CN113925836A - 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用 - Google Patents

清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113925836A
CN113925836A CN202111152475.9A CN202111152475A CN113925836A CN 113925836 A CN113925836 A CN 113925836A CN 202111152475 A CN202111152475 A CN 202111152475A CN 113925836 A CN113925836 A CN 113925836A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
plga
bait
cell
cell membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111152475.9A
Other languages
English (en)
Inventor
殷黎晨
周炀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN202111152475.9A priority Critical patent/CN113925836A/zh
Publication of CN113925836A publication Critical patent/CN113925836A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1611—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本申请提供了一种清除核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用。具体而言，本申请提供了一种纳米诱饵，其包括：(a)纳米核；和(b)包被所述纳米核的破骨前体细胞细胞膜。所述纳米诱饵可为RAW‑PLGA，其中RAW细胞膜为破骨前体细胞的细胞膜，PLGA为纳米核。本申请还提供了该纳米诱饵的制备方法及其应用，尤其是在治疗破骨细胞过多或功能亢进相关的疾病(如骨质疏松症)中的应用。本申请中的纳米诱饵可有效地清除骨质疏松症中高表达的RANKL，同时能够从巨噬细胞捕获中逃脱并且在全身施用后具备长时间的血液循环，在骨质疏松症的临床治疗中具有极大的潜力。

Description

清除RANKL的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用
技术领域
本申请属于生物材料和医学领域。具体而言，本申请涉及细胞膜包被技术，更具体涉及破骨细胞膜包被的纳米复合物，其能有效结合并清除高表达的RANKL。
背景技术
骨质疏松症是一种进行性骨骼疾病，其特征在于骨矿物质密度和质量的下降、骨微观结构的破坏和骨脆性的增加。对于女性来说，由***缺乏引起的绝经后骨质疏松症是最常见的类型，大约50％的女性在绝经后至少经历一次骨折。在绝经期妇女中，***缺乏导致RANKL上调，其通过与破骨前体细胞的RANK结合进一步激活核因子-κB(NF-κB)途径，从而上调c-Fos基因表达。此外，RANKL通过启动一系列信号分子如p38，ERK和JNK的磷酸化来激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。两种途径的激活都会导致单核细胞分化为破骨细胞，并启动基质金属蛋白酶(MMP)和碱性磷酸酶(ALP)等基因的转录程序，最终促进骨吸收并诱导骨质流失。
在临床上，骨保护素(OPG)和抗体如地诺单抗(Denosumab)已被广泛应用于清除RANKL来抑制绝经后骨质疏松。然而，现有RANKL抑制剂(主要是蛋白质药物)经常因其血液循环时间短、生物分布不理想、制造工艺复杂和抗体抗性等缺点而应用有限。
破骨细胞(Osteoclast，OC)是骨吸收的主要功能细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用。破骨细胞起源于血系单核-巨噬细胞***，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞的分离培养始于20世纪80年代，到2018年7月，破骨细胞的培养方法主要有：骨髓机械分离法，骨髓细胞诱导法，脾干细胞诱导法，血液单核细胞诱导法，小鼠RAW 264.7细胞系诱导法及骨巨细胞瘤分离法。
破骨细胞以其骨质吸收功能为人所知晓。而且作为骨组织成分的一种，行使骨吸收(bone resorption)的功能。破骨细胞与成骨细胞(osteoblast，亦称bone-formingcells)在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。除此之外，破骨细胞还具有其他的生物学作用。例如造血调控作用、骨形成调控作用、骨内血管生成调控作用、骨钙素的激素作用。破骨细胞功能异常会造成骨质吸收的异常，若其功能亢进，会引起骨退行性病变如骨质疏松症、癌症的骨转移、关节炎等；若其功能障碍或衰退，会造成骨硬化症、致密性成骨不全、变形性骨炎、大块骨溶解病等。
破骨细胞信号通路的研究为研制靶向阻断破骨细胞分化和功能的新药提供了新方向：RANKL参与了骨髓瘤、骨大细胞癌等疾病中破骨细胞的形成分化过程，通过阻断RANK/RANKL通路可阻止破骨细胞的分化过程，防止骨吸收、维持骨密度、降低骨折风险。
因此，本领域中亟需研发一种新型的更安全和更有效的药物用于预防或治疗与破骨细胞RANKL通路相关的疾病，尤其是骨质疏松症(例如绝经后骨质疏松症)。
发明内容
本申请正是提供了一种纳米复合物，其能有效结合并清除高表达的RANKL，同时能够从巨噬细胞捕获中逃脱，在全身施用后具备长时间的血液循环，在RANKL过表达相关疾病(尤其是骨质疏松症)的临床治疗中具有极大的潜力。
在本申请的第一方面中，提供了一种纳米诱饵，其包括：(a)纳米核；和(b)包被所述纳米核的破骨前体细胞细胞膜。
在一些实施方式中，纳米核由选自下组的一种或多种材料制成：聚合物纳米颗粒，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)、壳聚糖、明胶；无机纳米颗粒，如金、硅、铁或铜。
在一些实施方式中，纳米核具有选自下组的一种或多种特征：带负电；粒径为50-200nm。
在一些实施方式中，破骨前体细胞来源于：骨髓造血干细胞、脾干细胞、骨髓或血液单核细胞、骨巨细胞瘤、髓系树突状细胞、破骨细胞样细胞。在一些实施方式中，破骨前体细胞选自：RAW 264.7细胞、人骨髓或外周血单核/巨噬细胞、ANA-1细胞、J774A.1细胞、THP-1细胞。在一些实施方式中，破骨前体细胞选自：天然破骨前体细胞、诱导分化形成的破骨前体细胞、经基因工程化改造的破骨前体细胞。在一些实施方式中，破骨前体细胞源自人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿、猴)、啮齿类动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、偶蹄类动物(例如羊、牛、猪、骆驼、羊驼)、奇蹄类动物(例如马)。在一些实施方式中，破骨前体细胞源自：待施用对象自体、与该对象的同种异体、或与该对象不同的物种。
在一些实施方式中，破骨前体细胞的细胞膜表达巨噬细胞特异性表面标志物，例如选自下组的一种或多种分子标志物：RANK、MAC-1、巨噬唾液酸蛋白、IFN-γR、TNF-αR和IL-6R。
