WO2010095673A1 - 免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル - Google Patents

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porous cellulose
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polysaccharide
particles
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吉裕 松本
靖人 梅田
茂之 青山
正美 戸所
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チッソ株式会社
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
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    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography

Definitions

  • the present invention relates to the production and use of a packing material for cation exchange chromatography suitable for the separation and purification of chromatographic packing materials, particularly protein preparations such as immunoglobulins that can be used for antibody drugs and biopharmaceuticals for blood products.
  • Non-Patent Document 1 Journal of Chromatography A, 679 (1994) 11-22
  • an ion-exchange adsorbent comprising a dextran-derived hydrogel in which ion-exchange groups are added to core particles made of polystyrene-silica. It has been reported that the protein adsorption performance is improved by using “S HyperD (trademark)” from Biosepra (France).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2008-528966
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-232764
  • a ligand using 2-bromoethanesulfone into a gel in which pullulan having a molecular weight of 500,000 is immobilized on porous methacrylate particles. It is described that a matrix for strong cation ion exchange chromatography showing flow rate characteristics was obtained.
  • an adsorption capacity of 160 mg / ml of human immunoglobulin has been achieved.
  • Non-Patent Document 2 Journal of Chromatography A, 1146 (2007) 202-215 reports the effect of surface modification using dextran on agarose core particles. According to this, by modifying the surface of the core particle using dextran, the diffusibility of the target protein in the carrier is improved, and thus mass transfer of the target is increased.
  • SP Sepharose (trademark) XL” is commercially available from GE Healthcare Science.
  • Patent Document 3 As an example of a gel matrix for cation exchange chromatography that can be used for antibody drug production, a dextran having a molecular weight of 40 kDa is covalently bonded to a crosslinked agarose gel. It was reported that a gel having an ability to adsorb immunoglobulin (IgG) of 143 mg / ml was obtained by introducing an ion exchange group into the resulting particles using vinyl sulfonic acid.
  • IgG immunoglobulin
  • a typical silica-based filler as a chromatography filler is excellent in high flow rate.
  • the material is unstable under alkaline conditions, it is disadvantageous for general alkali cleaning properties.
  • the packing material for chromatography based on polysaccharides has strong alkali resistance. Moreover, the packing material for chromatography based on polysaccharide has a porosity suitable for separation and purification of protein size, and is promising for separation and purification of protein or vaccine preparation.
  • Cellulose and agarose which are typical polysaccharides, are more advantageous for increasing the flow rate required for chromatographic packing materials because cellulose has a stronger hydrogen bonding network.
  • flow rate characteristics and adsorption characteristics suitable for separation and purification of immunoglobulins for protein preparations, particularly antibody drugs, based on cellulose.
  • JP 2008-528966 A Japanese Patent Laid-Open No. 2008-232764 International Publication No. 2007-027139 Pamphlet
  • a chromatography filler can be produced by a simpler method by using a polysaccharide having a high intrinsic viscosity.
  • the present invention provides a porous cellulose-based gel, a chromatographic filler, a production method thereof, an application, and the like as described below.
  • a porous cellulose gel obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and drying per unit volume of the porous cellulose gel A porous cellulose gel characterized by having a weight of 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles.
  • the porous cellulose particles have a particle size of 30 to 200 ⁇ m and are expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase with standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da.
  • the porous cellulose gel according to [1] which has a gel distribution coefficient of 0.15 to 0.6.
  • [6] A chromatographic packing material obtained by adding a ligand to the porous cellulose gel described in any one of [1] to [5].
  • the filler according to [7], wherein the introduced amount of the ligand is 0.13 to 0.30 mmol / ml in terms of ion exchange capacity.
  • the filler according to [6], wherein the ligand is a sulfate group.
  • the filler according to [9] wherein the introduced amount of the ligand is 5000 to 60000 ppm in terms of sulfur content.
  • a porous cellulose gel obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and drying per unit volume of the porous cellulose gel A method for producing a chromatographic filler, comprising a step of adding a ligand to a porous cellulose gel having a weight of 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles.
  • the porous cellulose particles have a particle diameter of 30 to 200 ⁇ m, and are expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase with standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da.
  • [18] A method for producing an immunoglobulin preparation, comprising a step of separating and purifying immunoglobulin using the filler according to any one of [6] to [8] and [11] to [13].
  • [18a] A method for producing a blood product, comprising the step of separating and purifying the blood product using the filler according to [9] or [10].
  • [18b] A method for producing an immunoglobulin preparation, comprising a step of separating and purifying immunoglobulin using the filler according to [9] or [10].
  • porous cellulose gel is a separation agent for chromatography, and porous particles formed by adding polysaccharides to porous cellulose particles contain a solvent therein. Or in a swollen state after absorbing a solvent.
  • a chromatographic filler having improved flow rate characteristics and adsorption characteristics, and a base material suitably used therefor.
  • a ligand can be efficiently introduced by using dextran having a predetermined intrinsic viscosity as a polysaccharide to be added to porous cellulose particles. Can be increased.
  • a cation exchange type that can be used for separation and purification of immunoglobulins in the field of antibody medicine by introducing a sufficient amount of a sulfone group as a ligand into the porous cellulose gel of the present invention.
  • a chromatographic gel can be provided.
  • immunoglobulin adsorption performance can be greatly improved.
  • porous cellulose gel of the present invention the packing material for chromatography, the production method and use thereof will be described in detail.
  • porous Cellulose Gel First, the porous cellulose gel of the present invention will be described.
  • the porous cellulose gel of the present invention is obtained by adding a polysaccharide having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g to porous cellulose particles, and the dry weight per unit volume is as described above. It is characterized by 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of porous cellulose particles.
  • the porous cellulose gel of the present invention is obtained by adding a predetermined amount of a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to porous cellulose particles, and cellulose molecules are crosslinked by a crosslinking agent such as epichlorohydrin.
  • a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity By modifying the surface of the porous cellulose particles or the inside of the pores with a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity, a high flow rate characteristic is ensured when used as a packing material for chromatography, and a ligand is efficiently introduced. This makes it possible to impart high adsorption characteristics.
  • a desired amount of polysaccharide can be added to porous cellulose by a simple method by using a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity.
  • the porous cellulose particles used in the present invention preferably have a particle size of 30 to 200 ⁇ m, and particularly preferably have a particle size of 50 to 150 ⁇ m.
  • the desired particle size can be adjusted, for example, by classification using a JIS standard sieve.
  • a sieve having an aperture of 54 ⁇ m (wire diameter 0.04 mm) and an aperture of 125 ⁇ m (wire diameter 0.088 mm) is suitable for obtaining the particle size of the present invention.
  • the average particle size of the porous cellulose particles used in the present invention is preferably 80 to 120 ⁇ m, more preferably 90 to 110 ⁇ m.
  • the average particle diameter of the porous cellulose particles can be calculated by actually measuring an arbitrary number of cellulose particle photographs taken using a scanning electron microscope or an optical microscope and obtaining the average. The specific measurement method is as shown in the examples.
  • the sphericity (minor axis / major axis) of the porous cellulose particles used in the present invention is not particularly limited, but those having a spherical shape of 0.8 to 1.0 are preferred.
  • the porous cellulose particles used in the present invention are porous.
  • As an index of sex a commercially available standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da, having a gel distribution coefficient of 0.15 to 0.6 expressed by Kav when pure water is used as a mobile phase. Those are preferred.
  • the gel distribution coefficient is more preferably 0.20 to 0.55, and further preferably 0.25 to 0.50.
  • the standard polyethylene oxide having a weight average molecular weight of 1.5 ⁇ 10 5 Da is preferably, for example, standard polyethylene oxide “SE-5” manufactured by Tosoh Corporation.
  • the gel distribution coefficient Kav can be obtained from the relationship between the elution volume of the standard substance having a molecular weight and the column volume by the following equation.
  • Kav (Ve ⁇ V 0 ) / (Vt ⁇ V 0 ) [In the formula, Ve is a sample holding capacity (ml), Vt is an empty column volume (ml), and V 0 is a dextran T2000 holding capacity (ml). ]
  • the method for measuring the gel partition coefficient Kav is described in, for example, L. Fischer Biochemistry Experimental Method 2 “Gel Chromatography” 1st Edition (Tokyo Kagaku Dojin). The specific measurement method is as shown in the examples.
  • the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles of the present invention can be adjusted, for example, by controlling the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles described in Reference Example 1 described later.
  • the gel distribution suitable for the porous cellulose particles of the present invention is preferably adjusted to 4 to 6% (W / W).
  • the coefficient Kav can be obtained.
  • the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles can be controlled, for example, by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles.
  • a gel distribution coefficient Kav suitable for the porous cellulose particles of the present invention can be obtained by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions described in Reference Example 1 described later.
  • a method combining the control of the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles and the control of the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles may be used.
  • the porous cellulose particles used in the present invention may be crosslinked cellulose particles or non-crosslinked cellulose particles, but when a chromatography filler is produced using the porous cellulose gel of the present invention as a base material. Moreover, it is preferable to use crosslinked cellulose particles because higher flow rate characteristics can be obtained.
  • Crosslinked cellulose particles can be obtained by crosslinking uncrosslinked cellulose particles. Crosslinking is performed between the free hydroxyl groups of the cellulose molecules that have formed a three-dimensional network structure in each cellulose particle and the functional groups of the crosslinking agent.
  • the manufacturing method in particular of a crosslinked cellulose particle is not restrict
  • the solvent is not particularly limited as long as it can disperse uncrosslinked cellulose particles, and any of water, an organic solvent such as alcohol, ketone, ether, and aromatic hydrocarbon, or a mixture of water and an organic solvent may be used. Good. Among these solvents, water-soluble solvents are preferable, and water is particularly preferable.
  • an inexpensive inorganic salt such as sodium sulfate may coexist in the suspension.
  • the crosslinking agent is not particularly limited as long as it is polyfunctional, and a bifunctional one is preferably used in the present invention. Since the crosslinking agent used in the present invention is chemically stable in the bond with cellulose and does not introduce charged groups that can cause undesirable adsorption during the reaction, epichlorohydrin, polyethylene glycol or sorbitol A preferable example is an epoxy compound in which a hydroxyl group is glycidyl etherified. These crosslinking agents can be used alone or in combination of two or more. Among these, in the present invention, it is preferable to use epichlorohydrin in which the bond becomes stronger.
  • the crosslinking reaction is preferably performed in the presence of an alkali.
  • alkali include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, and alkaline earth such as calcium hydroxide.
  • alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide
  • alkaline earth such as calcium hydroxide.
  • a hydroxide of a similar metal Of these, sodium hydroxide and potassium hydroxide are preferred, and sodium hydroxide is particularly preferred because alkali metal hydroxide has good solubility.
  • methods described in Japanese Patent Publication No. 43-10059, Japanese Patent Publication No. 2000-508361 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-39558 can be used as a method for producing crosslinked cellulose particles. it can.
  • the water swelling degree of the porous cellulose particles used in the present invention is preferably 5 to 20 ml / g, particularly 6 to 13 ml / g.
  • the degree of water swelling of the porous cellulose particles is defined by volume / solid weight (ml / g).
  • a gel swollen with water is placed in a graduated cylinder, and vibration is occasionally applied until the volume becomes constant. Then, the volume is measured, then the gel is taken out from the graduated cylinder, the entire amount of the gel is dried and the dry weight of the porous cellulose particles is measured, and the obtained measurement value is used to obtain from the following formula: be able to.
