JP5606314B2 - A−b−c−d−で誘導体化されたペプチドとその治療用途 - Google Patents
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Description
この発明の他の目的は、例えば1週間に1回、皮下投与、又は代替として非侵襲的送達に使用される、治療的用量を低減するために、高い作用強度(レセプター親和性)を有するペプチド誘導体、例えばGLP-1、エキセンディン-4の誘導体、又はそのアナログを提供することである。
この発明の他の目的は、タンパク質分解からペプチドを保護し、ペプチドの腎クリアランスを低下させる、高いアルブミン結合親和性を有するペプチド誘導体、例えばGLP-1誘導体又はそのアナログを提供することである。
作用強度、特に低及び高濃度のアルブミンの存在下におけるGLP-1レセプターに対する結合親和性の比率、半減期、アルブミンに対する結合親和性は、長時間作用し、安定しており、もちろん治療的に活性であり、1週間1回の投与が可能なペプチド誘導体、例えばGLP-1誘導体を得るという全目的に対して潜在的に関連する特性である。
本発明のペプチド誘導体は、好ましくは化学的、物理的及び酵素的に安定している。
A-は、
[上式中、Rは低級の直鎖状又は分枝状アルキル、例えばイソブチルであり、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]であり、
-B-は、
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]からなる群から選択され、
又はAは、
[上式中、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択される]であり、
Bは、
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-は、
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、fが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-は前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーであり、結合を表すか、又は存在しない。
また本発明は、これらのペプチド誘導体の組成物及び使用に関する。
定義及び特定の実施態様
本明細書において、以下の用語は、以下に示した意味を有する:
ここで使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合した、少なくとも5つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は遺伝暗号によりコードされるアミノ酸からなる群からのものであってよく、また遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばγ-カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニン及びD-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のD-異性体、例えばD-アラニン及びD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
光学異性体が記載されない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解される。
他の特定の実施態様では、リンカーDは、少なくとも5、8、10、19、20、29、41、又は少なくとも60の非水素原子を含む及び含有する。
さらなる他の実施態様では、リンカーの非水素原子の30−50%(例えば、34、38、40、41又は42%)が、N又はO原子で構成されている。
本発明の多くのペプチド誘導体は合成であり、実験部分に記載されているようにして試験される。
本発明のペプチド誘導体は、実施例を参照することで、以下に説明されるように、いくつかの有利で有益な特性を有する。
第1の態様では、本発明のペプチド誘導体は、作用の遅延化特性を有しており、潜在的に、1日に1回未満の投与頻度、1週間に1回の可能性、又はそれ未満の投与頻度に適している。作用プロフィールは、実験動物、例えばマウス又はブタを用いて、薬物動態実験にて評価される。適切な実験は、本出願の実施例73(ミニブタ)及び実施例77(マウス)において見出される。
実施例73の一つと同様、薬物動態実験は、時間に対する当該問題の化合物の血漿濃度プロフィールとされ、半減期T1/2に基づき測定され得る。
第2の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、32時間以上、好ましくは34時間以上、より好ましくは36時間以上、さらに好ましくは38時間以上、最も好ましくは40時間以上である。
第4の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、45時間以上、好ましくは50時間以上、より好ましくは55時間以上、さらに好ましくは60時間以上、最も好ましくは65時間以上である。
第6の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、ミニブタに皮下投与した後、92時間以上、好ましくは94時間以上、より好ましくは96時間以上、さらに好ましくは98時間以上、最も好ましくは100時間以上である。
従って、本発明のペプチド誘導体の例示的半減期間隔(hour、hで示す時間)は:ミニブタへの皮下投与で測定して、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、又は90-100(時間)である。
第2の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、db/dbマウスに皮下投与した後、15時間以上、好ましくは16時間以上、より好ましくは17時間以上、さらに好ましくは18時間以上、最も好ましくは19時間以上である。
第3の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、db/dbマウスに皮下投与した後、20時間以上、好ましくは21時間以上、より好ましくは22時間以上、さらに好ましくは23時間以上、最も好ましくは24時間以上である。
第5の特定の実施態様では、本発明のペプチド誘導体の半減期は、db/dbマウスに皮下投与した後、30時間以上、好ましくは31時間以上、より好ましくは32時間以上、さらに好ましくは33時間以上、最も好ましくは34時間以上である。
従って、本発明のペプチド誘導体の例示的半減期間隔(hour、hで示す時間)は、db/dbマウスへの皮下投与でアッセイして:5-35、10-35、15-35、20-35、又は25-35(時間)である。
ここで使用される場合「インスリン分泌性剤」なる用語は、ヒトGLP-1レセプターのアゴニストである誘導体、すなわち、ヒトGLP-1レセプターを含有する適切な媒体(このような媒体の一つは以下に開示される)において、cAMPの形成を刺激する誘導体を意味する。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、1.80以下、好ましくは1.60以下、より好ましくは1.40以下、さらに好ましくは1.20以下、最も好ましくは1.00(nM)以下の作用強度(nMでのEC50)を有する。
第3の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、0.80以下、好ましくは0.60以下、より好ましくは0.40以下、さらに好ましくは0.20以下、最も好ましくは0.10(nM)以下の作用強度(nMでのEC50)を有する。
第5の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、cAMPアッセイを使用して測定した場合に、0.040以下、好ましくは0.030以下、より好ましくは0.020以下、最も好ましくは0.010(nM)以下の作用強度(nMでのEC50)を有する。
従って、本発明のGLP-1誘導体の作用強度(cAMPアッセイを使用して測定した場合、nMでのEC50)の例示的範囲は、0.010-2.00、0.010-1.80、0.010-1.60、0.010-1.40、0.010-1.20、0.010-1.00、0.010-0.80、0.010-0.60、0.010-0.40、0.010-0.30、0.010-0.20、0.010-0.10、及び0.010-0.90(nM)、好ましくは0.010-0.40、0.010-0.30、0.010-0.20、0.010-0.10、及び0.010-0.90(nM)である。
第2の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、90以下、好ましくは80以下、より好ましくは70以下、さらに好ましくは69以下、最も好ましくは50以下の[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)超低HSA]比率を有する。
第4の特定の実施態様では、本発明のGLP-1誘導体は、15以下、好ましくは10以下、より好ましくは8以下、さらに好ましくは5以下、最も好ましくは4以下の[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)超低HSA]比率を有する。
従って、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)超低HSA]比率の例示的範囲は、2-500、2-300、2-100、2-50、2-30、2-20、及び2-10である。
第2の特定の実施態様では、アルブミン結合親和性(すなわち、実施例76のアッセイを使用して測定した場合の、競合曲線のEC50値(nM))は、500以下、好ましくは400以下、より好ましくは300以下、さらに好ましくは200以下、最も好ましくは100(nM)以下である。
従って、本発明のGLP-1誘導体のアルブミン結合親和性(nMでのEC50)の例示的範囲は:1-3000、1-2500、1-2000、100-2000、200-2000、400-1500、600-1500、及び800-1500(nM)である。
本発明の誘導体であり得る他のペプチドの具体例は、100kDa未満、50kDa未満、又は10kDa未満の分子量を有する治療用ペプチドである。
本発明で誘導体化可能な他のペプチドの具体例は、エキセンディン-4、ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子を含む凝固因子、副甲状腺ホルモン、ヒト卵胞刺激ホルモン、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)、上皮成長因子(EGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、ソマトメジン、例えばインスリン成長因子I(IGF-I)、インスリン成長因子II(IFG-II)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)又はアンジオポエチン、インターフェロン、プロ-ウロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター2、フォン・ヴィルブランド因子、サイトカイン、例えばインターロイキン、例えばインターロイキン(IL)1、IL-1Ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20又はIL−21、コロニー刺激因子(CFS)、例えばGM-CSF、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、例えばTNF-α、リンホトキシン-α、リンホトキシン-β、CD40L、又はCD30L、プロテアーゼインヒビター、例えばアプロチニン、酵素、例えばスーパーオキシドジスターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、カタラーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、トリプシン、パパイン、アルカリホスファターゼ、β-グルコロニダーゼ(glucoronidase)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はバトロキソビン、オピオイド、例えばエンドルフィン類、エンケファリン類又は非天然オピオイド類、ホルモン又はニューロペプチド、例えばカルシトニン、グルカゴン、ガストリン類、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、コレシストキニン類、黄体形成ホルモン、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン放出因子、バソプレシン、オキシトシン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、レラキシン、プロラクチン、ペプチドYY、Y2レセプターアゴニスト、Y4レセプターアゴニスト、混合Y2/Y4レセプターアゴニスト、ニューロペプチドY、膵臓ポリペプチド、レプチン、CART(コカイン及びアンフェタミン調節転写物)、CART関連ペプチド、ペリリピン、ナトリウム利尿ペプチド、アドレノメデュリン、エンドセリン、セクレチン、アミリン、血管作用性小腸ペプチド(VIP)、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、チモシン、ヘパリン結合タンパク質、可溶性CD4、視床下部放出ホルモン、メラノトニン類(melanotonins)、及びそのアナログ、ヘマタイド(hematide)及びそのアナログである。
であり、7位の天然に生じるヒスチジンがデスアミノHisで置換され、22位の天然に生じるグリシンがグルタメートで、26及び34位のリジンがアルギニンで置換されている。
ここで使用される「GLP-1ペプチド」なる用語は、GLP-1(7-37)(配列番号:1)又はGLP-1(7-37)アナログを意味する。
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Arg34]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Glu22 Arg26,Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys、
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)、
[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-ベンジル)33,]GLP-1-(7-37)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37),[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)、
[Aib8,Lys20,Arg26, 2-ナフチルアラニン28,Glu30,]GLP-1(7-37)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)-Lys、
[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン12,Glu30,]GLP-1-(7-37)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37)、
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)、
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-アミド、
[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)、
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[Aib8,Lys26]GLP-1(7-37)アミド、
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)、
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)、
[Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)、
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド、
[Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys、
[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド、
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド、
Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys、
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys、及び
[Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)、
からなる群から選択される。
ここで使用される場合「インスリン分泌性剤」なる用語は、ヒトGLP-1レセプターのアゴニストである誘導体、すなわち、ヒトGLP-1レセプターを含有する適切な媒体(このような媒体の一つは以下に開示される)において、cAMPの形成を刺激する誘導体を意味する。インスリン分泌性剤の作用強度は、以下に記載されるように、用量応答曲線から、EC50値を算出することにより決定される。
クローンされたヒトGLP-1レセプターを発現するベビーハムスター腎臓(BHK)細胞(BHK-467-12A)を、100IU/mLのペニシリン、100μL/mLのストレプトマイシン、5%のウシ胎仔血清(FCS)及び0.5mg/mLのジェネテシンG-418(Life Technologies)が添加されたDMEM培地で増殖させる。細胞を、リン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、ヴェルセンを用いて収集する。バッファー1(20mMのHEPES-Na、10mMのEDTA、pH7.4)において、ウルトラトゥラックス(Ultraturrax)を用いてホモジナイズすることにより、細胞から細胞膜を調製する。ホモジネートを、4℃で15分、48000xgの遠心分離にかける。バッファー2(20mMのHEPES-Na、0.1mMのEDTA、pH7.4)においてホモジナイズすることにより、ペレットを懸濁させ、ついで、4℃で15分、48000xgの遠心分離にかける。洗浄手順を1回以上繰り返す。最終ペレットをバッファー2に懸濁させ、直ちにアッセイに使用するか、又は−80℃で保存する。
本発明の一態様では、前記GLP-1ペプチドは、リラグルチドの安定性よりもDPP-IVに対して安定している。
一実施態様では、本発明の誘導体は、リラグルチドよりもDPP-IVに対して耐性のある、DPP-IV保護された誘導体である。
ペプチドのアリコート(5nmol)を、5mUの酵素活性に相当する1μLの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に、10-180分、100μLの0.1Mトリエチルアミン-HClバッファー、pH7.4において、37℃でインキュベートする。10%のトリフルオロ酢酸を5μL添加することにより、酵素反応を終了させ、ペプチド分解生成物を分離し、HPLC分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである:混合物をVydac C18ワイドポア(widepore)(30nmの孔、5μmの粒子)250x4.6mmのカラムに適用し、Siegelら, Regul. Pept. 1999;79;93-102及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35に従い、0.1%のトリフルオロ酢酸に直線段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(3分間は0%のアセトニトリル、17分間は0-24%のアセトニトリル、1分間は24-48%のアセトニトリル)を、1ml/分の流速で溶出させる。ペプチドとその分解生成物は、220nm(ペプチド結合)又は280nm(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし、標準体に対するそれらのピーク領域を積分することにより定量してよい。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解速度は、10%未満のペプチドが加水分解されるインキュベート時間で概算される。
ペプチドのアリコート(4nmol)を、1.6%のヒト血清アルブミンの存在下又は不在下、40μLの0.085Mトリス-HClバッファー、pH8.0において22時間、10.9mUの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に、37℃でインキュベートする。0、4及び22時間後、10μlのサンプルを取り出し、1%のトリフルオロ酢酸を100μL混合することにより、酵素反応を終了させる。ペプチド分解生成物を分離し、HPLC分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである:混合物をアリゲント・ゾーバックス(Agilent Zorbax)300SB-C18(5μmの粒子)150x2.1mmのカラムに適用し、0.07%のTFAと共に、0.1%のトリフルオロ酢酸から100%のアセトニトリルまでの直線段階的勾配で、0.5ml/分の流速で30分溶出させる。ペプチドとその分解生成物は、214nmの吸光度をモニターし、それらのピーク領域を積分することにより定量される。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVに対するペプチドの安定性は、無傷ペプチドと、切断後に2つのアミノ末端アミノ酸を欠く分解生成物のピーク領域の合計に対する、無傷ペプチドのピーク領域として決定される。
