JP5594114B2 - 多糖複合粒子の製造方法、及び、多糖複合粒子 - Google Patents
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Description
蛋白質などの生体高分子の精製を高効率に行うため、クロマトグラフィー用担体には、高流速での使用を可能にする高い耐圧性能、リガンドを導入した場合の生体高分子に対する高い結合容量が求められる。従来、クロマトグラフィー用担体として、シリカのような無機材料、ポリ(メタ)アクリルエステル類、ポリ(メタ)アクリルアミド類等の合成ポリマー、もしくは多糖類のような天然ポリマー等が用いられている。
1)下記の工程(1)〜(3):
(1)イオン液体に二種以上の多糖類を溶解する多糖類溶液の調製工程、
(2)前記多糖類溶液の液滴を前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤中に分散させる多糖類溶液の液滴分散液の調製工程、及び、
(3)複合化された多糖を凝固させて当該多糖複合粒子を得る凝固工程、
を含むことを特徴とする多糖複合粒子の製造方法。
2)多糖類がセルロース、アガロース、プルラン、デキストランから選ばれる二種以上である、上記1)の製造方法。
3)多糖類のうち少なくとも一種がセルロースである、上記1)又は2)の製造方法。
4)イオン液体がアルキルイミダゾリウム塩である、上記1)〜3)の製造方法。
5)イオン液体が酢酸1−エチル−3−メチルイミダゾリウム、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロリド又はそれらの混合物である上記1)〜4)の製造方法。
6)前記工程(2)において、多糖類溶液の液滴分散が、前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤及び親油性高分子を含む溶液を前記多糖類溶液と混合することにより行われる、上記1)〜5)の製造方法。
7)上記1)〜6)の製造方法によって製造された多糖複合粒子。
8)上記7)の多糖複合粒子を含むクロマトグラフィー用充填剤。
9)上記7)の多糖複合粒子を用いた抗体精製用吸着体。
10)アフィニティーリガンドとしてプロテインAが導入された、上記9)の抗体精製用吸着体。
そのため、バイオ医薬品等の精製工程での生産性を格段に向上させることが可能となる。
以下、工程ごとに説明する。なお、本明細書中、数値範囲を表す「A〜B」は、「A以上、B以下」と同義であり、A及びBを数値範囲内に含む。
本発明の多糖複合粒子の製造方法は、イオン液体に二種以上の多糖類を溶解する多糖類溶液の調製工程を含む。
本工程では、原料多糖類(原料として使用する多糖類。以下、単に「多糖類」ともいう。)をイオン液体に溶解して多糖類溶液が調製される。多糖類は、後述する有機溶剤に溶解しないか、有機溶剤に難溶性のものが好ましい。有機溶剤に難溶性のものとは、室温(25℃)で、有機溶剤100gに溶ける多糖類の質量(g)が1g以下であることを意味する。
具体的には、セルロース、アガロース、キチン、キトサン、デキストラン、プルラン、デンプン、グアーガム、カラギナン、アルギン酸、アラビアガム、アラビノガラクタン、ペクチン、ローカストビーンガム、タラガム、タマリンドシードガム、サイリウムシードガム、カシアガム、グルコマンナン、キサンタンガム、ジェランガム、カードラン、イヌリン、シクロデキストリン等が挙げられ、これらのうち2種以上が選択して使用される。このうち好適な多糖類としては、セルロース、アガロース、プルラン、デキストランが挙げられ、少なくとも1種がセルロースであるのが好ましい。
また、セルロースを含む場合には、セルロースの含有量が、糖総重量に対し5%以上であるのが好ましく、20%以上であるのがより好ましく、50%以上であるのがさらに好ましい。
ここで、イオン液体は、溶液の粘度上昇による液滴の形成の困難性、及び多糖濃度低下による液滴形成時の微小粒子の多発を抑制する点から、溶液中の総多糖濃度が3〜50質量%、好ましくは6〜30質量%となるように用いるのが好ましい。
尚、原料多糖類のイオン液体への溶解濃度により、得られる多糖粒子の細孔径が変化する。すなわち、原料多糖類の溶解濃度が濃いほど多糖粒子の細孔径が小さくなる傾向がある。従って、上記の範囲内において、総多糖類濃度を調整することにより、任意の細孔径をもつ多糖粒子を得ることができる。尚、本発明の多糖粒子において細孔径に特に制限はないが、一般にクロマトグラフィー用充填剤として用いられる場合には数nm〜数μm程度が好ましい。
本発明の多糖複合粒子の製造方法は、前記多糖類溶液の液滴を前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤中に分散させる多糖類溶液の液滴分散液の調製工程を含む。
本工程では、上記の如く調製された多糖類溶液を、イオン液体と相溶性の低い有機溶剤(以下、単に「有機溶剤」とも称する)中に分散させて、多糖類溶液の液滴分散液が調製される。
