JP6491486B2 - ８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ - Google Patents

８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ Download PDF

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Description

本発明は、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体ならびに該ヌクレオシド誘導体又はポリヌクレオチド誘導体を含むプローブに関する。
周辺の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物については、これまでに多く報告されている。同様のヌクレオシドについてもいくつかの報告例がある。
本願発明者らも、次式で示されるプリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光性分子を導入してなる化合物が周辺の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献１：特開２０１１−３７７９６号公報）。
また、次式で示されるプリン塩基のＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光性分子を導入してなる化合物が周辺の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献２：特開２０１３−１５９５７４号公報）。
周辺の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物は、対象物質の極性環境の変化を色の違いによって検出できるため、遺伝子検出用のプローブ、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとしての利用が期待される。例えば、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面に蛍光ヌクレオシドを導入したプローブＤＮＡを作製し、対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を利用することで、目的とする塩基の種類を色の違いで識別することができるため、このような化合物は遺伝子検出用のプローブとして有用である。
しかし、一般的に、プリン塩基のＣ８位に置換基を導入すると、置換基とＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとが衝突し、その上、ヌクレオシドの糖と塩基とが通常のａｎｔｉ配座からｓｙｎ配座へと反転しやすくなってしまうため、Ｃ８位に置換基を導入したヌクレオシドを用いた場合にはＤＮＡの二重らせん構造が不安定化することが知られている。ＤＮＡの二重らせん構造が不安定化すると、その影響によっても周辺の極性環境が変化してしまうため、蛍光ヌクレオシドと対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を正確に検出できない場合がある。
また、プリン塩基のＣ７位に置換基を導入した化合物は、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化しない点では優れているが、例えば、７−デアザアデニン塩基などは一般的にマッチすると考えられるチミン塩基の他に、シトシン塩基とも水素結合を形成する場合があり、塩基識別能の点で改良の余地がある。また、この化合物を用いた場合、ＤＮＡのメジャーグルーブに蛍光色素を導入することになるが、この位置に導入された蛍光色素は上下のＧＣ塩基対により強く蛍光消光されてしまい、利用できるＤＮＡ配列に制限があった。
特開２０１１−３７７９６号公報 特開２０１３−１５９５７４号公報
このような状況の下、従来の化合物の良い光学特性を維持しつつ、ＤＮＡに導入した場合にもＤＮＡの二重らせん構造を不安定化せず、塩基識別能に優れた新規な蛍光ヌクレオシド及びそれを利用したプローブの開発が求められている。
本発明者等は、新規な環境感応型蛍光性プリンヌクレオシドを開発するために、まず、プリン塩基における置換基（蛍光性分子）の修飾位置について検討したところ、デアザアデニン塩基の７位及び３位に置換基を導入しても、天然の塩基対と同様に水素結合能を保持することが可能であることを知見し、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンに着目した。本発明者等は、まず、このアデニン類縁体を有するヌクレオシドを合成し、さらにアデニン類縁体の３位に蛍光性分子を導入することに成功した。また、本発明者等は、得られたヌクレオシド誘導体が、周辺の極性環境等の違いに応じて蛍光発光波長を変化させうることを見出した。本発明者等はさらに検討を進め、このヌクレオシド誘導体をポリヌクレオチド誘導体に導入し、得られたポリヌクレオチド誘導体を用いて標的遺伝子中の対面塩基の識別を行ったところ、対面塩基がフルマッチのチミン塩基の場合のみ蛍光発光波長を変化させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に示した８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびに該ヌクレオシド誘導体又はポリヌクレオチド誘導体を含むプローブに関するものである。
［１］下記式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
で示される化合物。
［２］前記Ｒ２が、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である、［１］に記載の化合物。
［３］前記Ｘが炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である、［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］前記Ｒ１が水素原子である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の化合物を含むプローブ。
［６］下記式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
で示される化合物。
［７］前記Ｒ１が水素原子である、［６］に記載の化合物。
［８］下記式（ＩＩＩ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）であり、ｓは、１、２又は３である。］
で示される化合物。
［９］前記Ｒ２が、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である、［８］に記載の化合物。
［１０］前記Ｘが炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である、［８］又は［９］に記載の化合物。
［１１］前記Ｒ１が水素原子である、［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の化合物。
［１２］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の化合物で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［１３］［１２］に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
［１４］下記式（ｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
で示される化合物。
［１５］前記Ｒ１が水素原子である、［１４］に記載の化合物。
［１６］下記式（ｉｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
で示される化合物。
［１７］前記Ｒ１が水素原子である、［１６］に記載の化合物。
［１８］下記式（ｉｉｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
で示される化合物。
［１９］前記Ｒ１が水素原子である、［１８］に記載の化合物。
［２０］下記式（ｉｖ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
で示される化合物。
［２１］前記Ｒ１が水素原子である、請求項２０に記載の化合物。