在一些实施方式中，破骨前体细胞的细胞膜具有如下特征：维持或保留细胞膜原有的天然结构完整性(例如一级结构、二级结构、三级结构或四级结构完整性)或活性(例如结合活性、受体活性、信号传导通路活性)。
在一些实施方式中，细胞膜与纳米核的质量比为1:100～1:0.1，或1:80～1:20，如1:64～1:4。
在一些实施方式中，纳米核为PLGA，细胞膜为单核巨噬细胞(例如RAW264.7细胞系)的细胞膜。
在一些实施方式中，纳米诱饵的形态为球形、立方体、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、或其它规则或不规则的形状；大小范围为1纳米～10微米或其间的任何数值或数值范围。
在一些实施方式中，纳米诱饵具有选自下组的一个或多个如下特征：(1)具有特异性结合并清除RANKL的能力；(2)与空载纳米核相比，巨噬细胞内吞减少；(3)与空载纳米核相比，具有延长的体内半衰期(例如循环半衰期超过10小时)；(4)降低RANKL/RANK/OPG***基因相关因子(例如RANKL、RANK、TRAF6)、破骨细胞生成相关因子(NFATc1、c-Fos、ctsK、TRAP、RECK)和/或骨吸收相关因子(MMP-2、MMP-9、MMP-13)的mRNA和蛋白质水平。
在本申请的一些方面中，提供了本申请纳米诱饵的制备方法，所述方法包括：(A)提供纳米核；(B)提供破骨前体细胞的细胞膜；(C)使所述细胞膜包裹到所述纳米核上，形成所述纳米诱饵。
在一些实施方式中，步骤(A)通过选自下组的一种或多种方法进行：纳米沉淀法、乳化溶剂挥发法、离子凝胶法、直接溶解法、透析法、乳化法、介质研磨法、高压均质法、超临界流体法、类乳化溶剂扩散法、固态反相胶束溶液法。
在一些实施方式中，步骤(B)通过破骨前体细胞的裂解和组分分离进行，例如所述裂解包括：超声裂解、酶裂解、化学裂解、匀浆裂解和/或低渗溶胀裂解；所述分离包括：离心(例如逐级离心)、沉淀、过滤、磁珠、层析分离。
在一些实施方式中，步骤(C)包括施加外力使所述细胞膜包裹到所述纳米核上，例如采用声波法(例如超声法)、机械共挤压、电穿孔法、加热法。
在一些实施方式中，所述方法包括：通过超声裂解破骨前体细胞，并通过逐级离心得到细胞膜；将所得细胞膜与纳米核共同超声，得到纳米诱饵。在一些实施方式中，所述破骨前体细胞为RAW 264.7细胞，所述纳米核为PLGA，所述细胞膜与所述纳米核的质量比为4:1；和/或所述共同超声为100W，2分钟。
在本申请的一些方面中，提供了一种产品，其包含本申请的纳米诱饵或用于形成纳米诱饵的组分(a)和组分(b)；以及，可任选的，药学上或生理学上可接受的载体。
在本申请的一些方面中，提供了本申请纳米诱饵或其组分(a)和(b)的组合物在制备用于预防和/或治疗破骨细胞过多或功能亢进(例如RANKL过激)相关疾病的产品中的应用。
在本申请的一些方面中，提供了一种预防和/或治疗破骨细胞过多或功能亢进(例如RANKL过激)相关疾病的方法，所述方法包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的本申请的纳米诱饵或其组分(a)和(b)的组合物或包含前者的产品。
在本申请的一些方面中，提供了本申请纳米诱饵或其组分(a)和(b)的组合物或包含前者的产品，其用于预防和/或治疗破骨细胞过多或功能亢进(例如RANKL过激)相关疾病。
在一些实施方式中，破骨细胞过多或功能亢进(例如RANKL过激)相关疾病选自：骨退行性或流失性病变，例如骨质疏松症，尤其是***水平改变(如绝经)导致的骨质疏松症、牙周炎、根尖周炎、种植体周围炎；癌症(例如乳腺癌、***癌、肺癌)的骨转移；关节炎(如慢性关节炎)；变形性骨炎；骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)；骨大细胞癌。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本申请的发明构思和保护范围。本申请的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本申请作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本申请的实施方案，而不是为了局限本申请的范围。
图1：RAW-PLGA纳米诱饵制备流程示意图(图1A)；以及透射电镜下的RAW-PLGA形貌(图1B)。
图2：PLGA、RAW囊泡和RAW-PLGA的水合粒径及电位。
图3：Western blot分析下RAW 264.7膜和RAW-PLGA的特征蛋白质条带。
图4：RAW囊泡和RAW-PLGA在含10％胎牛血清的PBS中不同时间点时的粒径。
图5：RAW 264.7细胞与PLGA或RAW-PLGA共孵育后的CLSM图像及流式图。
图6：RAW 264.7细胞与RAW-PLGA共孵育后的细胞生存率，以及TNF-α和IL-6的分泌量。
图7：PLGA或RAW-PLGA作用后的相对RANKL浓度(反映RANKL相对去除量)。
图8：Cy3RANKL和Cy5RAW-PLGA混合溶液的荧光发射光谱。
图9：RAW 264.7细胞与RANKL和RAW-PLGA共孵育后的胞外RANKL水平。
图10：RAW 264.7细胞与RAW-PLGA或RANKL抗体共孵育后的CLSM图像。
图11：骨髓来源的单核巨噬细胞与RAW-PLGA和RANKL共孵育后的c-Fos mRNA相对水平的表达。
图12：骨髓来源的单核巨噬细胞与RAW-PLGA和RANKL共孵育后的p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白水平。
图13：骨髓来源的单核巨噬细胞与RAW-PLGA和RANKL共孵育后的TRAP染色图像。
图14：PLGA、RAW囊泡、RBC-PLGA和RAW-PLGA在静脉注射后的药代动力学。
图15：分别用PBS、PLGA、RAW-PLGA处理后OVX小鼠的RANKL蛋白水平。
图16：RAW-PLGA处理后OVX小鼠的骨质疏松相关mRNA水平。
图17：RAW-PLGA处理后OVX小鼠的TRACP-5b、BGP、BAP蛋白水平。
图18：RAW-PLGA处理后OVX小鼠股骨的TRAP染色图像以及破骨细胞计数。
图19：PLGA或RAW-PLGA处理后OVX小鼠股骨微结构的典型微计算机断层扫描(μCT)图像以及CT定量的骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N；1/mm)和骨小梁间隙(Tb.Sp；mm)。
图20：PBS或RAW-PLGA处理后C57/BL6小鼠的代表性血液学参数(图20A)和生化参数(图20B)。
图21：PBS或RAW-PLGA处理后C57/BL6小鼠的主要器官的H&E染色图像。
各图中，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001。
具体实施方式
本申请中提供了一种细胞膜包被的纳米诱饵，其能够特异性清除RANKL，从而避免RANKL与破骨前体细胞的RANK结合并启动破骨细胞的分化。尤其是，RAW-PLGA纳米诱饵在体内具备较长的循环时间，解决了现有技术使用的蛋白质药物(例如抗体药物)血液循环时间短等缺点。
在本申请的一些具体实施方式中，首先将破骨前体细胞通过超声进行裂解，并通过逐级离心得到RAW细胞膜；再将RAW细胞膜与PLGA纳米核共同超声2分钟(100W)，得到RAW-PLGA纳米诱饵。相关实验表明，这种纳米诱饵具备高效而稳定的RANKL清除能力，并能避免被巨噬细胞内吞，防止被过早地清除。在卵巢切除(OVX)小鼠模型中，使用尾静脉注射方式将RAW-PLGA纳米诱饵注入小鼠体内，成功下调异常增高的RANKL，并显著改善OVX小鼠的生理指标和骨指标。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本申请提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。例如，“基本上”可包括所指全部的90％或以上。