ここで、「イオン液体と相溶性の低い有機溶剤」とは、イオン液体と有機溶剤とを体積比で1:1で混合した際に、イオン液体と有機溶剤との間に界面が形成される有機溶剤を意味する。
ここで、用いられる界面活性剤は、表面張力を減ずる作用を有し、分子内に疎水性部位と親水性部位をもつ有機化合物であって、前記多糖類溶液を液滴の状態を安定に保ったまま分散できるものあれば特に限定されない。
アルキルアミノ脂肪酸ナトリウム、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド等の両性界面活性剤;
しょ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンプロピレン脂肪酸エステル等のノニオン系の界面活性剤;
等が挙げられる。
これらのうちノニオン系の界面活性剤が好ましく、特に好ましくはソルビタンモノオレエート(SPAN80)、ソルビタントリオレエート(SPAN85)である。
これらのうち、セルロース誘導体が好ましく、とりわけエチルセルロースが好ましい。
上記親油性高分子は、1種のみを使用することができるが、2種以上を併用することもできる。
尚、平均分子量とは、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ(GPC)によるポリスチレン換算重量平均分子量を意味する。
本発明の多糖複合粒子の製造方法は、複合化された多糖を凝固させて当該多糖複合粒子を得る凝固工程を含む。
「複合化された多糖」とは、前記二種以上の多糖類を混合して含む多糖を意味し、「多糖複合粒子」とは、前記二種以上の多糖類を含む粒子を意味する。
本工程では、多糖類溶液の液滴分散液から多糖複合粒子を凝固させるが、斯かる方法としては、例えば、当該多糖類溶液の液滴分散液に、イオン液体に相溶し且つ実質的に多糖類を溶解しない媒体を接触させる方法が挙げられる。
媒体は直接多糖類溶液の液滴分散液に添加してもよいが、多糖類溶液の液滴の形状を保ったまま多糖複合体を凝固させることができる方法が好ましい。具体的にはイオン液体と相溶性の低い有機溶剤と、水、メタノール、エタノール等の媒体とを混合・撹拌して媒体の分散液を調製後、多糖類溶液の液滴分散液に接触させる方法を挙げることができる。このときの有機溶剤は多糖類溶液の分散媒と同種のものであることが好ましく、液滴形成のために界面活性剤及び/又は親油性高分子を含んでいてもよい。
後記実施例に示すとおり、本発明の多糖複合粒子を、クロマトグラフィー用担体として容器に充填し、適切な線速度で通液した場合、セルロース粒子を用いた場合に比べ親和性物質等の動的結合容量が低下しにくいという性質を有する(実施例9)。
例えば、一態様として、本発明の多糖複合粒子の水酸基の少なくとも一部を介してプロテインAを公知の方法(米国特許6399750号等)により固定化することにより、抗体精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤、すなわち抗体精製用吸着体とすることが挙げられる。
500mlバッフル付きセパラブルフラスコ内で1−エチル−3−メチルイミダゾリウムアセテート(Aldrich社製)60gにセルロース粉末(フナコシ株式会社製)4.04g、アガロース粉末(清水食品株式会社製)0.13gを加え、温水バスにセットし95℃に加熱し、2時間撹拌を行い溶解し多糖類溶液を得た。別の500mlセパラブルフラスコ内でトルエン200mlにエチルセルロース45(和光純薬工業社製)16gを加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した。さらに別のセパラブルフラスコ内でトルエン150mlにエチルセルロース45を12g加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した後、0.2M硫酸ナトリウム水溶液62.5mlを加え400rpm、80℃で30分間撹拌をおこないW/O型エマルジョンを得た。次にエチルセルロース45含有トルエンを多糖類溶液に加え400rpm、90℃で10分間撹拌しIL/O型エマルジョン(ここで、ILはイオン液体)を調製後、上記で得られたW/O型エマルジョンを加え400rpmで撹拌しながら室温に冷却した。その後、1500mlエタノール中に注ぎ撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。さらにエタノール1500mlでデカンテーションを2回おこなった後、エタノールで濾過洗浄を行い、さらに水で濾過洗浄を行い目的のセルロース/アガロース複合粒子を得た。次に、セルロース/アガロース複合粒子を106μmと45μmのふるいにかけ45μm〜106μmの粒径をもつ粒子を得た。光学顕微鏡で確認したところ平均粒径は89μmであった。得られた粒子量は沈降体積50mlであった。
