖を合成する(伸長させる)工程(図1C)。
(c)鎖置換合成が可能な1つ以上のポリメラーゼおよびdNTPを用いて当該第1および第2の核タンパク質プライマーの3’末端を伸長させて、第1および第2の二本鎖標的核酸分子ならびに核酸の第1および第2の置換鎖を生成する工程;ならびに、
(d)所望の程度の増幅が達成されるまで(b)および(c)を繰り返して反応を継続する工程。
(a)上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅プロセスの際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である工程;
(b)標的分子にオリゴヌクレオチドを適用し、オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程;
(c)標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程。
(a)(i)少なくとも一部分が標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド30個未満の一本鎖DNA分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー;(ii)少なくとも一部分が、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド30個の一本鎖DNA分子を含み、場合によって、標的分子の配列に相補的でありポリメラーゼ基質ではない下流要素を3’末端に含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程;
(b)オリゴヌクレオチド(ii)をリコンビナーゼと接触させて、オリゴヌクレオチドが標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程;
(c)標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程;(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程。
(a)上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、上流プライマーおよび下流プライマーは増幅法の際の鎖侵入系の基質ではなく、鎖侵入系と無関係には標的分子を増幅せず、オリゴヌクレオチドは鎖侵入系の基質である工程;
(b)標的分子にオリゴヌクレオチドを適用し、オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程;
(c)標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程。
(a)(i)少なくとも一部分が標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド30個未満の一本鎖DNA分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、(ii)少なくとも一部分が、上流プライマーおよび下流プライマーに介在する標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド30個の非伸長性一本鎖DNA分子を含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程;
(b)オリゴヌクレオチド(ii)をリコンビナーゼと接触させて、オリゴヌクレオチドが標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程;
(c)標的分子の一本鎖領域に上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)下流プライマーを一本鎖標的分子に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程;(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程。
上流プライマーは、介在するオリゴヌクレオチド(IO)の5’領域においてまたはその近位において標的核酸分子の一方の鎖と結合する。
下流プライマーは、IOの3’末端においてまたはその近位において標的核酸分子の一方の鎖と結合する。上流プライマーが結合する鎖と反対の鎖へ結合する。
介在する、すなわち中間のオリゴヌクレオチド(IO)は、鎖侵入系(SIS)の基質である。鎖侵入系の基質は、標的テンプレート二重鎖の分離または標的核酸上へのプライマー伸長の産物の分離を促進し、これにより、標的分子上の相補的一本鎖DNAへのプライマーのアクセスが可能になる。
上記のように、好ましくは鎖侵入系はリコンビナーゼ系を含む。リコンビナーゼは、ヌクレオチド約30個より長いDNA分子と結合するのがよい。好ましくは、リコンビナーゼは、一本鎖DNAに対して高い選択性(preference)を有し、二本鎖DNAに対しては選択性が比較的低い。本発明の方法では、これにより上流プライマーまたは下流プライマーではなくIOにリコンビナーゼが結合することが可能になる。