当在一系列两个或更多个事项中使用时，术语“和/或”意指任何一个所列出的事项可以单独或与所列出的事项中的任何一个或多个组合采用。例如，表述“A和/或B”旨在意指A和B之一或两者，即单独A、单独B或A与B组合。表述“A、B和/或C”旨在意指单独A、单独B、单独C、A与B组合、A与C组合、B与C组合或A、B与C组合。
数值范围的描述应当被认为具有确切公开的所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，如1至6的范围描述应当被认为具有确切公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等等，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5以及6。
纳米诱饵
如本文所用，术语“纳米诱饵”、“细胞膜包被/包裹的纳米诱饵/材料”、可互换使用，是指包含纳米核以及包裹其外的细胞膜的人工合成纳米材料，其可具有伪装仿生以诱捕并去除***内不利因子或成分的功能。
如本文所用，术语“破骨前体细胞”是指由骨髓中的造血干细胞生成的细胞，主要包括单核细胞和巨噬细胞。本申请中的破骨前体细胞可经过遗传工程化改造，以在其表面过表达有助于提高破骨细胞亲和力和/或RANKL清除力的物质，例如过表达RANK等。
如本文所用，术语“细胞膜”是指获自破骨前体细胞或其细胞器的天然存在的生物膜，或经过修饰、改变的具有破骨前体细胞全部或部分生物活性的膜。用于本申请的细胞膜可为获自本申请破骨前体细胞的细胞膜，其可经分离、去除部分组分(例如脂质、糖链)和/或添加部分组分(例如过表达的RANK、其他细胞表面抗原)。
如本文所用，术语“纳米核”是指具有纳米级尺寸的可用于支持本申请细胞膜的任何纳米颗粒。可用于制备本申请纳米诱饵纳米核的材料包括但不限于高分子纳米材料或无机纳米材料，例如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)、壳聚糖、明胶；金、硅、铁、铜等。
根据所用材料或方法的不同，本申请的纳米诱饵可具有各种适合的形状，例如球形、立方体、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、或其它规则或不规则的形状。本申请纳米诱饵的尺寸可为1纳米～10微米或其间的任何数值或数值范围，例如10纳米～5微米，500纳米～1微米等。
纳米诱饵的制备方法
本申请中还提供了制备本申请纳米诱饵的方法，所述方法包括：
(A)提供纳米核；
(B)提供破骨前体细胞的细胞膜；
(C)使所述细胞膜包裹到所述纳米核上，形成所述纳米诱饵。
本申请的纳米核可采用本领域中已知的各种方法，从原料制得(例如采用纳米沉淀法)，也可直接购自各供应商。纳米核可与细胞膜具有相反的电势，以形成电荷吸引进一步稳定纳米诱饵。
破骨前体细胞细胞膜可通过细胞裂解和分离获得，例如所述裂解包括：超声裂解、酶裂解、化学裂解、匀浆裂解和/或低渗溶胀裂解；所述分离包括：离心(例如逐级离心)、沉淀、过滤、磁珠、层析分离。在获得细胞膜之前可对细胞进行采集、培养、工程化改造等处理，以获得具有所需数量和功能的破骨前体细胞。
细胞膜应具有一定的结构完整性和保留所需的功能，并能够部分或完全包裹纳米核。优选细胞膜能够完全包裹纳米核以增加纳米诱饵的稳定性。在一些实施方式中，细胞膜具有大于或等于纳米核表面积的尺寸。在一些实施方式中，细胞膜上保留了破骨前体细胞膜表面的功能性表位、受体等功能性分子。
细胞膜对纳米核的包被可通过外力的施加实现。例如，可采用声波(例如超声法)、机械力(如机械共挤压)、电能(电穿孔法)、热能(加热法)等方式实现包裹。在一些实施方式中，本申请的方法可包括：通过超声裂解破骨前体细胞，并通过逐级离心得到细胞膜；将所得细胞膜与纳米核共同超声，得到纳米诱饵。
药物、药物组合物或试剂盒
本申请还提供了一种药物、药物组合物或试剂盒，其中含有有效量的本申请的纳米诱饵或组分(a)和(b)的组合物，以及药学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“本申请的活性物质”可互换使用，是指纳米诱饵或组分(a)和(b)的组合物。其中，组分(a)和(b)的组合物中可包含独立存放的组分(a)和组分(b)以及可任选的载剂，在临用前，可将组分(a)和组分(b)与可任选的载剂混合并制备成可供预防和/或治疗用的纳米诱饵药物。
在一些实施方案中，所述药物可用于预防和/或治疗与破骨细胞过度活化相关的疾病。例如，本申请的活性物质、包含所述活性物质的产品可用于预防和/或治疗破骨细胞过度活化导致的骨退行性或骨流失性疾病，例如骨质疏松症，尤其是***水平改变(如绝经)导致的骨质疏松症、牙周炎、根尖周炎、种植体周围炎；癌症(例如乳腺癌、***癌、肺癌)的骨转移、关节炎(如慢性关节炎)、变形性骨炎、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、骨大细胞癌。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本申请的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
应理解，所用活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。
本申请的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：静脉注射、腹腔注射、病灶内注射、口服、局部给药、肌内、皮内、直肠、吸入等方式。
此外，本申请的组合物中还可含有用于改善和治疗破骨细胞过多或功能亢进相关疾病的其它活性物质。例如，所述的其它活性物质选自下组：临床常用破骨细胞抑制剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗炎剂等。
本申请的纳米诱饵还可以与其它药物和治疗手段联合，例如化疗、放疗、光疗、冷冻疗法、手术、细胞疗法、移植等。
具体示例
本部分中提供了本申请的一些具体实施方式，应理解这些示例并不用于限制本申请的保护范围，而仅为了帮助理解本申请。
在本申请的一些具体实施方式中，提供了一种细胞膜包被的纳米诱饵，其结构为RAW-PLGA，其中RAW为破骨前体细胞的细胞膜，PLGA为纳米核。
在本申请的一些具体实施方式中，RAW-PLGA细胞膜包被的纳米诱饵的制备方法可包括，将破骨前体细胞通过超声进行裂解，并通过逐级离心得到RAW细胞膜；再将RAW细胞膜与PLGA纳米核共同超声2分钟(100W)，得到RAW-PLGA纳米诱饵。
在本申请的一些具体实施方式中，破骨前体细胞的细胞膜通过超声和离心进行分离。具体的，将RAW 264.7细胞悬浮于含有20mM Tris·HCl(pH 7.5)，10mM KCl，75mM蔗糖，2mM MgCl2和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的匀浆缓冲液中。用JY 92-IIN匀浆器(75W)破碎悬浮液，然后以20000g离心25分钟收集上清液，并对上清液以100000g离心35分钟收集细胞膜。使用BCA试剂盒测定收集的细胞膜的蛋白质含量。含有约5mg膜蛋白的膜可以从3×107个RAW264.7细胞中提取。
在本申请的一些具体实施方式中，PLGA纳米核通过丙酮挥发进行制备。具体的，将溶有PLGA(10mg/mL)的1mL丙酮滴加到2mL的去离子水中，然后将混合物在露天搅拌直至丙酮完全蒸发。