ここで使用される場合「賦形剤」なる用語は、薬学的組成物に通常添加される化学化合物、例えばバッファー、等張剤、保存料等を意味する。
ここで使用される場合「有効量」なる用語は、処置しない場合と比較して、患者を処置するのに十分有効な投与量を意味する。
ここで使用される場合「病気の処置」なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。処置の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。処置には、病気、病状又は疾患の除去又は制御、並びに病気、病状又は疾患に関連する症候群又は合併症を緩和するために、本発明の活性誘導体を投与することを含む。
他の態様では、本発明は、2%のアルブミンの存在下、100nM以下、好ましくは30nM以下の親和性で、GLP-1レセプターに結合するGLP-1ペプチドの誘導体に関する。
他の態様では、本発明は、GLP-1レセプターに対する親和性が、2%のヒトアルブミンの存在下における親和性に対し、非常に低濃度(例えば0.005%〜0.2%)のヒトアルブミンの存在下における親和性を比較した場合に幾分減少している、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。これらの条件下での、結合親和性におけるシフトは、50倍以下、好ましくは30倍以下、さらに好ましくは10倍以下である。
500nM以下のアルブミン結合親和性を有する、強いアルブミン結合誘導体について、cAMPアッセイでのGLP-1作用強度は1マイクロモルより良好、好ましくは、作用強度は0.2マイクロモルより良好である。
他の態様では、本発明は、高いアルブミン結合親和性を有する、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。この発明の誘導体は、1マイクロモル以下のアルブミン結合親和性を有する。より好ましくは、この発明の誘導体は500nM以下、さらに好ましくは200nM以下、又は100nM以下のアルブミン結合親和性を有する。
アルブミン結合アッセイ:
ヒト血清アルブミン(HSA)に対するGLP-1誘導体の親和性を、競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)により測定する。ストレプトアビジン-SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009)を5時間、ビオチニル化HSAと共にインキュベートする。バッファーを用いてビーズを洗浄し、未結合のHSAを除去する。ビーズを、125I-標識されたアシル化GLP-1アナログ、例えばN-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Arg34]GLP-1(7-37)、又はN-イプシロン37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Glu22,Arg26,34,Lys37]GLP-1(7-37)-NH2と、100mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.025%のトゥイーン-20を含有するバッファー、pH7.4において混合する。パーキン・エルマー・オプチプレート-96 6005290のウェルに、混合物をピペットで移し(ウェル当たり100μl)、測定されるGLP-1誘導体の希釈シリーズを100μl、同様のバッファーに添加する。室温でゆっくりと揺らして20時間後、プレートを遠心分離し、トップカウンターにおいて計測する。GLP-1誘導体の濃度の関数として、結合cpmをプロットし、競合曲線のEC50値を、HSAに対する誘導体の親和性の測定値として使用する。
この発明の一態様では、齧歯動物及び非齧歯動物モデルにおける末端半減期は、リラグルチドの少なくとも3倍改善されている。
この発明の他の態様では、非齧歯動物モデルにおける末端半減期は、リラグルチドの少なくとも6倍改善されている。
他の態様では、本発明は、ミニブタへの皮下投与の後、少なくとも50時間のインビボ半減期を有する、好ましくは、ミニブタへの皮下投与の後、少なくとも80時間のインビボ半減期を有する、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。
他の態様では、本発明は、中性pH、最も好ましくは6-8の範囲で、化学的かつ物理的に安定している、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。
他の態様では、本発明は、ほとんど又は全く、凝集傾向を有していない、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。一態様では、凝集傾向は、チオフラビンアッセイで試験される場合、リラグルチドの凝集傾向に対してかなり改善されている。
本発明の一実施態様では、上述した特徴の組合せが達成される。
アルブミン結合残基の範囲は、遠位酸性基を有する4-40の炭素原子を含む、直鎖状及び分枝状の脂質親和性部分が公知である。
以下の式において、結合基からの末端結合は、記載がない限りは、付着結合(attachment bonds)とみなされ、メチレン基で終結しない。
本発明の他の目的は、0.1mg/ml〜25mg/mlの濃度で存在する、本発明の誘導体を含有する薬学的製剤を提供することであり、ここで該製剤は、3.0〜9.0のpHを有する。製剤は、バッファー系、保存料(類)、等張剤(類)、キレート剤(類)、安定剤、及び界面活性剤をさらに含有する。
本発明のさらなる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。
「水性製剤」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する製剤と定義される。同様に「水溶液」なる用語も、少なくとも50%w/wの水分を含有する溶液と定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する懸濁液と定義される。
他の実施態様では、薬学的製剤は、何ら事前に溶解することなく使用準備が整った乾燥した製剤(例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.0〜約9.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約3.0〜約7.0である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約5.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.5〜約9.0である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約7.5〜約8.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約6.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様では、製剤のpHは約6.0〜約7.0である。他の実施態様では、薬学的製剤は8.0〜8.5である。
本発明のさらなる実施態様では、製剤は安定剤をさらに含有する。薬学的組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、それは溶解したままか、溶液に沈殿し、大きくて可視できる程に会合する可能性がある。「保存中」とは、調製されて直ぐの液状薬学的組成物又は製剤が、被験者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ次の準備のために、液状の形態、凍結状態、液体の形態に後ほど再構成される乾燥した形態、又は被験者への投与に適した他の形態で保存用に包装されている。「乾燥した形態」とは、液状薬学的組成物又は製剤が、凍結乾燥(すなわち氷結乾燥;例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版;Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676;Broadheadら, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;及びMumenthalerら, (1994) Pharm. Res. 11:12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25:459-470;及びRoser (1991) Biopharm. 4:47-53)により乾燥されることを意図している。液状薬学的組成物の保存中のポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼし、薬学的組成物の治療効果が損なわれるおそれがある。さらに凝集体形成は、他の問題、例えば管組織、膜組織、又はポリペプチド含有薬学的組成物が注入システムを使用して投与される場合はポンプを閉塞させる原因となりかねない。
本発明のさらなる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばPEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばHPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び2-メチルチオエタノール、及び種々の塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。
本発明で特に関心を持たれた安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するEDTA及びメチオニン、及び凍結-解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者によく知られている。簡便には、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
本発明の組成物は、本発明の誘導体の安定性を高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、悪影響を低減させ、当業者によく知られている時間治療を達成し、患者のコンプライアンスを高める、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び先端の薬剤送達系を、さらに組合せ又はこれらに附随させてもよい。担体、薬剤送達系及び先端の薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコ-ポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、L2相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。
本発明の誘導体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに蓄積させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが:低吸入速度(例えば30L/分)、呼吸停止、及び作動のタイミングを修正して最適化されてよい。
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、タンパク質が熱-機械的ストレスに暴露される、及び/又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性の表面及び界面と相互作用する結果として、タンパク質が生物学的に不活性になり及び/又は不溶性の凝集体が形成されるといったタンパク質の傾向を意味する。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、種々の時間、異なる温度で機械的/物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び/又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライトにおいて実施される。製剤の濁度は、例えば0〜3のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア0に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア3に相当する)により特徴付けられる。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質の立体構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維に、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンTが約450nmで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約482nmで増強発光する。未結合のチオフラビンTは本質的には、その波長で非蛍光性である。
本発明の他の実施態様では、本発明の誘導体を含有する薬学的製剤は、使用で4週間以上、保存で3年以上安定している。
本発明のさらなる実施態様では、本発明の誘導体を含有する薬学的製剤は、使用で4週間以上、保存で2年以上安定している。
本発明のさらなる実施態様では、本発明の誘導体を含有する製剤組成物は、使用で2週間以上、保存で2年以上安定している。
一実施態様では、本発明の誘導体は、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防する薬剤を調製するために使用される。
他の実施態様では、本発明の誘導体は、2型糖尿病の病気の進行を遅延化又は防止する薬剤を調製するために使用される。
他の実施態様では、本発明の誘導体は、食物の取込を低減させ、β-細胞アポトーシスを低減させ、β-細胞機能及びβ-細胞質量を増大させ、及び/又はβ-細胞に対するグルコース感度を回復させる薬剤を調製するために使用される。
本発明の一態様では、ペプチド、例えばGLP-1ペプチドの患者における作用時間を約40時間以上に長くする方法であって、該ペプチド、例えばGLP-1(7-37)が、上述したA-B-C-D-で誘導体化されていることを特徴とする方法が提供される。
本発明の一態様では、本発明の薬学的組成物は、非経口投与に適している。
本発明のさらなる態様では、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防する薬剤を調製するための、本発明の誘導体の使用が提供される。
本発明のさらなる態様では、2型糖尿病の病気の進行を遅延化又は防止する薬剤を調製するための、本発明の誘導体の使用が提供される。
本発明の誘導体と、一又は複数の上述した化合物、及び場合によっては一又は複数のさらなる薬理学的活性物質との任意の適切な組合せは、本発明の範囲に入ると考えられると、理解すべきである。
配列に応じて、この本発明のアナログは、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドを発現可能なDNA配列を含む宿主細胞を、ペプチドの発現が可能な条件下、適切な栄養培地において培養し、その後、得られたペプチドを培地から回収することを含む方法によっても作製できる。
細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の従来からの培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地であってよい。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるペプチドは、硫酸アンモニウム等の塩により、上清又は濾液のタンパク質様成分を遠心分離又は濾過、沈殿にて培地から宿主細胞を分離させ、当該分野のペプチドの種類に応じて、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順により精製することを含む従来からの手順により、培養培地から回収されてよい。
親ペプチドをコードするDNA配列、プロモーター及び場合によってはターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, 上掲)。
1.少なくとも一のアミノ酸残基がA-B-C-D-で誘導体化されているペプチドを含有するペプチド誘導体であって、
A-が:
[上式中、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]
であり、
-B-が:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
又はAが:
[上式中、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択される]
であり、
Bが:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-が:
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、又はfが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-が前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーである誘導体。
3.誘導体化されたアミノ酸残基がアミノ基を有する、実施態様1-2のいずれか一つの誘導体。
4.誘導体化されたアミノ酸残基がリジンである、実施態様1-4のいずれか一つの誘導体。
(これらの構造の1、3、4、5及び6のものが好ましくは、すなわち2は除く)
[上式中、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは、0、1、2、3、4、5及び6からなる群から選択され、Dは*で表された末端でアミノ酸残基に結合している]
からなる群から選択される、実施態様1-4のいずれかの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46 式(I)(配列番号:2)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa20は、Leu、Met、又はLys、好ましくはLeu又はMetであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArg、好ましくはAla、Glu、又はArgであり;
Xaa33は、Val又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg、Gly又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Gly、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Ala、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa42は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa43は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa44は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa45は、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa46は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45又はXaa46が存在しないならば、各アミノ酸残基の下流も存在しない]
のアミノ酸配列を有する、実施態様1-5のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38 式(II)(配列番号:3)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArg、好ましくはAla、Glu、又はArgであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu又はLysであり;
Xaa38は、Lys、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有する、実施態様1-5のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Xaa23-Ala-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(III)(配列番号:6)
[上式中、
Xaa7-Xaa8は、L-ヒスチジン-Aib、デスアミノ-ヒスチジン-アラニン又はデスアミノ-ヒスチジン-Aibであり;
