JP5650034B2 - コク味付与物質のスクリーニング方法、コク味付与物質及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
(2)カルボキシアルキルアミノ酸が、カルボキシメチルリジン又はカルボキシエチルリジンである前記(1)に記載のスクリーニング方法。
(3)コク味付与物質が、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味の少なくとも一種を増強するものである前記(1)又は(2)に記載のスクリーニング方法。
(4)(a)抗体と被験物質とを接触させる工程、(b)被験物質に対する該抗体の結合を検出する工程、及び(c)該抗体に結合した被験物質を候補物質として選択する工程をこの順に含む前記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)抗体が、モノクローナル抗体である前記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)被験物質が、麦汁由来のものである前記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られるコク味付与物質。
(8)麦芽煮沸液由来のものである前記(7)に記載のコク味付与物質。
(9)カルボキシメチルリジンを含み、かつ分子量10〜20kDaのペプチドである前記(7)又は(8)に記載のコク味付与物質。
(10)前記(7)〜(9)のいずれかに記載のコク味付与物質を指標とした、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法。
(11)前記(7)〜(9)のいずれかに記載のコク味付与物質の量を測定する工程を含む前記(10)に記載の方法。
(12)前記(1)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのカルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を含むコク味付与物質検出用キット。
例えば、カルボキシアルキルアミノ酸中、カルボキシメチルリジン(以下、CMLともいう)は、側鎖アミノ基がカルボキシメチル化(以下、CM化ともいう)されたリジン(N−ε−カルボキシメチルリジン)であり、本発明におけるカルボキシアルキルアミノ酸として好ましい。同様に、アルキル部分がエチルであるカルボキシエチルリジン(以下、CELともいう)、アミノ酸部分がアルギニンであるカルボキシメチルアルギニン(以下、CMAともいう)なども好適である。
以下に、カルボキシメチルリジン(CML)等のCM化アミノ酸に対する抗体を例に、抗体の具体的な製造方法の一例を示す。
CM化する対象となるタンパク質は、複合タンパク質、単純タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などいずれのものでもよい。これらのタンパク質としては、例えばアルブミン(BSA等)、ヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヒト血清アルブミン(HSA)、リボヌクレアーゼ(RNase)、β2マイクログロブリン、ヒストン、コラーゲン、血球膜タンパク質、又は低密度若しくは高密度リポタンパク質などが挙げられる。また、タンパク質に限らず、ペプチド、例えばオリゴペプチド、ポリペプチドも用いることができ、タンパク質から修飾又は分解を受けて合成されたものも使用可能である。例えば、CMLに対する抗体を製造する場合には、リジンを含むタンパク質、ペプチド又はリジンをCM化して用いる。
(1)CM化タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
(i)抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したCM化タンパク質、CM化ペプチド又はCM化ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜10mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、例えば、好ましくは数日から数週間間隔、より好ましくは2〜5週間間隔で、好ましくは1〜10回、より好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から、好ましくは1〜60日後、より好ましくは1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウス等の動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば、P3X63−Ag.8.U1(P3U1)、NS−I等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等で適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に3×105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、得られたハイブリドーマを無血清の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
前記CM化タンパク質又はCM化ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)又は EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA;radioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
例えば、酵素標識抗体等を用いて、被験物質を添加した場合と添加しなかった場合との発色の程度を比較し、被験物質を添加した場合の発色の程度が大きい(又は小さい)場合に該被験物質が抗体と結合したと判定される。