尚、粒子沈降体積は、粒子を水分散し、目盛り付き容器に入れ、12時間静置後の粒子沈降体積を目視により測定した(以下同様)。
実施例1でアガロース粉末の代わりにプルラン粉末(林原生物化学研究所社製)を用いた以外は実施例1と同様にしてセルロース/プルラン複合粒子を得た。光学顕微鏡で確認したところ平均粒径は92μmであった。得られた粒子量は沈降体積50mlであった。
実施例1でセルロース粉末(フナコシ株式会社製)4.04g、アガロース粉末(清水食品株式会社製)0.13gの代わりにセルロース粉末5.14g、デキストラン40000(和光純薬工業社製)0.64gを用いた以外は実施例1と同様にしてセルロース/デキストラン複合粒子を得た。光学顕微鏡で確認したところ平均粒径は92μmであった。得られた粒子量は沈降体積60mlであった。
500mlバッフル付きセパラブルフラスコ内で1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロリド(Aldrich社製)60gにセルロース粉末4.17g、デキストラン40000(和光純薬工業社製)0.13gを加え、温水バスにセットし95℃に加熱し、2時間撹拌を行い溶解し多糖類溶液を得た。別の500mlセパラブルフラスコ内でmineral oil (heavy)(Aldrich社製)200mlにSpan85(和光純薬工業株式会社製)9mlを加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した。さらに別のセパラブルフラスコ内でmineral oil (heavy)150mlにSpan85 6.75mlを加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した後、0.2M硫酸ナトリウム水溶液62.5mlを加え400rpm、80℃で30分間撹拌をおこないW/O型エマルジョンを得た。次にSpan85含有mineral oil (heavy)を多糖類溶液に加え800rpm、100℃で10分間撹拌し多糖類溶液の液滴分散液(IL/O型エマルジョン)を調製後、上記で得られたW/O型エマルジョンを加え800rpmで撹拌しながら室温に冷却した。その後、1500mlエタノール中に注ぎ撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。さらにエタノール1500mlでデカンテーションを2回おこなった後、エタノールで濾過洗浄を行い、さらに水で濾過洗浄を行い目的のセルロース/デキストラン複合粒子を得た。次に、セルロース/デキストラン複合粒子を106μmと40μmのふるいにかけ40μm〜106μmの粒径をもつ粒子を得た。光学顕微鏡で確認したところ平均粒径は92μmであった。得られた粒子沈降体積は10mlであった。
J.Chromatogr.A 1217(2010)1298-1304(前記非特許文献1)記載の方法に従って、セルロース粒子を製造した。
すなわち、500mlバッフル付きセパラブルフラスコ内で1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロリド(Aldrich社製)60gにセルロース粉末4.17gを加え、温水バスにセットし95℃に加熱し、2時間撹拌を行い溶解しセルロース溶液を得た。別の500mlセパラブルフラスコ内でmineral oil (heavy)(Aldrich社製)200mlにSpan85(和光純薬工業株式会社製)9mlを加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した。さらに別のセパラブルフラスコ内でmineral oil (heavy)150mlにSpan85 6.75mlを加え、温水バスにセットし80℃で2時間撹拌を行い溶解した後、0.2M硫酸ナトリウム水溶液62.5mlを加え400rpm、80℃で30分間撹拌をおこないW/O型エマルジョンを得た。次にSpan85含有mineral oil (heavy)をセルロース溶液に加え800rpm、100℃で10分間撹拌しセルロース溶液の液滴分散液(IL/O型エマルジョン)を調製後、上記で得られたW/O型エマルジョンを加え800rpmで撹拌しながら室温に冷却した。その後、1500mlエタノール中に注ぎ撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。さらにエタノール1500mlでデカンテーションを2回おこなった後、エタノールで濾過洗浄を行い、さらに水で濾過洗浄を行い目的のセルロース粒子を得た。次に、セルロース粒子を106μmと40μmのふるいにかけ40μm〜106μmの粒径をもつ粒子を得た。光学顕微鏡で確認したところ平均粒径は90μmであった。得られた粒子沈降体積は10mlであった。