Xaa9は、Glu又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Argであるか、又は存在せず;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37が存在しない場合は、Xaa38も存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、34、36、37又は38位で誘導体化されている、実施態様1-5のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(IV)(配列番号:7)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、Argであるか、又は存在せず、好ましくはAla、Glu、又はArgであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、34、36、37又は38にて、アルブミン結合残基で誘導体化されている、実施態様1-5のいずれか一つの誘導体。
11.Xaa37及びXaa38 が双方とも存在しない、実施態様1-10のいずれか一つの誘導体。
12.Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様1-11のいずれか一つの誘導体。
13.Xaa8がAibである、実施態様1-12のいずれか一つの誘導体。
15.高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される、実施態様1-13のいずれか一つの誘導体。
Xaa7(配列番号:2の1位)は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8(配列番号:2の2位)は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa16(配列番号:2の10位)は、Val又はLeuであり;
Xaa18(配列番号:2の12位)は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa19(配列番号:2の13位)は、Tyr又はGlnであり;
Xaa20(配列番号:2の14位)は、Leu、Met又はLysであり;
Xaa22(配列番号:2の16位)は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23(配列番号:2の17位)は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25(配列番号:2の19位)は、Ala又はValであり;
Xaa26(配列番号:2の20位)は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa27(配列番号:2の21位)は、Glu又はLeuであり;
Xaa30(配列番号:2の24位)は、Ala、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa33(配列番号:2の27位)は、Val又はLysであり;
Xaa34(配列番号:2の28位)は、Lys、Glu、Asn又はArgであり;
Xaa35(配列番号:2の29位)は、Gly又はAibであり;
Xaa36(配列番号:2の30位)は、Arg、Gly又はLysであり;
Xaa37(配列番号:2の31位)は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa38(配列番号:2の32位)は、Lys、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa39(配列番号:2の33位)は、Ser、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa40(配列番号:2の34位)は、Gly、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa41(配列番号:2の35位)は、Ala、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa42(配列番号:2の36位)は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa43(配列番号:2の37位)は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa44(配列番号:2の38位)は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa45(配列番号:2の39位)は、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa46(配列番号:2の40位)は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45又はXaa46(それぞれ、配列番号:2の32ないし40位)が存在しないならば、各アミノ酸残基の下流も存在しない。
8a.次の式(I):
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46 式(I)(配列番号:2)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、2(3H-イミダゾール-4-イル)アセチル、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa20は、Leu、Met、又はLysであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa33は、Val、Thr(O-ベンジル)、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Gln、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Gly又はLysあるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、イプシロン-アミノ-Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Gly、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Ala、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa42は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa43は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa44は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa45は、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa46は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45又はXaa46が存在しないならば、各アミノ酸残基の下流も存在しない]
のアミノ酸配列を有するGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38 式(II)(配列番号:3)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、2(3H-イミダゾール-4-イル)アセチル、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Gln、又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、又はイプシロン-アミノ-Lysであり;
Xaa38は、Lys、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有するGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Xaa23-Ala-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(III)(配列番号:6)
[上式中、
Xaa7-Xaa8は、2(3H-イミダゾール-4-イル)アセチル-アラニン、L-ヒスチジン-Aib、デスアミノ-ヒスチジン-アラニン、又はデスアミノ-ヒスチジン-Aibであり;
Xaa9は、Glu又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa33は、Val、Thr(O-ベンジル)、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Gln、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Pro、イプシロン-アミノ-Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37が存在しない場合は、Xaa38も存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、26、30、31、34、36、37又は38位で誘導体化されている、好ましくは実施態様8a-9aのいずれか一つのGLP-1誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(IV)(配列番号:7)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、2(3H-イミダゾール-4-イル)アセチル、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Gln又はArgであり;
Xaa35は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa36は、Arg、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa37は、Gly、Aib、Pro、イプシロン-アミノ-Lysであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、26、30、31、34、36、37又は38位にて、アルブミン結合残基で誘導体化されているGLP-1誘導体。
13a.Xaa37及びXaa38 が双方とも存在しない、実施態様8a-12aのいずれか一つの誘導体。
14a.Xaa7がデスアミノ-ヒスチジンである、実施態様8a-13aのいずれか一つの誘導体。
15a.Xaa8がAibである、実施態様8a-14aのいずれか一つの誘導体。
N-ε20−{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib2,Leu14,Lys20,Gln28,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン-4(1-39)アミド:
N-ε26{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]-3-(カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22 Arg26, Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル);
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-ベンジル)33,]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37);
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン28、Glu30,]GLP-1(7-37)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン12、Glu30,]GLP-1-(7-37)アミド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-{4-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ブチリル}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-アミド;
N-イプシロン18-{2-(2-(2-(2-[2-(2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブタノイルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル}[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37);
N-ε20-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[トランス-4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis1,Lys20,Ser(O-ベンジル)33,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン(1-39);
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-3-[4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(トランス-19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]−アミド;
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル[Aib8,Lys26]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-2-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Lys26]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]-ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}-ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル];
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys(2-(2-(3-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-[4-(S)-カルボキシ-4-(4-(S)-カルボキシ-4-(4-{4-[16-(テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ}ブタノイルアミノ)ブチリルアミノ)ブチリルアミノ];
エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)ペプチド;
N-アルファ37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,イプシロン-Lys37]GLP-1-(7-37);
N-アルファ8-[2-(4-イミダゾリル)アセチル]N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(8-37);
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)ペプチド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]ペプチド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys((S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル)ペプチド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル)ペプチド;
[デスアミノHis7,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)ペプチド;
N-イプシロン37-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)-ピペリジン-4-カルボニル]-アミノ}-ブチリル)[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)-ピペリジン-4-カルボニル]-アミノ}-ブチリル)ペプチド;
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(R)-4-カルボキシ-4-((R)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-[Aib8,Arg34]GLP-1(7-37);
N-イプシロン37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-tert-ブチル-2H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル]ブチリルアミノ}ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
[ImPr7,Arg26,34,Glu22]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イルヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-アミド;
N-イプシロン36-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,22,35、Lys18,Arg26,34]GLP-1-(7-37);及び
N-イプシロン18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37);
から選択されるGLP-1誘導体。
1.少なくとも一のアミノ酸残基がA-B-C-D-で誘導体化されているペプチドを含有するペプチド誘導体であって、
A-が:
[上式中、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択される]
であり、
-B-が:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
又はAが:
[上式中、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択される]
であり、
Bが:
[上式中、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択される]
からなる群から選択され、
-C-が:
[上式中、b及びeはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、c及びfはそれぞれ独立して、0、1及び2からなる群から選択され、但し、cが0の場合、bは1又は2であり、又はcが1又は2である場合、bは0であり、fが0である場合、eは1又は2であり、又はfが1又は2である場合、eは0である]
からなる群から選択され、
-D-が前記アミノ酸残基に結合しており、リンカーである誘導体。
3.誘導体化されたアミノ酸残基がアミノ基を有する、実施態様1-2のいずれか一つの誘導体。
4.誘導体化されたアミノ酸残基が、側鎖に第1級アミノ基を有している、実施態様1-3のいずれか一つの誘導体。
5.誘導体化されたアミノ酸残基がリジンである、実施態様1-4のいずれか一つの誘導体。
6.唯一のアミノ酸残基が誘導体化されている、実施態様1-5のいずれか一つの誘導体。
12.dが0、1及び2からなる群から選択され、pが12、13又は14からなる群から選択され、好ましくはdが1及び2からなる群から選択され、pが13及び14からなる群から選択され、最も好ましくはdが1であり、pが13である、実施態様1-6及び9-11のいずれかのGLP-1誘導体。
である、実施態様1-12のいずれかの誘導体。
14.-B-が
である、実施態様1-12のいずれかの誘導体。
15.-B-が
である、実施態様1-12のいずれかの誘導体。
16.-B-が
である、実施態様1-12のいずれかの誘導体。
18.-B-が
である、実施態様1-6及び9-12のいずれかの誘導体。
19.yが2、3、4、5、6、7、8、9及び10からなる群から選択され、好ましくはyが2、3、4、5、6、7及び8からなる群から選択される、実施態様1-6及び9-13のいずれかの誘導体。
である、実施態様1-19のいずれかの誘導体。
21.cが0及び1からなる群から選択され、bが1及び2からなる群から選択され、好ましくはbが1であり;cが0である、実施態様20の誘導体。
である、実施態様1-19のいずれかの誘導体。
23.fが0及び1からなる群から選択され、eが1及び2からなる群から選択され、好ましくはeが1であり、fが0である、実施態様22の誘導体。
24.-C-が
である、実施態様1-19のいずれかの誘導体。
[上式中、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは0、1、2、3、4、5及び6からなる群から選択される]
からなる群から選択され、Dが*で表された末端でアミノ酸残基に結合している、実施態様1-24のいずれかの誘導体。
26.-D-が
である、実施態様1-25のいずれかの誘導体。
27.kが1、2、3、11及び27からなる群から選択され、好ましくはkが1である、実施態様25-26のいずれかの誘導体。