本発明によれば、新規なヌクレオシド誘導体である８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体及びそのヌクレオチド誘導体である８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体、それらの化合物の合成中間体、さらにはそれらの化合物のアミダイト体を提供することができる。また、本発明によれば、少なくとも１つのヌクレオチドが該ヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体を提供することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、周辺の極性環境等の微細環境の変化に伴って蛍光発光波長を変化させることができる。この性質を利用して、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体を、例えば生体内における極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、蛍光物質のみの場合と比べて溶解性が良好であり、細胞膜透過性も向上すると考えられることから、生体内における局所的な極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとしての有用性は高いと考えられる。
また、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、オリゴヌクレオチド鎖へ容易に導入することが可能である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体を導入してなる本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ｍＲＮＡやタンパク質、更には細胞内における局所的な極性環境等の微細環境の調査用プローブとして利用可能である。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、対面塩基のマッチ−ミスマッチの違いに伴って生じる極性環境等の微細環境の変化によって蛍光発光波長を変化させることから、対面塩基の種類を蛍光発光色で識別する遺伝子検出用のプローブとして利用可能である。本発明のポリヌクレオチド誘導体は、蛍光発光色の違いによって塩基の種類を判別することができるため、遺伝子検査用キットとして利用しやすいといった利点がある。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体である化合物１２を各種溶媒に溶解した溶液のＵＶスペクトル（ａ）、励起スペクトル（ｂ）及び蛍光スペクトル（ｃ）を示す図である。 本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体である化合物１２を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ２）と相補鎖ＤＮＡ（ｃＯＤＮ２）（ａ）、ＯＤＮ２とｃＯＤＮ２をハイブリダイズした後のＵＶスペクトル（ｂ）、励起スペクトル（ｃ）及び蛍光スペクトル（ｄ）を示す図である。
以下、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びそれらの合成中間体、さらにはそれらのアミダイト体、ポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ等について詳細に説明する。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
で示される化合物である。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体において、核酸塩基と結合する五炭糖は、２−デオキシリボースでもリボースでもよく、式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体をヌクレオチドに導入してＤＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ１は水素原子が好ましく、ＲＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ１としては水酸基が好ましい。
式（Ｉ）中、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である。Ｘが、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であると、核酸塩基と蛍光性分子とがＸを介してπ共役系を形成することができる。
式（Ｉ）中、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環である。なお、式中、＊は、Ｘとの結合位置を示す。これらの縮合環の中でも、ＤＮＡのマイナーグルーブに蛍光色素を導入する際に収まりがよいことから、ナフチル基、キノリル基及びイソキノリル基からなる群から選ばれる縮合環であることが好ましく、下記式で示される１−ナフチル基又は２−ナフチル基が特に好ましい。
上記のとおり、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンの３位に単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）を介して蛍光性分子が導入された構造を有しており、アデニン類縁体である核酸塩基部位と蛍光性分子とが単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）を介してπ共役系を形成できるように設計されている。８−アザ−３，７−ジデアザアデニンの３位に蛍光性分子が導入されていると、例えば該ヌクレオシド誘導体を含むポリヌクレオチドがＤＮＡ二重らせん構造を形成するときに蛍光性分子がＤＮＡのマイナーグルーブ側に位置することができ、より平面構造を形成し易く、π共役系が繋がり易くなる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、周辺の極性環境等の微細環境の変化に伴って蛍光発光波長を大きく変化させることができる。例えば極性の高い環境下では長波長側に極大をもつブロードな発光が観測され、極性の低い環境下では短波長側に極大を持つ蛍光発光が観測される。
このように本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、周辺の極性環境等の微細環境の変化に伴って蛍光発光波長が大きく変化する特徴的な性質を有しており、周辺の微細環境の変化を蛍光発光色の違いによって識別することが可能である。この性質を利用して、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体を、例えば、生体内における極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、パラジウム触媒及び必要に応じて銅触媒を用いたクロスカップリング反応を用いて、化合物（iii）の核酸塩基部位の３位に単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）を介して所望の縮合環を導入することにより簡便な方法で製造することができる。本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、例えば、下記のスキームに従って製造することができる。
［式中、Ａｒは、式（Ｉ）中、Ｒ２で示される縮合環であり、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。Ｒは水素原子又はアルキル基である。］
例えば、化合物（Ｉａ）は、化合物（iii）に、触媒量のパラジウム試薬及び銅試薬、過剰量の塩基の存在下、エチニル基を有する縮合環をクロスカップリングさせることにより得ることができる。
パラジウム試薬としては、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドなどを用いることができる。
銅試薬としては、ヨウ化銅などを用いることができる。
塩基としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどを用いることができる。
エチニル基を有する縮合環は、化合物（iii）に対して、等モルないしやや過剰で用いることが好ましく、その使用量は、化合物（iii）に対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
パラジウム試薬及び銅試薬は、それぞれ、触媒量で用いればよく、化合物（iii）に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
塩基は、化合物（iii）に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
反応は溶媒中で行うことが好ましく、溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
