CN101631796B - 具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了能够有效地检测例如核酸双螺旋结构的标记物。提供了具有衍生自单核苷或单核苷酸的结构的化合物、其互变异构体或立体异构体、或其盐,其中所述结构由下述式(1)、(1b)或(1c)表示。例如,B为具有核酸碱基骨架的原子团,E为具有脱氧核糖骨架、核糖骨架或自其衍生的结构的原子团,或具有肽结构或拟肽结构的原子团,Z11和Z12分别表示氢原子、保护基或展现出荧光性的原子团,可以相同或者不同。
Description
技术领域
本发明涉及具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒。
背景技术
在疾病的基因诊断和基因的表达分析等中,需要检出具有某种特定序列的核酸。为此常使用利用荧光的方法,例如通常使用通过将一种荧光染料共价结合到DNA上所得的荧光探针作为标记物。
这样的标记物(荧光探针)的问题在于例如在没有与互补的核酸形成双螺旋的情况下仍发出荧光。为了消除探针本身的荧光而利用FRET的方法虽然有效(非专利文献1-4等),但存在引入两种荧光染料的成本等问题。
此外,已知噻唑橙(thiazole orange)是作为通过与DNA或RNA的相互作用增加荧光强度的荧光染料的花菁染料之一。虽然尝试过通过使噻唑橙共价键结合至DNA来制作荧光探针的实例,然而其仍通过与含有嘌呤碱基的单链DNA的相互作用发出强烈的荧光(非专利文献5),因此在形成双螺旋时荧光强度的增加较小,不能说是成功(非专利文献6和7)。
非专利文献1:Tyagi,S.Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechnol.14,303-308。
非专利文献2:Nazarenko,I.A.,Bhatnagar,S.K.,Hohman,R.J.(1997)Nucleic Acids Res.25,2516-2521。
非专利文献3:Gelmini,S.,Orlando,C.,Sestini,R.,Vona,G.,Pinzani,P.,Ruocco,L.,Pazzagli,M.(1997)Clin.Chem.43,752-758。
非专利文献4:Whitcombe,D.,Theaker,J.,Buy,S.P.,Brown,T.,Little,S.(1999)Nat.Biotechnol.17,804-807。
非专利文献5:Biopolymers 1998,46,39-51。
非专利文献6:Analytica Chimica Acta 2002,470,57-70。
非专利文献7:Chemistry-A European Journal 2006,12,2270-2281。
发明内容
因此,本发明的目的是提供能够有效地检测出核酸双螺旋结构的标记物。
为了解决上述问题,本发明的化合物为具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、其互变异构体或立体异构体,或其盐,其中所述结构以下述式(1)、(1b)或(1c)表示。
[化20]
在所述式(1)、(1b)和(1c)中,
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或者人工核酸碱基骨架的原子团,
E为
(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架或由这其中的任一骨架衍生的结构的原子团,或
(ii)具有肽结构或拟肽结构的原子团,
Z11和Z12分别表示氢原子、保护基或展现出荧光性的原子团,可以相同或者不同,
Q在
E为前述(i)的原子团时,为O,
E为前述(ii)的原子团时,为NH,
X在
E为前述(i)的原子团时,为氢原子、能够用酸脱保护的羟基保护基、磷酸基(单磷酸酯基)、二磷酸基(二磷酸酯基)或三磷酸基(三磷酸酯基),
E为前述(ii)的原子团时,为氢原子或氨基保护基,
Y在
E为前述(i)的原子团时,为氢原子、羟基保护基或亚磷酰胺基(phosphoramidite group),
E为前述(ii)的原子团时,为氢原子或保护基,
L1、L2和L3各自为连接体(桥连原子或原子团),主链长(主链原子数)任意,在主链中,各自均可以含有或不含C、N、O、S、P和Si,在主链中,各自均可以含有或不含单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、亚胺基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3彼此之间可以相同或不同,
D为CR、N、P、P=O、B或SiR,R为氢原子、烷基或任意取代基,
b为单键、双键或三键,
或者,在所述式(1)中,L1和L2为所述连接体,L3、D和b不存在,L1和L2直接连接于B,
所述式(1b)中、T在
E为前述(i)的原子团时,为磷酸桥连(PO4 -),其中1个以上的氧原子(O)可由硫原子(S)替代,