在本申请的一些具体实施方式中，RAW-PLGA纳米诱饵通过超声法制备。具体的，将RAW细胞膜和PLGA纳米核以1:4的质量比用浴超声波仪(Fisher Scientific FS30D，100W)超声处理2分钟。作为一个优点，本申请的RAW-PLGA纳米诱饵由FDA批准的PLGA和生物来源的细胞膜组成，具有优秀的生物相容性和安全性。
本申请进一步公开了上述细胞膜包被的纳米诱饵在制备抗绝经后骨质疏松药物中的应用。
作为具体示例，本申请制备RAW-PLGA纳米诱饵的方法如图1A所示。具体制备方法举例为：
(1)将RAW 264.7细胞悬浮于含有20mM Tris·HCl(pH 7.5)，10mM KCl，75mM蔗糖，2mM MgCl2和一片蛋白酶/磷酸酶抑制剂的匀浆缓冲液中。用JY92-IIN匀浆器(75W)破碎悬浮液，然后以20000g离心25分钟收集上清液，并对上清液以100000g离心35分钟收集细胞膜。使用BCA试剂盒测定收集的细胞膜的蛋白质含量。含有约5mg膜蛋白的膜可以从3×107RAW 264.7细胞中提取。
(2)将溶有PLGA(10mg/mL)的1mL丙酮滴加到2mL的去离子水中，然后将混合物在露天搅拌直至丙酮完全蒸发，得到PLGA纳米核。
(3)将RAW细胞膜和PLGA纳米核以1:4的质量比用浴超声波仪(Fisher ScientificFS30D，100W)超声处理2分钟，得到RAW-PLGA纳米诱饵。
本申请的优点
本申请至少包括如下优点：
1.细胞膜包被的纳米诱饵继承了破骨前体细胞的表面受体，通过受体识别作用直接清除RANKL，避免了潜在的不良反应。
2.纳米核(例如PLGA)的引入限制了膜组分的流动，大大提高了纳米诱饵的血清稳定性。
3.纳米诱饵通过继承破骨前体细胞的表面特异性蛋白，避免被巨噬细胞内吞，从而延长了血液循环。
4.相比于现行骨质疏松症治疗药物，本申请的纳米诱饵具备长循环、高RANKL中和效率、高安全性等优势。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本申请做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本申请的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)、《动物细胞培养》(Animal Cell Culture，R.I.Freshney编著，1987)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
所有数据均以平均值±标准差表示，并使用Student’s t-test进行统计分析。在*p<0.05时判断两组之间差异显著，在**p<0.01和***p<0.001时差异非常显著。
实施例一、RAW-PLGA纳米诱饵(nanodecoy)的制备和表征
按照图1A中所述流程制备本申请的细胞膜包被纳米复合物——RAW-PLGA纳米诱饵。具体制备步骤如下：
(1)膜材料的制备：将小鼠单核/巨噬细胞样细胞RAW 264.7(购自中国科学院细胞库，目录号SCSP-5036，培养基为含有10％FBS的DMEM，37℃，5％CO2)悬浮于含有20mMTris·HCl(pH 7.5)、10mM KCl、75mM蔗糖、2mM MgCl2和蛋白酶/磷酸酶抑制剂(购自Pierce，货号A32953，每片溶于10mL溶液中)的匀浆缓冲液中。用JY 92-IIN匀浆器(75W)破碎悬浮液中的细胞，然后以20000g离心25分钟收集上清液，并对上清液以100000g离心35分钟收集细胞膜。使用BCA试剂盒测定所收集细胞膜的蛋白质含量。可从约3×107个RAW264.7细胞中提取出含有约5mg膜蛋白的膜材料。
(2)纳米核的制备：将溶有聚乳酸-羟基乙酸共聚物——PLGA(所用PLGA购自Sigma-Aldrich，目录号719900，酸封端,lactide:glycolide 50:50,分子量38000-54000)10mg/mL)的1mL丙酮滴加到2mL的去离子水中，然后将混合物在露天搅拌直至丙酮完全蒸发，得到PLGA纳米核。
(3)将RAW细胞膜和PLGA纳米核以预设的质量比(1:64～2:1)在去离子水中用浴超声波仪(Fisher Scientific FS30D，100W)超声处理2分钟，得到RAW-PLGA纳米诱饵。
结果显示，在RAW：PLGA的质量比为1:64-2:1时可得到均一的纳米诱饵，而在1:16-1:4质量比时，纳米诱饵具备完整的包膜和合适的粒径。所得纳米诱饵在制备后可在室温保存一个月而不发生沉淀或粒径改变。
如下对所得细胞膜包被纳米复合物进行表征：
用乙酸双氧铀(0.2wt％)染色后，使用透射电子显微镜(TEM，TECNAI G2，FEI，US)观察RAW-PLGA纳米诱饵的形态。具体参见图1。如图1所示，纳米诱饵呈球状结构，并具有可辨识的清晰膜结构。
使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Ltd.，UK)测定纳米诱饵的流体动力学尺寸和zeta电位。具体参见图2。如图2所示，纳米诱饵的流体动力学尺寸约为109.5nm，zeta电位约为-14.5mV。
通过Western blot检查RAW囊泡和RAW-PLGA纳米诱饵上的巨噬细胞特异性表面标志物：整合蛋白：MAC-1和巨噬唾液酸蛋白(Macrosialin)；细胞因子结合受体：IFN-γR、TNF-αR、IL-6R和RANK)。MAC-1、巨噬唾液酸蛋白、IFN-γR、TNF-αR、IL-6R、RANK和GAPDH一抗的浓度为1:1000，HRP标记的二抗的浓度为1:500。具体参见图3。如图3所示，包裹在纳米核上的RAW细胞膜具有与天然细胞膜基本相同的表面标志物表达，提示其与天然细胞可具有相似的膜功能。
通过测量纳米诱饵在去离子水或含有10％的FBS的DMEM中的粒径来评估纳米诱饵的血清稳定性。具体参见图4。如图4所示，RAW囊泡的粒径随时间变化发生明显变化，而RAW-PLGA粒径基本维持不变。该结果表明刚性PLGA纳米核限制了包裹其外的膜组分的流动，使得整个RAW-PLGA在血清中具有改善的稳定性。
综上，通过本申请的方法制得了包含PLGA纳米核和有效包裹该纳米核的破骨细胞前体细胞膜RAW的稳定纳米诱饵，其能够在表面上提供与相应天然细胞类似的表面蛋白，例如各种整合蛋白和细胞因子结合受体。
实施例二、RAW-PLGA纳米诱饵的细胞实验：细胞内吞、生物相容性和免疫刺激性
使用激光共聚焦实验对纳米诱饵的细胞内吞进行研究。将RAW 264.7细胞按照每皿4×104个的数量接种在细胞培养皿(Ф＝20mm)上并培养24小时(培养基为含有10％FBS的DMEM，37℃，5％CO2)。用DiI(购自碧云天生物，5μg/mL)染色细胞膜后，将细胞与DiDPLGA(以PLGA/DiD质量比1000:1将DiD(购自碧云天生物)加入到PLGA丙酮溶液中，待丙酮挥发后离心去除过量的DiD(20000g，15分钟))或RAW-DiDPLGA(使用RAW细胞膜和DiDPLGA纳米核制备，制备方法等同于RAW-PLGA)(DiDPLGA组分在培养基中的终浓度为100μg DiDPLGA/mL)在37℃温育4小时。用冷PBS洗涤三次后，通过CLSM(Leica，TCS SP5，Germany)观察细胞。具体参见图5。共聚焦实验结果显示RAW-DiDPLGA的胞内荧光显著弱于DiDPLGA，流式细胞检测结果也显示被RAW 264.7细胞内吞的RAW-DiDPLGA纳米诱饵的水平比被内吞DiDPLGA水平低约20倍。上述结果表明细胞膜的包裹使得纳米诱饵被巨噬细胞内吞的比例大大降低。由此，本申请的RAW-PLGA可有效逃脱巨噬细胞捕获，避免了被过早清除，从而在体内可更持久发挥作用。