  • Water swelling degree (ml / g) gel volume (ml) ⁇ gel dry weight (g)
  • the degree of water swelling of the porous cellulose particles of the present invention can be adjusted, for example, by controlling the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles described in Reference Example 1 described later.
  • the water swelling suitable for the porous cellulose particles of the present invention is preferably adjusted by adjusting the concentration to 4 to 6% (w / w). You can get a degree.
  • the degree of water swelling of the porous cellulose particles can be controlled by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles.
  • the degree of water swelling suitable for the porous cellulose particles of the present invention can be obtained by controlling the crosslinking method and crosslinking conditions described in Reference Example 1 described later.
  • a method combining the control of the cellulose dissolution concentration during the production of cellulose particles and the control of the crosslinking method and crosslinking conditions of the cellulose particles may be used.
  • the polysaccharide added to the porous cellulose particles is one having an intrinsic viscosity of 0.21 to 0.90 dL / g.
  • the polysaccharide used in the present invention has the above intrinsic viscosity, a desired amount of polysaccharide can be added to the porous cellulose particles.
  • the polysaccharide having the above intrinsic viscosity is used, there is an advantage that the reaction operation is not burdened.
  • the range of intrinsic viscosity of the polysaccharide used in the preferred embodiment of the present invention is, for example, 0.21 to 0.90 dL / g, 0.21 to 0.80 dL / g, or 0.21 to 0.70 dL / g. Further, it may be 0.21 to 0.64 dL / g.
  • the intrinsic viscosity of the polysaccharide may be adjusted, for example, by selecting a polysaccharide having an appropriate intrinsic viscosity from commercially available products, or may be adjusted by a known method, for example, an appropriate intrinsic viscosity Select microorganisms that produce saccharides, obtain polysaccharides from the microorganisms, change culture conditions for microorganisms that produce polysaccharides, and obtain polysaccharides produced under the culture conditions. Also good.
  • the intrinsic viscosity of a polysaccharide is determined according to the viscosity measurement method in the general measurement method listed in the Japanese Pharmacopoeia 14th edition, the first method “capillary viscometer method” of several polymer solutions having different concentrations.
  • the viscosity can be determined by measuring the concentration dependence of the viscosity and extrapolating the obtained linear density to zero.
  • the weight average molecular weight of the polysaccharide used in the present invention is more preferably 60 kDa or more, and even more preferably 70 kDa or more. Further, the weight average molecular weight of the polysaccharide is more preferably 500 kDa or less, and further preferably 300 kDa or less.
  • polysaccharides used in the present invention include no charged groups so as not to cause undesirable non-specific adsorption during the reaction, and can be bound to porous cellulose particles, and thereafter There is no particular limitation as long as it has a reactive functional group (preferably a hydroxyl group) for enabling introduction of a ligand.
  • a reactive functional group preferably a hydroxyl group
  • examples include agarose, dextran, pullulan, starch, and derivatives thereof. Among these, it is preferable to use dextran, which is water-soluble and advantageous in terms of reaction operability, and can be obtained at low cost.
  • the polysaccharide used in another preferred embodiment of the present invention is pullulan.
  • the amount of polysaccharide added to the porous cellulose particles is represented by the amount of change in dry weight per unit volume before and after polysaccharide addition. That is, in the present invention, the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel is preferably 1.06 to 1.40 times the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles. This ratio has a suitable range depending on the viscosity of the polysaccharide, but is generally preferably 1.10 times or more, more preferably 1.15 times or more, and particularly preferably 1.20 times or more.
  • a ligand can be efficiently introduced when producing the packing material for chromatography using the porous cellulose gel of the present invention, and the adsorption property of the target substance is enhanced. be able to.
  • the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel and the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles can be determined as follows. First, 10.0 g of porous cellulose gel is added to a 50 ml stoppered graduated cylinder, and further pure water is added up to the 50 ml line, stoppered and allowed to stand until the volume remains unchanged. When the volume no longer changes, read the gel volume from the graduated cylinder scale. Next, the gel is taken out from the graduated cylinder, the whole amount of the gel is dried, and the weight of the dried gel is measured. Using each measured value, the dry weight per unit volume of the porous cellulose gel can be determined according to the following formula.
  • Dry weight per unit volume (g / ml) Dry weight of gel (g) ⁇ Gel volume (ml)
  • the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles can also be determined in the same manner as described above. The specific measurement method is as shown in the examples.
  • the dry weight per unit volume of the porous cellulosic gel and the dry weight per unit volume of the porous cellulose particles for example, select the molecular weight of the polysaccharide used and control the amount added to the porous cellulose particles. Can be adjusted.
  • the method for adding the polysaccharide to the porous cellulose particles is not particularly limited as long as the polysaccharide can be bonded to the porous cellulose particles by a chemical covalent bond.
  • the polysaccharide may be added to the porous cellulose particles by reacting the porous cellulose particles with a crosslinking agent in a solvent in the presence of an alkali and then reacting the obtained reaction product with the polysaccharide. it can.
  • the crosslinking agent used for the reaction is not particularly limited as long as it is bifunctional or polyfunctional, and examples thereof include those similar to those used for crosslinking porous cellulose particles. In particular, epichlorohydrin is preferably used.
  • the alkali used for reaction can illustrate the thing similar to what is used for bridge
  • the solvent used for the reaction is not particularly limited as long as the porous cellulose particles can be dispersed.
  • crosslinking of a porous cellulose particle can be illustrated.
  • water is particularly preferable.
  • an inorganic salt such as sodium sulfate may coexist in the reaction mixture.
  • JP-A-60-77769 As a method for adding a polysaccharide to porous cellulose particles, a method described in JP-A-60-77769 may be used. That is, epichlorohydrin is reacted with crosslinked cellulose particles to introduce an epoxy group, and dextran sulfate or a salt thereof is reacted therewith, whereby dextran can be added to the crosslinked cellulose particles.
  • This method has an advantage that unreacted dextran sulfate or a salt thereof can be recovered and reused.
  • the porous cellulose gel of the present invention can be obtained by adding a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to the porous cellulose particles.
  • a ligand to the porous cellulose-based gel of the present invention thus obtained, a desired flow rate characteristic can be imparted, and a chromatographic filler excellent in the target substance adsorption characteristic can be obtained.
  • the chromatographic packing material of the present invention is obtained by adding a ligand to at least a part of the reactive functional group present in the above-described porous cellulose gel of the present invention.
  • the porous cellulose gel of the present invention obtained by adding a predetermined amount of a polysaccharide having a predetermined intrinsic viscosity to the porous cellulose particles has excellent flow rate characteristics and can efficiently introduce a ligand.
  • the packing material for chromatography of the present invention obtained by adding a ligand to this is excellent in flow rate characteristics and adsorption characteristics.
  • the types of ligands include ion exchange groups, hydrophobic groups, affinity groups and the like. Specifically, diethylamino, aminoethyl, carboxymethyl, sulfoneethyl, sulfone, phenyl, phosphate ester group, sulfate ester group, fanylboric acid Group, Protein A, and other reactive functional groups having affinity.
  • the packing material for chromatography of the present invention can be easily obtained by adding a ligand to at least a part of the reactive functional group of the porous cellulose gel of the present invention.
  • chromatography suitable for the separation and purification of proteins such as lysozyme and immunoglobulin by introducing a sulfone group into at least a part of the reactive functional group (for example, hydroxyl group) of the porous cellulose gel of the present invention.
  • a filler can be obtained.
  • a chromatographic packing material can be obtained.
  • a sulfone group when introduced into the porous cellulose gel of the present invention, it can be carried out as follows.
  • Sulfonating agents include haloalkanesulfonic acids such as sodium 3-chloro-2-hydroxypropanesulfonate or sodium 3-bromopropanesulfonate; sulfonic acids having an epoxide such as 1,4-butanesultone or 1,2-epoxyethanesulfonic acid Etc.
  • a sulfonic acid having an epoxide such as 1,4-butanesultone or 1,2-epoxyethanesulfonic acid.
  • the amount of the sulfonating agent used may be arbitrarily selected depending on the target sulfone group introduction rate and reaction conditions. For example, 0.001 to 1 equivalent of the reactive functional group in the porous cellulose gel It is appropriate to use
  • the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of the solvent and sulfonating agent, but are usually 0 to 100 ° C., preferably 20 to 85 ° C., preferably 0.5 to 24 hours, more preferably in an inert gas. For 0.5 to 10 hours.
  • the reaction mixture may be neutralized by adding an aqueous alkali solution such as an aqueous sodium hydroxide solution. Thereafter, the obtained reaction mixture is filtered or centrifuged to recover the product and washed with water until neutral to obtain the target substance.
  • the amount of the sulfone group introduced can be adjusted by changing the amount of the sulfonating agent used, and may be appropriately determined according to the use of the chromatography filler. Specifically, the amount of sulfone group introduced can be increased by increasing the amount of sulfonating agent used.
  • JP-A-2001-302702 and JP-A-9-235301 can be referred to for details of the method for introducing a sulfone group.
  • the amount of ligand introduced into the chromatographic packing material of the present invention is not particularly limited, but it is preferably 0.13 to 0.30 mmol / ml in terms of ion exchange capacity since desired adsorption characteristics can be obtained. 15 mmol / ml or more is particularly preferable. Moreover, 0.20 mmol / ml or less is especially preferable.
  • ion exchange capacity means the molar amount of ligand per volume gel. The specific measurement method is as shown in the examples.
  • transducing a sulfate group into the porous cellulose gel of this invention it can carry out as follows.
  • the introduction of the sulfate ester group into the porous cellulose gel of the present invention may be carried out by a generally known method disclosed in, for example, US Pat. No. 4,480,091 and JP-A-2006-274245, that is, dimethyl
  • a method of allowing chlorosulfonic acid to act on a sulfating agent in a solvent such as formamide or pyridine can be used.
  • the amount of sulfating agent used in this case varies depending on the sulfur content of the target particles, but the weight ratio of cellulose gel to sulfating agent (cellulose gel: sulfating agent) is preferably 100: 10 to 100: 100. Is suitably in the range of 100: 10 to 100: 50.
  • the reaction varies depending on the type of solvent and sulfating agent, but in an inert gas, at 0 to 100 ° C., preferably 20 to 85 ° C., for 0.5 to 24 hours, preferably 0.5 to 10 hours. Do.
  • the introduction amount of the sulfate ester group can be adjusted according to the amount of the sulfating agent charged as described above, and may be appropriately determined according to the use of the chromatography filler. Specifically, the amount of sulfate ester groups introduced can be increased by increasing the weight ratio of the sulfating agent to the cellulose gel.
  • the amount of the sulfate ester group introduced into the chromatographic filler of the present invention is not particularly limited, but it is preferably 5000 to 60000 ppm in terms of sulfur content and more preferably 10,000 ppm or more in order to obtain desired adsorption characteristics. Moreover, 50000 ppm or less is particularly preferable.
  • the “sulfur content” means the ratio of the sulfur weight to the total dry weight of the porous cellulose gel. The specific measurement method is as shown in the examples.
  • the chromatography packing material of the present invention is particularly preferably used for separation and purification of immunoglobulins.
  • a desired amount of the sulfone group can be efficiently introduced, so that affinity for immunoglobulin can be imparted.