E为前述(ii)的原子团时,为NH。
此外,本发明的核酸是具有至少一种以下式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的核酸、其互变异构体或立体异构体,或其盐。此外,在本说明书中,当化学式(例如以下式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的键从括号内部向括号外延伸并且在括号外侧在所述键上添加星号时,所述星号表示在该键上结合某个原子或原子团。
[化21]
[化22]
[化23]
[化24]
[化25]
[化26]
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中
B、E、Z11、Z12、L1、L2、L3、D和b各自与上述式(1)、(1b)或(1c)中结构相同,
其中
式(16)、(17)和(18)中,E为上述式(1)、(1b)或(1c)中的(i)的原子团,磷酸桥连中至少一个O原子可被S原子替代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为上述式(1)、(1b)或(1c)中的所述(ii)的原子团,
式(17)和(17b)中,各B可相同或不同,各E可相同或不同。
此外,本发明的标记物为
(i)这样的标记物:一个分子内的两个平面化学结构不在同一平面内,而是以某一角度存在,但该分子在***或沟结合到核酸中时,所述两个平面化学结构在同一平面内排列配置,从而产生荧光发光;
(ii)由两个以上染料分子群形成的标记物,其中,虽然由于两个以上染料分子由于平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但这些分子在***或沟结合至核酸中时,通过所述聚集状态的解除会产生荧光发光;或者
(iii)一种复合体标记物,其以在同一分子内具有两个以上染料分子的化学结构作为特征性化学结构,其中,虽然由于两个以上的染料分子平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但是这些分子在***或沟结合到核酸中时,通过所述聚集状态的解除会产生荧光发光。
此外,本发明的核酸检测方法为:
(I)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——标记单核苷酸或标记寡核苷酸作为底物进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现出荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测核酸合成;
(II)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——单链核酸作为第一核酸,将其与具有与所述第一核酸互补的序列或与所述互补序列类似的序列的第二核酸杂交来进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测所述第一核酸与所述第二核酸的杂交情况;
(III)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——单链核酸作为第一核酸,将其与具有与所述第一核酸互补的序列或与所述互补序列类似的序列的第二核酸杂交来进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测所述第一核酸与所述第二核酸的杂交情况;
或者
(IV)核酸检测方法,其特征在于使用第三核酸来检测三链核酸或核酸类似物的形成情况,所述第三核酸通过使用具有所述第一核酸序列、所述第二核酸序列或与这些序列互补的序列、或者与所述的这些序列互补的序列相似的序列,并且由本发明的标记物或复合体标记物标记或未被其标记。
此外,本发明的试剂盒含有核酸合成装置、标记物和荧光强度测定装置,所述标记物为所述的本发明标记物。
本发明的化合物和核酸由于具有所述结构,从而可用作能够有效地检测出核酸双螺旋结构的标记物。更具体而言,在例如所述式(1)、(1b)、(1c)、(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)中,Z11和Z12为展现荧光性的原子团的化合物或核酸适合用作所述的本发明标记物。此外,Z11和Z12为氢原子或保护基的化合物或核酸可用作所述标记物的合成原料或合成中间体。然而,本发明的化合物和核酸的用途不限于此,可以用于任何用途。
附图说明
图1:图1为模型化地显示本发明原理的图。
图2:图2显示了实施例化合物的1H和13C NMR谱图。
图3:图3显示了实施例其他化合物的1H和13C NMR谱图。
图4:图4显示了经过纯化的DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’的MALDI TOF质谱图。箭头为经过纯化的生成物的质量峰(4101.9)。通过分子量计算值4102.8(C134H176N52O76P12)得到的[M-H]-计算值为4101.8,其是一致的。