一例として、例えば、工程(a)で被験物質と上記抗体とを反応させた後、酵素標識抗体(二次抗体)を添加して反応させる工程、次いで該酵素の基質を添加して酵素による発色反応をさせる工程、発色の程度を比色計等により測定する工程、該発色の程度を、被験物質を添加しない場合と比較する工程を行ない、該被験物質を添加した場合の発色の程度が、被験物質を添加しない場合と比較して大きい場合に該被験物質が抗体と結合したと判定される。
このような方法として、例えば、工程(a)で被験物質と上記抗体とを反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などで標識した抗マウスIgG抗体(二次抗体)をさらに反応させる方法が挙げられ、CM化アミノ酸、CM化ペプチド及びCM化タンパク質等のカルボキシアルキルアミノ酸又は該アミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質を検出及び定量することが可能である。
CM化アミノ酸に対する抗体への結合が検出された被験物質は、候補物質として選択される。
上記コク味付与物質を指標とした、飲食品の評価方法又は製造工程管理方法も、本発明の1つである。指標として用いられるコク味付与物質は、1種又は2種以上であってよい。本発明の方法においては、コク味付与物質の量を指標とすることが好ましい。コク味付与物質の量を指標とすることにより、官能評価とは異なり、コク味を定量的に評価することができる。
このように飲食品の製造工程を管理することにより、一定の品質の飲食品を効率よく製造することができる。
このようなキットは、上述したスクリーニング方法、飲食品の評価方法、製造工程管理方法等に好適に使用されるものである。
欧州産麦芽を市販の穀類粉砕機で乾式粉砕し、その4倍の重量の水を加え、常法に従い52℃で20分、65℃で60分撹拌した後、遠心分離及び濾紙濾過によって麦汁を得た(サンプル1)。サンプル1をオートクレーブで100℃で90分間加熱して得られた液体をサンプル2とした。サンプル1にカラメル色素(池田糖化工業株式会社製)を加えることにより430nmにおける吸光度をサンプル2と等しくしたものをサンプル3とした。なお、麦汁の色調による評価は一般的に430nmにおける吸光度を測定することにより行われる。サンプル1〜3の吸光度(430nm)の測定は分光光度計(島津製作所製)により測定した。
1.麦汁調製方法
欧州産麦芽を市販の穀類粉砕機で乾式粉砕し、その4倍の重量の水を加え、常法に従い52℃で20分、65℃で60分撹拌した後、遠心分離及び濾紙濾過によって麦汁を得た。得た麦汁をオートクレーブで100℃で90分間加熱して得られた液体を煮沸麦汁とした。
CM化リジンに対する抗体(一次抗体)は、特許第4012722号明細書の実施例1に記載の方法に従って調製した。
特許第4012722号明細書の実施例1に記載の方法に従って得たCM化アルブミンを含む溶液をマイクロプレートに加え、2時間静置しCM化タンパク質等をプレート上に固定化(コーティング)した。溶液とコーティングされていないCM化タンパク質等を洗浄除去後、ゼラチンを含む溶液をプレート上に加え、1時間静置し、以後の工程でプレート上にその他の成分が固定化されないようにゼラチンを固定化した(ブロッキング)。ゼラチン溶液とコーティングされていないゼラチンを洗浄除去後、被験物質を含む試料溶液(上記の煮沸麦汁)及び上記CM化アミノ酸(CM化リジン)に対する抗体(一次抗体)を添加し、1時間静置し競合反応をさせた。固定化したCM化アミノ酸等と結合しなかった被験物質及び一次抗体を洗浄除去後、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP))で標識した抗マウスIgG抗体を加えて一次抗体と結合させた。コントロールにおいては、煮沸麦汁を添加しない以外は同様の手順を行った。溶液と一次抗体に結合していない二次抗体を洗浄除去後、酵素基質を添加して酵素による発色反応をさせ発色を確認後、濃硫酸により発色を停止させた後に、発色の程度(492nmの吸光度)を比色計等で測定し、煮沸麦汁を添加した場合と煮沸麦汁を添加しなかった場合(コントロール)との発色度を比較した。この方法においては、被験物質の添加によりコントロールと比較して発色度が減少する場合に、該被験物質がCM化アミノ酸に対する抗体に結合したと判定される。煮沸麦汁の添加により、コントロールと比較して発色度が減少したことから、煮沸麦汁中に含まれる物質がCM化アミノ酸に対する抗体に結合したと判定した。CM化アミノ酸に対する抗体と結合した物質を、AGE産物(終末糖化産物)として選択した。
煮沸前麦汁及び煮沸後麦汁をそれぞれ濃縮し、SDS−PAGEによる電気泳動を行った。同一ゲルにサンプル及び分子量マーカーを2セットアプライして電気泳動を行った後ゲルを分割し、1セットはクマシーブルー染色を行い、もう1セットはウェスタンブロッティングに供した。ウェスタンブロッティングは常法に従って行い、一次抗体としては抗カルボキシメチルリジン抗体、二次抗体としてはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体を用いてAGE産物(メイラード反応したタンパク質)の検出を行った。
図2のBに、ウェスタンブロッティングの結果を示す。図2のB中、(1)は、煮沸前麦汁であり、(2)は、煮沸後麦汁である。図2のBに矢印で示す15kdのバンドが、検出されたAGE産物(メイラード反応したタンパク質)であり、麦汁中の多くのタンパク質の中から、AGE産物(メイラード反応したタンパク質)を特異的に検出することが出来た。
麦汁中の成分の分子量による分取
実施例1と同様にして得られた煮沸麦汁を、ゲルろ過により分子量で分画分取した。