  • the amount of adsorbed immunoglobulin in the chromatographic packing material of the present invention is 110 to 250 mg / ml.
  • the “adsorbed amount of immunoglobulin” means the adsorbed amount of immunoglobulin per volume gel measured by the measurement method shown in Examples.
  • the chromatography filler according to some embodiments of the present invention in which the ligand is a sulfate group can be suitably used as a chromatography filler instead of a heparin gel.
  • the chromatographic packing material of this embodiment can be suitably used for separation and purification of various proteins such as lysozyme.
  • the adsorption amount of lysozyme in the chromatographic packing material of this embodiment is 50 to 250 mg / ml.
  • an adsorption amount of 100 to 250 mg / ml can be obtained with respect to lysozyme, and a chromatographic packing useful for separation and purification of lysozyme can be provided.
  • the “adsorption amount of lysozyme” means the adsorption amount of lysozyme per volume gel measured by the measurement method shown in the examples.
  • a highly pure immunoglobulin preparation can be provided by a simple method by separating and purifying the immunoglobulin using the chromatography filler of the present invention.
  • a blood product can be provided in a simple manner by separating and purifying the blood product from plasma or the like using the chromatographic filler of some embodiments of the present invention as a chromatographic filler instead of heparin gel. can do.
  • the obtained cellulose particles were classified by a sieving operation with a wire mesh sieve having an opening of 54 ⁇ m (wire diameter 0.04 mm) and an opening of 125 ⁇ m (wire diameter 0.088 mm).
  • the average particle size of the classified cellulose particles was 100 ⁇ m, and the degree of water swelling was 16.4 ml / g for 6% cellulose particles and 9.6 ml / g for 10% cellulose particles, respectively.
  • the Kav measured using pure water as the mobile phase using 1.5 ⁇ 10 5 Da) is as follows. Water swelling degree 11.4ml / g Average particle size 100 ⁇ m Gel partition coefficient Kav 0.38 (SE-15), 0.60 (SE-5)
  • the Kav measured using pure water as the mobile phase using 1.5 ⁇ 10 5 Da) is as follows. Water swelling degree 7.1 ml / g Average particle size 100 ⁇ m Gel partition coefficient Kav 0.27 (SE-15), 0.47 (SE-5)
  • an epoxy group was introduced into the crosslinked cellulose particles by the following method.
  • dextran was added to the epoxidized crosslinked cellulose particles obtained in Reference Example 2A or 2B to obtain a porous cellulose gel, which was further sulfonated to obtain a chromatography filler.
  • Example 1 To a 500 ml separable flask, 43 g of pure water and 32.0 g of dextran 70 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000) were added and stirred until dissolved at room temperature. When dissolved, 60 g of the wet gel obtained in Reference Example 2A was added thereto and stirred at 30 ° C. for 1 hour. Next, 6.6 g of 45% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution was added to the flask, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 18 hours.
  • dextran 70 name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight of about 70,000
  • the reaction mixture was subjected to suction filtration, and the obtained wet gel was washed 5 times with 3 times the amount of pure water. After washing, the wet gel was suction filtered to remove excess water, and stored in a wet gel state.
  • the Kav obtained using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as the mobile phase was 0.30.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 50%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.06 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • the resulting gel was suction filtered to remove excess water and stored in a wet gel state. In this way, a wet gel having a sulfone group introduced as a ligand was obtained.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.17 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 146 mg / ml.
  • Example 2 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 24.8 g of dextran 70 was used.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.09 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • 1.28 g of 1,4-butanesultone was used to sulfonate the obtained gel and stored in a wet gel state.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml
  • the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 122 mg / ml.
  • Example 3 The same as Example 1 except that 17.5 g of high molecular weight dextran EH (namely sugar industry, intrinsic viscosity 0.42 dL / g, weight average molecular weight of about 178,000 to 218,000) was used instead of dextran 70 A wet gel was obtained.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.17.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 28%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.11 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 4 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 33.0 g of polymer dextran EH was used in place of dextran 70.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 5%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.34 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 5 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 10.9 g of dextran T500 (Pharmacosmos, weight average molecular weight 500 kDa, intrinsic viscosity 0.64 dL / g) was used instead of dextran 70.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.21.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 35%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 2 the gel obtained using 1.29 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.14 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 117 mg / ml.
  • Example 6 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 17.3 g of dextran T500 was used instead of dextran 70.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.17.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 28%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.22 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 7 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 24.5 g of dextran T500 was used instead of dextran 70.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.34 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • the gel obtained using 1.55 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state. At this time, the ion exchange capacity was 0.17 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 217 mg / ml.
  • Example 1 A wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 33 g of dextran 40 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.17 dL / g, weight average molecular weight of about 40,000) was used instead of dextran 70.
  • the Kav obtained by using pure polyethylene oxide (made by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.42.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 70%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 2 the gel obtained using 1.29 g of 1,4-butane sultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 101 mg / ml.
  • a wet gel was obtained in the same manner as in Example 1 except that 17.5 g of dextran 70 (name sugar industry, intrinsic viscosity 0.23 dL / g, weight average molecular weight about 70,000) was used.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.43.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose obtained in Reference Example 1 (A) to Kav was 72%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.04 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • the gel obtained using 1.23 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml
  • the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 70 mg / ml.
  • ⁇ Comparative Example 3> Wet gel in the same manner as in Example 1 except that 11.0 g of high molecular weight dextran EH (namely sugar industry, intrinsic viscosity 0.42 dL / g, weight average molecular weight about 200,000) was used instead of dextran 70 Got.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.32.
  • the ratio of the crosslinked 6% cellulose of Reference Example 1 to Kav was 53%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.05 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • Example 2 the gel obtained using 1.26 g of 1,4-butanesultone was sulfonated and stored in a wet gel state.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.12 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 76 mg / ml.
  • ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity, Kav, change in dry weight before and after dextran addition, ion exchange capacity, and average particle size were measured according to the following measurement methods 1-5. Asked.
  • the column was connected to the system and equilibrated with a buffer at a flow rate of 1 ml / min until the UV (ultraviolet light absorbance, 280 nm) and electric conductivity of the column effluent were constant. Thereafter, the baseline UV was reduced to zero.
  • the antibody solution was allowed to flow from the bypass line, and the flow path to the column was replaced with the antibody solution.
  • the line was switched from the bypass line to the column, and the antibody solution was allowed to flow through the column at a flow rate of 1 ml / min.
  • the UV of the column effluent was monitored, and the flow of the antibody solution was stopped when the UV of the column effluent reached 10% of the previously measured UV of the antibody solution.
  • a pressure gauge was connected in the middle of the liquid feed line to monitor the pressure. The flow rate was increased until the pressure reached 0.3 MPa, and then filling was performed while flowing ultrapure water for 30 minutes. After filling, the pump was stopped and the adapter and reservoir lid were removed. Next, the ultrapure water in the reservoir was pipetted out. The reservoir was removed and the end fitting was connected except for the gel protruding from the column.
  • the method for obtaining the gel distribution coefficient Kav of the porous cellulose particles is the same as the method for the porous cellulose gel.
  • Kav measuring device System SCL-10APVP (SHIMAZU) Workstation: CLASS-VP (SHIMAZU) RI detector: RID-10A (SHIMAZU) Pump: LC-10AT (SHIMAZU) Autoinjector: SIL-10ADVP (SHIMAZU)
  • Kav (Ve ⁇ V 0 ) / (Vt ⁇ V 0 ) [In the formula, Ve is a sample holding capacity (ml), Vt is an empty column volume (ml), and V 0 is a dextran T2000 holding capacity (ml). ]
  • Dry weight per unit volume (g / ml) Dry weight of gel (g) ⁇ Gel volume (ml) Similarly, the dry weight (g / ml) per unit volume is determined for the wet gel after the dextran addition reaction, and the change in the dry weight relative to the dry weight per unit volume of the crosslinked cellulose particles is calculated.
  • Example 8 Example of 10% cross-linked gel Wet gel in the same manner as in Example 1 except that the cross-linked 10% cellulose particles obtained in Reference Example 2B were used in place of the cross-linked 6% cellulose particles and 54 g of dextran 70 was used. Got. The amount of dextran added at this time was 16.3 mg / ml.
  • the Kav obtained by using standard polyethylene oxide (manufactured by Tosoh Corporation) SE-5 (weight average molecular weight 4.3 ⁇ 10 4 ) using pure water as a mobile phase was 0.24.
  • the ratio of the crosslinked 10% cellulose obtained in Reference Example 1 (B) to Kav was 51%.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.10 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 10% cellulose particles.
  • Example 9 To a 500 ml separable flask, 40 g of pure water and 24 g of pullulan (manufactured by Hayashibara Co., Ltd., cosmetic pullulan, intrinsic viscosity 0.73 dL / g) were added and stirred until dissolved at room temperature. When dissolved, 60 g of the wet gel obtained in Reference Example 2A was added thereto and stirred at 30 ° C. for 1 hour. Next, 6.4 g of 45% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution was added to the flask, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 18 hours.
  • pullulan manufactured by Hayashibara Co., Ltd., cosmetic pullulan, intrinsic viscosity 0.73 dL / g
  • the reaction mixture was subjected to suction filtration, and the obtained wet gel was washed 5 times with 3 times the amount of pure water. After washing, the wet gel was suction filtered to remove excess water, and stored in a wet gel state.
  • the dry weight per unit volume of the obtained wet gel was 1.24 times the dry weight per unit volume of the crosslinked 6% cellulose particles.
  • the resulting gel was suction filtered to remove excess water and stored in a wet gel state. In this way, a wet gel having a sulfone group introduced as a ligand was obtained.
  • the ion exchange capacity at this time was 0.13 mmol / ml, and the ⁇ -globulin 10% dynamic adsorption capacity was 178 mg / ml.
  • Example 10-1 Ligand introduction of sulfate ester 300 g of methanol was added to 100 g of wet gel obtained by reacting with polymer dextran EH in the same manner as described in Example 4 and stirred at room temperature for 10 minutes, followed by suction filtration. This operation was repeated 5 times to obtain a methanol-substituted gel. The gel was vacuum dried at 50-60 ° C. until the water content was 2.5% (w / w). In a 500 ml separable flask, 200 g of pyridine was stirred and cooled to 10 ° C. or lower, and 4 g of chlorosulfonic acid was added dropwise under a nitrogen atmosphere.
  • the mixture was reacted at 10 ° C. or lower for 1 hour and then heated to 65 ° C. After reaching 65 ° C., 30 g of the dried gel was added and allowed to react for 4 hours with stirring. After completion of the reaction, the mixture was left overnight at 25 ° C., and then neutralized by adding 20% w / w NaOH. The reaction mixture was filtered to recover the gel and washed with pure water until neutral, to obtain a wet gel having sulfate ester groups as ligands.
  • Example 10-2 The adsorption amount of lysozyme measured according to the following measurement method 6 of the wet gel of Example 10-1 was 97 mg per 1 ml of gel. Further, the degree of sulfation (sulfur content) of this gel determined according to the following measurement method 7 was 22200 ppm.
  • the porous cellulose gel to which dextran of this example is added can also be used as a packing material for chromatography using a sulfate as a ligand, for example. Since the gel of this example is a ligand in which dextran is sulfated, it can also be used as a packing material for chromatography instead of heparin gel.