本発明の方法で使用されるポリメラーゼは、好ましくは、鎖置換活性を有するものである。この活性は特定のDNAポリメラーゼの周知の特性である(サムブルック(Sambrook)ら、1989年、「モレキュラークローニング:ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第2版、5.33〜5.35ページ、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー)。DNAポリメラーゼの特性(特に、DNAポリメラーゼのうちのいくつかの鎖置換活性)は、コーンバーグ(Kornberg)およびベイカー(Baker)、「DNAリプリケーション(DNA Replication)」、第2版、113〜225ページ、フリーマン、ニューヨーク州(1992年)により詳細に記載されている。DNAポリメラーゼのうちのいくらか(例えば、T4 DNAポリメラーゼ)は、鎖置換を単独で達成することができないので、鎖置換は、すべてのDNAポリメラーゼに共通の特性ではない。鎖置換は、これらの場合には、ポリメラーゼ付属タンパク質の付加により付与されてもよい。鎖置換活性は、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントに関して最初に示され(マサムネ(Masamune)およびリチャードソン(Richardson)、1971年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)」、246:2692〜2701)、これは、この酵素上で二本鎖DNAにおける切断部位の3’OH末端から核酸の複製を開始する能力を与える。この鎖置換活性はまた、Tli DNAポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼにおいて示されている(コング(Kong)ら、1993年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)」268:1965〜1975)。この場合、この酵素の変異形態は、より高い鎖置換能を有するエキソヌクレアーゼ5’−3’活性を有さないことも示されている。この鎖置換活性は、T7 DNAポリメラーゼ(レチナー(Lechner)ら、1983年.「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)」258:11174〜11184)およびHIV逆転写酵素(フーバー(Huber)ら、1989年、「ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)」264:4669〜4678)に関しても示されている。
リコンビナーゼが鎖侵入工程に利用される場合、系はエネルギー源を必要とする場合がある。これらの酵素の大多数はエネルギー源としてATPを利用するが、ATPは酵素活性に必要なマグネシウムイオンを照合(collate)するので、ATPの濃度を上げるのではなくむしろさらなるATP再生系を供給するのが賢明である。ATP生成系は、解糖経路または他の生化学的経路において様々な酵素を伴う可能性があり、ATP消費と共に、SIS酵素と一緒にこれらの酵素は、AMPおよびADPの産生と同時にオルトリン酸および/またはピロリン酸の蓄積を引き起こす。無機リン酸の蓄積はまた、マグネシウムをキレート化し得、多くの点で系に害がある可能性がある。オルトリン酸へのピロリン酸の変換は、ピロホスファターゼにより達成されてもよく、より害が少ない有機リン酸へのオルトリン酸の変換も種々報告されている。
実際には、本発明の方法を行う場合、標準的な操作手順において示される系の様々な成分の標準的な滴定が、最適な増幅を確保するために必要とされる場合がある。成分の滴定としては、タンパク性金属イオン滴定および塩滴定が挙げられる。塩の場合、最適な増幅を達成するため、カチオンおよびアニオンの性質や最適な濃度を評価してもよい。
明細書の以下の部分は、本発明の一実施形態を記載し、ここで方法はリコンビナーゼにより誘導される鎖侵入系(SIS)に基づく。リコンビナーゼは一本鎖オリゴヌクレオチド基質と反応し、当該オリゴヌクレオチド基質が二重鎖核酸内の相補鎖に侵入することを可能にし、二重鎖の他方の放出鎖(outgoing strand)(OS)と置換する。
5A:アーチファクト的な増幅を誘導する系成分は、上流プライマー(I)、中間オリゴヌクレオチド(II)、および下流プライマー(III)を含む。
5B:下流プライマーは、時として中間オリゴ上にコピーし得る。
5C:任意のさらなるオリゴヌクレオチドプライマーが、下流プライマーが占める位置の上流にある中間物上にコピーし得る。
5D:上記さらなるオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、下流プライマー伸張の産物の置換をもたらすことになる。
5E:最後に、上流プライマーが、置換された産物上へコピーする場合、増幅可能な単位が製造され得る。