100ml三ツ口フラスコ内を用い実施例1で製造したセルロース/アガロース複合粒子25ml(沈降体積)に水35mlを加えた。次にNaBH4120mg、32重量%Na2SO4水溶液25ml、45重量%NaOH水溶液0.6mlを加え撹拌した。温度を50℃にして30分間撹拌を継続した。次に、45重量%NaOH0.9mlとエピクロロヒドリン0.72mlを1時間おきに12回加えた。添加終了後、温度50℃で12時間反応させた。その後、濾過により粒子を回収し、純水で洗浄し、化学架橋セルロース/アガロース複合粒子を得た。得られた粒子5ml(沈降体積)をサクションドライし、水を加えて計7mlの懸濁液とした。上記の懸濁液に5N水酸化ナトリウム水溶液0.8ml、NaBH424mg、及びエピクロロヒドリン4mlを加え、25℃で8時間振とうし、化学架橋セルロース/アガロース複合粒子にエポキシ基を導入した。その後、上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行った。得られた粒子をプロテインA(RepliGen社、rPA50)102mgを含む1.5M硫酸ナトリウム、0.1Mリン酸バッファー(pH6.8)45mlで懸濁した。上記懸濁液を25℃で24時間振とうし、プロテインAを粒子に結合させた。その後、粒子を遠心分離して上澄み液を除いた。次に1Mチオグリセロール、0.5M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)45mlを加えて25℃で4時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、0.1Mクエン酸バッファー(pH3.2)、0.1M水酸化ナトリウム水溶液、PBS(−)で順次洗浄し、プロテインA固定化セルロース/アガロース複合粒子を得た。
実施例2で得られたセルロース/プルラン複合化粒子を実施例5と同様の方法によりプロテインA固定化セルロース/プルラン複合粒子を得た。
実施例3で得られたセルロース/デキストラン複合化粒子を実施例5と同様の方法によりプロテインA固定化セルロース/デキストラン複合化粒子を得た。
実施例4で得られたセルロース/デキストラン複合化粒子を実施例5と同様の方法によりプロテインA固定化セルロース/デキストラン複合化粒子を得た。
比較例1で得られたセルロース粒子を実施例5と同様の方法によりプロテインAを固定化し、プロテインA固定化セルロース粒子を得た。
実施例5、6、7、8、比較例2で得られたプロテインA固定化多糖粒子をそれぞれ内径0.5cmのカラムにベッド高20.0cmまで詰めた。各カラムを20mMリン酸バッファー(pH7.4)で平衡化した後、ヒトポリクローナルIgG(5mg/ml)を含む20mMリン酸バッファー(pH7.4)を、線流速300cm/時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルIgG濃度が10%ブレークスルー(破過)の時のヒトポリクローナルIgG吸着量と充填剤体積から動的結合容量を求めた。また、そのときのカラム圧を測定した。結果を表1に示す。本発明品はカラム圧が低く体積当たりのIgG動的結合容量が高かった。
Claims (10)
- 下記の工程(1)〜(3):
(1)イオン液体に二種以上の多糖類を溶解する多糖類溶液の調製工程、
(2)前記多糖類溶液の液滴を前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤中に分散させる多糖類溶液の液滴分散液の調製工程、及び、
(3)複合化された多糖を凝固させて当該多糖複合粒子を得る凝固工程、
を含むことを特徴とする多糖複合粒子の製造方法。 - 多糖類がセルロース、アガロース、プルラン、デキストランから選ばれる二種以上である、請求項1記載の製造方法。
- 多糖類のうち少なくとも一種がセルロースである、請求項1又は2記載の製造方法。
- イオン液体がアルキルイミダゾリウム塩である、請求項1〜3の何れか1項記載の製造方法。
- イオン液体が酢酸1−エチル−3−メチルイミダゾリウム、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロリド又はそれらの混合物である請求項1〜4何れか1項記載の製造方法。
- 前記工程(2)において、多糖類溶液の液滴分散が、前記イオン液体と相溶性の低い有機溶剤及び親油性高分子を含む溶液を前記多糖類溶液と混合することにより行われる、請求項1〜5の何れか1項記載の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法によって製造された多糖複合粒子。
- 請求項7記載の多糖複合粒子を含むクロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項7記載の多糖複合粒子を用いた抗体精製用吸着体。
- アフィニティーリガンドとしてプロテインAが導入された、請求項9記載の抗体精製用吸着体。
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