  • Blank values .SO 4 standard solution was a value at the same operation without adding the dried sample (Kanto A 2 ⁇ g / ml solution was used as a standard solution for this measurement method from Anion mixed standard solution IV) manufactured by Kagaku Co., Ltd., and further diluted in stages and analyzed with an ion chromatograph analyzer under the same conditions to prepare a calibration curve. It calculated
  • Sulfur content (ppm) (X sample-X blank) x 25 x 2.5 x 0.3333 / 0.05 (sample amount g)
  • X sample and X blank are concentrations (ppm) determined from a calibration curve using SO 4 standard solution.
  • the chromatographic packing material of the present invention is useful as a packing material for separation and purification of a target substance in various fields because it has excellent flow rate characteristics and adsorption characteristics for the target substance.
  • the chromatographic packing material according to a preferred embodiment of the present invention is particularly suitable for the separation and purification of antibody drugs because of its particularly excellent ability to adsorb immunoglobulins.

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Abstract

　流速特性と吸着特性がともに改善されたクロマトグラフィー用充填剤を提供する。特に抗体医薬製造における免疫グロブリンの分離精製に適したクロマトグラフィー用充填剤を提供する。多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍である多孔性セルロース系ゲルを用いる。多孔性セルロース粒子に所定の極限粘度を有する多糖類を所定量付加することによって、流速特性と吸着特性を改善することができる。

Description

免疫グロブリン精製用セルロース系ゲル
　本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、特に抗体医薬に利用できる免疫グロブリン、血液製剤用バイオ医薬などタンパク質製剤などの分離精製に適した陽イオン交換型クロマトグラフィー用充填剤の製造と使用に関する。
　近年、抗体医薬に代表されるタンパク質製剤は、大量発酵及び高力価発酵により生産性が向上している。それに伴い精製工程も効率化が求められている。特に、精製に使用されるクロマトグラフィー用充填剤の高流速化と高吸着化は、コスト削減にもつながるために、改善が望まれている。
　高流速化を実現するために、ベースゲルを架橋して強度を上げる手法で製造されたクロマトグラフィー用充填剤が開発されている。さらに、これらの架橋ゲルに、デキストランなどの親水性高分子を組み合わせることで、吸着性が向上することが知られており、このような親水性高分子を導入した多孔性基材が、クロマトグラフィー用充填剤の開発領域において注目されている。
　例えば、非特許文献１（Journal of Chromatography A,679 (1994) 11-22）では、ポリスチレン－シリカからなるコア粒子にイオン交換基が付加してなる、デキストラン由来のハイドロゲルからなるイオン交換吸着剤（Biosepra社（フランス）より「S　HyperD（商標）」として市販されている）を用いることで、タンパク質の吸着性能が向上することが報告されている。
　また、特許文献１（特開２００８－５２８９６６号公報）では、メタクリレートポリマー粒子にポリエチレンイミンが付加してなるクロマトグラフィー用充填剤を用いることで、タンパク質の吸着特性が増強したことが報告されている。
　さらに、特許文献２（特開２００８－２３２７６４号公報）では、多孔性メタクリレート粒子に分子量５０万のプルランを固定化したゲルに、２－ブロモエタンスルホンを用いてリガンドを導入することで、良好な流速特性を示す強カチオンイオン交換型クロマトグラフィー用マトリクスが得られたことが記載されている。ここでは、ヒト免疫グロブリンの吸着容量１６０ｍｇ／ｍｌを達成したことが報告されている。
　また、非特許文献２（Journal of Chromatography A,1146 (2007) 202-215）では、アガロースからなるコア粒子にデキストランを用いて表面修飾を施したときの効果について報告されている。これによれば、デキストランを用いてコア粒子の表面を修飾することで、目的とするタンパク質の担体内における拡散性が向上するため、対象物の物質移動が増大するとされている。そして、このような設計のクロマトグラフィー用充填剤の例として、ＧＥヘルスケアサイエンス社から「SP Sepharose（商標）XL」が市販されている。
　さらに、特許文献３（国際公開第２００７－０２７１３９号パンフレット）では、抗体医薬製造用に利用できる陽イオン交換型クロマトグラフィー用ゲルマトリクスの例として、架橋アガロースゲルに分子量４０ｋＤａのデキストランが共有結合してなる粒子に、ビニルスルホン酸を用いてイオン交換基を導入することで、１４３ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン（ＩｇＧ）吸着性能を持つゲルが得られたことが報告されている。
　上記のように、ベースゲルに親水性高分子を付加させることにより、吸着性能が向上することが報告されている。しかし、特に、抗体医薬の製造分野では、製造の大容量化及び高力価化が鋭意実践されており、そのため精製基材に対しても高流速と動的吸着特性の更なる改善が強く望まれている。
　クロマトグラフィー用充填剤として代表的なシリカを基材とする充填剤は高流速性に優れている。しかし、アルカリ条件下において材質が不安定であるため、一般的なアルカリ洗浄性に対して不利となる。
　一方、多糖類を基材とするクロマトグラフィー用充填剤はアルカリ耐性が強い。また、多糖類を基材とするクロマトグラフィー用充填剤は、タンパク質サイズの分離精製に好適な多孔性を有しており、タンパク質又はワクチン製剤の分離精製用として有望である。
　代表的な多糖類であるセルロースとアガロースとでは、セルロースの方が水素結合のネットワークが強固なため、クロマトグラフィー用充填剤に求められている高流速化には有利である。しかし、これまで、セルロースを基材とし、タンパク質製剤、特に抗体医薬のための免疫グロブリンの分離精製に好適な流速特性と吸着特性を実現した例はない。
特開２００８－５２８９６６号公報 特開２００８－２３２７６４号公報 国際公開第２００７－０２７１３９号パンフレット
Journal of Chromatography A,679 (1994) 11-22 Journal of Chromatography A,1146 (2007) 202-215
　上記のような状況の中で、流速特性と吸着特性がともに改善されたクロマトグラフィー用充填剤の提供が求められている。特に、抗体医薬製造における免疫グロブリンの分離精製に適したクロマトグラフィー用充填剤、またはヘパリンゲル代替のクロマトグラフィー用充填剤の提供が望まれている。
　本発明者らは、鋭意努力の結果、多孔性セルロース粒子に多糖類が所定量付加してなるベースゲルに陽イオン交換基を導入することで、所望の流速特性を示すとともに、これまでにない高い値の吸着特性を示すクロマトグラフィー用充填剤を得ることに成功した。さらに、その過程で、高い極限粘度の多糖類を用いることにより、より簡易な方法でクロマトグラフィー用充填剤を製造できることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下に示したとおりの多孔性セルロース系ゲル、クロマトグラフィー用充填剤及びそれらの製造方法ならびに用途等を提供するものである。
［１］多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍であることを特徴とする多孔性セルロース系ゲル。
［２］前記多孔性セルロース粒子は、粒子径３０～２００μｍを有し、且つ、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のＫａｖで表されるゲル分配係数０．１５～０．６を有するものである、［１］記載の多孔性セルロース系ゲル。
［３］前記多糖類はデキストランである、［１］又は［２］記載の多孔性セルロース系ゲル。
［４］前記多糖類はプルランである、[１]又は[２]記載の多孔性セルロース系ゲル。
［５］前記多孔性セルロース粒子は、水膨潤度５～２０ｍｌ／ｇを有する架橋セルロース粒子である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の多孔性セルロース系ゲル。
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の多孔性セルロース系ゲルにリガンドが付加してなる、クロマトグラフィー用充填剤。
［７］前記リガンドはスルホン基である、［６］記載の充填剤。
［８］前記リガンドの導入量は、イオン交換容量で０．１３～０．３０ｍｍｏｌ／ｍｌである、［７］記載の充填剤。
［９］前記リガンドは硫酸エステル基である、［６］記載の充填剤。
［１０］前記リガンドの導入量は、硫黄含量で５０００～６００００ｐｐｍである、［９］記載の充填剤。
［１１］免疫グロブリン精製用である、［６］～［８］のいずれか１項に記載の充填剤。
［１２］免疫グロブリンの吸着量が１５０～２５０ｍｇ／ｍｌである、［１１］記載の充填剤。
［１３］免疫グロブリンの吸着量が１９０～２５０ｍｇ／ｍｌである、［１２］記載の充填剤。
［１３ａ］血液製剤の製造用である、［９］または［１０］記載の充填剤。
［１３ｂ］免疫グロブリン精製用である、［９］または［１０］記載の充填剤。
［１４］多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍である多孔性セルロース系ゲルに、リガンドを付加する工程を含む、クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１５］前記多孔性セルロース粒子は、粒子径３０～２００μｍを有し、且つ、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のＫａｖで表されるゲル分配係数０．１５～０．６を有するものである、［１４］記載の方法。
［１６］前記多糖類がデキストランである、［１４］又は［１５］記載の方法。
［１７］前記多糖類がプルランである、［１４］又は［１５］記載の方法。
［１８］［６］～[８]及び[１１]～［１３］のいずれか１項に記載の充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
［１８ａ］［９］又は［１０］記載の充填剤を用いて血液製剤を分離精製する工程を含む、血液製剤の製造方法。
［１８ｂ］［９］又は［１０］記載の充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
　なお、本明細書において、「多孔性セルロース系ゲル」とは、クロマトグラフィー用の分離剤であって、多孔性セルロース粒子に多糖類が付加してなる多孔性粒子が、その内部に溶媒を含んで、あるいは溶媒を吸収して、膨潤した状態のものをいう。
　本発明の好ましい態様によれば、流速特性と吸着特性がともに改善されたクロマトグラフィー用充填剤及びそれに好適に用いられる基材を提供することができる。
　本発明の好ましい態様によれば、多孔性セルロース粒子に付加させる多糖類として所定の極限粘度を有するデキストランを用いることで、リガンドを効率よく導入することができ、簡便な方法で目的物質に対する吸着性能を高めることができる。
　また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロース系ゲルにリガンドとして十分量のスルホン基を導入することで、抗体医薬分野における免疫グロブリンの分離精製に利用可能な陽イオン交換型クロマトグラフィー用ゲルを提供することができる。本発明の好ましい態様によれば、免疫グロブリンの吸着性能を大幅に向上させることができる。
実施例及び比較例で得られた湿ゲルの一例の分配係数Ｋａｖをプロットしたグラフである。
　以下、本発明の多孔性セルロース系ゲル、クロマトグラフィー用充填剤及びそれらの製造方法ならびに用途等について詳細に説明する。
　１．多孔性セルロース系ゲル
　まず、本発明の多孔性セルロース系ゲルについて説明する。
　本発明の多孔性セルロース系ゲルは、多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなるものであって、単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍であることを特徴とする。
　本発明の多孔性セルロース系ゲルは、多孔性セルロース粒子に所定の極限粘度を有する多糖類が所定量付加してなるものであり、エピクロロヒドリンなどの架橋剤によってセルロース分子間が架橋された多孔性セルロース粒子の表面又は細孔内部を、所定の極限粘度を有する多糖類で修飾することによって、クロマトグラフィー用充填剤に用いたときに高い流速特性を確保するとともに、リガンドを効率よく導入することができるために高い吸着特性を付与することを可能にする。また、本発明では、所定の極限粘度を有する多糖類を用いることで、簡易な方法で所望量の多糖類を多孔性セルロースに付加させることができる。
　本発明に用いる多孔性セルロース粒子は、粒子径３０～２００μｍを有するものが好ましく、粒子径５０～１５０μｍを有するものが特に好ましい。所望の粒子径は、例えば、ＪＩＳ標準ふるいなどを用いての分級操作により、調整することができる。特に、目開き５４μｍ（線径０．０４ｍｍ）と目開き１２５μｍ（線径０．０８８ｍｍ）でふるったものが、本発明の粒子径を得るのに好適である。
　また、本発明に用いる多孔性セルロース粒子の平均粒子径は、８０～１２０μｍが好ましく、９０～１１０μｍがより好ましい。多孔性セルロース粒子の平均粒子径は、走査電子顕微鏡又は光学顕微鏡を用いて撮影した任意の数のセルロース粒子写真を実測定し、その平均を求めることで算出できる。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
　なお、本発明に用いる多孔性セルロース粒子の真球度（短径／長径）は特に制限されないが、０．８～１．０の球状の形態を有するものが好ましい。