(i)上流プライマーは、侵入するIOと重複するように設計してもよい。重複する領域は、好ましくは、ヌクレオチド約5〜10個である。重複するプライマーの伸長は、IOを置換するテンプレート上へのプライマーの予備的分枝点移動に依拠することになる。ある状況下では、また一本鎖結合タンパク質が存在する場合は特に、分枝点移動は遅く、プライマー伸長を休止させるので、プライマーの結合および伸長と本来の二重鎖への回復との競合では、回復が優先されるようになり得る。この実施形態の他の利点としては、IOに近位の末端は、長さが塩基18〜23個より長い場合は分離しないということである。それゆえ、融解温度は、反応の周囲温度(これは約40℃である)よりも高い。このコンストラクト(construct)において記載のプライマーは、この数字を超えるTmを有するが、周囲温度より低いTmを有する末端を生成する。このようなプライマーが使用される場合、これは融解した二重鎖の同族末端へ結合することができ、その3’領域が同族であり、ポリメラーゼの作用によって後に伸長する場合、侵入された二重鎖の部分上に分岐鎖移動することになる。プライマーが、非特異性/テンプレート非依存性産物の一部分になる場合、IO領域と完璧に位置合わせされなければ、生存可能な増幅単位にならない場合がある。
(i)図3に示し、下に記載のように、IOは、標的末端領域と同族であるその3’末端の伸長である配列(下流要素、DE)を含んでもよい。
上に記載の方法はいずれも、検出可能なシグナルを測定することにより増幅をモニタリングする工程をさらに含んでもよい。検出系は、増幅系の一部である1つ以上のオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。検出系は、蛍光性であってもよい。シグナル発生系と同族の配列が増幅の際に生成されてもよい。
(a)フルオロフォアは、プライマーに結合されてもよく、これは、系が一般的な挿入染料を含む場合、Fretアクセプターとして使用されてもよい。
(b)プライマーが増幅産物に組み込まれると検出可能な蛍光変化が生じるように、フルオロフォアはプライマーに結合されてもよい。これは、フルオロフォアが増幅産物に組み込まれるまで自己消光するか基底状態消光するように、ごく近位に2つ以上のフルオロフォアを配置することにより達成することができる。
(c)IOが増幅産物に組み込まれると検出可能な蛍光変化が生じるように、フルオロフォアとクエンチャーまたはアクセプターフルオロフォアとがIOまたはそのDEに組み込まれてもよい。
(d)フルオロフォアアクセプター/クエンチャー(FRET)対が切断可能要素により分離されるように、そしてFRET対が部分的に切断可能要素により分離される場合、および切断可能要素が二重鎖特異的ヌクレアーゼにより作用される場合は、FRET対は増幅系の要素に挿入されてもよい。この要素が増幅産物に組み込まれている場合、この要素の切断は、FRET対の完全な分離を誘導することになり、結果として系の蛍光を増強する。切断可能要素は、IOの一部であってもよいし、プライマー系の一部または系の単位複製配列に付加され単位複製配列に同族な付加的な要素であってもよい。切断可能要素がプライマー系の一部である場合、切断可能要素は、プライマー結合部位の5’末端またはプライマー結合部位の3’末端にあってもよい。切断可能要素が部分結合領域の3’末端に配置される場合、非同族塩基3’末端を切断可能要素に配置することが有利である場合があり、これらの塩基は、フルオロフォアまたはクエンチャー/アクセプターのいずれかの付着を含んでもよい。これらの特質を有するプライマーは、それがテンプレート増幅系の一部ではないが、任意のアーチファクト的な増幅に含まれるように設計されてもよい。これらの特質を有するプライマーは、例えば、プライマーがその3’末端においてまたはその近傍でIOに同族の区域を有する場合に、陰性対照として使用することができ、図5に記載のアーチファクトをもたらす。
試薬および溶液:
UVSXおよびUVSYを先に記載のように精製した(ティモシー・フォルモサ(Timothy Formosa)およびブルース・M・アルバーツ(Bruce M.Alberts)、「JBC」第261巻、6107〜6118、1986年)。
マグネシウム緩衝液。トリス(100mM);酢酸マグネシウム(100mM);DTT(20mM);pH8.0
(ジ−トリス−)ホスホクレアチン(500mM)(シグマ社)(水酸化アンモニウムを用いてpH7.8まで)
H2O中のDTT(200mM)
H2O中のBSA(100倍)(10mg/ml)
H2O中のATP−ジナトリウム塩(100mM)(イエナバイオサイエンス社)
dNTPs(10mM)(シグマ社D7295)
H2O中の50%PEG1000(w/v)(フルカ社)
H2O中のショ糖(2M)(フルカ社)
クレアチンキナーゼ(ウサギ筋肉由来Type I)(シグマ社C3755)40%グリセロール/KAc(50mM)(pH8)中で10u/μlまで溶解
ミオキナーゼ(ニワトリ筋肉由来)(シグマ社M3003)
40%グリセロール/H20中で9u/μl(200倍)まで溶解
ピロホスファターゼ(シグマ社I1643)40%グリセロール/H2O中で0.4u/μl(200倍)まで溶解
スクロースホスホリラーゼ(シグマ社S0937)40%グリセロール/H2O中で0.4u/μlまで溶解
UvsX、UvsY;酢酸カリウム(300mM)中100μM;50%グリセロール
gp32(NEB、10mg/ml)
クレノー、エキソ−(イエナバイオサイエンス社、50u/μl)最終濃度0.05u/μlで使用
2つのプライマーを用いた系(中間オリゴヌクレオチドは使用せず)(従来技術による系)
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。オリゴヌクレオチド構成要素は、テンプレートAと共に、最終濃度150nMの2つのプライマーを含んでいた。テンプレート/プライマー構成を図6Aに示す。テンプレートAの濃度は、特に明記しない限り1nMであり、増幅に続いてSybrグリーン蛍光をモニタリングした。