图5:图5显示了DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’与生物素衍生物的反应产物的MALDI TOF质谱图。箭头为经过纯化的生成物的质量峰(4554.3)。通过分子量计算值4555.4(C134H176N52O76P12)得到的[M-H]-计算值为4554.4,其是一致的。
图6:图6显示了实施例化合物(用染料标记的DNA)的1H NMR谱图(DMSO-d6)。
图7:图7显示了图6化合物(用染料标记的DNA)的反相HPLC图。
图8:图8显示了图6化合物(用染料标记的DNA)的MALDI TOF质谱图。
图9:图9显示了实施例的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的UV谱。
图10:图10显示了在使用488nm的激发光时,图9的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的荧光谱。
图11:图11显示了在使用510nm的激发光时,图9的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的荧光谱。
图12:图12显示了另一实施例的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的UV谱。
图13:图13显示了图12的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的荧光谱。
图14:图14显示了再一实施例的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的UV谱。
图15:图15显示了图14的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的荧光谱。
图16:图16显示了又一实施例的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的UV谱。
图17:图17显示了图16的荧光探针为单链状态时、DNA-DNA双螺旋时以及DNA-RNA双螺旋时的三个样本的UV谱。
图18:图18为显示实施例中的几种荧光探针的吸收谱、激发谱和发射谱的图。
图19:图19为显示实施例中的其他荧光探针的吸收谱、激发谱和发射谱的图。
图20:图20为在各种温度和浓度下测定实施例的荧光探针的吸收谱所得的吸收谱图。
图21:图21为将实施例的荧光探针进行杂交所得的双链的CD谱图。
图22:图22为显示实施例中另一些荧光探针的吸收谱、激发谱和发射谱的图。
图23:图23为显示将实施例的另一些荧光探针进行杂交得到双链时的荧光发光的图。
图24:图24为显示实施例的再一些荧光探针的吸收谱和发射谱的图。
图25:图25为显示与实施例的荧光探针进行了杂交的RNA链被RNase H消化时的荧光变化的图。
图26:图26为观测的改变互补DNA链与实施例的荧光探针的浓度比时荧光发光强度的变化。
图27:图27是显示实施例的印迹检测中的荧光发光状态的图。
图28:图28是将实施例的荧光探针导入细胞时的微分干涉测定照片。
图29:图29是将实施例的荧光探针导入细胞时观察荧光所拍摄的照片。
图30:图30为显示将图28和图29重叠的照片。
图31A:图31A是将实施例的另一些荧光探针导入细胞时观察荧光所拍摄的照片。
图31B:图31B是将实施例的再一些荧光探针导入细胞时观察荧光所拍摄的照片。
图32:图32是显示将与图28-30相同的探针注入细胞核后荧光随时间的变化的图。
图33:图33是将实施例的又一些荧光探针导入细胞时观察荧光所拍摄的照片。
具体实施方式
以下,更具体地说明本发明的实施方案。
本发明的化合物、核酸和标记物
本发明的化合物和核酸除了用所述化学式表示以外,没有特别的限制。如前所述,对其用途也没有特别的限制,例如,可用作所述本发明的标记物、或其合成原料或合成中间体。关于本发明的化合物、核酸和标记物,更详细的描述例如下文。
本发明的化合物中,在所述式(1)、(1b)和(1c)中,
E优选为例如具有DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA、LNA或PNA(肽核酸)的主链结构的原子团。
此外,在所述式(1)和(1c)中,
[化27]
所示的原子团优选为下式(2)-(4)中任一个所表示的原子团,
[化28]
所述式(1b)中,
[化29]
所示的原子团优选为下式(2b)-(4b)中任一个所表示的原子团。
[化30]
所述式(2)-(4)和(2b)-(4b)中,
A为氢原子、羟基、烷基或吸电子基,
M和J各自为CH2、NH、O或S,可以相同或不同,
B、X和Y各自与所述式(1)、(1b)或(1c)中相同,