进一步研究RAW-PLGA的生物相容性和免疫刺激性。将RAW 264.7细胞按照每孔1×104个的数量接种在96孔板上并培养24小时，然后将细胞与RAW-PLGA纳米诱饵(5-160μgPLGA/mL)在37℃温育24小时。通过MTT法检测细胞存活率，并使用ELISA试剂盒(购自SanjiaBiochemical Supplies)定量上清液中的TNF-α和IL-6浓度。具体参见图6。RAW-PLGA纳米诱饵在5-160μg PLGA/mL的浓度范围内不会影响细胞生存率，同时不会刺激TNF-α和IL-6的产生。由此，本申请的RAW-PLGA具备高生物相容性和低免疫刺激功能。
实施例三、RAW-PLGA纳米诱饵对RANKL的体外结合与清除作用
将RANKL(购自Sigma-Aldrich，200pg/mL)与PLGA或RAW-PLGA(1mg PLGA/mL)在去离子水中混合，在37℃温育2小时。然后以16100g离心10分钟。使用ELISA试剂盒定量上清液中的RANKL浓度。具体参见图7。结果显示：RAW-PLGA结合了约53％的RANKL，而PLGA则几乎没有结合效果。
通过FRET进一步检测RANKL结合。使用RBC-PLGA作为阴性对照。将从雌性C57/BL6小鼠的全血收集的红细胞重悬于0.25×PBS中并以800g离心5分钟。重复该过程直至血红蛋白完全除去，收集红细胞膜，使用BCA试剂盒测定收集的细胞膜的蛋白质含量。将RAW细胞膜或红细胞膜与Cy5-NHS(购自Macklin)以质量比1000:1的比例混合，之后按照RAW-PLGA的制备流程制备Cy5RBC-PLGA和Cy5RAW-PLGA。
将作为FRET对的Cy3RANKL(200pg/mL)和红细胞膜包裹的Cy5RBC-PLGA或Cy5RAW-PLGA(1mg PLGA/mL)混合并如上所述温育。在565-750nm(λex＝550nm)的范围内收集荧光发射光谱。具体参见图8。结果显示RAW-PLGA组发生了能量转移，而RBC-PLGA组则没有。该结果再此证明了RAW-PLGA纳米诱饵与RANKL的有效特异性结合。
进一步检测在细胞存在下的实时RANKL清除作用。将RAW 264.7细胞按照每孔1×104个的数量接种在96孔板上并培养24小时，然后将细胞与RANKL(100ng/mL)和RAW-PLGA纳米诱饵(100μg PLGA/mL)在37℃温育。通过以预定时间间隔测量细胞培养基中的RANKL浓度来评估RANKL清除效率。具体参见图9。加入RAW-PLGA后RANKL呈现出显著的下降趋势。以上结果共同表明，RAW-PLGA对RANKL有着强力的特异性清除效果。
实施例四、RAW-PLGA纳米诱饵对破骨前体细胞的影响
为了显现纳米诱饵阻断了RANKL和RAW 264.7细胞膜之间的结合，将RAW 264.7细胞按照每皿4×104个的数量接种在细胞培养皿(Ф＝20mm)上并培养24小时。细胞用DiI(5μg/mL，细胞膜染料)染色，然后在含有FITCRANKL(100ng/mL)的新鲜培养基中培养。与RANKL抗体(0.05mg/mL，购自Abcam)或RAW-PLGA(100μg PLGA/mL，以PLGA计)温育4小时后，用冷PBS洗涤细胞三次，用Hoechst 33258(5μg/mL)对细胞核染色，并通过CLSM观察。具体参见图10。结果显示加入RAW-PLGA后，与RAW 264.7细胞结合的RANKL比例大幅降低。
进一步研究RAW-PLGA对NF-κB通路的阻断作用。从小鼠骨髓中分离小鼠骨髓单核巨噬细胞，按照每孔1×104个的数量接种在96孔板上并培养24小时。然后将细胞在含有M-CSF(30ng/mL)和RANKL(100ng/mL)的新鲜培养基中培养，并与RAW-PLGA(100μg PLGA/mL)一起温育24小时。使用实时PCR定量c-Fos mRNA水平。具体参见图11。经RAW-PLGA处理后，异常升高的破骨细胞相关转录因子c-Fos水平被降低了81％。
同时研究RAW-PLGA对MAPK通路的阻断作用。分离小鼠骨髓单核巨噬细胞并如上所述处理。使用ELISA定量p-ERK、p-p38和p-JNK蛋白水平。具体参见图12。经RAW-PLGA处理后，p-ERK、p-p38和p-JNK水平均较RANKL处理组显著降低，并基本恢复到正常水平。
之后，整体性研究RAW-PLGA对破骨细胞分化的抑制作用。将小鼠骨髓单核巨噬细胞(BMM)在含有M-CSF(30ng/mL)和RANKL(100ng/mL)的新鲜培养基中培养，并与RAW-PLGA纳米诱饵(100μg PLGA/mL)一起温育96小时。将细胞用4％***缓冲液固定10分钟，用PBS洗涤三次，使用TRAP染色试剂盒染色，并在倒置显微镜(Leica DM4000，Solms，Germany)下成像。具体参见图13。结果显示：BMM经诱导后分化为大的多核破骨细胞(图13中图)，而经RAW-PLGA处理后，破骨细胞的数量和直径均有大幅度减少，形态接近于未诱导的对照细胞(图13左图vs.右图)。
以上结果共同表明，RAW-PLGA对破骨细胞的分化有着极强的抑制作用。
实施例五、RAW-PLGA纳米诱饵的体内半衰期研究
为了证明RAW-PLGA具备较长的体内循环时间，对RAW-PLGA在静脉注射后的药代动力学进行研究。
雌性C57/BL6小鼠(6-8周，18-20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，以每笼四只饲养于洁净室中，随意饮水，12:12小时光暗循环，温度25±1℃。动物实验方案由苏州大学机构动物护理和使用委员会审查和批准)以10mg DiDPLGA/kg或2.5mg DiDRAW囊泡/kg的剂量静脉注射DiDPLGA、DiDRAW囊泡(将RAW细胞膜与DiD以质量比1000:1的比例混合，之后通过超声2分钟制备)、RBC-DiDPLGA或RAW-DiDPLGA。在预定的时间点收集血液，并通过分光荧光法(λex＝644nm，λem＝663nm)确定血浆中的DiDPLGA或DiDRAW的含量。计算循环半衰期(t1/2)。具体参见图14。RAW-PLGA显示比PLGA(t1/2＝4.08小时)和RAW囊泡(t1/2＝3.11小时)显著延长的血液循环时间，其t1/2为13.26小时。
该结果提示本申请的RAW-PLGA纳米诱饵在体内具有较长的循环半衰期，相较于循环半衰期较短的药物(例如蛋白质类药物)，能更有效发挥其治疗作用。
实施例六、RAW-PLGA纳米诱饵的体内抗骨质疏松作用
在体内检测RAW-PLGA对骨质疏松相关生化指标的改善。对雌性C57/BL6小鼠进行双侧卵巢切除术，建立OVX小鼠(ovariectomized mice)模型。在接下来的60天内，每3天以10mg PLGA/kg的剂量静脉注射PLGA或RAW-PLGA，并注射等体积PBS做为阴性对照。在第60天，处死小鼠，收集外周血并在4℃以500g离心10分钟以提取血清。使用ELISA试剂盒定量血清中的RANKL水平。具体参见图15。RAW-PLGA处理的OVX小鼠中的血清RANKL浓度相较于OVX组降低了57％(p<0.0001)，几乎恢复到正常水平。
进一步检测股骨组织中与RANKL(RANKL/RANK/OPG***基因：RANKL、RANK、TRAF6)、破骨细胞生成相关关键因子(破骨细胞相关转录因子：NFATc1、c-Fos；和破骨细胞特异性基因：ctSK、TRAP、RECK)和骨吸收相关的关键因子(MMP-2、MMP-9和MMP-13)的mRNA水平。将股骨组织在液氮中冷冻并用Trizol试剂匀浆以分离总RNA，并使用实时PCR对相应的mRNA水平进行检测。RANK、c-Fos、RANKL、TRAF6、NFATc1、ctsK、TRAP、RECK、MMP-2、MMP-9、MMP-13以及GAPDH的实时PCR所用引物对(正向引物+反向引物)序列分别如序列表中SEQ ID NO:1-24。