28.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様25-27のいずれかの誘導体。
29.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様29の誘導体。
である、実施態様1-25のいずれかの誘導体。
31.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様31の誘導体。
32.-D-が
である、実施態様1-25のいずれかの誘導体。
33.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様33の誘導体。
である、実施態様1-25のいずれかの誘導体。
35.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様35の誘導体。
36.-D-が
である、実施態様1-25のいずれかの誘導体。
37.mが0、1、2、3及び4からなる群から選択され、好ましくはmが0、1及び2からなる群から選択される、実施態様37の誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46 式(I)(配列番号:2)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa20は、Leu、Met、又はLysであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa33は、Val又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg、Gly又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa40は、Gly、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa41は、Ala、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa42は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa43は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa44は、Pro、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa45は、Ser、アミドであるか、又は存在せず;
Xaa46は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45又はXaa46が存在しないならば、各アミノ酸残基の下流も存在しない]
のアミノ酸配列を有する、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38 式(II)(配列番号:3)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys又はArgであり;
Xaa22は、Gly、Glu又はAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa26は、Lys、Glu又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、又はArgであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu又はLysであり;
Xaa38は、Lys、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有する、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
44.GLP-1ペプチドが、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-アミド、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、及びGLP-1(7-41)から選択され、場合によっては一又は複数の置換を有している、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
46.GLP-1(7-37)(配列番号:1)のアナログの誘導体である、実施態様1-45のいずれかの誘導体。
47.前記GLP-1アナログが、GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、置換、付加又は欠失しているアミノ酸残基を、15を越えて有していない、実施態様47の誘導体。
48.前記GLP-1アナログが、GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、置換、付加又は欠失しているアミノ酸残基を、10を越えて有していない、実施態様47の誘導体。
49.前記GLP-1アナログが、GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、置換、付加又は欠失しているアミノ酸残基を、6を越えて有していない、実施態様47の誘導体。
51.前記GLP-1アナログが、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸残基を、4を越えて有していない、実施態様51の誘導体。
52.前記GLP-1アナログが、GLP-1(7-37)(配列番号:1)に対して、置換、付加又は欠失しているアミノ酸残基を、3を越えて有していない、実施態様47の誘導体。
53.前記GLP-1アナログが、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸残基を、3を越えて有していない、実施態様53の誘導体。
55.前記GLP-1ペプチドが、DPPIV保護されたGLP-1ペプチドである、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
56.前記GLP-1ペプチドがDPPIV安定化されている、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
58.前記GLP-1ペプチドの7位にあるアミノ酸残基が、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、及び4-ピリジルアラニンからなる群から選択される、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
59.前記GLP-1ペプチドが、
Arg34GLP-1(7-37)、Lys38Arg26,34GLP-1(7-38)、Lys38Arg26,34GLP-1(7-38)-OH、Lys36Arg26,34GLP-1(7-36)、Aib8,22,35 GLP-1(7-37)、Aib8,35 GLP-1(7-37)、Aib8,22 GLP-1(7-37)、Aib8,22,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22,35 Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,35 Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22 Arg26Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22,35 Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,35Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22Arg34Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22,35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,35Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22Ala37Lys38GLP-1(7-38)、Aib8,22,35 Lys37GLP-1(7-37)、Aib8,35Lys37GLP-1(7-37)、及びAib8,22Lys37GLP-1(7-38)
からなる群から選択される、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
61.前記GLP-1ペプチドがZP-10、すなわちHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-アミド(配列番号:5)である、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
62.前記GLP-1ペプチドが、XがP又はYであるHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX、又はそのフラグメントもしくはアナログである、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
63.4前記GLP-1誘導体が、Arg18,Leu20,Gln34,Lys33(Nε-(γ-アミノブチロイル(Nα-ヘキサデカノイル)))エキセンディン-4-(7-45)-アミド又はArg33,Leu20,Gln34,Lys18(Nε-(γ-アミノブチロイル(Nα-ヘキサデカノイル)))エキセンディン-4-(7-45)-アミドである、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Xaa23-Ala-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(III)(配列番号:6)
[上式中、
Xaa7-Xaa8は、L-ヒスチジン-Aib、デスアミノ-ヒスチジン-アラニン又はデスアミノ-ヒスチジン-Aibであり;
Xaa9は、Glu又はGlu誘導体、例えばアルファ,アルファ ジメチル-Gluであり;
Xaa16は、Val又はLeuであり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa19は、Tyr又はGlnであり;
Xaa23は、Gln、Glu、Lys又はArgであり;
Xaa25は、Ala又はValであり;
Xaa27は、Glu又はLeuであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、Argであるか、又は存在せず;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、Asn又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lys、Gluであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在せず;
但し、Xaa37が存在しない場合は、Xaa38も存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、34、36、37又は38位で誘導体化されている、
上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39 式(IV)(配列番号:7)
[上式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン又は4-ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、Lys、又はArgであり;
Xaa30は、Ala、Glu、Lys、Argであり;
Xaa33は、Val、又はLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、又はArgであり;
Xaa35は、Gly又はAibであり;
Xaa36は、Arg又はLysであり;
Xaa37は、Gly、Aibであるか、又は存在せず;
Xaa38は、Lysであるか、又は存在せず;
Xaa39は、アミドであるか、又は存在しない]
のアミノ酸配列を有し、18、23、34、36、37又は38にて、アルブミン結合残基で誘導体化されている、上述した実施態様のいずれか一つの誘導体。
66.Xaa38が存在しない、上述した実施態様65-66のいずれか一つの誘導体。
67.Xaa37及びXaa38 が双方とも存在しない、上述した実施態様65-67のいずれか一つの誘導体。
69.GLP-1(7-37)に対して3つのアミノ酸が置換されている、上述した実施態様65-68のいずれか一つの誘導体。
70.GLP-1(7-37)に対して4つのアミノ酸が置換されている、上述した実施態様65-68のいずれか一つの誘導体。
71.GLP-1(7-37)に対して5つのアミノ酸が置換されている、上述した実施態様65-68のいずれか一つの誘導体。
72.GLP-1(7-37)に対して6つのアミノ酸が置換されている、上述した実施態様65-68のいずれか一つの誘導体。
74.Xaa8がAibである、上述した実施態様65-74のいずれか一つの誘導体。
N-イプシロン20-{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib2,Leu14,Lys20,Gln28,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン-4(1-39)アミド:
N-イプシロン26{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]-3-(カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22 Arg26, Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル);
N-イプシロン20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-ベンジル)33,]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン28、Glu30,]GLP-1(7-37)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン12,Glu30,]GLP-1-(7-37)アミド;
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-{4-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ブチリル}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-アミド;
N-イプシロン18-{2-(2-(2-(2-[2-(2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブタノイルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル}[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37);
N-イプシロン20-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[トランス-4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis1,Lys20,Ser(O-ベンジル)33,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン(1-39);
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-3-[4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(トランス-19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-アミド;
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル[Aib8,Lys26]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-2-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Lys26]GLP-1(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]-ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34);
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}-ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]アミド;
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
N-イプシロン37-[[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド;
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル];及び
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys(2-(2-(3-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-[4-(S)-カルボキシ-4-(4-(S)-カルボキシ-4-(4-{4-[16-(テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ}ブタノイルアミノ)ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]
エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)ペプチド
からなる群から選択される、上述した実施態様のいずれかの誘導体。
77.GLP-1ペプチドの患者における作用時間を約40時間以上に長くする方法であって、GLP-1(7-37)ペプチド又はそのアナログが、上述した実施態様のいずれかに開示のA-B-C-D-で誘導体化されていることを特徴とする方法。
79.非経口投与に適している、実施態様1-76の薬学的組成物。
81.高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防する薬剤を調製するための、実施態様1-76のいずれか一つの誘導体の使用。
82.2型糖尿病の病気の進行を遅延化又は防止する薬剤を調製するための、実施態様1-76のいずれか一つの誘導体の使用。
83.食物の取込を低減させ、β-細胞アポトーシスを低減させ、β-細胞機能及びβ-細胞質量を増大させ、及び/又はβ-細胞に対するグルコース感度を回復させる薬剤を調製するための、実施態様1-76のいずれか一つの誘導体の使用。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈すべきでない。
その全ての可能性のある変形例における、上述した要素の任意の組合せは、他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、本発明に含まれる。
ここで他に示されない限りは、ここでの値の範囲の記述は、単に、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に称する省略方法として提供することを意図しているものであって、ここで個々に列挙されているかのように、それぞれの別個の値が明細書に導入される。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
ここに記載されている全ての方法は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順番で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての実施例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に本発明をより例証することを意図しており、他に示されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明確に記載していない限りは、明細書中の如何なる語句も、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の製剤は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる製剤を記載すると理解されるべきである)。
この発明は、適用される法律に容認される最大範囲まで、ここに提供される態様又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
上述の記載及び以下の実施例に開示されている特徴は、双方とも別個に、またその任意の組合せにおいて、様々な形態で本発明を実践するための構成要素でありうる。
r.t: 室温
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
H2O: 水
CH3CN: アセトニトリル
DMF: NNジメチルホルムアミド
HBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3-テトラメチルウロ ニウムヘキサフルオロホスファート