所述式(2)、(3)、(2b)和(3b)中,磷酸桥连中一个以上的O原子可被S原子替代。
考虑到容易合成等方面,E优选为例如具有DNA、修饰DNA、RNA或修饰RNA的主链结构的原子团,但也可为具有LNA或PNA(肽核酸)的主链结构的原子团。
所述式(2)和(2b)中,
A中,优选例如所述烷基为甲氧基,所述吸电子基为卤素。
所述式(1)、(1b)或(1c)中,
L1、L2和L3的主链长(主链原子数)各自优选为2以上的整数。L1、L2和L3的主链长(主链原子数)的上限没有特别限制,例如为100以下,更优选为30以下,特别优选为10以下。
本发明的化合物例如优选为下式(5)、(6)、(6b)或(6c)所示的化合物、其互变异构体或立体异构体,或其盐。
[化31]
所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中,
l、m和n为任意值,可以相同或不同,
B、E、Z11、Z12、X、Y和T与所述式(1)和(1b)中相同。
所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中,
l、m和n各自优选为2以上的整数。l、m和n的上限没有特别限制,例如为100以下,更优选为30以下,特别优选为10以下。
本发明的化合物中,优选Z11和Z12是显示激子效应的原子团。由此,例如在形成双螺旋结构时荧光的增加变大,能够更加有效地检测出双螺旋结构。然而,在本发明的化合物中,即使Z11和Z12不是显示激子效应的原子团,或者1个分子中只导入1个展现出荧光性的原子团(染料),仍然能够有效地检测出双螺旋结构。
Z11和Z12例如如前所述优选为具有荧光性的原子团。对所述具有荧光性的原子团没有特别限制。Z11和Z12例如各自独立地更优选为由噻唑橙、噁唑黄、花菁、半花菁(hemicyanine)、其他花菁染料、甲基红、偶氮染料或其衍生物衍生而成的基团。此外,也适合使用由其他公知的染料衍生的基团。已报导了多种通过与DNA等核酸键合从而使荧光强度变化的荧光染料。典型的实例为,已知溴化乙锭通过***DNA双螺旋结构而显示强烈荧光,多用于DNA检测。此外,还已知芘甲酰胺(ピレンカルボキシアミド)和prodan是可根据很小的极性控制荧光强度的荧光染料。此外,所述噻唑橙是将苯并噻唑环与喹啉通过次甲基连接的荧光染料,通常显示微弱的荧光,但通过***具有双螺旋结构的DNA而产生强烈的荧光发光。此外,可列举例如荧光黄和Cy3等其他染料。
此外,更优选Z11和Z12例如各自独立地为下式(7)至(9)中任一个所表示的原子团。
[化32]
[化33]
[化34]
式(7)-(9)中,
X1和X2各自为S或O,可以相同或不同,
n为0或正整数,
R1-R10、R13-R21各自独立地为氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基或氨基,
R11和R12中,一者为所述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或L2、所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中与NH键合的连接基团,另一者为氢原子或低级烷基,
多个R15存在于式(7)、(8)或(9)中的情况下,它们可以相同或不同,
多个R16存在于式(7)、(8)或(9)中的情况下,它们可以相同或不同,
Z11中的X1、X2和R1-R21与Z12中的X1、X2和R1-R21彼此之间可相同或不同。
式(7)-(9)中,
R1-R21中,更优选所述低级烷基为碳原子数为1-6的直链或支链烷基,所述低级烷氧基为碳原子数为1-6的直链或支链烷氧基。
式(7)-(9)中,
R11和R12中,更优选所述连接基团为碳原子数为2以上的聚亚甲基羰基,通过羰基部分与所述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或L2、所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中的NH键合。所述聚亚甲基羰基的碳原子数的上限没有特别限制,例如为100以下,优选为50以下,更优选为30以下,特别优选为10以下。
Z11和Z12由所述式(7)-(9)表示时,更优选各自独立地为例如式(19)或(20)所示的基团。
[化35]
[化36]
式(19)和(20)中,X1表示-S-或-O-。R1-R10、R13和R14各自独立地表示氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基或氨基。R11和R12中的一个表示键合于所述式(1)、(1b)或(1c)中的L1或L2、所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中的NH上的连接基团,R11和R12中的另一个表示氢原子或低级烷基。
本发明的化合物可为例如具有下式(10)所示的结构的化合物、其互变异构体或立体异构体,或其盐。