3つのプライマーを用いた系(2つのプライマーおよび非伸長性の中間オリゴヌクレオチドを使用)
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。テンプレート/オリゴヌクレオチド/プライマー構成を図7Aに示す。プライマーは、それぞれ濃度200nMで使用されたU16およびD16であった。中間オリゴヌクレオチドの濃度は150nMであり、テンプレートの濃度は100fMであった。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。
三成分系におけるプライマーは、使用した条件下では、長さが塩基20個未満でなければならない(プライマーの融解温度および周囲温度ならびに変性剤による)
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。種々の長さを有するプライマーを、それぞれ濃度200nMで使用した。中間オリゴヌクレオチド(IO1)は150nMで使用し、テンプレートの濃度は100fMであった。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。
アーチファクトは、中間オリゴヌクレオチドにおいてメチル化下流要素を使用することによって回避することができる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。テンプレート/オリゴヌクレオチド/プライマー構成を図9Aに示す。プライマーは、それぞれ、濃度300nMで使用した。中間オリゴヌクレオチド(IO1)は150nMで使用し、テンプレートの濃度は10pMであった。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。
3つのオリゴヌクレオチドを用いた系は、生物学的に誘導されたDNAから増幅できる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。オリゴヌクレオチドは、凡例に示す通りであり、図9Aに示すように構成した。プライマーは、それぞれ濃度300nMで使用した。中間オリゴヌクレオチド(IO1)は、150nMで使用し、テンプレートの濃度は1fMであって。オリゴヌクレオチドの直ぐ上流に、ALU1に感受性のあるさらなるagct配列を有するテンプレート1を、IDT−DNA社(サンディエゴ)によるプラスミドベクターPXero−2に挿入した。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。100ul(1nM)のプラスミド0.1ugを用いてALU1でプラスミドを切断し、NEB緩衝液4中のALU1(ニュー・イングランド・バイオラボ社)5単位で37℃にて30分消化した。続いて、プラスミドテンプレートを標準的な操作手順に記載の通りに水で希釈した。
メチル化中間物を用いた系の感受性は、単一分子レベルで有り得る
使用したプロトコルは、特に明記しない限り上述のものと同様である。使用したオリゴヌクレオチドは、U20over、テンプレート1、IO1methextra、およびD20backであった。あらゆるアーチファクト的な増幅事象を回避するためにこの構成を用いた。なぜなら、IOmethextraは、IO1methと比較してさらなる2’メチル化RNA塩基を含み、下流プライマーがさらなる2’−メチル化塩基によって許容できない程度までコピーする機会をさらに低減するからである。オリゴヌクレオチド構成を図9Aに示す。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。
クラウディング剤は、系の動力学を改善することができる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り実施例1に記載したものと同様である。オリゴヌクレオチドは、凡例に示す通りであり、図9Aに示すように構成した。プライマーは、それぞれ濃度200nMで使用されたU16およびD16であった。中間オリゴヌクレオチド(IO1)の濃度は150nMであり、テンプレート1の濃度は100pMであった。シグナルは、Sybrグリーン蛍光によって発生させた。
増幅は、反応を多重化するため、あるいは正および負の実験対照を組む込む目的で、Sybrグリーンの代わりにプローブによって識別できる
使用したプロトコルは、特に明記しない限り実施例1に記載したものと同様である。使用したオリゴヌクレオチドは、U20over(200nM)、テンプレート1、IO1meth(75nM)、ならびにそれぞれ濃度が100nMであるD20およびD20プローブの混合物である。テンプレートの濃度は、100fMであった。オリゴヌクレオチド構成を図9Aに示す。超好熱始原菌(T.kodakaraensis)由来のRNASEHを最終濃度1nMでその他の成分と共に加えた。系を励起し、増幅を評価するために480/520nmで読み取りを行うか、あるいはプローブの切断を識別するために540/600nmでの読取を行った。プローブは、下流プライマー系の一部として組み込んだ。プライマーは、テンプレートと同族の領域、RNA塩基およびブロックされた非同族領域をその3’末端に含んでいた。RNA塩基を、プライマーがテンプレートに結合した際にRNASEHIIによって切断し、プライマーを伸長させた。プライマーは、クエンチャーおよびフルオロフォアをRNA塩基の両側に含んでいたため、RNA塩基の切断時に分離され、シグナルが発生した。図13は、Sybrグリーンによって発生したシグナルおよびプローブによって誘導されたシグナルを示す。