　多孔性セルロース粒子に多糖類を所定量付加させ、最終的に所望とするタンパク質を吸着し回収するために、適度の細孔サイズを持つことが好ましく、本発明に用いる多孔性セルロース粒子は、多孔性の指標として、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの市販の標準ポリエチレンオキシドで、純水を移動相として使用した時のＫａｖで表されるゲル分配係数０．１５～０．６を有するものが好ましい。該ゲル分配係数は、０．２０～０．５５がより好ましく、０．２５～０．５０がさらに好ましい。重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドとしては、例えば、東ソー社製の標準ポリエチレンオキシド「ＳＥ－５」が好ましく挙げられる。
　本発明において、ゲル分配係数Ｋａｖは、分子量の標準物質の溶出体積及びカラム体積の関係から次式により求めることができる。
　　　Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／  （Ｖｔ－Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍｌ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍｌ）、Ｖ０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍｌ）である。］
　ゲル分配係数Ｋａｖの測定方法は、例えば、L.Fischer著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）などに記載されている。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
　本発明の多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、後述の参考例1に記したセルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御により調整できる。結晶セルロース　セオラスＰＨ１０１（商品名、旭化成ケミカルズ株式会社製）を使用した場合、その濃度を好ましくは４～６％（W/W）に調整することで本発明の多孔性セルロース粒子に好適なゲル分配係数Ｋａｖを得ることができる。さらに、多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、セルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御によっても制御可能である。好ましくは、後述の参考例1に記載の架橋方法・架橋条件に制御することにより本発明の多孔性セルロース粒子に好適なゲル分配係数Ｋａｖを得ることができる。当然ながら、セルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御とセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御とを組み合わせた方法を利用してもかまわない。
　本発明に用いる多孔性セルロース粒子は、架橋セルロース粒子であっても、未架橋セルロース粒子であってもよいが、本発明の多孔性セルロース系ゲルを基材としてクロマトグラフィー用充填剤を製造したときに、より高い流速特性が得られることから、架橋セルロース粒子を用いることが好ましい。
　架橋セルロース粒子は未架橋セルロース粒子を架橋することにより得ることができる。架橋は、それぞれのセルロース粒子内に三次元的な網目構造を形成したセルロース分子の遊離ヒドロキシル基と架橋剤の官能基との間で行われる。
　架橋セルロース粒子の製造方法は、特に制限されないが、未架橋セルロース粒子を溶媒中に分散させた懸濁液に架橋剤を反応させることで製造することができる。
　溶媒は、未架橋セルロース粒子を分散できるものであれば特に制限されなく、水、アルコールやケトン、エーテル、芳香族炭化水素などの有機溶媒、または水と有機溶媒との混合物のいずれを用いてもよい。これらの溶媒の中でも水溶性溶媒が好ましく、特に水が好ましい。また、架橋反応の効率を上げるために、懸濁液には安価な硫酸ナトリウムなどの無機塩を共存させてもかまわない。
　架橋剤は、多官能のものであれば特に制限されず、本発明においては二官能のものが好ましく用いられる。本発明に用いる架橋剤は、セルロースとの結合が化学的に安定であり、反応の際に望ましくない吸着作用を生じうる荷電した基が導入されないことから、エピクロロヒドリン、ポリエチレングリコール又はソルビトールの水酸基をグリシジルエーテル化したエポキシ化合物などが好ましい例として挙げられる。これらの架橋剤は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの中でも、本発明においては、結合がより強固となるエピクロロヒドリンを用いることが好ましい。
　なお、溶媒として水を用いる場合は、アルカリの存在下で架橋反応を行うことが好ましく、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。中でも、アルカリ金属の水酸化物は溶解性が良好であることから、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
　架橋セルロース粒子の製造方法として、より具体的には、例えば、特公昭４３－１００５９号公報、特表２０００－５０８３６１号公報及び特開昭６０－３９５５８号公報などに記載された方法を用いることができる。特に、本発明に好適な多孔性を維持しながら優れた流速特性を有する架橋セルロース粒子を得ることができることから、本参考例１に記載された方法を用いることが好ましい。すなわち、未架橋セルロース粒子を水に分散させた懸濁液に、セルロースモノマーのモル数に対し４～１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数に対し０．１～２倍量のＮａＯＨとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程からなる方法にて製造することが好ましい。
　本発明に用いる多孔性セルロース粒子の水膨潤度は５～２０ｍｌ／ｇが好ましく、特に６～１３ｍｌ／ｇが好ましい。
　本発明において多孔性セルロース粒子の水膨潤度は、容積／固形分重量（ｍｌ／ｇ）で定義され、水で膨潤したゲルをメスシリンダーに入れて、その容積が一定になるまで時々振動を与えながら放置した後、容積を測定し、次いで、メスシリンダーからゲルを取り出して、ゲルの全量を乾燥させて多孔性セルロース粒子の乾燥重量を測定し、得られた測定値を用いて次式から求めることができる。
　　水膨潤度（ｍｌ／ｇ）＝　ゲルの容積（ｍｌ）÷　ゲルの乾燥重量（ｇ）
　本発明の多孔性セルロース粒子の水膨潤度は、例えば、後述の参考例1に記したセルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御により調整できる。結晶セルロース　セオラスＰＨ１０１（商品名、旭化成ケミカルズ株式会社製）を使用した場合、その濃度を好ましくは４～６％(w/w)に調整することで本発明の多孔性セルロース粒子に好適な水膨潤度を得ることができる。さらに、多孔性セルロース粒子の水膨潤度はセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御によっても制御可能である。好ましくは、後述の参考例1に記載の架橋方法・架橋条件に制御することにより本発明の多孔性セルロース粒子に好適な水膨潤度を得ることができる。当然ながら、セルロース粒子製造時のセルロース溶解濃度の制御とセルロース粒子の架橋方法・架橋条件の制御とを組み合わせた方法を利用してもかまわない。
　本発明において多孔性セルロース粒子に付加させる多糖類は、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有するものを用いる。本発明に用いる多糖類が上記極限粘度を有していると、所望量の多糖類を多孔性セルロース粒子に付加させることができる。これにより、クロマトグラフィー用充填剤を製造する際にリガンドを効率的に導入することが可能になり目的物質に対する吸着特性を高めることができる。また、多糖類が上記極限粘度のものを用いると、反応操作にも負荷がかからないといった利点もある。本発明の好ましい態様に用いる多糖類の極限粘度の範囲は、例えば０．２１～０．９０ｄＬ／ｇであり、０．２１～０．８０ｄＬ／ｇまたは０．２１～０．７０ｄＬ／ｇであってもよく、さらに、０．２１～０．６４ｄＬ／ｇであってもよい。
　多糖類の極限粘度は、例えば、市販のものの中から適当な極限粘度を有する多糖類を選択することにより調整するようにしてもよいし、あるいは、公知の方法、例えば、適当な極限粘度の多糖類を生産する微生物を選択し、その微生物から多糖類を得ること、多糖類を生産する微生物の培養条件を変更し、その培養条件で生成された多糖類を得ることなどにより調整するようにしてもよい。
　本発明において、多糖類の極限粘度は、日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」にしたがって、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めることができる。
　なお、デキストランの極限粘度は、重量平均分子量と下記の関係式を満たすことが知られていることから、デキストランの極限粘度を、重量平均分子量から求めることもできる。
　　　極限粘度（η）＝９×１０－４×重量平均分子量（Ｍｗ）０．５
　重量平均分子量を目安にする場合、本発明に用いる多糖類の重量平均分子量は、６０ｋＤａ以上がより好ましく、７０ｋＤａ以上がさらに好ましい。また、多糖類の重量平均分子量は、５００ｋＤａ以下がより好ましく、３００ｋＤａ以下がさらに好ましい。
　本発明に用いる多糖類の具体例としては、反応の際に望ましくない非特異的な吸着作用を生じさせないよう荷電した基をもたず、多孔性セルロース粒子に結合させることができ、かつ、その後にリガンドの導入が可能となるための反応性官能基（好ましくは、水酸基）をもつものであれば特に制限されない。例えば、アガロース、デキストラン、プルラン、デンプン及びそれらの誘導体が挙げられる。これらの中でも、水溶性で反応操作性の点で有利であり、安価に入手できるデキストランを用いることが好ましい。本発明の別の好ましい態様で用いる多糖類は、プルランである。
　本発明において、多孔性セルロース粒子に付加する多糖類の量は、多糖類付加前後の単位体積あたり乾燥重量の変化量で表される。すなわち、本発明では、多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍であることが好ましい。この比は多糖類の粘度により好適な範囲があるが、概ね、１．１０倍以上がより好ましく、１．１５倍以上がさらに好ましく、１．２０倍以上が特に好ましい。多糖類の付加量が上記範囲であると、本発明の多孔性セルロース系ゲルを用いてクロマトグラフィー用充填剤を製造するときにリガンドを効率よく導入することができ、目的物質の吸着特性を高めることができる。
　多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量及び多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量は、次のようにして求めることができる。
　まず、多孔性セルロース系ゲル１０．０ｇを５０ｍｌ栓付メスシリンダーに加え、さらに純水を５０ｍｌの線まで加え、栓をして体積が変わらなくなるまで静置する。体積が変わらなくなったらゲルの体積をメスシリンダーの目盛りから読み取る。
　次いで、メスシリンダーからゲルを取り出して、ゲルの全量を乾燥させた後、乾燥ゲルの重量を測定する。
　各測定値を用いて、下記の式にしたがって、多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量を求めることができる。
　単位体積あたりの乾燥重量（ｇ／ｍｌ）＝ゲルの乾燥重量（ｇ）÷ゲルの体積（ｍｌ）
　多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量も、上記と同様にして求めることができる。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
　多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量及び多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量は、例えば、使用する多糖類の分子量を選択することや多孔性セルロース粒子への付加量を制御することなどで調整できる。
　本発明において多孔性セルロース粒子に多糖類を付加させる方法は、多糖類を多孔性セルロース粒子に化学的な共有結合によって結合させることができるものであれば特に制限されない。例えば、溶媒中、アルカリの存在下、多孔性セルロース粒子を架橋剤と反応させ、次いで、得られた反応生成物を多糖類と反応させることにより、多孔性セルロース粒子に多糖類を付加させることができる。反応に用いる架橋剤は、二官能または多官能のものであれば特に制限されなく、多孔性セルロース粒子の架橋に用いられるものと同様のものを例示することができる。特にエピクロロヒドリンを用いることが好ましい。反応に用いるアルカリは、多孔性セルロース粒子の架橋に用いられるものと同様のものを例示することができる。反応に用いる溶媒は、多孔性セルロース粒子を分散できるものであれば特に制限されない。例えば、多孔性セルロース粒子の架橋に用いたものと同じものを例示することができる。これらの中でも特に水が好ましい。なお、反応効率を上げるために反応混合物中に硫酸ナトリウムなどの無機塩を共存させてもよい。
　多孔性セルロース粒子に多糖類を付加させる方法としては、特開昭６０－７７７６９号公報に記載された方法を用いてもよい。すなわち、架橋セルロース粒子にエピクロロヒドリンを反応させてエポキシ基を導入し、これにデキストラン硫酸又はその塩を反応させることにより、架橋セルロース粒子にデキストランを付加させることができる。この方法によれば、未反応のデキストラン硫酸又はその塩を回収して再利用できるという利点がある。
　上記のように多孔性セルロース粒子に所定の極限粘度を有する多糖類を付加させて本発明の多孔性セルロース系ゲルを得ることができる。こうして得られた本発明の多孔性セルロース系ゲルにリガンドを付加することにより、所望の流速特性を付与できるとともに、目的物質の吸着特性に優れたクロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。
　２．クロマトグラフィー用充填剤
　次に、本発明のクロマトグラフィー用充填剤について述べる。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、前述した本発明の多孔性セルロース系ゲル中に存在する反応性官能基の少なくとも一部にリガンドが付加してなるものである。多孔性セルロース粒子に所定の極限粘度を有する多糖類が所定量付加してなる本発明の多孔性セルロース系ゲルは、流速特性が優れている上に、リガンドを効率よく導入することができるため、これにリガンドが付加してなる本発明のクロマトグラフィー用充填剤は流速特性及び吸着特性に優れている。