反応温度は、２０〜１００℃が好ましく、５０〜８０℃がより好ましい。また、反応時間は、１〜６時間が好ましく、２〜４時間がより好ましい。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（Ｉａ）を得ることができる。
次に、化合物（Ｉｂ）は、化合物（iii）に、触媒量のパラジウム試薬、過剰量の塩基の存在下、ボロン酸又はボロン酸エステルを有する縮合環をクロスカップリングさせることにより得ることができる。
パラジウム試薬としては、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドなどを用いることができる。パラジウム試薬は、触媒量で用いればよく、化合物（iii）に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
塩基としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどを用いることができる。
塩基は、化合物（iii）に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
ボロン酸又はボロン酸エステルを有する縮合環は、化合物（iii）に対して、等モルないしやや過剰で用いることが好ましく、その使用量は、化合物（iii）に対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
反応は溶媒中で行うことが好ましく、溶媒としては、化合物（Ｉａ）の製造方法において例示した溶媒と同じものを使用することができる。
反応温度は、５０〜１２０℃が好ましく、８０〜１００℃がより好ましい。また、反応時間は、１〜６時間が好ましく、２〜４時間がより好ましい。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（Ｉｂ）を得ることができる。
化合物（Ｉｃ）は、化合物（iii）に、触媒量のパラジウム試薬、過剰量の塩基の存在下、ビニル基を有する縮合環をクロスカップリングさせることにより得ることができる。
パラジウム試薬としては、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドなどを用いることができる。パラジウム試薬は、触媒量で用いればよく、化合物（iii）に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
塩基としては、トリエチルアミン、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどを用いることができる。
反応は溶媒中で行うことが好ましく、溶媒としては、化合物（Ｉａ）の製造方法において例示した溶媒と同じものを使用することができる。
反応温度は、５０〜１２０℃が好ましく、８０〜１００℃がより好ましい。また、反応時間は、１〜６時間が好ましく、２〜４時間がより好ましい。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（Ｉｃ）を得ることができる。
化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）の合成中間体である化合物（iii）は、下記のスキームに従って製造することができる。すなわち、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンの９位に五炭糖を導入してヌクレオシド（化合物（ｉ））を製造し、得られたヌクレオシドの３位にヨウ素を導入して化合物（iii）を製造することができる。
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
以下、各工程について説明する。
＜工程１＞
まず、化合物ａをアセトニトリルに懸濁させた。これに、水素化ナトリウムを加え、室温〜５０℃の油浴中で３０分〜１時間反応させる。その後、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド又は３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリドを加え、室温で１５分〜３０分反応させる。
水素化ナトリウムの使用量は、化合物ａに対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド又は３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリドは、化合物ａに対して、等モルないしやや過剰で用いることが好ましく、その使用量は、化合物ａに対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
反応終了後は、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｂを得ることができる。
＜工程２＞
次に、化合物ｂを０．５Ｍ ナトリウムメトキシド溶液に溶解させ、室温で３０分〜１時間反応させる。反応終了後、希塩酸で反応溶液を中和させ、析出した塩をエタノールで吸引濾過し除去する。必要に応じて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｃを得ることができる。
＜工程３＞
次に、化合物ｃをヒドラジン無水物に溶解させ、９０〜１００℃の油浴中で１〜２時間反応させる。溶媒を留去した後、得られた残渣にエタノールとラネーニッケルを加え、１〜２時間還流させる。反応終了後、ラネーニッケルを吸引濾過により除去し、濾液を減圧濃縮により溶媒を留去する。必要に応じて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（ｉ）を得ることができる。
続いて、化合物（ｉ）を用いて化合物（iii）を製造する。
＜工程４＞
化合物（ｉ）とイミダゾールを溶媒中に溶解させ、これにｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを加えて、室温で１０〜２０時間反応させる。反応終了後、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｄを得ることができる。
イミダゾールの使用量は、化合物（ｉ）に対して２．０〜３．０（モル倍量）であることが好ましい。
また、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドの使用量は、化合物（ｉ）に対して２．０〜３．０（モル倍量）であることが好ましい。
溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
＜工程５＞
次に、化合物ｄを溶媒中に溶解させ、これにＮ−ヨードスクシンイミドを加えて、室温で１０〜２０時間反応させる。必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｅを得ることができる。
Ｎ−ヨードスクシンイミドの使用量は、化合物ｄに対して１．０〜２．０（モル倍量）であることが好ましい。
溶媒としては、工程４で用いられる溶媒で例示したものと同じものを使用することができる。
＜工程６＞
次に、化合物ｅを溶媒中に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリドを加えて、室温で３０分〜１時間反応させる。反応終了後、反応液に酢酸を加えて中和する。溶媒を留去し、必要に応じて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（iii）を得ることができる。
テトラブチルアンモニウムフルオリドの使用量は、化合物ｅに対して２．０〜２．５（モル倍量）であることが好ましい。
溶媒としては、工程４で用いられる溶媒で例示したものと同じものを使用することができる。
上記のようにして化合物（ｉ）及び化合物（iii）を得ることができる。化合物（ｉ）及び化合物（iii）は、新規な化合物であり、これらの化合物は、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体の合成中間体として用いられるが、これらの化合物のアミダイト体は、ＤＮＡ合成試薬などとして利用することもできる。
例えば、化合物（ｉ）を、下記のスキームに従ってアミダイト化し、化合物（ｉｉ）を得ることができる。
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
以下、各工程について説明する。
＜工程７＞
化合物（ｉ）を溶媒中に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールを加えて、６０〜８０℃の油浴中で１〜２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去し、必要に応じて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｆを得ることができる。