Fmoc: 9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Boc: tert-ブチルオキシカルボニル
OtBu: tert-ブチルエステル
tBu: tert-ブチル
Trt: トリフェニルメチル
Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
Mtt: 4-メチルトリトル
Mmt: 4-メトキシトリチル
DCM: ジクロロメタン
TIS: トリイソプロピルシラン)
TFA: トリフルオロ酢酸
Et2O: ジエチルエーテル
NMP: 1-メチル-ピロリジン-2-オン
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DBU: 1,8-ジアザビシクリ[5,4,0]ウンデセン-7
MW: 分子量
SPPS法A
保護されたペプチジル樹脂を、Fmoc保護基を検出するUVモニタリング、及びNMP(N-メチルピロリドン)におけるカップリングを媒介するHATU(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)、又はHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)を使用する、製造者から供給されるファストモック(FastMoc)UVプロトコルを用い、0.25mmol又は1.0mmolスケールにて、アプリド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)433Aペプチド合成器でFmoc法により合成した。ペプチドアミド合成に使用した出発樹脂はリンク(Rink)-アミド樹脂であり、ワン(Wang)又はクロロトリチル樹脂は、カルボキシC末端を有するペプチド用に使用した。使用される保護されたアミノ酸誘導体は、ABI433A合成器に適切な、事前計量されたカートリッジに供給され、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソ酪酸)等、非天然アミノ酸を除く、標準Fmoc-アミノ酸(例えばAnaspec、又はNovabiochemから供給)であった。N末端アミノ酸は、アルファアミノ基で保護されたBocであった(例えば、Boc-His(Boc)OHは、N末端にHisを有するペプチド用に使用した)。26位にあるリジンのイプシロンアミノ基を、アルブミン結合部分及びスペーサーの結合経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBocで保護した。いくつかのケースにおいては、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメトキシベンジルに限定されないが、酸性条件下で切断可能な基で、ジペプチドアミド結合で保護されたジペプチドを使用することにより、ペプチド合成が改善される。セリン又はスレオニンがペプチドに存在するケースにおいては、疑似プロリンジペプチドが使用されてもよい(例えば、Novobiochem 2002/2003又は新刊のカタログ、又はW.R. Sampson(1999), J. Pep. Sci. 5, 403を参照)。
ペプチド合成の代替法(方法B)は、マイクロ波ベースのリバティ(Liberty)ペプチド合成器(CEM Corp., North Carolina)におけるFmoc化学によるものであった。樹脂は、0.24mmol/g充填されたテンタゲル(Tentagel)S RAMであった。カップリング化学は、NMP、及び8-10倍過度のモルにて0.3Mのアミノ酸溶液を使用する、NMPにおけるDIC/HOAtであった。カップリング条件を70℃までで5分とした。70℃までで、NMPにおいて5%のピペリジンを使用し、検出を実施した。リジン側鎖の化学的修飾が所望されている場合、リジンをLys(Mtt)として導入した。20分、ストレートのヘキサフルオロイソプロパノールに樹脂を懸濁させ、続いてDCM及びNMPで洗浄することにより、Mtt基を除去した。手動合成、又はリバティにおける一又は複数の自動工程、続く手動カップリングにより、リジンの化学的修飾を実施した。HBTUカップリングを用いる、ABI433におけるFmoc化学により、ペプチド合成の他の方法がなされた。合成後、樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させ、TFA/TIS/水(92.5/5/2.5)で2時間処理し、ジエチルエーテルで沈殿させることにより、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを30%の酢酸、又は類似の溶媒に再溶解させ、アセトニトリル/TFAを使用するC18カラムにおける標準的RP-HPLCにより精製した。ペプチドの同一性をMALDI-MSにより確認した。
保護されたペプチジル樹脂を、NMP(N-メチルピロリドン)におけるカップリングを媒介するHOBt(1-ヒドロキシベンゾゾトリアゾール)及びDIC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)を使用する、製造者から供給されるプロトコルを用い、0.25mmolスケールにて、アドバンスド・ケムテック(Advanced ChemTech)合成器(APEX 348)でFmoc法により合成した。ペプチドアミド合成に使用した出発樹脂はリンク-アミド樹脂であり、ワン又はクロロトリチル樹脂を、カルボキシC末端を有するペプチド用に使用した。使用される保護されたアミノ酸誘導体を、標準Fmoc-アミノ酸(例えばAnaspec、又はNovabiochemから供給)とした。N末端アミノ酸は、アルファアミノ基で保護されたBocであった(例えば、Boc-His(Boc)OHは、N末端にHisを有するペプチド用に使用した)。26位にあるリジンのイプシロンアミノ基を、アルブミン結合部分及びスペーサーの結合経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBocで保護した。いくつかのケースにおいては、ペプチド、例えばNovabiochemからの疑似プロリン、Fmoc-Ser(tbu)-ΨSer(Me,Me)-OHを使用することにより、ペプチド合成が改善される。例えば、Novobiochem 2002/2003又は新刊のカタログ、又はW.R. Sampson(1999), J. Pep. Sci. 5, 403を参照。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺/濾過装置に配し、N-メチルピロリドンに2%のヒドラジンが入ったものを用いて処理し(20ml、2x12分)で処理し、Dde又はivDde基を除去し、N-メチルピロリドン(4x20ml)で洗浄した。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺/濾過装置に配し、DCMに2%のTFA及び2-3%のTISが入ったもので処理し(20ml、6-12回繰り替えしで5-10分)、Mtt又はMmt基を除去し、DCM(2x20ml)、DCMに10%のMeOH及び5%のDIPEAが入ったもの(2x20ml)、及びN-メチルピロリドン(4x20ml)で洗浄した。
樹脂をシリンジに配し、2x10分、ヘキサフルロ(fluro)イソプロパノールで処理し、Mtt基を除去した。ついで上述したようにして、樹脂をDCM及びNMPで洗浄した。
アルブミン結合残基(式(I)のB-U-側鎖)は、DIC、HOBt/DIC、HOAt/DIC、又はHBTUに限定されるものではないが、標準的なアシル化試薬を使用し、保護されていないペプチドを溶液中でアシル化する、又は樹脂に結合したペプチドをアシル化することにより、ペプチドに結合させることができる。
経路I
活性化した(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A-B)-式(I)の側鎖、例えばオクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら,欧州特許第511600号、樹脂に結合したペプチドに対して4モル当量)をNMP(25ml)に溶解させ、樹脂に添加し、室温で一晩振揺した。反応混合物を濾過し、NMP、ジクロロメタン、2-プロパノール、メタノール及びジエチルエーテルを用い、樹脂を広範囲に洗浄した。
アルブミン結合残基(A-(B)-式(I)の側鎖)を、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1、10ml)に溶解させた。活性化試薬、例えばヒドロキシベンゾゾトリアゾール(HOBt)(樹脂に対して4モル当量)、及びジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に対して4モル当量)を添加し、溶液を15分攪拌した。溶液を樹脂に添加し、ジイソプロピ(propy)エチルアミン(樹脂に対して4モル当量)を添加した。樹脂を、室温で2〜24時間振揺した。樹脂をN-メチルピロリドン(2x20ml)、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2x20ml)、及び塩化メチレン(2x20ml)で洗浄した。
活性化した(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A-B-式(I)の側鎖、例えばオクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら,欧州特許第511600号、ペプチドに対して1-1.5モル当量)を、有機溶媒、例えばアセトニトリル、THF、DMF、DMSO、又は水/有機溶媒(1-2ml)の混合物に溶解させ、10モル当量のDIPEAと共に、水(10-20ml)にペプチドが入った溶液に添加した。アルブミン結合残基、例えばtert-ブチルにおいて基が保護されているケースでは、反応混合物を凍結乾燥O/Nさせ、後に、単離された粗ペプチドを脱保護し−tert-ブチル基のケースでは、ペプチドを、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(90:5:5)の混合物に溶解させた。30分後、混合物を真空下で蒸発させ、最終ペプチドを調製用HPLCにより精製した。
樹脂(0.25mmol)を手動の振揺装置の濾過フラスコに配し、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2x20ml)、及びN-メチルピロリドン(1x20ml)、N-メチルピロリドンに20%のピペリジンが入った溶液(3x20ml、各10分)で処理した。樹脂を、N-メチルピロリドン(2x20ml)、N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2x20ml)及び塩化メチレン(2x20ml)で洗浄した。
室温で180分、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5〜92:4:4)の混合物と共に攪拌することにより、樹脂からペプチドを切断した。切断混合物を濾過し、窒素流により、濾液が油になるまで濃縮した。45mlのジエチルエーテルを用い、この油からペプチドを沈殿させ、45mlのジエチルエーテルで、1〜3回洗浄した。
粗ペプチドを、5μ又は7μのC-18シリカが包装された、20mm x 250mmのカラムにおける、半調製用HPLCにより精製した。ペプチドに応じて、1又は2の精製システムを使用した。
TFA:
乾燥後、粗ペプチドを5mlの50%酢酸H2Oに溶解させ、H2Oを用いて20mlに希釈し、カラムに注入し、0.1%のTFAにおける40-60%のCH3CN勾配を用いて、40℃で50分、10ml/分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集した。溶出液を水で希釈した後、精製されたペプチドを凍結乾燥させた。
濃H2SO4でpH2.5に調節された、0.05Mの(NH4)2SO4に40%のCH3CNが入ったものを用いて、カラムを平衡にした。乾燥後、粗ペプチドを5mlの50%酢酸H2Oに溶解させ、H2Oを用いて20mlに希釈し、カラムに注入し、ついで、0.05Mの(NH4)2SO4における40-60%のCH3CN勾配、pH2.5を用いて、40℃で50分、10ml/分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集し、3容量のH2Oで希釈し、0.1%のTFAで平衡にされたセップ-パック(Sep-Pak)(登録商標)C18カートリッジ(ウォーターズ(Waters)パーツ、#:51910)を通した。ついで、0.1%のTFAを含有する70%のCH3CNで溶出させ、溶出液を水で希釈した後、凍結乾燥により、精製されたペプチドを単離した。
得られた最終生成物を分析用RP-HPLC(保持時間)及びLCMSにより特徴付けした。
RP-HPLC分析を、214nmでのUV検出、及び例えばバイダック(Vydac)218TP54、4.6mm x 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia, USA)を使用して実施し、例えば42℃で1ml/分で溶出させた。多くの場合、次の特定の条件が使用される:
HPLC(方法03_A1_1):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で1ml/分溶出させる、218TP54、4.6mm x 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。4Mの硫酸でpH2.5に調節された、10%の0.5M硫酸アンモニウムを用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、同様の水性バッファーにおける0%〜60%のアセトニトリル勾配により、サンプルを溶出させた。
HPLC(方法03_B1_2):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で0.5ml/分溶出させる、ゾーバックス300SB-C18(4.5x150mm、5μ)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。水にTFA(0.1%)が入った水溶液を用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、水にTFA(0.1%)が入った水溶液における0%〜60%のアセトニトリル勾配(+0.1%のTFA)により、サンプルを溶出させた。
HPLC(方法02_B1_1):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド(dualband)検出器が取り付けられたアリアンス(Alliance)・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、バイダック218TP53、C18、300Å、5μm、3.2mm x 250mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。0.5ml/分の流速で、50分以上かけ、0-60%のアセトニトリル、95-35%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法01_B4_2):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ600Sシステムを使用して実施した。42℃で、シンメトリー(Symmetry)300 C18、5μm、3.9mm x 150mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。1.0ml/分の流速で、15分以上かけ、5-95%のアセトニトリル、90-0%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法02_B4_4):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、シンメトリー300 C18、5μm、3.9mm x 150mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。1.0ml/分の流速で、15分以上かけ、5-95%のアセトニトリル、90-0%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法02_B6_1):RP-分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ2695システムを使用して実施した。42℃で、バイダック218TP53、C18、300Å、5μm、3.2mm x 250mmカラムを使用し、214nmと254nmでのUV検出を収集した。0.50ml/分の流速で、50分以上かけ、0-90%のアセトニトリル、95-5%の水、及び5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線状勾配を用いて溶出させた。
HPLC(方法03_B1_1):RP-分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。42℃で1ml/分溶出させる、218TP54、4.6mm x 250mm、5μのC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia)において、214、254、276、及び301nmでのUV検出を収集した。水にTFA(0.1%)が入った水溶液に5%のアセトニトリル(+0.1%のTFA)が入ったものを用いて、カラムを平衡にした。注入後、50分、水にTFA(0.1%)が入った水溶液における0%〜90%のアセトニトリル勾配(+0.1%のTFA)により、サンプルを溶出させた。
また、調製用勾配溶出は上述したように実施することができ、化合物が溶出されるアセトニトリルのパーセンテージが示される。同一性はMALDIにより確認される。
LCMSを、サイエックス(Sciex)API 100シングル四極子(quadropole)質量分析計、パーキン・エルマー・シリーズ200クアード(Quard)ポンプ、パーキン・エルマー・シリーズ200オートサンプラー、アプリド・バイオシステムズ785A UV検出器、セデックス(Sedex)75蒸発性光散乱検出器からなるセットアップにおいて実施した。
機器のコントロールとデータ収集は、ウインドウズ2000コンピューターで起動するサイエックス・サンプルコントロールソフトウェアにより実施した。
B:アセトニトリルに0.05%のトリフルオロ酢酸が入ったもの
を収容する2つの溶出用容器に、HPLCポンプを連結した。
アセトニトリル勾配で溶出させるカラムに、適切な容量(好ましくは20μl)のサンプルを注入することにより、室温で分析を実施する。
使用するHPLC条件、検出器の設定及び質量分析計の設定を、以下に付与する。
カラム:ウォーターズ・エクステラ(Xterra)MS C-18 X 3mm 内径5μm
勾配: 1.5ml/分で、7.5分間直線状の5%-90%アセトニトリル
検出: 210nm(DADからのアナログ出力)
ELS(ELSからのアナログ出力)、40℃
MSイオン化モード API-ES
A:水に10mMのNH4OHが入ったもの
B:90%のアセトニトリルに10mMのNH4OHが入ったもの
を収容する2つの溶出用容器に、HPLCポンプを連結した。
A及びBの勾配で溶出させるカラムに、適切な容量(好ましくは20μl)のサンプルを注入することにより、23℃で分析を実施した。使用するHPLC条件、検出器の設定及び質量分析計の設定を、以下に付与する。
カラム:ウォーターズ・エクステラMS C-18 X 3mm 内径5μm
勾配: 1.5ml/分で、6.5分間直線状の5%-100%アセトニトリル
検出: 210nm(DADからのアナログ出力)
ELS(ELSからのアナログ出力)
MSイオン化モード API-ES スキャン100-1000amuステップ0.1amu
ペプチドの分子量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分(MALDI-MS)を使用して測定し、マイクロフレックス(Microflex)(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
0.1%のTFA/H2Oでカラム(エクステラTM MS C18、5μm、4.6 x 150mmのカラム、P7N 186 000490)を平衡にし、25分間は0%のCH3CN/0.1%のTFA/H2O〜60%のCH3CN/0.1%のTFA/H2Oの勾配、続いて5分以上、60%〜100%の勾配により溶出させる。
天然アミノ酸については1文字記号を使用し、例えばHはL-ヒスチジンであり、AはL-アラニンである。アミノ酸については3文字略語を使用してもよく、例えば、HisはL-ヒスチジンであり、AlaはL-アラニンである。非天然アミノ酸については、3文字略語が使用され、例えばAibはアミノイソ酪酸である。アミノ酸の位置は、アミノ酸記号、例えばLys37の後の上付文字、又はLys37の数字で示されてよい。N末端アミノ基はNH2又はHとして記号化されていてもよい。C末端カルボン酸は、-OH又は-COOHとして記号化されていてもよい。C末端アミド基は-NH2として記号化されている。
上述した手順に従い、以下の誘導体を、本発明の非限定的実施例として調製した:
N-ε37{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 B6
RT=35.49分
LCMS:m/z=1096.2(M+3H)3+
算出されたMW=4380.0