　リガンドの種類及び導入量に応じて目的の化合物に対する親和性が付与されるため、リガンドの種類及び導入量は、用途等に応じて適宜選択すればよい。リガンドの種類としては、イオン交換基、疎水基、アフィニティー基などがあり、具体的には、ジエチルアミノ、アミノエチル、カルボキシメチル、スルホンエチル、スルホン、フェニル、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ファニルホウ酸基、Protein　A、その他のアフィニティーを有する反応性官能基などが挙げられる。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、本発明の多孔性セルロース系ゲルの反応性官能基の少なくとも一部にリガンドを付加することによって、容易に得ることができる。
　例えば、本発明の多孔性セルロース系ゲルが有する反応性官能基（例えば水酸基など）の少なくとも一部にスルホン基を導入することにより、リゾチーム及び免疫グロブリンなどのタンパク質の分離精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。あるいは、本発明の多孔性セルロース系ゲルが有する反応性官能基（例えば水酸基など）の少なくとも一部に硫酸エステル基を導入することにより、リゾチーム、血液凝固因子ＩＸ、免疫グロブリンなどの分離精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。
　例えば、本発明の多孔性セルロース系ゲルにスルホン基を導入する際は、次のようにして行うことができる。
　まず、反応容器にスルホン化剤を準備する。スルホン化剤としては、３－クロロー２ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム又は３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムなどのハロアルカンスルホン酸；１，４－ブタンサルトン又は１，２－エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸等が挙げられる。これらの中でも、１，４－ブタンサルトン又は１，２－エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸を用いることが好ましい。スルホン化剤の使用量は、目的とするスルホン基の導入率及び反応条件によって任意に選択すればよく、例えば、多孔性セルロース系ゲル中の反応性官能基に対して、０．００１～１当量を用いるのが適当である。
　次に、乾燥させた多孔性セルロース系ゲルをスルホン化剤中に加えて反応させる。反応温度及び反応時間は、溶媒やスルホン化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、通常０～１００℃、好ましくは２０～８５℃で、好ましくは０．５～２４時間、より好ましくは０．５～１０時間行う。
　反応終了後、反応混合物にアルカリ水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和してもよい。
　その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的物質を得ることができる。スルホン基の導入量は、スルホン化剤の使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。具体的には、スルホン化剤の使用量を増やすことによって、スルホン基の導入量を増やすことができる。
　スルホン基の導入方法の詳細は、特開２００１－３０２７０２号公報及び特開平９－２３５３０１号公報などを参照することができる。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤におけるリガンドの導入量は特に制限されないが、所望の吸着特性が得られることから、イオン交換容量で０．１３～０．３０ｍｍｏｌ／ｍｌであることが好ましく、０．１５ｍｍｏｌ／ｍｌ以上が特に好ましい。また、０．２０ｍｍｏｌ／ｍｌ以下が特に好ましい。なお、本明細書において「イオン交換容量」とは、体積ゲルあたりのリガンドモル量を意味する。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
　また、本発明の多孔性セルロース系ゲルに硫酸エステル基を導入する際は、次のようにして行うことができる。
　本発明の多孔性セルロース系ゲルへの硫酸エステル基の導入は、例えば、米国特許第４，４８０，０９１号パンフレットや特開２００６－２７４２４５号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で硫酸化剤にクロロスルホン酸を作用させる方法が利用できる。その際の硫酸化剤の使用量は、目的とする粒子の硫黄含量により異なるが、セルロースゲルと硫酸化剤の重量比（セルロースゲル：硫酸化剤）は、１００：１０～１００：１００、好ましくは１００：１０～１００：５０の範囲であるのが適当である。反応は、溶媒、硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、０～１００℃、好ましくは２０～８５℃にて、０．５～２４時間、好ましくは０．５～１０時間行う。
　その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的物質を得ることができる。硫酸エステル基の導入量は、上述の通り硫酸化剤の仕込み量などによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。具体的には、セルロースゲルに対する硫酸化剤の重量比率をあげることによって、硫酸エステル基の導入量を増やすことができる。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤における硫酸エステル基の導入量は特に制限されないが、所望の吸着特性が得られることから、硫黄含量で５０００～６００００ｐｐｍであることが好ましく、１００００ｐｐｍ以上が特に好ましい。また、５００００ｐｐｍ以下が特に好ましい。なお、本明細書において「硫黄含量」とは、多孔性セルロースゲルの全乾燥重量に占める硫黄重量分の割合を意味する。具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤は特に免疫グロブリンの分離精製に好適に用いられる。本発明の多孔性セルロース系ゲルを用いることにより、所望量のスルホン基を効率よく導入することができるので、免疫グロブリンに対する親和性を付与することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のクロマトグラフィー用充填剤における免疫グロブリンの吸着量は１１０～２５０ｍｇ／ｍｌである。さらに、本発明の好ましい態様によれば、スルホン基の導入量を適宜調整することで、免疫グロブリンに対して１５０～２５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１９０～２５０ｍｇ／ｍｌの吸着量を得ることもでき、免疫グロブリンの分離精製に有用なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。なお、本明細書において「免疫グロブリンの吸着量」とは、実施例にて示した測定方法によって測定された体積ゲルあたりの免疫グロブリンの吸着量を意味する。
　リガンドが硫酸エステル基である本発明のいくつかの態様のクロマトグラフィー用充填剤は、ヘパリンゲル代替のクロマトグラフィー用充填剤として好適に利用することができる。本態様のクロマトグラフィー用充填剤は、リゾチームなどの種々のタンパク質の分離精製に好適に用いることができる。好ましくは、本態様のクロマトグラフィー用充填剤におけるリゾチームの吸着量は、５０～２５０ｍｇ／ｍｌである。さらに、硫酸エステルの導入量を適宜調整することで、リゾチームに対して１００～２５０ｍｇ／ｍｌの吸着量を得ることもでき、リゾチームの分離精製に有用なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。なお、本明細書において「リゾチームの吸着量」とは、実施例にて示した測定方法によって測定された体積ゲルあたりのリゾチームの吸着量を意味する。
　さらには、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製することにより、簡便な方法で高純度の免疫グロブリン製剤を提供することができる。
　あるいは、本発明のいくつかの態様のクロマトグラフィー用充填剤を、ヘパリンゲル代替のクロマトグラフィー用充填剤として用いて、血漿中などから血液製剤を分離精製することにより、簡便な方法で血液製剤を提供することができる。
　尚、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009－37651号（2009年2月20日出願）および特願2009－260183号（2009年11月13日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに制限されるものではない。
＜参考例１＞
　架橋セルロース粒子の調製
　Journal of Chromatography,195(1980)、221-230、特開昭５５－４４３１２号公報に記載された方法にしたがい、下記のようにしてチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に溶解させるセルロース濃度を６％（ｗ／ｗ）又は１０％（ｗ／ｗ）とするセルロース粒子を製造した。
（Ａ）６％球状セルロース粒子の製造
（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０～１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１３０～１４０℃に予め加熱したｏ－ジクロロベンゼン４８０ｍｌ中に滴下し、２００～３００ｒｐｍにて攪拌分散した。
（３）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９０ｍｌ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９０ｍｌにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）さらに大量の水で洗浄した後、目的とする球状セルロース粒子を得た。
（６）次いで、球状セルロース粒子をふるいにかけて、所望の粒子サイズ間隔（５０～１５０μｍ、平均粒子径１００μｍ）にした。
（Ｂ）１０％球状セルロース粒子の製造
　６．４ｇの結晶性セルロースを１０．０ｇの結晶性セルロースを用いたことを除いて、上記６％球状セルロース粒子の製造と同様にして１０％球状セルロース粒子を得た。
　次に、得られたセルロース粒子を、目開き５４μｍ（線径０．０４ｍｍ）と目開き１２５μｍ（線径０．０８８ｍｍ）の金網篩による篩操作で分級した。
　分級後のセルロース粒子の平均粒子径は１００μｍであり、水膨潤度は、それぞれ、６％セルロース粒子で１６．４ｍｌ/ｇ、１０％セルロース粒子で９．６ｍｌ／ｇであった。
　次いで、得られたセルロース粒子を下記の方法にしたがって架橋した。
（Ａ）架橋６％セルロース粒子の調製
（１）上記で得られた６％球状セルロース粒子１００ｇ（含水率１０．８）を、１２１ｇの純水に６０ｇのＮａ２ＳＯ４を溶解した液に加え、撹拌した。混合物の温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、この混合物に４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇとＮａＢＨ４０．５ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋６％セルロース粒子を得た。
　得られた架橋６％セルロース粒子の水膨潤度、平均粒子径、並びに、標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４Ｄａ）又はＳＥ－１５(重量平均分子量１．５×１０５Ｄａ)を用いて純水を移動相として測定したＫａｖは以下のとおりである。
　　　水膨潤度　　　　　　１１．４ｍｌ／ｇ
　　　平均粒子径　　　　　１００μｍ
　　　ゲル分配係数Ｋａｖ　０．３８（ＳＥ－１５）、０．６０（ＳＥ－５）
（Ｂ）架橋１０％セルロース粒子の調製
（１）上記で得られた１０％球状セルロース粒子１００ｇ（含水率６．３）を、２８２ｇの純水に１０４ｇのＮａ２ＳＯ４を溶解した液に加え、撹拌した。混合物の温度を５０℃にして２時間撹拌を継続した。
（２）次に、この混合物に４５重量％のＮａＯＨ水溶液５．７ｇとＮａＢＨ４０．９ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度［ＮａＯＨ］は０．６９％ｗ／ｗであった。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液８３ｇと、エピクロロヒドリン８５ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸４．０ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋１０％セルロース粒子を得た。
　得られた架橋１０％セルロース粒子の水膨潤度、平均粒子径、並びに、標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４Ｄａ）又はＳＥ－１５(重量平均分子量１．５×１０５Ｄａ)を用いて純水を移動相として測定したＫａｖは以下のとおりである。
　　　水膨潤度　　　　　　７．１ｍｌ／ｇ
　　　平均粒子径　　　　　１００μｍ
　　　ゲル分配係数Ｋａｖ　０．２７（ＳＥ－１５）、０．４７（ＳＥ－５）
　次に、架橋セルロース粒子に多糖類を付加させるために、下記の方法で架橋セルロース粒子にエポキシ基を導入した。
＜参考例２Ａ＞
　架橋６％セルロース粒子のエポキシ化
　１Ｌセパラブルフラスコに吸引ろ過した架橋６％セルロース粒子を２００ｇ入れた。そこへ純水１６０ｍｌを入れ、蓋をして該フラスコを３０℃の温浴へ浸した。フラスコ内の温度が３０℃になったら、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム５４ｇ、純水１３３ｇ）とエピクロロヒドリン１２０ｇとを加えて、３０℃で２時間攪拌した。
　２時間後、反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを３倍量の純水で５回洗浄した。
　洗浄後、得られたゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。
＜参考例２Ｂ＞
　架橋１０％セルロース粒子のエポキシ化
　架橋６％セルロース粒子に代えて架橋１０％セルロース粒子を用いたことを除いて、参考例２Ａと同様の手順でエポキシ化反応を行った。
　次に、参考例２Ａ又は２Ｂで得られたエポキシ化架橋セルロース粒子にデキストランを付加して多孔性セルロース系ゲルを得、さらにこれにスルホン化処理を行ってクロマトグラフィー用充填剤を得た。
＜実施例１＞
　５００ｍｌセパラブルフラスコに純水４３ｇとデキストラン７０（名糖産業、極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）３２．０ｇを加え、室温で溶解するまで攪拌した。
　溶解したらそこへ参考例２Ａで得られた湿ゲル６０ｇを加え、３０℃で１時間攪拌した。次に、該フラスコに４５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を６．６ｇ加え、そのまま３０℃で１８時間攪拌した。１８時間後反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを３倍量の純水で５回洗浄した。洗浄後、湿ゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．３０であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は５０％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６倍であった。