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールの使用量は、化合物（ｉ）に対して１．０〜２．０（モル倍量）であることが好ましい。
溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
＜工程８＞
化合物ｆを無水ピリジンに溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて、室温で１〜２時間反応させる。反応終了後、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｇを得ることができる。
４，４’−ジメトキシトリチルクロリドの使用量は、化合物ｆに対して１．０〜１．２（モル倍量）であることが好ましい。
＜工程９＞
化合物ｇをアセトニトリルに溶解させ、これにトリエチルアミンと２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジトを加えて、室温で３０分〜１時間反応させる。反応終了後、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物（ｉ）のアミダイト体である化合物（ｉｉ）を得ることができる。
工程７、８及び９と同様の方法で、化合物（iii）のアミダイト体である化合物（ｉｖ）を得ることもできる。
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
化合物（ｉｉ）及び（ｉｖ）はそれぞれ、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成試薬として用いることができる。特に（ｉｖ）は、オリゴヌクレチド合成後に様々な置換基の導入が可能な試薬となり得る。
次に、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体について述べる。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体は、上述した本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合してなる化合物であり、
下記式（ＩＩＩ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）であり、ｓは、１、２又は３である。］
で示される化合物である。
式（ＩＩＩ）におけるＲ１、Ｒ２及びＸは、式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２及びＸと同義であり、好ましい例も同じである。
ｓは１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）の一リン酸体（ｓ＝１）は、通常、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体（Ｉ）をトリメチルホスファイトなどの溶媒に溶解し、０℃でオキシ塩化リンを加えて反応させた後に水を加えることで簡単に合成することができる。また、三リン酸体（ｓ＝３）は、水を加える前にトリブチルアンモニウムピロリン酸（二リン酸）を加えるステップを加えることを除いて一リン酸体と同様にして合成することができる。
また、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）の三リン酸体は、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡに容易に導入することができ、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが本発明のヌクレオチド誘導体で置換された本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。
あるいは、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体に触媒量の４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて反応させて得られる化合物を、トリエチルアミンの存在下、更に２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイトと反応させて、下記式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
で示されるアミダイト体を得、得られたアミダイト体を直接ＤＮＡ自動合成機にかけることで、本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。
より具体的には、下記のスキームに従って、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体のアミダイト体である化合物（ＩＩ）を得ることができる。
以下、各工程について説明する。
＜工程１０＞
化合物（Ｉ）を溶媒中に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールを加えて、６０〜８０℃の油浴中で１〜２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去し、必要に応じて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｈを得ることができる。
Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールの使用量は、化合物（Ｉ）に対して１．０〜２．０（モル倍量）であることが好ましい。
溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
＜工程１１＞
化合物ｈを無水ピリジンに溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて、室温で１〜２時間反応させる。反応終了後、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物ｉを得ることができる。
４，４’−ジメトキシトリチルクロリドの使用量は、化合物ｈに対して１．０〜１．２（モル倍量）であることが好ましい。
＜工程１２＞
化合物ｉをアセトニトリルに溶解させ、これにトリエチルアミンと２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジトを加えて、室温で３０分〜１時間反応させる。反応終了後、必要に応じて、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物（Ｉ）のアミダイト体である化合物（ＩＩ）を得ることができる。
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、前述したとおりポリヌクレオチドにおいて少なくとも一つのヌクレオチドが、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体で置換されてなるものである。
本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。
以上のようにして、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体を製造することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、周辺の極性環境等の微細環境の変化に応じて蛍光発光色を変化させることができる。この性質を利用して、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体を、局所的な極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、蛍光物質のみの場合と比べて溶解性が良好であり、細胞膜透過性も向上すると考えられることから、それ自体、生体内等における局所的な極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとして利用可能である。
また、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、ヌクレオチド誘導体を合成し、オリゴヌクレオチド鎖へ容易に導入することが可能である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体又は８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体をオリゴヌクレオチド鎖へ導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、ｍＲＮＡ、タンパク質又は細胞内における局所的な極性環境等の微細環境の調査用プローブとして利用することができる。