结果具体参见图16。在RAW-PLGA处理后，RANKL/RANK/OPG***(RANKL、RANK和TRAF6)的关键因子降至正常水平，表明整个***已重新平衡。与此同时，RAW-PLGA不仅将异常上调的破骨细胞相关转录因子(NFATc1和c-Fos)恢复到正常水平，而且还抑制破骨细胞特异性基因(ctsK、TRAP和RECK)的表达水平，表明其具有抑制破骨细胞分化的强大能力。同时骨吸收相关基因(MMP-2、MMP-9和MMP-13)基本上恢复到正常水平，这将进一步有益于抗骨质疏松症以及骨形成。
同时通过检测骨转换的生化标志物来评估绝经后骨质疏松症期间的骨吸收和骨形成。使用ELISA试剂盒定量血清中的TRACP-5b、BGP和BAP水平。具体参见图17。在RAW-PLGA处理后，这些指标的水平也几乎恢复到了正常水平。
实施例七、RAW-PLGA纳米诱饵治疗对骨组织的组织学影响
对RAW-PLGA处理后的OVX小鼠的股骨进行组织学分析。在双侧卵巢切除术后第60天(给药方案同实施例六)，处死小鼠，收获股骨组织，固定在10％***缓冲液中，然后在脱钙溶液(14％EDTA)中于室温孵育1个月以进行脱钙。然后，将股骨包埋在石蜡中，以8μm的厚度横切片。使用TRAP染色试剂盒染色，并计算每个骨表面的破骨细胞数(N.Oc/BS)。具体参见图18。RAW-PLGA有效地降低了破骨细胞对骨小梁的侵蚀程度，同时使破骨细胞数量减少了61％，几乎恢复到正常水平。
实施例八、RAW-PLGA纳米诱饵治疗对骨组织的影像学影响
通过显微CT进一步分析股骨完整性的恢复。在双侧卵巢切除术后第60天(给药方案同实施例六)，使用显微CT(Skyscan 1176)扫描OVX小鼠的右股骨标本。获得高分辨率扫描图(9-20mm)(分辨率：8.8mm，源电压：50kV，源电流：500mA，旋转步长：0.7U)。使用CT分析仪软件(Skyscan)重建数据集以获得股骨组织的3D图像并测量形态测量参数。基于重建数据和内部编写的Fiji脚本计算微CT扫描的骨侵蚀。该程序确定骨表面和骨内部空间，并填充骨表面的孔隙。选择小梁骨中的感兴趣区域(ROI)用于分析以下形态测量参数，包括：(1)骨矿物质密度(BMD)，(2)骨体积密度比(BV/TV)，(3)骨小梁数(Tb.N)和(4)骨小梁间隙(Tb.Sp)。具体参见图19。结果显示RAW-PLGA极显著抑制了卵巢切除术诱导的骨丢失，并且减轻了骨小梁中的骨质减少表型。此外，在用RAW-PLGA处理后，BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp恢复到正常水平。
以上试验证据有力证明了RAW-PLGA纳米诱饵对于绝经后骨质疏松的巨大潜力。
实施例九、RAW-PLGA纳米诱饵的体内生物相容性
将PBS(200μL)或RAW-PLGA纳米复合物(10mg PLGA/kg，200μL)静脉内注射到雌性C57/BL6小鼠中，给药方案同实施例六。收集血液和主要器官(心、肝、脾、肺和肾)。在Cobas501自动血液分析仪(Roche，USA)上进行血液学评估。使用BC-5380自动化学分析仪(Mindray，China)测定血清生化参数水平。具体参见图20。将主要器官固定在10％***中，包埋在石蜡中，以8μm的厚度横切片，用H&E染色，并通过整体透视光学显微镜观察。具体参见图21。
结果显示RAW-PLGA纳米诱饵处理的小鼠在代表性血液学参数和生化参数上没有异常。此外，在H&E染色的主要器官横截面中，未检测到坏死、炎症、水肿或其他病理症状。这些结果表明全身给药后RAW-PLGA纳米诱饵具有良好的生物相容性，具有高安全性。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 清除RANKL的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用
<130> 217779 1CNCN
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agatgtggtc tgcagctctt ccat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acacacttct tgctgactgg aggt 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttcaacgcg gactacgagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgcaaaagt cctgtgtgtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagaaggaac tgcaacacat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagagtgact ttatgggaac c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgcacattc agtgtttttg g 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgcaagtgtc gtgccaag 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgttgcttc cagaaaataa ca 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgtgggatgt gaactcggaa 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agcgaacaga ttctcaacag c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agacagagca aagctcacca t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgtctctgca cagattgcat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aagcgcaaac ggtagtaagg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctccagcagt ctcccgtcat 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gttgtgggtg gtcagggtct a 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcaatacctg aacactttct atg 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tctggtcaag gtcacctgtc 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggcagaggc atacttgtac c 21