N-ε20-{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib2,Leu14,Lys20,Gln28,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン-4(1-39)アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=37.63分
LCMS:m/z=1705.9(M+3H)3+
算出されたMW=5113.9
N-ε26{2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[デスアミノHis7,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=36.45分
LCMS:m/z=1404.3(M+3H)3+
算出されたMW=4209.8
N-イプシロン37{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4409.1
N-イプシロン23-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]-3-(カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC法 02_B6_4:
RT=9.32分
LCMS:m/z=(M+3H)3+ 1413.8
算出されたMW=4238.8
N-イプシロン37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-イルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22, Arg26,Arg34,Phe(m-CF3)28]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 01_B6_2:
RT=11.92分
LCMS:m/z=1474.8(M+3H)3+
算出されたMW=4420.0
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)-Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)
調製法:B
fmoc-Lys(mtt)-ワン樹脂から出発し、CEMリバティペプチド合成器を使用するが、方法Aと同様にして、ペプチドを合成した。N末端アミンをBoc基で保護した。ヘキサフルオロ−2-プロパノールを使用して、Mttをリジンから除去し、CEMリバティペプチド合成器においてfmoc-化学を使用し、側鎖を調製した。
HPLC法 03_B6_1:
RT=35.50分
LCMS:m/z=1114.0(M+4H)4+
算出された(M)=4452.1
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,Glu30,Thr(O-ベンジル)33,]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=32.49分
LCMS:m/z=1459.0(M+3H)3+
算出されたMW=4375.0
N-イプシロン30{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22, Arg26,Lys30]GLP-1-(7-37)
調製法:アドバンスド・ケムテックからのアペックス(Apex)396において、ペプチドを調製し、最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC法(方法I):上述の記載を参照
RT=27.6分
MALDI-MS:4367.9
N-イプシロン31{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル[Aib8,Glu22, Arg26,Lys31]GLP-1-(7-37)
調製法:アドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC法(方法A):上述の記載を参照
RT=28.4分
MALDI-MS:4252.5
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン28、Glu30,]GLP-1(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=32.31分
LCMS:m/z=1445.0(M+3H)3+
算出されたMW=4332.9
[Aib8、Glu22、Arg26、Arg34,]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド
調製法:A
HPLC法 02_B4_4:
RT=9.73分
LCMS:m/z=(M/3)+1=1494.9、及び(M/4)+1=1120.9;(サイエックス100 API)
算出されたMW=4480.1
N-ε20({2-[2-(2-{2-[2-((R)-3-カルボキシ-3-{[1-(17-カルボキシヘプタデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys20,Arg26,2-ナフチルアラニン12、Glu30,]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=30.70分
LCMS:m/z=1084.0(M+4H)4+
算出されたMW=4332.9
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[1-[19-カルボキシノナデカノイル]ピペリジン-4-カルボニルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド
調製法:A、及び実施例72
HPLC法 02_B6_4:
RT=9.95分
LCMS:m/z=1484.(M+3H)3+
算出されたMW=4451.1
N-イプシロン31-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-3-カルボキシ-3-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}プロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Glu22,Arg26,Lys31, Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B、及び実施例72
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4280.9
N-イプシロン26-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B、及び実施例72
ペプチドを69%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=3990.6
N-イプシロン26-{4-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ブチリル}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを70%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4075.7
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B、及び実施例72
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4135.8
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-アミド
調製法:B、及び実施例72
ペプチドを70%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4279.9
N-イプシロン18-{2-(2-(2-(2-[2-(2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブタノイルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチル)エトキシ)エトキシ)アセチル}[Aib8,Lys18,Arg26,Arg34]GLP-1(7-37)
調製法:アドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、最終生成物を、分析用HPLC及びMALDI-MSで特徴付けした。
HPLC(方法 B6):
RT=34.1分
LCMS:m/z=XX(M+4H)4+:1088
算出されたMW=4350.0
N-ε20-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-4-[トランス-4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][デスアミノHis1、Lys20,Ser(O-ベンジル)33,Ser(O-ベンジル)39]エキセンディン(1-39)
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=39.22分
LCMS:m/z=1736.9(M+3H)3+
算出されたMW=5207.0
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-3-[4-([19-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4494.2
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを67%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4451.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4422.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(トランス-19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4350.0
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを69%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4423.1
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-アミド
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4479.1
[デスアミノHis7,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]アミド
調製法:A
HPLC法 B6:
RT=35.25分
LCMS:m/z=1469.0(M+3H)3+
算出されたMW=4407.1
N-イプシロン26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル[Aib8、Lys26]GLP-1(7-37)アミド
調製法:方法C
HPLC法 01_B4_2:
RT=11.26分
LCMS:m/z=XX(M+4H)4+ 1071
算出されたMW=4279.9
N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-2-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]-4-カルボキシブタノイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、Lys26]GLP-1(7-37)アミド
調製法:方法C
HPLC法 01_B4_2:
RT=11.11分
LCMS:m/z=XX(M+4H)4+ 1103
算出されたMW=4409.1
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを71%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4351.0
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Glu30,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4481.1
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを62%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4341.9
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4454.1
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
調製法:B
ペプチドを62%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4370.0
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4071.6
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]-ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4183.8
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-34)
調製法:B
ペプチドを67%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4099.7
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)
調製法:B
ペプチドを70%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4240.9
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4156.7
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4311.9
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{6-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ヘキサノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-35)
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4128.7
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys33,Arg34]GLP-1-(7-34)
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4113.7
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4396.1
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys26,Arg34]GLP-1-(7-36)アミド
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=5121.9
[Aib8,Glu22,Arg26,Arg34]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}-ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]アミド
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4681.4
N-イプシロン20-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを62%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4638.3
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを69%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4624.3
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4595.3
N-イプシロン37-[[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)アミド
調製法:B
ペプチドを66%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4523.2
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-(4-カルボキシ-4-{4-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]
調製法:8-10倍過度のモルのアミノ酸、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用するアドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、Mtt基をヘキサフルオロイソプロパノールで脱保護することを除けば、方法A。チオアミドリンカーの結合を2つの工程で成し遂げた;まず、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用して、4-スルファモイル酪酸(3倍過度)を樹脂にカップリングさせた。ついで、NMPにおいて、カルボニルジイミダゾールと混合された16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカン酸(3倍過度)を樹脂に添加し、続いてDBUを添加した。
HPLC法 B6:
RT=29.8分
LCMS:m/z=1161.2(M+4H)4+
算出されたMW=4640.2
[Aib8,Glu22,Arg26,Glu30,Pro37]GLP-1-((7-37)Lys(2-(2-(3-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-[4-(S)-カルボキシ-4-(4-(S)-カルボキシ-4-(4-{4-[16-(テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ}ブタノイルアミノ)ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)ペプチド
調製法:アドバンスド・ケムテックからのアペックス396において、ペプチドを調製し、チオアミドリンカーの結合を2つの工程で成し遂げた;まず、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)を使用して、4-スルファモイル酪酸を樹脂にカップリングさせた。ついで、NMPにおいて、カルボニルジイミダゾールと混合された16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカン酸を樹脂に添加し、続いてDBUを添加した。その他は、実施例の最初に記載されたものと同様のプロトコルである。
HPLC(方法 B6):
RT=30分
LCMS:m/z=XX(M+4H)4+: 1274
算出された(M+H)+=5096
N-アルファ37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,イプシロン-Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 02_B6_1:
RT=37.05分
LCMS:m/z=1106.3(M+4H)4+
算出された(M)=4423.1
N-アルファ8-[2-(4-イミダゾリル)アセチル]N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(8-37)
調製法:B
ペプチドを68%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4409.1
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=35.58分
LCMS:m/z=1077.8(M+4H)4+
算出された(M)=4306.9
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-カルボキシ-4-({4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 02_B6_1:
RT=34.40分
LCMS:m/z=1120.8(M+4H)4+
算出された(M)=4480.1
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys((S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル)ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=35.14分
LCMS:m/z=(M+4H)4+
算出された(M)=4436.1
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル)ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=34.92分