また、ＤＮＡ又はＲＮＡが二重鎖を形成すると、鎖中に含まれるリン酸基の影響により局所的な極性環境が変化することが知られているため、本発明のポリヌクレオチド誘導体を標的ＤＮＡやＲＮＡを検出する試薬として利用することもできる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、対面塩基のマッチ−ミスマッチの違いに伴って生じる極性環境等の微細環境の変化により蛍光発光波長を変化させることができる。特に、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、対面塩基がフルマッチのチミン塩基の場合に蛍光発光波長を変化させることから、対面のチミン塩基の識別に利用することができる。
上記のとおり、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体又はポリヌクレオチド誘導体を用いることによって、生体内等における局所的な環境の変化を検出することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。なお、以下において、％は、質量基準に基づくものである。
８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン（化合物４）及びそのホスホロアミダイト体（化合物７）の合成ならびにオリゴヌクレオチドＤＮＡへの導入
下記スキームに従って８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン（化合物４）及びそのホスホロアミダイト体（化合物７）を合成し、ＤＮＡ鎖に導入した。
化合物２の合成
化合物１（1.00 g, 6.5 mmol）をアセトニトリル（100 ml）中に懸濁させた。これに、水素化ナトリウム（339 mg, 8.5 mmol）を加え、５０℃の油浴中で反応させた。１時間後、室温に冷却してから、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（ｐ−トルオイル）−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド（2.66 g, 6.8 mmol）を加え、室温で３０分反応させた。反応終了後、懸濁液を吸引濾過により濾塊を除去した。続いて、濾液を減圧濃縮により溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、酢酸エチルークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物２（1.77 g, 54 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.41 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.75 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 4.44 (dd, J = 6.4, 13.2 Hz, 1H), 4.60-4.65 (complex, 2H), 5.90 (m, 1H), 6.55 (m, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.28 (m, 2H), 7.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.85 (m, 2H), 7.98 (m, 2H), 8.12 (s, 1H), 8.16 (d, J = 6.0 Hz, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 21.7, 21.7, 36.4, 63.8, 75.1, 82.9, 87.3, 104.3, 121.0, 126.0, 126.8, 129.1 (2C), 129.3 (2C), 129.7 (2C), 129.8 (2C), 134.4, 143.9 (2C), 143.9, 144.4, 145.3, 166.0, 166.2
化合物３の合成
化合物２（1.18 g, 2.3 mmol）を０．５Ｍ ナトリウムメトキシド溶液に溶解させ、室温で３０分反応させた。反応終了後、希塩酸で反応溶液を中和させ、析出した塩をエタノールで吸引濾過させ除去した。濾液を減圧濃縮により溶媒を留去し、再度エタノールを加え、析出した塩を取り除く操作を合計３回行なった。残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物３（566 mg, 90 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.33 (ddd, J = 4.4, 6.4, 13.2 Hz, 1H), 2.87 (ddd, J = 6.0, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.72 (dd, J = 5.2, 5.6 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 6.0, 6.4 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 38.4, 62.1, 70.8, 86.4, 87.9, 105.5, 119.7, 133.7, 143.4, 143.6, 144.0
化合物４の合成
化合物３（800 mg, 3.0 mmol）をヒドラジン無水物（8 ml）に溶解させ、９０℃の油浴中で２時間反応させた。溶媒を留去した後、得られた残渣をエタノール（50 ml）とラネーニッケルを加え、2時間還流させた。反応終了後、吸引濾過を行い、ラネーニッケルを除去した。続いて、濾液を減圧濃縮により溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルム（１％アンモニア水含有）の混合溶液で溶出し、化合物４（400 mg, 54 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.24 (ddd, J = 4.4, 6.8, 13.2 Hz, 1H), 2.83 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 3.81 (m, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.72 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.73 (br, 2H), 6.83 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.21 (s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 38.3, 62.4, 71.0, 85.6, 87.5, 94.6, 108.1, 133.8, 144.0, 144.4, 154.0
化合物５の合成
化合物４（50.0 mg, 0.20 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.14 ml, 0.60 mmol）を加えて、８０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５（72.9 mg, 93 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (m, 6H), 1.32 (m, 4H), 1.61 (m, 4H), 2.27 (ddd, J = 4.4, 6.4, 12.8 Hz, 1H), 2.86 (m, 1H), 3.30-3.41 (complex, 5H), 3.49 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.73 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.71 (s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 13.6, 13.7, 19.2, 19.6, 28.7, 30.7, 38.3, 44.2, 50.6, 62.4, 71.0, 85.8, 87.5, 99.1, 115.5, 134.4, 143.4, 144.5, 155.5, 157.0
化合物６の合成