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgtccagctc accagtct 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctggaccaaa ctatggtggg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggtccttgga gtgatccaga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttcaccacca tggagaaggc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggcatggact gtggtcatga 20

Claims (10)

1.一种纳米诱饵，其包括：
(a)纳米核；和
(b)包被所述纳米核的破骨前体细胞细胞膜。
2.如权利要求1所述的纳米诱饵，其中，所述纳米核由选自下组的一种或多种材料制成：聚合物纳米颗粒，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)、壳聚糖、明胶；无机纳米颗粒，如金、硅、铁或铜；和/或
所述纳米核具有选自下组的一种或多种特征：带负电；粒径为50-200nm。
3.如权利要求1所述的纳米诱饵，其中，
所述破骨前体细胞来源于：骨髓造血干细胞、脾干细胞、骨髓或血液单核细胞、骨巨细胞瘤、髓系树突状细胞、破骨细胞样细胞；
例如所述破骨前体细胞选自：RAW 264.7细胞、人骨髓或外周血单核/巨噬细胞、ANA-1细胞、J774A.1细胞、THP-1细胞；和/或
所述破骨前体细胞选自：天然破骨前体细胞、诱导分化形成的破骨前体细胞、经基因工程化改造的破骨前体细胞；和/或
所述破骨前体细胞源自人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿、猴)、啮齿类动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、偶蹄类动物(例如羊、牛、猪、骆驼、羊驼)、奇蹄类动物(例如马)；和/或
所述破骨前体细胞源自：待施用对象自体、与该对象的同种异体、或与该对象不同的物种。
4.如权利要求1所述的纳米诱饵，其中，所述破骨前体细胞的细胞膜表达巨噬细胞特异性表面标志物，例如选自下组的一种或多种分子标志物：RANK、MAC-1、巨噬唾液酸蛋白、IFN-γR、TNF-αR和IL-6R；和/或
所述破骨前体细胞的细胞膜具有如下特征：维持或保留细胞膜原有的天然结构完整性(例如一级结构、二级结构、三级结构或四级结构完整性)或活性(例如结合活性、受体活性、信号传导通路活性)。
5.如权利要求1所述的纳米诱饵，其中，所述细胞膜与所述纳米核的质量比为1:100～1:0.1，或1:80～1:20，1:64～1:4；和/或
所述纳米核为PLGA，所述细胞膜为单核巨噬细胞(例如RAW 264.7细胞系)的细胞膜；和/或
所述纳米诱饵的形态为球形、立方体、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、或其它规则或不规则的形状；大小范围为1纳米～10微米或其间的任何数值或数值范围。
6.如权利要求1～5中任一项所述的纳米诱饵，其中，所述纳米诱饵具有选自下组的一个或多个如下特征：
(1)具有特异性结合并清除RANKL的能力；
(2)与空载纳米核相比，巨噬细胞内吞减少；
(3)与空载纳米核相比，具有延长的体内半衰期(例如循环半衰期超过10小时)；
(4)降低RANKL/RANK/OPG***基因相关因子(例如RANKL、RANK、TRAF6)、破骨细胞生成相关因子(NFATc1、c-Fos、ctsK、TRAP、RECK)和/或骨吸收相关因子(MMP-2、MMP-9、MMP-13)的mRNA和蛋白质水平。
7.如权利要求1～6中任一项所述的纳米诱饵的制备方法，所述方法包括：
(A)提供纳米核；
(B)提供破骨前体细胞的细胞膜；
(C)使所述细胞膜包裹到所述纳米核上，形成所述纳米诱饵；
例如，所述步骤(A)通过选自下组的一种或多种方法进行：纳米沉淀法、乳化溶剂挥发法、离子凝胶法、直接溶解法、透析法、乳化法、介质研磨法、高压均质法、超临界流体法、类乳化溶剂扩散法、固态反相胶束溶液法；和/或
所述步骤(B)通过破骨前体细胞的裂解和组分分离进行，例如所述裂解包括：超声裂解、酶裂解、化学裂解、匀浆裂解和/或低渗溶胀裂解；所述分离包括：离心(例如逐级离心)、沉淀、过滤、磁珠、层析分离；和/或
所述步骤(C)包括施加外力使所述细胞膜包裹到所述纳米核上，例如采用声波法(例如超声法)、机械共挤压、电穿孔法、加热法；和/或
在一个实施方式中，所述方法包括：通过超声裂解破骨前体细胞，并通过逐级离心得到细胞膜；将所得细胞膜与纳米核共同超声，得到纳米诱饵；
优选，所述破骨前体细胞为RAW 264.7细胞，所述纳米核为PLGA，所述细胞膜与所述纳米核的质量比为4:1；和/或所述共同超声为100W，2分钟。
8.一种产品，其包含：
权利要求1～6中任一项所述的纳米诱饵或如权利要求1～6中任一项中所限定的组分(a)和组分(b)；以及，可任选的，药学上或生理学上可接受的载体。
9.如权利要求1～6中任一项所述的纳米诱饵或其组分(a)和(b)的组合物在制备用于预防和/或治疗破骨细胞过多或功能亢进(例如RANKL过激)相关疾病的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中，所述疾病选自：骨退行性或流失性病变，例如骨质疏松症，尤其是***水平改变(如绝经)导致的骨质疏松症、牙周炎、根尖周炎、种植体周围炎；癌症(例如乳腺癌、***癌、肺癌)的骨转移；关节炎(如慢性关节炎)；变形性骨炎；骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)；骨大细胞癌。
CN202111152475.9A 2021-09-29 2021-09-29 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用 Pending CN113925836A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111152475.9A CN113925836A (zh) 2021-09-29 2021-09-29 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111152475.9A CN113925836A (zh) 2021-09-29 2021-09-29 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113925836A true CN113925836A (zh) 2022-01-14

Family

ID=79277352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111152475.9A Pending CN113925836A (zh) 2021-09-29 2021-09-29 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113925836A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029310A (zh) * 2022-04-28 2022-09-09 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒及制备方法和应用
WO2024040807A1 (zh) * 2022-08-22 2024-02-29 浙江大学 基于细胞膜的跨物种细胞组分递送的生物材料及制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130337066A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Membrane Encapsulated Nanoparticles and Method of Use