すなわち、煮沸麦汁を透析膜(SPECTRUM LABS社製、Spectra/Por(登録商標)7、分画分子量10kDa)を用いて2日間透析を行い、低分子成分を麦汁中から除去した。得られた透析麦汁を、減圧下溶媒を留去することによって4倍程度に濃縮した後、ゲル濾過分画の大型カラム(長さ30cm、内径2cm)を用いて、水を移動相として分子量分画フラクションを得た。フラクションは各4mLとし、得られたフラクションをNo.1〜No.10とした。この操作を10回繰り返し、各操作で得られた同じ番号のフラクションを合一して官能実験及び競合ELISAに用いた。フラクション中のAGE産物(メイラード反応したタンパク質)量は実施例1の競合ELISA法により測定した。なお、合一した各フラクションは凍結乾燥により乾燥固体重量を測定した。
官能評価
上記のゲル濾過で得られたフラクションのうち、固体乾燥物が含まれているがAGE産物(メイラード反応したタンパク質)を含まないフラクションNo.7及びNo.11の画分とAGE産物(メイラード反応したタンパク質)を含むフラクションNo.9について、官能評価を行なった。具体的には各フラクションの固体乾燥物を市販のビール(サントリー酒類製)にそれぞれ10ppm増加するように添加したものをサンプルとし、該市販ビールをコントロールとして、訓練されたパネラーにより飲み応え、味の厚み、及び余韻の量を評価した。コントロールの値を1とし、各フラクションの飲み応え、味の厚み、及び余韻の量がコントロールよりも高く感じたときはスコアを2、強く感じたときのスコアは3として、それぞれのフラクションの固体乾燥物を評価した。
官能評価の平均スコアを、図5に示す。メイラード反応したタンパク質を多く含む画分(フラクションNo.9)は、他の画分と比較して味わい付与に効果が大きいことが分かった。
以下のワイン、ビール、味噌抽出液、日本酒及びチーズ抽出液を検体として用いて、実施例1と同様にして、各検体中のAGE産物(メイラード反応したタンパク質)の量を競合ELISA法により分析した。
シャトームートンロートシルト2007(商品名、シャトームートンロートシルト製(フランス))
シャトームートンロートシルト1975(商品名、シャトームートンロートシルト製(フランス))
バローロボルゴーニュ2001(商品名、ボルゴーニュ製(イタリア))
バローロボルゴーニュ1967(商品名、ボルゴーニュ製(イタリア))
上記の各ワインを、競合ELISAに供した。
カンティヨン グーズ(商品名、カンティヨン醸造所製、ベルギー産の3年以上熟成したランビックビールと熟成の若いビールをブレンドしたビール)
カンティヨン グランクリュ ブルオクセラ(商品名、カンティヨン醸造所製、ベルギー産の3年以上熟成したランビックビールのみを使用したビール)
上記の各ビールを、競合ELISAに供した。
石井味噌三年蔵白(一年熟成)(商品名、石井味噌社製)
石井味噌三年蔵赤(三年熟成)(商品名、石井味噌社製)
サンプル(上記の各味噌)5gに15gの水を加えて、10000rpm、2分ホモゲナイザーにて十分に攪拌を行った。その後に5000rpm、30分4℃、で遠心分離を実施し、その上澄み液を0.45μmの径のフィルター(商品名GLクロマトディスク 水系0.45μm、クラボウ社製)でろ過したものを競合ELISAに供した。
月桂冠PREMIUM 山田錦大吟醸(商品名、月桂冠社製)
月桂冠PREMIUM 雄町純米吟醸(商品名、月桂冠社製)
月桂冠浪漫 超特選秘蔵酒十年(商品名、月桂冠社製)
月桂冠王冠(商品名、月桂冠社製)
木戸泉二十五年古酒(商品名、木戸泉酒造社製)
達磨正宗千歳不易十五年古酒(商品名、白木恒助商店より購入)
上記の各日本酒を、競合ELISAに供した。
ベームスターゴーダ(Vlaskaas)(商品名、CONO社製(オランダ)、熟成なし)
ベームスターゴーダpremier(商品名、CONO社製(オランダ)、6ヶ月熟成タイプ)
ベームスターゴーダclassic(商品名、CONO社製(オランダ)、18ヶ月熟成タイプ)
ベームスターゴーダX-O-ExtraOld(商品名、CONO社製(オランダ)、26ヶ月熟成タイプ)
サンプル(上記の各チーズ)30gに水90gを加えて、15000rpm、2分ホモゲナイザーにて十分に攪拌を行った。その後に3500rpm、15分、4℃で遠心分離を行った。遠心分離後、3層に分かれたうちの真ん中の水層をデカンテーションにより分けとり、さらにその水層を再度遠心分離し上澄み液を得た。その上澄み液を0.45μmの径のフィルター(商品名GLクロマトディスク 水系0.45μm、クラボウ社製)でろ過したものを競合ELISAに供した。
訓練されたパネラー5名(パネラーA〜E)により、実施例4の各検体について官能評価を行った。評価基準は、以下のとおりである。
コク味を感じない:1、コク味をあまり感じない:2、コク味を感じる:3、コク味をやや強く感じる:4、コク味を強く感じる:5の評点で評価を行った。
Claims (6)
- カルボキシアルキルアミノ酸に対する抗体を使用し、該抗体に対する反応性を指標とすることを特徴とするコク味付与物質のスクリーニング方法。
- カルボキシアルキルアミノ酸が、カルボキシメチルリジン又はカルボキシエチルリジンである請求項1に記載のスクリーニング方法。
- コク味付与物質が、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味の少なくとも一種を増強するものである請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- (a)抗体と被験物質とを接触させる工程、(b)被験物質に対する該抗体の結合を検出する工程、及び(c)該抗体に結合した被験物質を候補物質として選択する工程をこの順に含む請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 抗体が、モノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 被験物質が、麦汁由来のものである請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
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