U40 GTTACGATTGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
U35 GATTGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
U32 TGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
U23−overlap GAGTTGTGATGATGTC ATTCGCA
U23 CGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
U20 GAGTGAGTTGTGATGATGTC
U18 GTGAGTTGTGATGATGTC
U15 AGTTGTGATGATGTC
U12 TGTGATGATGTC
D40 TCTGGCATGTTACAAGGTCAAGATGAACCAACCACTTATA
D35 CATGTTACAAGGTCAAGATGAACCAACCACTTATA
D32 GTTACAAGGTCAAGATGAACCAACCACTTATA
D23 TCAAGATGAACCAACCACTTATA
D20 AGATGAACCAACCACTTATA
D18 ATGAACCAACCACTTATA
D16 GAACCAACCACTTATA
D14 ACCAACCACTTATA
D12 CAACCACTTATA
D20back GGTCAAGATGAACCAACCAC
X=3’アミノ−6炭素−スペーサーを含むブロック塩基
X=2’−O−メチルRNA
X=RNA塩基
TQは、BHQ2に付着したTである
TFは、テトラメチルローダミン(TAMRA)に付着したTである
IO1 TGAGCATAGACGGC
ATTCGCAGATCCAGTCAGCAGTTCTTCTCACTCTTCAA
IO2 GAGGCTAAGGAAT
ACACGCAAAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTTCAA
IO1met TGAGCATAGACGGC
ATTCGCAGATCCAGTCAGCAGTTCTTCTCACTCTTCAA GTATAG
IO1met extra TGAGCATAGACGGC
ATTCGCAGATCCAGTCAGCAGTTCTTCTCACTCTTCAA GTATAAGTGGA
IO1met2 TGAGCATAGACGGC
ATTCGCAGATCCAGTCAGCAGTTCTTCTCACTCTTCAA TTCTAG
テンプレートA GTTACGATTGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
CTGTATAAGTGGTTGGTTCATCTTGACCTTGTAACATGCCAG
テンプレート1 GTTACGATTGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
ATTCGCAGATCCAGTCAGCAGTTCTTCTCACTCTTCAA
GTATAAGTGGTTGGTTCATCTTGACCTTGTAACATGCCAG
テンプレート2 GTTACGATTGTCCTAATGGAGAGTGAGTTGTGATGATGTC
ACACGCAAAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTTCAA
GTATAAGTGGTTGGTTCATCTTGACCTTGTAACATGCCAG
D20probe AGATGAACCAACCAC(TQ)TATATTT(TF)TTT
D20probe2 T(TF)TTTTTAGA(TQ)GAACCAACCACTTATA
Claims (15)
- 下記工程を含む、二本鎖核酸標的分子の等温増幅法:
(a)上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを準備する工程であって、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーは、前記増幅法の際の前記鎖侵入系の基質ではなく、前記鎖侵入系と無関係には前記標的分子を増幅せず、前記オリゴヌクレオチドは前記鎖侵入系の基質であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的配列の一部分に相補的であり、前記鎖侵入系がリコンビナーゼ系を含む工程;
(b)前記標的分子に前記オリゴヌクレオチドを適用し、当該オリゴヌクレオチドを二重鎖に侵入させて、これにより前記標的分子を部分的にまたは完全に一本鎖にする工程;
(c)前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)前記下流プライマーを前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程。 - 前記オリゴヌクレオチドが、少なくともヌクレオチド30個からなる一本鎖DNA分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 二本鎖核酸標的分子の等温増幅法であって、
(a)(i)少なくとも一部分が前記標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド30個未満の一本鎖DNA分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、