化合物５（70.0 mg, 0.18 mmol）を無水ピリジン（3 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（73.0 mg, 0.22 mmol）を加えて、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物６（103 mg, 83 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 0.98 (m, 6H), 1.41 (m, 4H), 1.69 (m, 4H), 2.43 (m, 1H), 3.07-3.17 (complex, 3H), 3.47 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.66 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 4.09 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.77 (m, 1H), 6.52 (dd, J = 4.0, 6.8 Hz, 1H), 6.66-6.75 (complex, 4H), 7.11-7.38 (complex, 10H), 8.00 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 8.80 (s, 1H); 13C-NMR (acetone-d6, 100 MHz) δ 14.0, 14.2, 20.5, 20.9, 30.4, 32.0, 39.6, 45.6, 52.1, 55.4 (2C), 65.5, 72.6, 86.5, 86.9, 87.1, 100.0, 113.7 (4C), 117.5, 127.3, 128.4 (2C), 129.0 (2C), 130.8 (2C), 131.0 (2C), 135.2, 136.9, 137.0, 144.4, 145.8, 146.4, 156.5, 158.4, 159.4, 159.4
化合物７の合成
化合物６（60.0 mg, 8.7×10-2 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエリルアミン（0.5 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（100 μl,）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物７を得た。
ＤＮＡ合成
得られた化合物７をアセトニトリル６００μｌに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００ ＤＮＡシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入し、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１）を得た。
３−ヨード−８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン（化合物１０）の合成
下記スキームに従って３−ヨード−８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン（化合物１０）を合成した。
化合物８の合成
化合物４（170 mg, 0.68 mmol）とイミダゾール（462 mg, 6.8 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させ、これにｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（512 mg, 3.4 mmol）を加えて、室温で一晩中反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、塩化アンモニウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物８（245 mg, 75 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ -0.02 (s, 3H), -0.01 (s, 3H), 0.13 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 2.29 (ddd, J = 3.2, 6.4, 13.2 Hz, 1H), 3.05 (m, 1H), 3.65 (complex, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.66 (m, 1H), 5.08 (br, 2H), 6.38 (m, 1H), 6.91 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ -5.5 (2C), -4.7 (2C), 18.0, 18.4, 25.8 (3C), 25.9 (3C), 38.7, 63.5, 72.8, 86.9, 87.9, 97.0, 109.1, 132.3, 143.5, 144.9, 152.8
化合物９の合成
化合物８（230 mg, 0.48 mmol）をＤＭＦ（6 ml）に溶解させ、これにＮ−ヨードスクシンイミド（216 mg, 0.96 mmol）を加えて、室温で一晩中反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物９（272 mg, 94 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ -0.05 (s, 3H), -0.02 (s, 3H), 0.14 (s, 6H), 0.85 (s, 9H), 0.94 (s, 9H), 2.32 (ddd, J = 4.0, 6.4, 13.2 Hz, 1H), 3.14 (ddd, J = 6.0, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 3.58-3.66 (complex, 2H), 4.00 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 5.09 (br, 2H), 7.41 (dd, J = 6.0, 6.4 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 8.13 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ -5.4 (2C), -4.7, -4.6, 18.0, 18.3, 25.8 (3C), 25.9 (3C), 38.5, 57.5, 63.6, 72.8, 84.8, 87.6, 111.3, 132.3, 143.8, 152.5, 152.8
化合物１０の合成
化合物９（260 mg, 0.43 mmol）をＴＨＦ（10 ml）に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（１M, 0.90 ml, 0.90 mmol）を加えて、室温で１時間反応させた。反応後、反応液に酢酸(51 μl, 0.90 mmol)を加えて中和した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物１０（136 mg, 84 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.29 (ddd, J = 4.4, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 2.99 (ddd, J = 6.0, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 3.27 (m, 1H), 3.44 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.68 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.96 (br, 2H), 7.27 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 8.23 (s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 38.1, 55.4, 62.4, 71.1, 84.2, 87.6, 110.6, 133.9, 143.0, 152.7, 154.0
３位にエチニルナフタレンを連結した８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン誘導体（化合物１２）の合成
下記スキームに従って３位にエチニルナフタレンを連結した８−アザ−３，７−ジデアザ−２’−デオキシアデノシン誘導体（化合物１２）を合成した。
化合物１２の合成