　さらに、５０ｍｌ栓付三角フラスコへ得られた湿ゲル５ｇを入れた。そこへ硫酸ナトリウム（和光純薬）５ｇ、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム０．９８ｇ、純水７．８ｇ）を入れ、５０℃のインキュベーターで３０分攪拌した。３０分後１、４－ブタンサルトン（和光純薬）１．４１ｇを加え、５０℃で６時間攪拌した。６時間後反応溶液を吸引ろ過し、得られたゲルを５倍量の純水で５回洗浄した。洗浄後、得られたゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。このようにして、リガンドとしてスルホン基を導入した湿ゲルを得た。この時のイオン交換容量は０．１７ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は、１４６ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例２＞
　デキストラン７０を２４．８ｇで実施したことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．３７であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は６２％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０９倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．２８ｇを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１２２ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例３＞
　デキストラン７０に代えて高分子デキストランＥＨ（名糖産業、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約１７８，０００～２１８，０００）１７．５ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．１７であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は２８％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．１１倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．３９ｇを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１５ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１２４ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例４＞
　デキストラン７０に代えて高分子デキストランＥＨ３３．０ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．０３であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は５％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．３４倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．５７ｇを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１９ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は２４１ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例５＞
　デキストラン７０に代えてデキストランＴ５００（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ、重量平均分子量５００ｋＤａ、極限粘度０．６４ｄＬ／ｇ）１０．９ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．２１であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は３５％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．１０倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．２９ｇを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１４ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１１７ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例６＞
　デキストラン７０に代えてデキストランＴ５００を１７．３ｇ用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．１７であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は２８％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．２２倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．４１ｇを用いて、得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１４ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１９９ｍｇ／ｍｌであった。
＜実施例７＞
　デキストラン７０に代えてデキストランＴ５００を２４．５ｇ用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．０２であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は３％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．３４倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．５５ｇを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１７ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は２１７ｍｇ／ｍｌであった。
＜比較例１＞
　デキストラン７０に代えてデキストラン４０（名糖産業、極限粘度０．１７ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約４０，０００）３３ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチテンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．４２であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は７０％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．１０倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１、４－ブタンスルトン１．２９ｇを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１０１ｍｇ／ｍｌであった。
＜比較例２＞
　デキストラン７０（名糖産業、極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）１７．５ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．４３であった。参考例１（Ａ）で得られた架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は７２％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０４倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．２３ｇを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は７０ｍｇ／ｍｌであった。
＜比較例３＞
　デキストラン７０に代えて高分子デキストランＥＨ（名糖産業、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約２００，０００）１１．０ｇを用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．３２であった。参考例１の架橋６％セルロースのＫａｖに対する割合は５３％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０５倍であった。
　さらに、実施例１と同様に、１，４－ブタンサルトン１．２６ｇを用いて得られたゲルをスルホン化し、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は７６ｍｇ／ｍｌであった。
　実施例１～７及び比較例１～３の結果を表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　表１に示したとおり、実施例で得られた多孔性セルロース系ゲルのγ－グロブリン吸着量は、比較例のものと比べて顕著に高い数値を示した。
　なお、上記実施例及び比較例において、γ－グロブリン１０％動的吸着容量、Ｋａｖ、デキストラン付加前後の乾燥重量の変化量、イオン交換容量及び平均粒子径は、下記の測定法１～５にしたがって求めた。
［測定法１］
　γ－グロブリンを用いた動的吸着容量の測定
（１）使用機器及び試薬
　ＬＣシステム　　：　ＢｉｏＬｏｇｉｃＬＰ（ＢＩＯＲＡＤ）
　バッファー　　　：　酢酸バッファーＰＨ４．３、０．０５ＭＮａＣｌ
　抗体　　　　　　：　γ―グロブリン、人血清由来（和光純薬）
　カラム　　　　　：　ガラスカラム内径５ｍｍ、長さ５０ｍｍ（ＥＹＥＬＡ）
（２）測定方法
　まず抗体をバッファーに溶かし１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を作製した。そしてカラムにイオン交換基を付加したゲルを隙間のないよう充填した。次にカラムをシステムに接続しバッファーを用いて、カラム流出液のＵＶ（紫外線吸光度、280nm）と電気伝導度が一定になるまで流速１ｍｌ／分で平衡化した。その後、ベースラインのＵＶをゼロにした。バイパスラインから抗体溶液を流しカラムへの流路を抗体溶液で置換した。次にバイパスラインからカラムへのラインへ切り変え、カラムに抗体溶液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで流した。カラム流出液のＵＶをモニターし、カラム流出液のＵＶが、予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に達した時点で抗体溶液を流すのを止めた。以下の式により１０％動的吸着容量を求めた。尚、この分析は２０℃の部屋で行った。
 
｛抗体溶液濃度（ｍｇ／ｍｌ）×抗体溶液を流し始めてから終えるまでの時間（ｍｉｎ）×流速（ｍｌ／ｍｉｎ）－空カラム容量｝／カラム体積＝１０％動的吸着容量（ｍｇ／ｍｌ）
［測定法２］
　多孔性セルロースゲルのゲル分配係数Ｋａｖの測定
（１）使用機器及び試薬
　カラム　　　：　エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、
　　　　　　　　　１０Ｆ（東ソー）
　リザーバー　：　パッカ・３/８（東ソー）
　ポンプ　　　：　ＰＯＭＰ　Ｐ－５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
　圧力計　　　：　ＡＰ－５３Ａ（ＫＥＹＥＮＣＥ）
（２）カラム充填法
　カラムとリザーバーを接続しカラム下部にエンドフィッティングを接続した。Ｋａｖを測定するゲルを減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇ計りとり、５０ｍｌビーカーへ入れた。そこへ超純水２０ｍｌ加え軽く攪拌した。粒子またはゲルが溶液に分散した状態でリザーバーの壁を伝わらせるようにカラムへゆっくり加えた。ビーカーへ残ったゲルは少量の超純水ですすぎゆっくりとカラムへ加えた。その後リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加えリザーバーの蓋をした。リザーバー上部へアダプターを接続しポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中に圧力計を接続しておき圧力をモニターした。圧力が０．３ＭＰａになるまで流速を上げ、その後３０分超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止めアダプターとリザーバーの蓋を外した。次にリザーバーの中の超純水をピペットで吸いだした。リザーバーを外し、カラムからはみ出したゲルを除きエンドフィッティングを接続した。
　多孔性セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖの求め方も、上記多孔性セルロースゲルの方法と同様である。
（３）Ｋａｖ測定装置
　システム　　　　　　　：　ＳＣＬ－１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ワークステーション　　：　ＣＬＡＳＳ－ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ＲＩ検出器　　　　　　：　ＲＩＤ－１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ポンプ　　　　　　　　：　ＬＣ－１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　オートインジェクター　：　ＳＩＬ－１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
（４）Ｋａｖ測定サンプル
　１．デキストランＴ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
　２．ＳＥ－７０（東ソー）分子量５．８×１０５
　３．ＳＥ－３０（東ソー）分子量３．０×１０５
　４．ＳＥ－１５（東ソー）分子量１．５×１０５
　５．ＳＥ－８（東ソー）分子量１．０１×１０５
　６．ＳＥ－５（東ソー）分子量４．３×１０４
　７．ＳＥ－２（東ソー）分子量２．７７×１０４
　８．ＰＥＧ１９０００（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ　ＰＯＬＹＭＥＲ　ＰＲＯＤＵＣＴＳ）分子量１９７００