(ii)少なくとも一部分が、前記上流および前記下流プライマーに介在する前記標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド30個の一本鎖DNA分子を含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程;
(b)前記オリゴヌクレオチド(ii)をリコンビナーゼと接触させて、前記オリゴヌクレオチドが前記標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより前記標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程;
(c)前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)前記下流プライマーを前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、伸長性のない3’末端を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼ系が、T4 gp32、UvsX、およびUvsYを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖侵入系の基質が、前記標的テンプレート二重鎖の分離または前記標的核酸上へのプライマー伸長の産物の分離を促進する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドが、前記介在するオリゴヌクレオチドによる前記標的二重鎖の分離を促進する、請求項6に記載の方法。
- 前記さらなるオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドにより放出される鎖に結合し、近位の二重鎖核酸へ分岐点移動する、請求項7に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的配列に相補的であり、ポリメラーゼ基質ではない下流要素をその3’末端に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換ポリメラーゼを使用する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記上流プライマーが、前記オリゴヌクレオチドと重複する配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記下流プライマーが、前記下流要素の配列に相補的な配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 検出可能なシグナルを測定することにより前記増幅をモニタリングすることをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖核酸標的分子の等温増幅法であって、
(a)(i)少なくとも一部分が前記標的分子の配列に相補的である、ヌクレオチド30個未満の一本鎖DNA分子をそれぞれ含む上流プライマーおよび下流プライマー、
(ii)少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的分子の配列に相補的である、少なくともヌクレオチド30個の一本鎖DNA分子を含み、さらに、前記標的分子の配列に相補的でありポリメラーゼ基質ではない下流要素を3’末端に含むオリゴヌクレオチド、を準備する工程;
(b)前記オリゴヌクレオチド(ii)をリコンビナーゼと接触させて、当該オリゴヌクレオチドが前記標的分子の相補領域に侵入することを可能にし、これにより前記標的分子の相補領域および隣接領域を一本鎖にする工程;
(c)前記二本鎖核酸標的分子における一本鎖に前記上流プライマーを適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記上流プライマーの3’末端を伸長させて、二本鎖核酸標的分子を産生する工程;
(d)前記下流プライマーを二本鎖核酸標的分子における一本鎖に適用し、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて前記下流プライマーの3’末端を伸長させて、さらなる二本鎖核酸標的分子を産生する工程であって、下流プライマーは上流プライマーが結合する反対鎖に結合する;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して反応を継続する工程を含む、請求項3に記載の方法。 - 上流プライマー、下流プライマー、鎖侵入系、およびオリゴヌクレオチドを含む、核酸標的分子の等温増幅キットであって、
前記上流プライマーおよび下流プライマーは前記増幅法の際の前記鎖侵入系の基質ではなく、前記鎖侵入系と無関係には前記標的分子を増幅せず、
前記オリゴヌクレオチドは前記鎖侵入系の基質であり、
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記上流プライマーおよび前記下流プライマーに介在する前記標的配列の一部分に相補的であり、前記鎖侵入系がリコンビナーゼ系を含む、キット。
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