JP6989591B2 - 多能性細胞の誘導及び自己再生並びにその使用 - Google Patents
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Description
ンβ及びγ鎖はラミニン-インテグリン結合を調節することが可能であるが、細胞相互作用は主に受容体へのα鎖の結合を介して媒介される。したがって、α5含有又はα4含有ラミニンは、例えば、α2含有又はα1含有ラミニンとは高度に違っている。α1含有ラミニンは長い間細胞培養では広い範囲で使用されてきたが、本発明の文脈での培養拡大及び/又はIsl1+誘導のために使用されるラミニン(すなわち、α5含有及び/又はα4含有ラミニン)とは機能的にも構造的にも類似していない。
群(TRAPS)、インターロイキン1受容体アンタゴニストの欠損(DIRA)、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、又は腎不全、肝不全、肺不全、心不全等の本質的にいかなるタイプの臓器不全も、並びに/或いはその任意の組合せから選択してもよい。
1若しくはラミニン423又はα4鎖を含む他の任意のラミニントリマーのポリペプチド配列由来のポリペプチドを含む任意の細胞培養成長下層又は細胞培養培地添加物を含む群から選択されてもよい。
の賢明な組合せも本発明の範囲内である。
、例えば、α5若しくはα4鎖(LN-521、LN-511、LN-411、LN-421)及び/又はLN-111、LN-211、LN-221、若しくはその任意の組合せのうちのいずれか1つを含むラミニンから選択してもよい。
Karolinska大学病院の動物管理委員会はすべての実験動物手順を承認した。妊娠したスプラーグドーリー(B&K Universal AB社、Sollentuna, Sweden)、妊娠日数14日及びRowettヌードラット(RNU, genotype rn/rnu) (Charles River Deutchland社、Germany)体重250〜300gが本研究では使用された。骨髄組織、心臓組織、及び臍帯血を収集するため、標準インフォームドコンセント手順及び地域倫理委員会による事前承認を使用して個人の許可を得た。ヒト胚組織(妊娠5〜10週)を収集するため、標準インフォームドコンセント手順及び地域倫理委員会による事前承認を使用して個人の許可を得た。調査は、ヘルシンキ宣言で概要を述べられている原則に適合している。
細胞は種々の方法を使用して低酸素状態下で成長させることが可能である。通常、細胞培養のために低酸素状態は、5%又はそれ未満の酸素を含有する雰囲気での細胞の培養と定義されている。
1)低酸素が窒素等の化学的に不活性な重質気体を注入することによって達成される、細胞が曝露される酸素濃度を低減させた環境での細胞の培養。
2)予混合雰囲気が供給されて正常で酸素豊富な雰囲気が完全に置き換えられる環境での細胞の培養。
Isl1開始コドンの上流の3kbゲノムヒトDNA断片(ATGから-3から-3170)は、高忠実度Phusion DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific社)を用いてPCRにより増幅させた。フォワードプライマー5'- aaa gag ctc GGT GTA ACA GCC ACA TTT -3'及びリバースプライマー5'- gga gaa ttc CTG TAA GAG GGA GTA ATG TC -3'。PCR産物は、ベクターpEGFP-1のMCS(Clontech Laboratories社、USA)の制限酵素切断部位SaclとEcoRIとの間にクローニングされた。Isl1プラスミドは、Neon(商標)エレクトロポレーションシステム(Invitrogen社、US)を使用してラット及びヒト細胞に導入された。ブタ膵臓Isl1+細胞は正の対照として使用し、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)はIsl1遺伝子構築物の負の対照として使用した。
実験ごとに、10頭の妊娠したスプラーグドーリーラット(妊娠日数、GD、13〜14日)を使用した。ラットはCO2チャンバーで安楽死させ、その後に全胎仔(おおよそ10胎仔/ラット)を低正中開腹手術により摘出した。それぞれの胎仔から、顕微鏡下で心臓を摘出し、刻んで小片にし、ハンクス緩衝食塩水(HBSS)(GibcoBRL社、NY, USA)で繰り返しゆすいだ。次に心臓小片は、HBSS中0.5mg/mlトリプシン溶液で4℃、終夜予め消化した。次の工程は間葉系画分を調製することであり、この工程はLaugwitz及び共同研究者ら(Laugwitzら、2005)が開発したプロトコルの改変である。予め消化された心臓小片は、穏やかに撹拌しながら10〜15分間、37℃でインキュベータ中1ラウンドあたり2〜3ml、
コラーゲナーゼタイプII(Worthington Biochemical社、Lakewood, NJ)HBSS中240U/mlで処置された。次に、上澄みは330〜350gで8分間遠心分離し、氷冷したHBSSに再懸濁した。この手順は心臓小片が解離されるまで繰り返した。プールした細胞は再び洗浄し、330〜350gで2回遠心分離し、10%ウマ血清(GibcoBRL社)及び5%ウシ胎仔血清(FBS)(PAA Laboratories社、USA)をMycoZap(Lonza社、Switzerland)と一緒に含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)4.5/M199(4対1)(GibcoBRL社)に再懸濁した。間葉系(付着)画分は、インキュベータ中37℃、3%O2中5%CO2で1時間プラスチックウェル上で2ラウンド培養することにより、心筋細胞及び内皮細胞から分離した。付着画分からのIsl1+細胞の誘導を追跡するため、これらの細胞を、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子に連結されたIsl1遺伝子用のプロモーターを含有するIsl1遺伝子構築物(上に記載)で標識した。この遺伝子構築物のおかげで、直接培養皿でIsl1+細胞の誘導を追跡することができた。間葉系細胞のIsl1+細胞への形質転換を刺激するため、付着画分をTrypLE(商標)Express(GibcoBRL社)を使用して引き離し、インキュベータ中37℃、3%O2中5%CO2で、培地DMEM高グルコース(GibcoBRL社)、MycoZap(Lonza社)、Hepes(25mM)(GibcoBRL社)、グルタミン(2mM)(Fisher Scientific社)及び15%FBS(PAA社)において培養したラミニン511、521又はこれらの組合せの薄層で被覆したプレート上で再培養した。密集時(48時間)、細胞はTrypLE(商標)Express(GibcoBRL社)を使用して引き離し、1ml B27(GibcoBRL社)、2%FBS(PAA社)、MycoZap(Lonza社)、上皮成長因子(EGF、10ng/ml)(R&Dsystems社、Minneapolis、USA)、2.5mM BIO(Sigma-Aldrich社、USA)、Wnt 3a(100ng/ml)(R&Dsystems社)を補充したDMEM/F12を含有するWnt培地において、ラミニン511、521又はこれらの組合せで被覆したプレート上で再培養した。密集時、細胞は継代させ、同じ培地で、ラミニン511、521又はこれらの組合せで被覆したウェル上で再培養した。それぞれの継代時、細胞は下に記載される分析のために収穫した。Wnt培地を用いた2週間の処置後、培養過程は終了し、細胞は更なる分析又は注射のために収穫した。更に、異なる時点由来の付着細胞も凍結し解凍した。培養された付着細胞の凍結は、細胞を引き離し、遠心分離後細胞を冷却Recovery(商標)細胞培養凍結培地(GibcoBRL社)に再懸濁することにより実施した。細胞は貯蔵バイアルに移し-70℃まで徐々に凍結し(1分あたり-1℃)、その後液体窒素(-180℃)に移した。凍結細胞を再培養する場合、37℃まで急速に解凍し、洗浄し、同じWnt培地及び上記と同じ培養条件で、ラミニン511、521又はこれらの組合せで被覆したプラスチックプレート上で再培養した。
骨髄細胞の吸引は若い健康なヒトドナーから以前記載した通りに実行した。臍帯血及び羊膜細胞は、標準的な従来の手順を使用して収集し単離した。成人心臓検体は従来の手順を使用して得た。流産はWestgrenらが以前記載した技法に従って実施した。予め蒔いておく手順は72時間まで延ばされ、DMEM低グルコース(GibcoBRL社)、10%FBS(PAA)及びMycoZap(Lonza社)を有する間葉系幹細胞培地で実施する以外は、以下の手順はラットIsl1+細胞の培養と同じ工程に従った。代案として、非ヒト成分のない培養培地を用いてもよく、FBSがヒト血液から入手可能な溶解血小板で置き換えられる。Isl1+細胞の誘導を追跡するため、間葉系細胞をラットIsl1+細胞の誘導と同じIsl1遺伝子構築物を使用して標識した。適切な場合にIsl1+細胞への形質転換を刺激するため、ラミニン511、521若しくは組合せ、又はラミニン511若しくは521とラミニン411若しくは421の任意の組合せを用いて、しかしBIOが排除され血清レベルが15%FBS(PAA社)まで増加したWnt培地を(又は溶解ヒト血小板を適切な濃度で)用いてラットIsl1+細胞と類似する培養条件を使用した。それぞれの継代後、細胞は更なる分析のために保存され、2週間後培養過程は終了して、細胞は免疫組織化学的染色及びマイクロアレイ分析のために収穫された。ラットIsl1+細胞について記載された通りに、異なる時期由来の間葉系細胞も凍結され、解凍された。
それぞれの継代で及び培養過程の終了時に、細胞増殖を検出するため、細胞はサイトスピンし、Isl1+細胞及びKi67の存在について免疫組織化学的に分析した。サイトスピンされた細胞は最初凍結保存され、続いて4%ホルムアルデヒドに固定し、血清で遮断し、一次抗体と一緒にインキュベートした(それぞれIsl1対ヤギ抗ヒトIsl1(R&D systems社);Ki67対マウス抗ラットKi67(clone MIB-5, DakoCytomation社、Denmark)及び直接コンジュゲートマウス抗ヒトKi67-FITC (clone MIB-1, DakoCytomation社))。非コンジュゲート一次抗体を可視化するため、切片を洗浄し蛍光標識二次抗体と一緒にインキュベートした(Isl1対Alexa Fluor488ウサギ抗ヤギ(Molecular Probes社、Invitrogen社)及びKi67では対Alexa fluor568ヤギ抗マウス(Molecular Probes社))。対照抗体での染色、並びに負及び正対照組織の染色は、すべての抗体の特異性を確認するために行った。
異なる供給源からのヒト間葉系幹細胞(MSC)は上記と同じプロトコルに従って調製した。Wnt培地に変える代わりに、MSCは、37℃で5週間、5%CO2及び3%O2を含有する加湿空気でDMEM高グルコース(GibcoBRL社)、MycoZap(Lonza社)、Hepes(25mM)(GibcoBRL社)、グルタミン(2mM)(Fisher Scientific社)及び15%FBS(PAA)において維持した。この期間の間細胞は2度継代させ、続いてフローサイトメトリーにかけた。適切なMSCが拡大していることを試験するため、細胞をラミニン511、521、421、411又はこれらの組合せで被覆したウェルに移した。多能性は、骨、軟骨及び脂肪組織の3つの間葉系列への分化により評価されてきた。免疫調節特性は、場合により、炎症誘発性刺激、例えば、INF-γ処置への応答での、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)及びHLA-Gの発現により評価してきた。
1回の染色あたりおおよそ0.85×105細胞をPBSで洗浄し、300gで5分間で1回遠心分離し、適切な量の抗体と一緒に4℃で30分間インキュベートした。次に、標識された細胞は上と同じくPBSで洗浄した。間葉系画分の特徴付けでは、ヒト表面抗原に対する蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体(mAb)を含有する以下のパネル:CD31(WM59)、CD34(581)、CD73(AD2)、CD44(G44-26)、CD14(MoP9)、CD19(HIB19)、CD105(266)(すべてBD Biosciences社製、San Jose, CA);HLA DR (Tu36)、CD45(HI30)(Invitrogen社)及びCD90(eBio5E10) (eBioscience社、USA)を使用した。それぞれの抗体クローンは、一次ヒト試料を使用して最適染色濃度まで滴定した。データ取得はCyFlow ML(Partec GmbH社、Munster, Germany)上で行い、続いてFloJoソフトウェア(TreeStar社、USA)を用いてデータ分析した。
頭部から尾部まで横断面でスライスした、全ラット胎仔(GD13)の凍結切片(7μm)並びに凍結切片(7μm)のヒト胚性心臓(妊娠9.5週)及び骨髄由来MSCを無菌ガラススライド上に並びに1-μm-厚PEN-膜被覆ガラススライド(Carl Zeiss社、Germany)上に収集した。Isl1陽性と陰性の両方を含む標的領域は、10×及び40×対物レンズを使用するキャプチャのために選択した。陰性領域は発生中の左心室から収穫した。凍結切片化は4-2-4プロトコルを使用して実施し、それぞれのスライドは3切片を乗せた。このプロトコルを使用する際、2つの非染色膜スライドを先行させ、その後4つの凍結切片スライドを続けたが、それに続いて、後者のスライドは培養された細胞についてと同じ一次及び二次抗体を使用して、Isl1に対して染色された。これらのプロトコルは、Isl1陽性及び陰性領域の位置を組織解剖学的に突き止め並びに高い品質のRNA収率を生むことを目指した。顕微解剖過程は目的の細胞を同定することにより実施し、この細胞は次の工程では線引きされて、レーザー解剖により切り取られた。
培養されたラット及びヒト多能性幹細胞由来の全RNAは、前のセクションに記載された通りにPicoPure RNA単離キット(PicoPure RNA isolation kit)を製造業者のプロトコルに従って使用して単離した。顕微解剖した組織由来の並びに培養された細胞由来の精製された全RNAの相当量(約2ng)は逆転写して、Ovation Pico WTA system(NuGEN Technologies社、CA, USA)を製造業者の使用説明書に従って使用して増幅させた。センス鎖cDNAはWT-Ovation Exon Module (NuGEN Technologies社)を使用して作製した。cDNAは断片化し、Encore Biotin Module (NuGEN社)を使用して標識した。標識されたcDNAは、それぞれAffymetrixラット及びヒト遺伝子ST 1.0マイクロアレイ(Affymetrix社、CA, USA)にハイブリダイズさせた。遺伝子チップを洗浄し、染色し、Fluidic Station 450及びGeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix社)を使用してスキャンした。マイクロアレイデータの前処理は、以下の方法:要約:PLIER;バックグランド補正:PM-GCBG;標準化:Global Medianを使用して、Affymetrix Expression Console (v. 1.1) (Affymetrix社)で実施した。
ヒートマップはQlucore Omics Explorer 2.2を使用して作成された。試料と変数の両方の階層的クラスタリングは、ユークリッド計量及びデータを使用して行われ、それぞれの変数は平均値0及び変動1に標準化された。平均連結法及びシグナルのlog2変換が使用された。ヒートマップカラースケールは赤色(高発現)から黒色(平均発現)を介して緑色(低発現)までの範囲である。
標識されたラットIsl1+細胞の心筋内注射用に使用されたRNUラット(遺伝子型rn/rnu, Charles River Deutschland社)は、ミダゾラム(ドルミカム, 5mg/kg)(Algol Pharma AB社、Germany)、メデトミジン塩酸塩(Domitor vet, 0.1mg/kg)(Orion社、Espoo, Finland)、フェンタニル(0.3mg/kg)(B.Braun Medical AG社、Seesatz, Switzerland)の皮下注射により麻酔し、それに続いて、心筋内注射を実施し下記の心筋梗塞を誘発することができるように気管内に挿管した。換気装置(7025 Rodent ventilator, UGO BASILE社 S.R.L, Italy)を使用して、室内気が一回換気量4〜5mlを用いて1分間あたり100サイクルの速度で陽圧換気を保った。麻酔は、フルマゼニル(Lanexat, 0.1mg/kg)(Hameln Pharma社、Germany)及びティパメゾル(Tipamezol)塩酸塩(Antisedan vet 5mg/kg)(Orion社、Espoo, Finland)の筋肉内注射により無効にした。術後鎮痛法は、ブプレノルフィン塩酸塩(Temgesic,3日間で1日あたり0.004mg/kg/twice) (Schering-Plough社、Belgium)を投与することにより維持した。機能不全の兆候を示したラットは研究から排除した。
RUNラットはIsl1+細胞がどのようにして注射されたかに応じて4つの群に分けられた。それぞれの実験では、心臓は左開胸術により露出された。心筋梗塞群では、左前下行動脈(LAD)は永久に結紮され、梗塞誘発は左心室の前後側壁の変色及びジスキネジアにより確かめられた。それぞれの実験では、400万の細胞が注射された静脈内実験を除いて、100万の標識されたIsl1+細胞(心臓組織から又は骨髄から得られた)を使用した。注射前、Isl1+細胞は、Neon(商標)エレクトロポレーションシステム(Invitrogen社)を使用して、2μgのpT2/C-fluc(Addgene社、US)、2μgのpT2-β-gal及び1μgのSB 100×を標識した。心筋への移植後細胞を検出するため、D-ルシフェリン(300mg/kg)を腹腔内に注射し、続いて15分間インキュベートした。生物発光撮像は、次の工程で、5分間露出及び高感度設定を使用して、IVIS(登録商標)Spectrum CT (Perkin Elmer社)において実施した。ラットは、移植細胞の発現を検出し全流束をLiving Image Software (Perkin Elmer社)を使用して定量化できるように腹側位で撮像した。対応するCT画像はQuantum FX μCT (Caliper, Perkin Elmer社)上17秒スキャン時間で実施した。発光画像は対応するCTスキャン上でスーパーインポーズした。
心臓は収穫され、7μm厚切片に凍結切片化された。ヘマトキシリン及びエオシン染色を使用して、心臓の異なる領域及びサブドメインの全体像を得た。これらの切片から、次に、目的の領域に対するX-gal染色へと向けることは可能であった。X-gal染色はβ-gal染色キット(K1465-01)(Invitrogen社)を製造業者のプロトコルに従って使用して行った。
Claims (18)
- 間葉系幹細胞(MSC)を培養増殖するための方法であって、少なくとも1つの、α4鎖を含むラミニンの存在下、低酸素又は正常酸素状態下でMSCを培養することを含む方法。
- 細胞を、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423からなる群から選択されるα4鎖を含む少なくとも1つのラミニンの存在下で培養する、請求項1に記載の方法。
- 細胞を低酸素状態で培養する、請求項1又は2に記載の方法。
- 少なくとも1つの、α4鎖を含むラミニンが、全ラミニンの少なくとも50%(w/w)を占める、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの、α4鎖を含むラミニンが、全ラミニンの少なくとも70%(w/w)を占める、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性前駆細胞を誘導するために使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋前駆細胞を誘導するために使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- MSCが、Wnt古典的経路を活性化する少なくとも1つの薬剤の存在下で培養される、請求項6又は7に記載の方法。
- PDGFR-アルファ及び/又はHLA-Gを発現する、請求項6又は8に規定の方法により得られた、多能性前駆細胞。
- 請求項9に規定の多能性前駆細胞を心細胞に分化させるための方法であって、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン221、及びその任意の組合せを含む群から選択される少なくとも1つのラミニンの存在下で前記多能性前駆細胞を培養する工程を含む方法。
- (i)心細胞がα-アクチニン、トロポニンT、及びトロポニンIを発現し;並びに
(ii)心細胞が自発的に1分間あたり40〜100拍動で拍動している
ことを特徴とする、請求項10に規定の方法により得られた、心細胞。 - Isl1、Sox2、SSEA1、Nanog、Tra-1、Brachyury T、CXCR4、PDGFRα、及びHLA-Gのうちの少なくとも1つに対して陽性であることを特徴とする、請求項7又は8に規定の方法により得られた、心筋前駆細胞。
- CXCR4を発現し、虚血心臓組織において伸張された形態で配置される、請求項12に記載の心筋前駆細胞。
- LN-511、LN-521、LN-421、LN-411、LN-111、LN-121、LN-221、LN-211を含む群から選択される少なくとも1つの外因的に由来するラミニンにより被覆されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に規定の方法により得られたMSC、又は請求項6から8及び10のいずれか一項に規定の方法により得られた前駆細胞、心筋前駆細胞又は心細胞。
- 請求項9及び11から14のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬。
- 心臓機能不全、心不全、心筋梗塞、先天性心疾患、心筋炎、弁膜機能不全、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、移植片対宿主病(GvHD)、固形臓器拒絶並びに/又は細胞及び/若しくは組織移植の拒絶、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、関節炎等のリウマチ様疾患、多発性硬化症等の任意のタイプの炎症駆動型若しくは免疫誘発疾患、ALS、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子(TNF)受容体関連周期熱症候群(TRAPS)、インターロイキン1受容体アンタゴニストの欠損(DIRA)、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、又は腎不全、肝不全、肺不全、心不全等の本質的に任意のタイプの臓器不全、並びに/或いはその任意の組合せの処置及び/又は予防において使用するための、請求項15に記載の医薬。
- 請求項9及び11から14のいずれか一項に記載の細胞並びに少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 少なくとも1つのラミニンを更に含む、請求項17に記載の医薬組成物。
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