化合物１０（61.1 mg, 0.16 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）（9.4 mg, 0.81×10-2 mmol）、ヨウ化銅（1.5 mg, 0.79×10-2 mmol）および１−エチニルナフタレン（30.4 mg, 0.20 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（0.3 ml）を加えて、６０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物１２（62.0 mg, 95 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.33 (ddd, J = 4.0, 6.8, 13.2 Hz, 1H), 3.01 (m, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.52 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 5.29 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.43 (br, 2H), 7.54-7.72 (complex, 3H), 7.85-8.02 (complex, 3H), 8.18 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.47 (m, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 38.2, 62.4, 71.1, 85.5, 87.8, 89.9, 90.9, 91.5, 107.6, 120.5, 125.6, 125.8, 126.7, 127.4, 128.4, 128.4, 129.9, 132.0, 132.9, 134.6, 142.2, 150.0, 154.2
実施例３で得られた化合物１２について、下記の手順に従い、光学特性を測定した。
［１]ＵＶスペクトルの測定
化合物１２を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール、エタノール、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール、エチレングリコール）に溶解し、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）を用いてＵＶスペクトルを測定した。
［２］蛍光スペクトルの測定
化合物１２を、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール、エタノール、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール、エチレングリコール）に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて蛍光スペクトルを測定した。
［３］励起スペクトルの測定
化合物１２を、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール、エタノール、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール、エチレングリコール）に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて励起スペクトルを測定した。
測定結果を図１に示す。なお、化合物１２の各溶媒中における最大吸収波長λab.max(nm)、最大蛍光波長λmax (nm)及び蛍光量子収率Φflは、表１に示したとおりである。
これらの結果に示されるとおり、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体である化合物１２は、周辺の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させることがわかった。
ホスホロアミダイト体（化合物１５）の合成及びオリゴヌクレオチドＤＮＡへの導入
下記スキームに従って、実施例３で得られた本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体（化合物１２）をアミダイト化し、ＤＮＡ鎖に導入した。
化合物１３の合成
化合物１２（40.0 mg, 0.10 mmol）をＤＭＦ（2 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（72 μl, 0.30 mmol）を加えて、８０℃の油浴中で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物１３（42.0 mg, 78 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.95 (m, 6H), 1.34 (m, 4H), 1.62 (m, 4H), 2.36 (ddd, J = 4.0, 6.8, 13.2 Hz, 1H), 3.04 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.44-3.55 (complex, 3H), 3.62 (m, 2H), 3.92 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 5.30 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.44 (m, 1H), 7.56-7.75 (complex, 3H), 7.91-8.03 (complex, 3H), 8.25 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.85 (s, 1H); 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 13.6, 13.7, 19.2, 19.6, 28.7, 30.6, 38.2, 44.5, 50.9, 62.5, 71.1, 85.5, 87.9, 89.5, 93.0, 95.2, 115.2, 120.1, 125.7, 125.8, 126.8, 127.5, 128.4, 128.9, 130.4, 132.0, 132.9, 135.2, 142.5, 149.1, 156.3, 157.2
化合物１４の合成
化合物１３（42.0 mg, 7.8×10-2 mmol）を無水ピリジン（2 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（31.6 mg, 9.3×10-2 mmol）を加えて、室温で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、エタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物１４（64.2 mg, 98 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 1.00 (m, 6H), 1.43 (m, 4H), 1.73 (m, 4H), 2.51 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.20-3.28 (complex, 2H), 3.53 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.68-3.72 (complex, 8H), 4.21 (m, 1H), 4.46 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.86 (m, 1H), 6.70 (m, 4H), 7.09-7.41 (complex, 9H), 7.54 (dd, J = 4.0, 6.8 Hz, 1H), 7.56-7.73 (complex, 3H), 7.97-8.01 (complex, 3H), 8.16 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.74 (m, 1H), 8.92 (s, 1H); 13C-NMR (acetone-d6, 100 MHz) δ 14.0, 14.2, 20.4, 20.8, 30.0, 31.9, 39.7, 45.9, 52.4, 55.4 (2C), 65.6, 72.7, 86.5, 86.9, 87.1, 90.7, 93.7, 97.2, 113.7 (4C), 117.0, 122.0, 126.4, 127.2, 127.2, 127.5, 128.1, 128.3 (2C), 129.0 (2C), 129.2, 129.5, 130.8 (2C), 131.0 (2C), 131.3, 133.7, 134.3, 135.9, 136.9, 137.0, 143.9, 146.4, 150.0, 157.1, 158.5, 159.3, 159.4
化合物１５の合成
化合物１４（64.2 mg, 7.8×10-2 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエチルアミン（0.5 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（150 μl,）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物１５を得た。