　９．ＰＥＧ８６５０（ＰＯＬＹＭＥＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量８６５０
１０．ＰＥＧ４１２０（ＰＯＬＹＭＥＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量４１２０
（５）Ｋａｖ導出式
　Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／  （Ｖｔ－Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍｌ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍｌ）、Ｖ０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍｌ）である。］
（６）測定結果
　Ｋａｖプロットの一例を図１に示す。
［測定法３］
　デキストラン付加前後の乾燥重量変化量の測定
　参考例１で得られた架橋セルロース粒子１０．０ｇを５０ｍｌ栓付メスシリンダーに加え、さらに純水を５０ｍｌの線まで加え、栓をして体積が変わらなくなるまで静置する。体積が変わらなくなったらゲルの体積をメスシリンダーの目盛りから読み取る。
　次いで、メスシリンダーからゲルを取り出して、ゲルの全量を、８０℃のオーブンで１６時間乾燥させた後、乾燥ゲルの重量を測定する。得られた測定値から、下記の式にしたがって、架橋セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量を求めることができる。
　単位体積あたりの乾燥重量（ｇ／ｍｌ）＝ゲルの乾燥重量（ｇ）÷ゲルの体積（ｍｌ）
　デキストラン付加反応後の湿ゲルについても同様にして単位体積あたりの乾燥重量（ｇ／ｍｌ）を求め、架橋セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量に対する乾燥重量変化を算出する。
［測定法４］
　イオン交換容量測定法
　ブタンサルトンを付加した湿ゲル１ｍｌをビーカーに秤量し、０．５ｍｏｌ／ｌ塩酸（和光純薬）を加えて３分間攪拌した。その後、吸引濾過により塩酸を取り除き、さらに純水で洗浄した。
　洗浄したゲル１ｍｌをビーカーに加え、０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液（和光純薬）３ｍｌとフェノールフタレイン溶液１滴を加えた。この溶液に、０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸（和光純薬）を溶液の色が透明になるまで加えた。透明になるまで加えた塩酸量をＸｍｌとすると、ゲル１ｍｌあたりのイオン交換容量（ＩＥＣ）は、次式
（０．１×３/１０００－０．１×Ｘ／１０００）×１０００　（ｍｍｏｌ／ｍｌ）
で求めることができる。
［測定法５］
　平均粒子径の測定
　スライドグラスに湿潤セルロース粒子を取り、光学顕微鏡を用いて倍率１００倍で撮影した写真から任意に２００粒子の直径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
＜実施例８＞
　１０％架橋ゲルの実施例
　架橋６％セルロース粒子の代わりに参考例２Ｂで得られた架橋１０％セルロース粒子を用い、デキストラン７０を５４ｇ用いたことを除いて、実施例１と同様にして湿ゲルを得た。この時のデキストラン付加量は１６．３ｍｇ／ｍｌであった。標準ポリエチレンオキシド（東ソー社製）ＳＥ－５（重量平均分子量４．３×１０４）で純水を移動相に使用して求めたＫａｖは０．２４であった。参考例１（Ｂ）で得られた架橋１０％セルロースのＫａｖに対する割合は５１％であった。また、得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋１０％セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．１０倍であった。
　５０ｍｌ栓付三角フラスコへ得られた湿ゲル５ｇを加え、そこへ硫酸ナトリウム（和光純薬）５ｇ、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム１．５５ｇ、純水１５．３７ｇ）を入れ５０℃のインキュベーターで３０分攪拌した。３０分後、１、４－ブタンサルトン（和光純薬）４．１１ｇを加え、５０℃で６時間攪拌した。６時間後、反応混合物を吸引ろ過し、得られたゲルを５倍量の純水で５回洗浄した。洗浄後のゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。この時のイオン交換容量は０．２８ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は１２５ｍｇ／ｍｌであった。
　上記の結果から、１０％架橋セルロース粒子を用いても、６％架橋セルロース粒子を用いた場合と同様に免疫グロブリンを効率よく分離精製することができるクロマトグラフィー用充填剤が得られることが実証された。
＜実施例９＞
　５００ｍｌセパラブルフラスコに純水４０ｇとプルラン（林原社製、化粧品用プルラン、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）２４ｇを加え、室温で溶解するまで攪拌した。
　溶解したらそこへ参考例２Ａで得られた湿ゲル６０ｇを加え、３０℃で１時間攪拌した。次に、該フラスコに４５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を６．４ｇ加え、そのまま３０℃で１８時間攪拌した。１８時間後反応混合物を吸引ろ過し、得られた湿ゲルを３倍量の純水で５回洗浄した。洗浄後、湿ゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。得られた湿ゲルの単位体積あたりの乾燥重量は、架橋６％セルロース粒子の単位体積あたり乾燥重量の１．２４倍であった。
　さらに、５０ml栓付三角フラスコへ得られた湿ゲル８ｇを入れた。そこへ硫酸ナトリウム（和光純薬）８．９ｇ、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム１．８ｇ、純水１５ｇ）を入れ、５０℃のインキュベーターで３０分攪拌した。３０分後１、４－ブタンサルトン（和光純薬）１．２ｇを加え、５０℃で６時間攪拌した。６時間後反応溶液を吸引ろ過し、得られたゲルを５倍量の純水で５回洗浄した。洗浄後、得られたゲルを吸引ろ過して余分な水分を除き、湿ゲルの状態で保存した。このようにして、リガンドとしてスルホン基を導入した湿ゲルを得た。この時のイオン交換容量は０．１３ｍｍｏｌ／ｍｌであり、γ―グロブリン１０％動的吸着容量は、１７８　ｍｇ／ｍｌであった。
　実施例６との比較から判るように、デキストランの代わりの多糖類にプルランを用いてもγ－グロブリン吸着量は高い値を示した。
＜実施例１０－１＞
　硫酸エステルのリガンド導入
　実施例４に記載した方法と同様にして高分子デキストランＥＨと反応させて得た湿ゲル１００gに３００gのメタノールを加え室温で１０分間攪拌した後、吸引ろ過した。この作業を５回繰り返すことによりメタノール置換ゲルを得た。このゲルを水分含量が２．５％（ｗ／ｗ）になるまで５０～６０℃にて真空乾燥した。５００ｍｌセパラブルフラスコにピリジン２００ｇを攪拌しながら１０℃以下まで冷却後、窒素雰囲気下、クロロスルホン酸４ｇを滴下した。滴下終了後、１０℃以下で1時間反応させた後、６５℃まで加熱した。６５℃到達後、前記乾燥させたゲル３０ｇを投入し、攪拌下４時間反応させた。反応終了後、２５℃にて一晩放置し、その後、２０％ｗ／ｗＮａＯＨを添加して中和した。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で中性になるまで洗浄し、硫酸エステル基をリガンドに持つ湿ゲルを得た。
＜実施例１０－２＞
　実施例１０－１の湿ゲルの下記測定法６に従って測定したリゾチームの吸着量は、ゲル1ｍｌあたり９７ｍｇであった。またこのゲルの下記測定法７に従って求めた硫酸化度（硫黄含量）は２２２００ｐｐｍであった。
　本実施例のデキストランが付加されてなる多孔性セルロースゲルはリガンドを例えば硫酸エステルとするクロマトグラフィー用充填剤としての利用も可能である。本実施例のゲルはデキストランが硫酸エステル化されたリガンドであるため、ヘパリンゲル代替のクロマトグラフィー用充填剤としての利用も可能である。
［測定法６］
　リゾチーム吸着量の測定
　内径７ｍｍのカラムに上記実施例１０－１の湿ゲルを１ｍｌ充填し０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５０ｍｌ/ｈの流量で０．６時間平衡化した。濃度が５．０ｍｇ／ｍｌになるようにリゾチーム（和光純薬社製）に０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）を加え溶解し、この溶液１００ｍｌを前記の充填ゲルに５０ｍｌ/ｈの流量で通液し、リゾチームを充填ゲルに吸着させた。さらに、充填ゲルを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５０ｍｌ/ｈの流量で５０ｍｌ洗浄した。これら、リゾチーム溶液と洗浄液の充填ゲル通過液を全量回収し、２５０ｍｌにメスアップした。充填ゲルにおけるリゾチーム吸着量は吸着前後の２８０ｎｍの吸光度より計算されたリゾチームの差し引きによって求めた。具体的には、それぞれのリゾチーム溶液を１０倍希釈した溶液の、２８０ｎｍの吸光度は下記の通りであった。
　５．０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液の吸光度　Ａ２８０＝１．２５０
　充填ゲルの通過液＋洗浄液の吸光度　Ａ２８０＝０．３９７
　リゾチーム吸着量（ｍｇ／ｍｌ－ｇｅｌ）＝
　５．０ｘ１００－５．０ｘ（０．３９７／０１．２５０）ｘ２５０＝１０３
［測定法７］
　硫酸化度（硫黄含量）の測定
　　硫黄含量は、「イオンクロマトグラフィー法」（文献名：改訂5版分析化学便覧ｐ３０（社団法人　日本分析化学会編）にしたがい、次に記載の方法によって求めた。６０℃で１６～２０時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、１０５℃にて２時間乾燥した。この乾燥試料０．０５ｇに２Ｍの塩酸２．５ｍｌを加え、１１０℃にて１６時間加水分解した。氷冷後、上澄液を１ｍｌ採取し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、２５ｍｌにメスアップした。カラムに横河電気社製ＩＣＳ－Ａ－２３を用い、オーブン温度４０℃、溶離液に３ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３溶液、除去液に１５ｍＭ　硫酸をそれぞれ１ｍｌ／ｍｉｎの流量の条件で使用し、横河電機社製ＩＣ７０００イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線を基にＳＯ４濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作し時の値とした。ＳＯ４標準液（関東化学社製　陰イオン混合標準液IV）より２μｇ／ｍｌ液を本測定法の標準溶液とし、更に段階希釈し、同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。イオン含量は以下の式により求めた。
　硫黄含量（ｐｐｍ）＝（Ｘ試料－Ｘブランク）ｘ２５ｘ２．５ｘ０．３３３３／０．０５（試料量　ｇ）
　上記式中、Ｘ試料、ＸブランクはＳＯ４標準液による検量線から求めた濃度（ｐｐｍ）である。
　本発明のクロマトグラフィー用充填剤は流速特性及び目的物質に対する吸着特性に優れているため、各種分野における目的物質の分離精製用充填剤として有用である。本発明の好ましい態様のクロマトグラフィー用充填剤は、免疫グロブリンの吸着性能が特に優れているため、抗体医薬の分離精製に好適に用いられる。

Claims (18)

  1. 　多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍であることを特徴とする多孔性セルロース系ゲル。
  2. 　前記多孔性セルロース粒子は、粒子径３０～２００μｍを有し、且つ、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のＫａｖで表されるゲル分配係数０．１５～０．６を有するものである、請求項１記載の多孔性セルロース系ゲル。
  3. 　前記多糖類はデキストランである、請求項１又は２記載の多孔性セルロース系ゲル。
  4. 　前記多糖類はプルランである、請求項１又は２記載の多孔性セルロース系ゲル。
  5. 　前記多孔性セルロース粒子は、水膨潤度５～２０ｍｌ／ｇを有する架橋セルロース粒子である、請求項１～４のいずれか１項に記載の多孔性セルロース系ゲル。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の多孔性セルロース系ゲルにリガンドが付加してなる、クロマトグラフィー用充填剤。
  7. 　前記リガンドはスルホン基である、請求項６記載の充填剤。
  8. 　前記リガンドの導入量は、イオン交換容量で０．１３～０．３０ｍｍｏｌ／ｍｌである、請求項７記載の充填剤。
  9. 　前記リガンドは硫酸エステル基である、請求項６記載の充填剤。
  10. 　前記リガンドの導入量は、硫黄含量で５０００～６００００ｐｐｍである、請求項９記載の充填剤。
  11. 　免疫グロブリン精製用である、請求項６～８のいずれか１項に記載の充填剤。
  12. 　免疫グロブリンの吸着量が１５０～２５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１１記載の充填剤。
  13. 　免疫グロブリンの吸着量が１９０～２５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１２記載の充填剤。
  14. 　多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１～０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、前記多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、前記多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６～１．４０倍である多孔性セルロース系ゲルに、リガンドを付加する工程を含む、クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
  15. 　前記多孔性セルロース粒子は、粒子径３０～２００μｍを有し、且つ、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドで純水を移動相として使用した時のＫａｖで表されるゲル分配係数０．１５～０．６を有するものである、請求項１４記載の方法。
  16. 　前記多糖類がデキストランである、請求項１４又は１５記載の方法。
  17. 　前記多糖類がプルランである、請求項１４又は１５記載の方法。
  18. 　請求項６～８及び１１～１３のいずれか１項に記載の充填剤を用いて免疫グロブリンを分離精製する工程を含む、免疫グロブリン製剤の製造方法。
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