US20170216218A1 (en) * 2014-10-14 2017-08-03 The Brigham And Women S Hospital, Inc. Nanoparticles and Methods of Use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130337066A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Membrane Encapsulated Nanoparticles and Method of Use
US20170216218A1 (en) * 2014-10-14 2017-08-03 The Brigham And Women S Hospital, Inc. Nanoparticles and Methods of Use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈鹏等: "绝经后骨质疏松症 TNF-α通过激活NF-κB促进RANKL诱导的破骨细胞形成", 《基因组学与应用生物学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029310A (zh) * 2022-04-28 2022-09-09 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒及制备方法和应用
CN115029310B (zh) * 2022-04-28 2024-03-08 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒及制备方法和应用
WO2024040807A1 (zh) * 2022-08-22 2024-02-29 浙江大学 基于细胞膜的跨物种细胞组分递送的生物材料及制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10675244B2 (en) Microvesicles derived from nucleated, mammalian cells and use thereof
US20210212948A1 (en) Nanovesicles derived from cell membrane, and use thereof
Bhunia et al. Large amino acid transporter 1 selective liposomes of l-DOPA functionalized amphiphile for combating glioblastoma
US10426801B2 (en) Encapsulated diagnostics and therapeutics in nanoparticles—conjugated to tropic cells and methods for their use
Zheng et al. Exosomes: Multiple-targeted multifunctional biological nanoparticles in the diagnosis, drug delivery, and imaging of cancer cells
WO2023134122A1 (zh) 清除促炎因子和抑制t细胞活化的细胞膜包被纳米诱饵及其制备方法与应用
CN113925836A (zh) 清除rankl的细胞膜包被纳米诱饵、其制备及应用
US7217735B1 (en) Methods and compositions for enhancing delivery of therapeutic agents to tissues
US20180126014A1 (en) Compositions for enhancing delivery of agents across the blood brain barrier and methods of use thereof
Chen et al. Engineered extracellular vesicles for concurrent Anti-PDL1 immunotherapy and chemotherapy
Shi et al. Active targeting schemes for nano-drug delivery systems in osteosarcoma therapeutics
JP5436650B1 (ja) スーパーアパタイト超微細ナノ粒子
Mocanu et al. P-selectin targeted RAGE-shRNA lipoplexes alleviate atherosclerosis-associated inflammation
JP2020500218A (ja) 遺伝子治療のための構造体および方法
Zhou et al. Immunogenic PANoptosis‐Initiated Cancer Sono‐Immune Reediting Nanotherapy by Iteratively Boosting Cancer Immunity Cycle
Cao et al. Matrix metalloproteinase-2-induced morphologic transformation of self-assembled peptide nanocarriers inhibits tumor growth and metastasis
Li et al. Co-delivery of Interleukin-12 and doxorubicin loaded Nano-delivery system for enhanced immunotherapy with polarization toward M1-type Macrophages
TWI682937B (zh) 經官能化以供癌症靶向之化學活化的奈米蛋白殼體
JP2003524624A (ja) 治療薬の組織への送達を高める方法及び組成物
WO2023142357A1 (zh) 药物及siRNA共递送纳米复合物及其制备方法与应用
Deng et al. Advances in the treatment of atherosclerosis with ligand‐modified nanocarriers
Xu et al. Enhancement of Microglia Functions by Developed Nano‐Immuno‐Synergist to Ameliorate Immunodeficiency for Malignant Glioma Treatment
JP2010235564A (ja) フコシル化糖鎖産生細胞用物質送達担体
CN112823023A (zh) 肿瘤相关巨噬细胞的结合分子及使用方法
Ma et al. Systemic and Local Administration of a Dual-siRNA Complex Efficiently Inhibits Tumor Growth and Bone Invasion in Oral Squamous Cell Carcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination