JP5467275B2 - 電子移動抑制剤とその利用 - Google Patents
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Description
本明細書に開示されるインスレーターは、1又は2以上の蛍光標識に隣接して、隣接する蛍光色素、さらには隣接する可能性のある核酸塩基への電子移動を抑制することにより蛍光標識の蛍光強度の低下を抑制する分子又はその分子の構造を実質的に維持する基である。インスレーターは、これにより蛍光色素の蛍光強度を増強する増強剤として機能する。また、インスレーターを介在させて核酸塩基や蛍光塩基への電子移動を抑制することで、pHによって発光強度が影響される蛍光標識もpHにかかわらず発光強度を増強することができる。このため、蛍光を検出するために、ハイブリダイゼーション時とは異なるpHの適用が求められていたような蛍光標識であっても、蛍光検出のためのpH範囲の要請が緩まりpHの自由度が高まることで、実験操作におけるpH調整の簡略化や省略化が可能となる。
本インスレーターは非平面構造の1又は2以上の環状体を有している。非平面構造とは、その環状体の立体構造が非平面構造であることをいい、非平面構造を有しているとは、こうした非平面構造が許容されていることを意味する。こうした環状体としては、例えば、結合軸周りの回転が許容された結合を少なくとも2以上備えている環状体が挙げられ、具体的には、sp3結合様式を含む炭素−炭素結合を2以上有する環状体が挙げられる。こうした環状体としては、各種の単環炭化水素、橋かけ環炭化水素、スピロ炭化水素及びこれらの誘導体が挙げられる。
インスレーターは、1又は2以上の蛍光標識に隣接されて用いられる。ごく通常には、後述するように、蛍光標識を備えるラベル化剤においてインスレーターとして用いられる。蛍光標識は、特に限定しないで公知の蛍光標識を利用できる。例えば、シアニン系色素、メロシアニン系色素、アクリジン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、フラビン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素等が挙げられ、これらから適宜選択して使用できる。より具体的には、シアニン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、縮合芳香族環色素、キサンテン系色素が好ましく用いることができる。さらに具体的には、Cy3,Cy5,チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ピレン、ペリレン、ペリレンビスイミド、フルオレッセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン及びテキサスレッド並びにこれらの誘導体からなる群から選択される。
特に、ペリレンビスイミドは光化学的に安定であり、他の蛍光色素と比べ光退色に非常に強いという特長があるため、好ましい。ペリレンビスイミドは、本発明のインスレーターと組み合わせることにより他の蛍光色素同等もしくはそれ以上の量子収率を得ることが出来る。本発明によれば、好適なペリレンビスイミドは、以下の式Aで表される。
本明細書に開示されるラベル化剤は、蛍光標識を有する1又は2以上の蛍光標識ユニットと、非平面構造の環状体を有するインスレーターを含むインスレーターユニットと、を備え、インスレーターユニットを、前記インスレーターを1又は2以上の前記蛍光標識に隣接して配置可能に備えることができる。ここで、非平面構造の環状体を有するインスレーターは、本明細書に開示されるインスレーターである。
蛍光標識ユニットは、蛍光標識を有してラベル化剤を構成する単位である。蛍光標識以外のユニット構成部分は、主鎖又はバックボーン構造体の種類に依存した構成を有することができる。例えば、バックボーンがリン酸−糖バックボーン構造である場合、蛍光標識ユニットは、リン酸−糖部分を有することができる。すなわち、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位の塩基以外の骨格単位を備えることができる。また、バックボーン構造がPNAのバックボーン構造の場合には、当該PNAの骨格単位を備えることができる。さらに、バックボーン構造がリン酸−アルキレン鎖バックボーンである場合、リン酸−アルキレン鎖の骨格単位を備えることができる。リン酸−アルキレン鎖バックボーンは、合成の簡便性の観点から本ラベル化剤に有利である。また、蛍光標識ユニットは、主鎖又はバックボーンの種類に依存した構成を必ずしも採る必要はない。例えば、バックボーンがリン酸−糖バックボーンであっても、リン酸−アルキレン鎖の骨格単位を有していてもよい。リン酸−アルキレン鎖バックボーンを構成する蛍光標識ユニットは、例えば、以下の式(1)で表される。
インスレーターユニットは、インスレーターを有してラベル化剤を構成する単位である。蛍光標識ユニットと同様、インスレーター以外のユニット構成部分は、主鎖又はバックボーンの種類に依存した構成を有していてもよいし、異なる構成を有していてもよい。リン酸−アルキレン鎖バックボーンを構成するインスレーターユニットは、例えば、以下の式(2)で表される。
本明細書に開示の生体分子の検出方法は、生体分子を本ラベル化剤の蛍光標識に基づくシグナルによって検出する工程を備えることができる。本検出方法によれば、感度よく生体分子を検出することができる。生体分子の検出形態は特に限定されない。生体分子自体を本ラベル化剤でラベルして検出してもよいし、ラベル化されかつ生体分子を特異的に検出可能な検出用試薬、例えば、抗体、プローブ、プライマーなどによって、生体分子を検出してもよい。
本実施例では、以下に示す、インスレーターを有するユニット(炭素数3)を合成し、さらにそのアミダイトモノマーを以下のスキームに従い合成した。300mlのナスフラスコにD−トレオニノール(0.50g,4.6mmol)をジメチルホルムアミド(DMF)20mlに溶解させ、4−シクロヘキシル安息香酸(1.04g,5.1mmol)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(0.81g,6.0mmol)を加え、攪拌した。次に、10mlのDMFに溶解させておいたジシクロヘキシルカルボジイミド(1.24g,6.0mmol)を、室温で上記のDMF溶液に滴下した。室温で終夜攪拌後、溶媒をエバポレーターで留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法(展開溶媒 クロロホルム:メタノール=5:1)で精製し、化合物1−1を得た。
以下に示す蛍光標識(P:ペリレン)を備える蛍光標識ユニット、インスレーターHを備えるインスレーターユニット(化合物B)及びインスレーターJを備えるインスレーターユニット(化合物C)を合成した。なお、これらのユニットは、いずれも、核酸合成のためのアミダイトモノマーの形態で合成した。蛍光標識ユニットは、化合物Aを用いたケミストリー・アン・ユーロピアン・ジャーナル(Chemistry An European Journal)誌2010年第16巻2479−2486頁記載の方法で得、化合物B及びCは、原料としてtrans−4−イソプロピルシクロヘキサンカルボン酸及びビフェニル−4−カルボン酸を使用すること以外は、実施例1と同様の方法により得た。
本実施例では、実施例1〜2で合成した蛍光標識ユニット及びインスレーターユニットが導入された、以下に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。
実施例4で合成した各種オリゴヌクレオチドを以下に示す組み合わせで二重鎖として、合計6種類の二重鎖オリゴヌクレオチドを取得した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件で蛍光強度を測定した。結果を図5に示す。
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
本実施例では、以下に示す、蛍光標識としてペリレンビスイミド(B)を有する蛍光標識ユニット(アミダイトモノマー)を合成し、インスレーターI、Hを有するインスレーターユニット(アミダイトモノマー)とともに以下に示すオリゴヌクレオチドを、実施例4に準じて合成した。
本実施例では、蛍光標識を連結するユニット(炭素数3)のアミダイトモノマー(化合物A)を以下のスキームに従い合成した。100mlのナスフラスコにD−トレオニノール(1.00g,9.51mmol)を脱水メタノール15mlに溶解させ、攪拌した。次に、トリフルオロ酢酸エチル(1.25ml,10.5mmol)を、氷浴下上記のメタノール溶液に滴下した。氷浴下で2時間攪拌後、溶媒をエバポレーターで留去し、化合物1−7を得た。
次に、得られた化合物1−7(1.76g、8.75mmol)を200mlの二口ナスフラスコに採取し、窒素下で脱水ピリジン20mlを加えて溶解させ、これにN,N,ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA:1.74mL、10.5mmol)を加えて攪拌した。次に、100mlの二口ナスフラスコにジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl:3.56g、10.5mmol)とジメチルアミノピリジン(DMAP:0.16g、1.31mmol)を窒素下で加え、さらに溶媒として脱水ジクロロメタン15mlを加えて溶解させた。その後、このジクロロメタン溶液を、上記のピリジン溶液に氷浴中でゆっくりと滴下した。15分ほど氷浴下で攪拌した後に氷浴を取り除いて室温で攪拌を続け、ジクロロメタン溶液滴下後3時間後に反応を停止した。溶媒をエバポレーターで留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル:トリエチルアミン=80:20:3)で精製し、化合物1−8を得た。
実施例5で合成した各種オリゴヌクレオチドを、B1a/S0、I1BA/I1B、H1BA/H1B、H3BA/H3Bで組み合わせて二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件でこの蛍光強度を測定した。結果を図6に示す。
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
本実施例では、以下に示す、実施例1及び実施例2で準備した蛍光標識ユニットとインスレーターユニット(化合物A、B)を用いて、以下に示すオリゴヌクレオチドを、実施例3に準じて合成した。
実施例7で合成した各種オリゴヌクレオチドを、以下の組み合わせで二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、以下の条件で蛍光強度を測定した。結果を図7に示す。また、発光量を測定した。結果を以下に示す。
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
インスレーターH及び蛍光標識としてFITCを有するオリゴヌクレオチドは、アリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーを経由し、合成後のオリゴヌクレオチドに対して、FITCを導入するというスキームで行った。まず、ABI394型DNA合成機を使用し、実施例2で合成したインスレーターHを備えるインスレーターユニット(化合物B)、D−トレオニノールのアミノ基をアリルオキシカルボニル基で保護したホスホロアミダイトモノマーA、4つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いて、以下に示す3種のオリゴヌクレオチドをFITCに相当する部位にホスホロアミダイトモノマーAが配置されるオリゴヌクレオチドF1H0p(5’-FGGCAGCGTAGGTCCT-3’)及びF1H2p(5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’)を合成した。なお、4つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いて、相補鎖q(3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’)も合成した。
オリゴヌクレオチドp及び相補鎖qを塩基対を形成させて得られる二重鎖オリゴヌクレオチドの形態を図8に示す。
F1H2p…5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
F…蛍光色素(FITC)
H…インスレーター(trans-Isopropylcyclohexane)
相補鎖q…3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’(DNA)
実施例8で合成した各種オリゴヌクレオチドを、図8示す組み合わせで二重鎖オリゴヌクレオチドとして準備した。これらのオリゴヌクレオチドにつき、2つの異なるpH条件(7及び9)で蛍光強度を測定した。結果を図9に示す。
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
温度:20℃
条件2:pH9
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
Trisバッファー:10mmol/l(pH9.0)
温度:20℃
HFHp 5’-HFHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
HFp 5’-HFGGCAGCGTAGGTCCT-3’
FHp 5’-FHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
FHHp 5’-FHHGGCAGCGTAGGTCCT-3’
q(Target) 3’-CCGTCGCATCCAGGA-5’ (DNA)
(測定条件)
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
I1B 3’-CCATAGIICGTTAG-3’
DNA:1.0μmol/l
塩化ナトリウム:0.1mol/l
リン酸バッファー:10mmol/l(pH7.0)
Claims (16)
- 電子移動を抑制する電子移動抑制剤であって、
前記電子移動は、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動であり、
前記蛍光標識は、核酸塩基を備えるバックボーン構造体に連結されており、
前記電子移動抑制剤は、炭素数が4以上7以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を前記蛍光標識に隣接して備える、電子移動抑制剤。 - 前記電子移動抑制は、前記環状体を一つの前記蛍光標識の両側に隣接して備える、請求項1に記載の電子移動抑制剤。
- 前記環状体は、前記バックボーン構造体又は前記バックボーン構造体の前記核酸塩基と相補する核酸塩基を備える別のバックボーン構造体に連結されて用いられる、請求項1又は2に記載の電子移動抑制剤。
- 前記単環式アルカンは、シクロヘキサン誘導体である、請求項1〜3のいずれかに記載の電子移動抑制剤。
- 前記環状体は、以下から選択される、請求項4に記載の電子移動抑制剤。
- ラベル化剤であって、
核酸塩基を備えるバックボーン構造体に連結された、蛍光標識を有する一又は二以上の蛍光標識ユニットと、
前記バックボーン構造体及び/又は前記バックボーン構造体の前記核酸塩基と相補する核酸塩基を備える別のバックボーン構造体に連結された炭素数が4以上7以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を含む電子移動を抑制するための一又は二以上の電子移動抑制ユニットと、
を備え、
前記電子移動は、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動であり、
前記一又は二以上の電子移動抑制ユニットを、前記蛍光標識ユニットと前記蛍光標識ユニットとの間又は前記蛍光標識ユニットと前記核酸塩基との間に備える、ラベル化剤。 - 前記二つの電子移動抑制ユニットを、前記一つの蛍光標識ユニットの両側に隣接して備える、請求項6に記載のラベル化剤。
- 前記バックボーン構造体は、リン酸−糖バックボーン及び/又はリン酸−アルキレン鎖バックボーンのいずれかである、請求項6又は7に記載のラベル化剤。
- 前記蛍光標識ユニットは、以下の式(1)で表される、請求項6〜8のいずれかに記載のラベル化剤。
- 前記電子移動抑制ユニットは、以下の式(2)で表される、請求項6〜9いずれかに記載のラベル化剤。
- 前記蛍光標識は、シアニン系色素、メロシアニン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素、クマリン系色素及びアクリジン系色素からなる群から選択される、請求項6〜10のいずれかに記載のラベル化剤。
- 請求項6〜11のいずれかに記載のラベル化剤をオリゴヌクレオチドの一部に備える、ラベル化されたオリゴヌクレオチド。
- 以下の式(3)で表される、炭素数が4以上7以下であって置換されていてもよい非平面構造の単環式アルカンを有する環状体を備える、蛍光標識と蛍光標識との間又は蛍光標識と核酸塩基との間の電子移動を抑制する電子移動抑制剤用材料。
- 前記環状体は、以下から選択される、請求項13に記載の電子移動抑制剤用材料。
- 生体分子の検出方法であって、
生体分子を、請求項6〜11のいずれかに記載のラベル化剤の前記蛍光標識に基づくシグナルによって検出する工程、
を備える、方法。 - 蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの生産方法であって、
請求項6〜11のいずれかに記載のラベル化剤を含んだオリゴヌクレオチドを合成する工程、を備える、生産方法。
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