ＤＮＡ合成
得られた化合物１５をアセトニトリル６００μｌに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００ ＤＮＡシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入し、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ２）を得た。
実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ２）について、下記の手順に従い、各種相補鎖（ｃＯＤＮ２）とハイブリダイズした後の光学特性を測定した。
［１]ＵＶ吸収スペクトルの測定
実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ（ｃＯＤＮ２）を2.5μＭの濃度になるように各種加え、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）にてＵＶ吸収スペクトルを測定した。
［２］蛍光スペクトルの測定
実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ（ｃＯＤＮ２）を2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて蛍光スペクトルを測定した。
［３］励起スペクトルの測定
実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ（ｃＯＤＮ２）を2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて励起スペクトルを測定した。
測定結果を図２に示す。なお、最大吸収波長λab.max (nm)、最大蛍光波長λmax (nm)及び発光波長変化Δλは、表２に示したとおりである。
これらの結果に示されるとおり、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体である化合物１２を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、対面塩基によって蛍光発光波長を変化させることがわかった。特に対面塩基が、フルマッチ配列となるチミン塩基の時には長波長側で発光が観察され、波長変化によりチミン塩基の識別が可能である。
実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ２）について、下記の手順に従い、ＤＮＡ高次構造の熱安定性を評価した。
Ｔｍ値（融解温度：melting temperature）は、特定の条件下における固有のＤＮＡ高次構造の熱安定性の指標である。実施例５で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ２）に各種相補鎖（Ｎ＝Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ａ）を加えたときのＴｍ値及びその変化量を次の手順に従って測定し、ＤＮＡ二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度２．５μＭに調製したＤＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：ＵＶ−２５５０）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてＴｍ値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチドＤＮＡのＴｍ値をもとに、変化量を算出した。結果を表３に示す。
これらの結果に示されるとおり、対面塩基がフルマッチのチミンの時に最も高いTｍ値が観察され、チミン塩基とのみ安定な塩基対を形成することが示唆された。
なお、本測定に用いたオリゴヌクレオチドＤＮＡ及び相補鎖ＤＮＡの塩基配列を下表に示す。
本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体は、生体内等における極性環境等の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。また、本発明の８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体又は８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、ｍＲＮＡ、タンパク質又は細胞内における局所的な極性環境等の微細環境の変化を検出するためのプローブとして利用することができる。また、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのプローブとして利用することもできる。

Claims (21)

  1. 下記式（Ｉ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
    で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
    で示される化合物。
  2. 前記Ｒ２が、下記式：
    で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記Ｘが炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物を含むプローブ。
  6. 下記式（ＩＩ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
    で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である。］
    で示される化合物。
  7. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項６に記載の化合物。
  8. 下記式（ＩＩＩ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基であり、Ｘは、単結合、炭素−炭素二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）又は炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）であり、Ｒ２は、下記式：
    で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）であり、ｓは、１、２又は３である。］
    で示される化合物。
  9. 前記Ｒ２が、下記式：
    で示される縮合環（但し、＊は、Ｘとの結合位置を示す。）である、請求項８に記載の化合物。
  10. 前記Ｘが炭素−炭素三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）である、請求項８又は９に記載の化合物。
  11. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが請求項８〜１１のいずれか一項に記載の化合物で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
  13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
  14. 下記式（ｉ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
    で示される化合物。
  15. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項１４に記載の化合物。
  16. 下記式（ｉｉ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
    で示される化合物。
  17. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項１６に記載の化合物。
  18. 下記式（ｉｉｉ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
    で示される化合物。
  19. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項１８に記載の化合物。
  20. 下記式（ｉｖ）：
    ［式中、Ｒ１は、水素原子又は水酸基である。］
    で示される化合物。
  21. 前記Ｒ１が水素原子である、請求項２０に記載の化合物。
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