LCMS:m/z=1146.3(M+4H)4+
算出された(M)=4581.2
[デスアミノHis7,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=35.39分
LCMS:m/z=1095.8(M+4H)4+
算出された(M)=4380.0
N-イプシロン37-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ}ブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_A1_1:
RT=35.73分
LCMS:m/z=1081.3(M+4H)4+
算出された(M)=4323.0
N-イプシロン37-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)-ピペリジン-4-カルボニル]-アミノ}-ブチリル)[デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=36.28分
LCMS:m/z=1009.5(M+4H)4+
算出された(M)=4032.6
[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,34]-GLP-1(7-37)-Lys-((S)-4-カルボキシ-4-{[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)-ピペリジン-4-カルボニル]-アミノ}-ブチリル)ペプチド
調製法:B、実施例7に記載のものと同様の方式
HPLC法 03_B6_1:
RT=36.06分
LCMS:m/z=1041.0(M+4H)4+
算出された(M)=4161.8
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[(R)-4-カルボキシ-4-((R)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]-[Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)
調製法 B
ペプチドを70%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4454.1
N-イプシロン37-{2-[2-(2-{(S)-4-[(S)-4-(12-{4-[16-(2-tert-ブチル-2H-テトラゾール-5-イル)-ヘキサデカノイルスルファモイル]ブチリルアミノ}ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ]-4-カルボキシブチリルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル}[デスアミノHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)
調製法 B
ペプチドを74%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4652.4
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-((S)-4-カルボキシ-4-{12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ}ブチリルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
調製法 B
ペプチドを65%のアセトニトリルで溶出させた。
MALDI-MSにより構造を確認
算出されたMW=4524.2
N-イプシロン37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37)
SPPS方法Bに類似した調製法
HPLC法 02_B6_1:
RT=33.58分
LCMS:m/z=1114(M+4H)4+
Calculated(M)=4451.1
[ImPr7,Arg26,34,Glu22]GLP-1-(7-37)Lys[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-1H-テトラゾール-5-イルヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-アミド
調製法 A
ペプチドを61%のアセトニトリルで溶出させた。
LC--MSにより構造を確認
算出されたMW:(M/3)+1=1550.8、及び(M/4)+1=1163.1;(サイエックス100 API)
実測されたMw:(M/3)+1=1551.9、及び(M/4)+1=1164.3;(サイエックス100 API)
N-イプシロン36-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC(方法 B6):
RT=36.8分
MS-TOF:m/z=4468
算出された(M+H)+=4469
N-イプシロン26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC(方法 B4):
RT=11.4分
LCMS:m/z=1433(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4296.9
N-イプシロン18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,22,35,Lys18,Arg26,34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC(方法 B4):
RT=11.0分
LCMS:m/z=1459(M+3H)3+
算出された(M+H)+=4378.1
N-イプシロン18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((R)-3-[トランス-4-((9-カルボキシノナデカノイルアミノ]メチル)シクロヘキシルカルボニルアミノ]3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]GLP-1-(7-37)
調製法:A
HPLC(方法 B4):
RT=11.4分
MS-TOF:m/z=4338
算出された(M+H)+=4338
マイクロ波ベースのリバティペプチド合成器(CEC Corp., North Carolina、A-B-C-D-誘導体化Lys GLP-1アナログを0.125mmol合成
一般的通知
ペプチドアミドの合成に使用した出発樹脂はリンク-アミド樹脂であり、ワン又はクロロトリチル樹脂は、カルボキシC末端を有するペプチド用に使用した。
工程1
ペプチド配列を全てそろえた後、mtt保護を、Lysのイプシロンアミノ基から除去し、NMP(2.5ml)にFMOC 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程1で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にFMOC 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程2で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にFMOC Glu-OTBU/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程3で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にFMOC-トラネキサム酸/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程4で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にエイコサンジオン酸(eicosanedioic acid)モノ-tert-ブチルエステル及びHOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
tert-ブチルエステル保護の除去及び樹脂からの切断
工程5で得られた樹脂をDCM(4x7ml)で洗浄し、乾燥させた。乾燥樹脂をリバティから取り出し、TFA/TIS/水(92.5/5/2.5)で2時間処理して、樹脂からペプチドを切断し、tert-ブチルエステル保護基を除去した。樹脂を濾過し、ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させ、遠心分離により単離した。ペプチドを30%の酢酸又は代替溶媒混合物に再溶解させ、記載した方法の一つを使用して精製した。
工程7
ペプチド配列を全てそろえた後、mtt保護を、Lysのイプシロンアミノ基から除去し、樹脂を工程1-3に記載したようにして修飾した。樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にFMOC-イソニペコチン酸(isonipecotic acid)/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程7で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にエイコサンジオン酸モノ-tert-ブチルエステル/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄し、工程6に記載した切断手順を実施した。
工程9
工程2で得られた樹脂を、NMP(7ml)に5%のピペリジンが入ったものを使用して、FMOC脱保護し、30秒加熱し、排水し、NMP(7ml)、続いてNMP(7ml)にさらに5%のピペリジンが入ったものを用いて洗浄し、70-75℃で3分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
NMP(2.5ml)にFMOC-Asp-OTBU/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、続いて、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄した。
工程9で得られた樹脂に、FMOC-イソニペコチン酸を付着させる工程7、ついで、エイコサンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを付着させる工程8を施し、工程6に記載された脱保護により、合成を終了させた。
工程11
N-イプシロン26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-({トランス-4-[(19-カルボキシ-ノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]誘導体を、工程1-3-4-5及び6に従い得た。
工程12
Mttを脱保護した後、NMP(2.5ml)にFMOC-Glu-OTBU/HOATが入った0.3M溶液を樹脂に添加し、NMP(1ml)にDICが入った0.75M溶液を添加した。反応体を70-75℃で5分加熱し、ついで、NMP(4x7ml)で洗浄し、続いて工程4-5及び6を施した。
アルブミンバインダーの記載されたA部を付着させるために、工程8の手順を使用可能で、酸として適切なAで、エイコサンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを置き換えた。
工程14
アルブミンバインダーの記載されたB部を付着させるために、工程7の手順を使用可能で、酸として適切なBで、FMOC-イソニペコチン酸を置き換えた。
工程15
アルブミンバインダーの記載されたC部を付着させるために、工程9の手順を使用可能で、酸として適切なCで、FMOC-Asp-OTBUを置き換えた。
工程16
アルブミンバインダーの記載されたD部を付着させるために、工程1の手順を使用可能で、酸として適切なDで、FMOC-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を置き換えた。
静脈内又は皮下投与後のGLP-1の遅延性
本発明の多くのGLP-1誘導体の遅延性を、以下の方法を使用し、健康なブタに皮下投与した後、血漿におけるその濃度をモニターすることにより測定してよい。続いて、皮下投与後のGLP-1(7-37)の血漿中の濃度と比較してよい。本発明の他のGLP-1誘導体の遅延性は、同様の方式で測定することができる。
本発明の多くのGLP-1誘導体(実施例1、2、5、7、9、10、14、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、31、33、34、35、49、50、52、59及び63の化合物)に、ミニブタにおける薬物動態試験を施した。リラグルチドを、比較目的のための試験に含めた。
一般的に、試験物質は、皮下又は静脈内投与に適したビヒクルに溶解されている。本研究において、試験物質は皮下に投与された。各動物は2nmol/kg体重を受容し、濃度は、次のビヒクル:0.05%w/vのトゥイーン80を有する50mMのリン酸バッファー(pHは約8)を使用して、投与量が約1mlになるように調節される。
本研究を、相対湿度≧50%、室温が21-23℃に設定された、適切な動物用の部屋において実施した。12時間は明るく、12時間は暗いというサイクルで、部屋に光をあてた。6.00〜18.00時までを明るいとした。動物を、寝具としてわら作りの囲いにおいて、各囲い毎に6匹を飼った。研究中、動物は、家庭用の質の飲用水に自由に近づくことができるが、投与の前日の午後4時から、投与の約12時間後まで、絶食させた。動物を、到着時、及び投与した日に計量した。
各試験物質を、典型的は3匹の動物に与えたが、いくつかのケースでは、1又は2匹の動物に与えた。12-16のサンプリング点を使用し、全血漿濃度-時間のプロフィールを各動物から得た。以下のスケジュールに従い、血液サンプルを収集した。
プレ投与(0)、注入後0.17(10分)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96及び120時間。いくつかのケースでは、投与後168時間及び240時間。
皮下投与後:
プレ投与(0)、注入後0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96及び120時間。
GLP-1誘導体の酵素的分解を防止するために、安定化用のバッファーを含有する試験用チューブに、血液サンプルを収集した。適切なバッファーの例は:EDTA(ジ-ナトリウム)0.18M;アプロチニン 15000KIE/ml、Val-Pyr 0.30mM、pHは7.4に調節)である.又はEDTA試験用チューブ(すなわち、Sarstedt Micro tube 1.3 mL K3E)に直接収集される。血液サンプルを、遠心分離の前に、最大で20分、好ましくは氷上で保持する。
遠心分離(例えば、4dgC、10分、1500G)を使用して、血漿を分離し、直ちにマイクロニック(Micronic)-チューブに移した。約200μlの血漿を、各マイクロニック-チューブに移した。アッセイまで、血漿を−20℃で保存した。適切なアッセイ、例えばイムノアッセイ、特にELISA、RIA、RRA、又はLCMSアッセイを使用し、GLP-1誘導体の含有量について、血漿サンプルをアッセイした。
本発明の選択された誘導体を、デンマーク・ランドレースブタで試験する。
ブタ(50%デュロック、25%ヨークシャー、25%デンマーク・ランドレース、約40kg)を、実験の開始から絶食させる。50μMの等張液(5mMのホスファート、pH7.4、0.02%のトゥイーン(登録商標)-20(Merck)、45mg/mlのマンニトール(ピロゲンフリー、Novo Nordisk)にて、kg体重当たり0.5nmolの試験用誘導体を、各ブタに投与する。頸静脈のカテーテルから、血液サンプルを取り出す。5mlの血液サンプルを、175μlの次の溶液:0.18MのEDTA、15000KIE/mlのアプロチニン(Novo Nordisk)、及び0.30mMのバリン-ピロリジド(Novo Nordisk)、pH7.4を収容したチルド冷却されたグラスに注ぐ。30分以内に、サンプルを10分、5-6000*gの遠心分離にかける。温度を4℃で保持する。異なるグラスに上清をピペット取りし、使用するまで、−20℃で保持する。
血漿のペプチド濃度を、種々のモノ-又はポリクローナル抗体を使用する、サンドイッチELISA又はRIAにおいて測定する。抗体の選択はGLP-1誘導体に依存する。血漿におけるピーク濃度に達した時間は、選択された特定のGLP-1誘導体に応じて、広範囲で変化する。
コーティング用バッファー(PBS):リン酸緩衝食塩水、pH7.2
洗浄用バッファー(PBS-洗浄):リン酸緩衝食塩水、0.05%v/vのトゥイーン2 0、pH7.2
アッセイ用バッファー(BSA−バッファー):リン酸緩衝食塩水、10g/lのウシ血清
アルブミン
(Fluka 05477)
0.05%v/vのトゥイーン20、
pH7.2
ストレプトアビジン-バッファー:リン酸緩衝食塩水、0.5MのNaCl、0.05% v/vのトゥイーン20、pH7.2
標準体:血漿マトリックスにおける個々の誘導体
A-TNP:ナンセンス抗体
AMDEX:ストレプトアビン(Streptavin)-西洋ワサビ-ペルオキシダーゼ(Amersham RP N4401V)
TMB-基質:3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(<0.02%)、過酸化水素
1)PBS-バッファーに5μg/mlで捕捉抗体(catching antibody)が入ったもの100μlでのコーティング
・4℃でインキュベートo/n
・PBS-洗浄5回
・最小で30分、最後の洗浄でブロック
・ついでプレートを空にする
2)10μg/mlのA-TNPと共に、BSA-バッファーに1μg/mlでビオチニル化検出抗体が入ったもの100μl+サンプル20μl
・振揺器において、室温で2時間インキュベート。PBS-洗浄5回。ついでプレートを空にする。
3)ストレプトアビジン-バッファーにおいて、AMDEX100μlを1:8000
・振揺器において、室温で45-60分インキュベート
・PBS-洗浄5回、ついでプレートを空にする
4)TMB-基質100μl
・振揺器において、室温でx分インキュベート
・4MのH3PO4100μlで反応を停止させる
参照として、450nmと620nmでの吸光度を読み取る。
サンプル中の濃度を、標準曲線から算出した。
DB-バッファー:80mMのリン酸バッファー、0.1%のヒト血清アルブミン、10 mMのEDTA、0.6mMのチオマーサル、pH7.5
FAM-バッファー:40mMのリン酸バッファー、0.1%のヒト血清アルブミン、0. 6mMのチオマーサル、pH7.5
木炭:40mMのリン酸バッファー、0.6mMのチオマーサル、16.7%のウシ血漿、 15g/lの活性炭、pH7.5(4℃での使用前、最小1時間、懸濁液を混合)
標準体:血漿マトリックスにおける個々の誘導体
混合−4℃で30分、インキュベート−3000rpmで30分、遠心分離−直後に新たなチューブに上清を移動−ストッパーで閉じ−1分間、ガンマ計測器で計測。
サンプル中の濃度を、個々の標準曲線から算出した。
本方法は、リードシーカー(LEADseeker)画像粒子を使用する、放射測定-リガンド結合アッセイである。アッセイは、GLP-1レセプター、未標識のGLP-1アナログ、125Iで標識されたヒトGLP-1、及び小麦胚芽凝集素(WGA)でコーティングされたPS リードシーカー粒子を含有する膜フラグメントからなる。冷却され、125I-標識されたGLP-1は、レセプターに対する結合について、競合するであろう。リードシーカー粒子が付加される場合、それらは、WGA-残基を介して、膜フラグメントの炭水化物残基に結合するであろう。125I-分子とリードシーカー粒子との間が近接していることで、粒子から光の放射が引き起こされる。リードシーカーは発光した光をイメージし、サンプルに存在するGLP-1アナログの量と可逆的に相関するであろう。
動物血漿の予備処理:動物血漿を56℃で4時間加熱処理し、10000rpmで10分遠心分離した。その後、Val-Pyr(10μM)及びアプロテニン(500KIE/mL)を添加し、使用するまで<−18℃で保存した。
GLP-1アナログ標準物質:GLP-1アナログを、加熱処理された血漿に混ぜ、約1μM〜1pMの範囲の希釈線を作製した。
GLP-1 RRAアッセイ用バッファー:25mMのNa-HEPES(pH=7.5)、2.5mMのCaCl2、1mMのMgCl2、50mMのNaCl、0.1%の卵白アルブミン、0.003%のトゥイーン20、0.005%のバシトラシン、0.05%のNaN3。
GLP-1レセプター懸濁液:GLP-1レセプター膜フラグメントを、ヒト膵臓GLP-1レセプターを安定して発現するベビーハムスター腎臓(BHK)細胞から精製した。使用まで<−80℃で保存。
WGAがカップリングしたポリスチレンリードシーカー画像粒子(RPNQ0260, Amersham):ビーズを、GLP-1 RRAアッセイ用バッファーを用いて、13.3mg/mLの濃度に再構成させた。ついで、GLP-1レセプター膜懸濁液を添加し、使用前に少なくとも1時間、回転させつつ、冷状態(2-8℃)でインキュベートした。
[125I]-GLP-1(7-36)アミド(Novo Nordisk A/S)。使用まで<-18℃で保存。
エタノール99.9%容量(De Dansk Spritfabrikker A/S):使用まで<-18℃で保存。
マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナート(Solvinert)0.45μmの疎水性PTFEプレート(MSRPN0450, Millipore Corp.)
ポリプロピレンプレート(カタログ番号650201, Greiner BiO-One)
ホワイト・ポリスチレン384-ウェルプレート(カタログ番号781075, Greiner BiO-One)
水平プレートミキサー
標準的なスイングバケット式マイクロタイタープレート回転アセンブリを具備する遠心分離器
ウルトラバップ(UltraVap)−ドライダウン・サンプル濃縮器(Porvair)
リードシーカーTM多様式画像システム(Amersham)
サンプル調製:
濾液を収集するために、化学-比較用受皿(すなわち、ポリプロピレンプレート)に、マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナートフィルタープレートを搭載。
マルチスクリーン(MultiScreen)(登録商標)ソルビナートフィルタープレートの空のウェルに150μLの氷冷されたエタノール99.9%、ついで50μLの標準物質又は血漿サンプルを添加。フィルタープレート上に保存用蓋を配置。
水平プレートミキサーにおいて、18-22℃で15分、インキュベート。
標準的なスイングバケット式マイクロタイタープレート回転アセンブリに、蓋を有する受皿とフィルターのアセンブリを配置。ついで、1500rpmで2分、受皿の空のウェルに濾液を収集。
15分の持続時間、加熱された(40℃)N2を用いるウルトラバップを使用し、濾液をドライダウン。各ウェルに100μLのGLP-1 RRAアッセイ用バッファーを添加することにより、乾燥物質を再構成。水平ミキサーで5分、インキュベート。
次のピペット用スキーム及びホワイト・ポリスチレン384-ウェルプレートを使用
・35μLのGLP-1 RRAアッセイ用バッファー
・5μLの再構成された濾液
・10μLの[125I]-GLP-1(7-36)アミド。保存溶液をGLP-1 RRAアッセイ用バッファーで、使用前に20000cpm/ウェルに希釈した。
・15μLのGLP-1レセプター膜フラグメント(〜0.5μg/ウェル)で、WGA-ポリスチレンリードシーカー画像ビーズ(0.2mg/ウェル)をプレコーティング。
プレートを密封し、18-22℃で一晩インキュベート。
各ウェルからの発光を、10分の持続時間、リードシーカーTM多様式画像システムを使用して検出する。
本発明の多数のGLP-1誘導体(実施例1-28、31-37、及び39-71の化合物)の作用強度を、以下に記載するようにして、すなわちヒトGLP-1レセプターを含有する媒体における、環状AMP(cAMP)形成の刺激性について測定した。比較のために、リラグルチドの作用強度も測定した。
ヒトGLP-1レセプターを発現する、安定した形質移入細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製された細胞膜を、当該問題のGLP-1誘導体で刺激させ、cAMP生成の作用強度を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンスからのアルファスクリーンTMcAMPアッセイキットを使用して測定した。
安定した形質移入細胞系を、NN A/S、デンマークで調製し、高発現クローンをスクリーニング用に選択した。DMEM、5%のFCS、1%のPen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)、及び0.5mg/mlの選択マーカーG418において、5%のCO2にて、細胞を増殖させた。
6つの化合物を除き、本発明の全ての試験されたGLP-1誘導体は、4.00以下の作用強度(EC50)を有していることが見出された。
ヒトGLP-1レセプターに対する、GLP-1ペプチドの結合親和性を、レセプターから125I-GLP-1を置き換える方法により測定した。
アルブミンに対するペプチドの結合性を試験するために、低濃度のアルブミン(0.005%−トレーサーにおけるその残存量に相当)、並びに高濃度のアルブミン(2.0%添加)で、アッセイを実施した。
結合親和性におけるシフト、IC50は、当該問題のペプチドがアルブミンに結合することの指標であり、よって動物モデルにおける、当該問題のペプチドの潜在的遅延性の薬物動態プロフィールの予測である。
種(インビトロ):ハムスター
生物学的終点:レセプターの結合
アッセイ方法:SPA
レセプター:GLP-1レセプター
細胞系:BHK tk-ts13
細胞(約80%のコンフルエンス)をPBSで2回洗浄し、(PBS+EDTA又はヴェルセンス(Versene))を収集し、ついで、それらを1000rpm、5分の遠心分離により分離させた。細胞/細胞ペレットは、次の工程に及ぶ可能性まで、氷上で保持しなければならない。細胞ペレットを、適量のバッファー1(細胞量によるが、例えば10ml)において、20-30秒、ウルトラトゥラックスでホモジナイズした。ホモジナートを2000rpmで15分、遠心分離した。ペレットを10mlのバッファー2に再懸濁(ホモジナイズ)し、再度、遠心分離を行った。この工程を1度繰り返した。得られたペレットをバッファー2に再懸濁させ、タンパク質濃度を測定した。膜を−80℃で保存した。
バッファー1:20mMのNa-HEPES+10mMのEDTA
バッファー2:20mMのNa-HEPES+0.1mMのEDTA
SPA:
試験用混合物/ペプチド、膜、SPA-粒子及び[125I]を、アッセイ用バッファーに希釈した。25μl(マイクロリットル)の試験用化合物/ペプチドを、オプチプレートに添加する。HSA(「高アルブミン」実験)、又はバッファー(「低アルブミン」実験)を添加する(50μl)。0.1-0.2mgのタンパク質/ml(好ましくは、各膜調製物に対して最適にされる)に相当する、5-10μgのタンパク質/サンプル(50μl)を添加。SPA-粒子(小麦胚芽凝集素SPAビーズ)RPNQ 0001)0.5mg/ウェル(50μl)を添加。[I125]-GLP-1(最終濃度0.05nMは49.880DPM、25μlに相当)と共にインキュベート開始。プレートシーラーでプレートを密封する。振揺しつつ、30℃で120分インキュベート。プレートを遠心分離(1500rpm、10分)し、トップカウンターで計測。
アッセイ用バッファー:50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgCl2
0.005%のトゥイーン20
pH7.4
HSAはシグマ(SIGMA)A1653であった。
ヒト血清アルブミン(HSA)に対する本発明の多数のGLP-1誘導体(実施例1-2、4-16、22-28、31、及び33-71)の親和性を、以下に記載するようにして、競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)により測定した。
ストレプトアビジン-SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009)を5時間、ビオチニル化HSAと共にインキュベートした。バッファーを用いてビーズを洗浄し、未結合のHSAを除去した。ビーズを、125I-標識されたアシル化GLP-1アナログ(N-イプシロン37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-NH2)と、100mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.025%のトゥイーン-20、pH7.4を含有するバッファーにおいて混合した。パーキン・エルマー・オプチプレート-96 6005290のウェルに、混合物をピペットで移し(ウェル当たり100μl)、測定されるGLP-1誘導体の希釈シリーズを100μl、同様のバッファーに添加した。室温でゆっくりと揺らして20時間後、プレートを遠心分離し、トップカウンターにおいて計測した。GLP-1誘導体の濃度の関数として、結合cpmをプロットし、競合曲線のEC50値を、HSAに対する誘導体の親和性の測定値として使用した。
表1:アルブミン結合親和性
表1から明らかなように、本発明のいくつかのGLP-1誘導体は、2000M以下のEC50に相応する、高いアルブミン結合親和性を有する(EC50が低ければ低い程、アルブミン結合親和性は高くなる)。
本発明の多数のGLP-1誘導体(実施例1、7、14、16、22、23、24、26、27、28、31、33、46、47、48、49、50、53、及び59の化合物)を、以下に記載するようにして、肥満症、糖尿病のマウスモデル(db/dbマウス)における用量応答研究を試験した。
10-12の週齢の50匹のdb/dbマウス(Taconic, Denmark)を、Novo Nordiskの標準的な動物保護規則に従って飼い、標準的な食べ物(例えば、Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Denmark)、及び水道水に自由に近づくことができ、24℃で保持した。順応して1週間後、基礎血糖を2回算定した。
平均血糖値に基づき、42匹のマウスをさらなる実験用に選択し、血糖値に合わせて7つのグループ(n=6)に配分した。マウスを、3-6日の期間で4回までの実験に使用し、その後安楽死させた。
1:ビヒクル、皮下
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、皮下
3:GLP-1誘導体、1nmol/kg、皮下
4:GLP-1誘導体、3nmol/kg、皮下
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、皮下
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、皮下
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、皮下
ビヒクル:50mMのホスファート、0.05%のトゥイーン80、pH8。GLP-1誘導体をビヒクルに、例えば0.05、0.17、0.5、1.7、5及び17nmol/mlの濃度で溶解させ、300マイクロリットルを、マウス50g毎に、皮下投与した(6ml/kg)。
次の日、血糖を、投与の24、48,72及び96時間後(すなわち2、3、4、5日目の午前9時)に算定し、続いて計量した。いくつかの研究においては、血糖と体重を、投与後120時間(6日目)にさらに算定した。
マウスは個々にデジタル計量で計量した。
仮定
(1)血漿からの化合物の消失は単一指数である;
(2)血糖における影響(デルタBG)は、標準的なS字型用量応答曲線で記載可能である;
(3)吸収及び分配の最初の6時間は無視し、底部から基線(最小0)へのグルコースの回復のみが適合される;
ついで、グルコース反応(Y)(例えばデルタBG)は次の等式
Y=底部+(頂部-底部)/(1+用量*exp(−In2*t/T1/2)/ED50)
により記載可能であり、ここで変数ED50及びT1/2は、以下の通りに定義される:
EDは、BGにおいて最大効果の半分まで上昇させる用量(nmol/kg)である。
T1/2は、半減期(時間)であり;以下は包括的定数である:
頂部(基線グルコースへの回復後の反応)、底部(最大グルコース低下での反応);また次は、各データ設定への定数(各用量)での定数である:
用量(投与量(nmol/kg))。
全てのデータ設定を同時に適合させる。
試験される全ての化合物は、12-35時間の範囲の半減期(T1/2)を有する。
Claims (6)
- 請求項1に記載の誘導体又はその薬学的に許容可能な塩、アミド、アルキル、又はエステルと、薬学的に許容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍の治療又は予防に使用される医薬の製造における、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物の使用。
- 薬学的に活性な量の、請求項1に記載の誘導体、又は請求項2に記載の薬学的組成物を含んでなる、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、X症候群、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患及び他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、胃腸障害、及び胃潰瘍を治療又は予防するための医薬。
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