[化37]
式(10)中,
E、Z11、Z12、Q、X和Y与所述式(1)中相同。
所述式(1)、(1b)和(1c)中,B可具有天然核酸碱基骨架,但如前所述,也可具有人造核酸碱基骨架。
例如,B优选为Py、Py der.、Pu或Pu der.所示的结构,
其中,
所述Py为在下式(11)表示的六元环中在1位具有与E键合的共价键、并且在5位具有与连接体部分发生键合的共价键的原子团,
所述Py der.为由所述Py的六元环的全部原子中至少有一个由N、C、S或O原子替代所得的原子团,所述N、C、S或O原子可适当地具有电荷、氢原子或取代基,
所述Pu为在下式(12)所示的稠环中在9位具有与E键合的共价键、并且在8位具有与连接体部分发生键合的共价键的原子团,
所述Pu der.为所述Pu的五元环的全部原子中至少有一个由N、C、S或O原子替代所得的原子团,所述N、C、S或O原子可适当地具有电荷、氢原子或取代基,
[化38]
本发明的化合物例如可为下式(13)或(14)所示的化合物、其互变异构体或立体异构体,或其盐。
[化39]
[化40]
所述式(13)和(14)中,E、Z11、Z12、Q、X和Y与所述式(1)中相同。Py、Py der.、Pu和Pu der.如上文定义。
本发明的化合物具有亚磷酰胺基时,所述亚磷酰胺基例如优选以下式(15)表示。
-P(OR22)N(R23)(R24) (15)
式(15)中,R22为磷酸基团的保护基,R23和R24为烷基或芳基。
更优选地,所述式(15)中,R15为氰乙基,R16和R17中,所述烷基为异丙基,所述芳基为苯基。
本发明化合物中,例如所述式(1)所示化合物可以为下式(21)所示化合物。
[化41]
式(21)中,A表示氢原子或羟基。优选A为氢原子。B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的残基。例如,腺嘌呤和鸟嘌呤在8位上与双键键合,胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶在5位上与双键键合。Z11和Z12各自独立地表示展现出荧光性的原子团、氢原子或氨基的保护基,特别优选噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物的残基。X表示氢原子,可用酸去保护的羟基保护基,或者单磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y为氢原子、羟基保护基或亚磷酰胺基。
所述式(21)所示化合物更优选为例如下式(22)所示化合物。
[化42]
式(22)中,A表示氢原子或羟基。Z11和Z12各自独立地表示展现出荧光性的原子团、氢原子或氨基保护基,特别优选噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物的残基。X表示氢原子,可用酸去保护的羟基保护基,或者单磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y为氢原子、羟基保护基或亚磷酰胺基。
所述式(21)或(22)的化合物中,Z11和Z12为氢原子或氨基保护基时,由于一个分子中具有两个氨基(或者被保护的氨基),因此可利用所述氨基在一个分子中导入2分子的标记分子。例如,通过结合荧光物质、化学发光物质等制造标记核酸,从而能够提高核酸检出的灵敏度。并且在Z11和Z12为展现出荧光性的原子团时,通过用特定的荧光物质标记,可简单地进行核酸的检测。
此外,在所述式(21)或(22)的化合物中,Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的化合物为用2分子荧光性分子例如噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物修饰的核苷酸。由含有这样的化合物的单链核酸形成的探针通过由激子耦合(exciton coupling)引起淬灭,在只有探针的状态下荧光非常微弱,但通过与DNA或RNA杂交可显示强烈的荧光发光。即,例如噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物的荧光通过这样扭转的结构被强烈地抑制,但噻唑橙衍生物或噁唑黄衍生物通过键合在DNA上,结构的扭转被消除和固定化,从而显示出强烈的荧光。荧光可通过用例如488nm、514nm的Ar激光进行激发而检测,但不限于此。
所述式(1)、(1b)或(1c)所示的本发明化合物例如可用于核酸(多核苷酸)的合成中。即,本发明的化合物可用作核酸的标记物(核酸标记试剂)。例如,通过将所述式(1)、(1b)或(1c)所示的本发明化合物用作核苷酸底物,使用单链核酸作为模板进行核酸合成反应,或者通过使用所述式(1)、(1b)或(1c)所示的本发明化合物化学合成单链核酸(例如使用核酸自动合成仪的亚磷酰胺法等化学合成法),可制造在一个分子中含有至少一分子以上本发明化合物的核酸。此时,所述原子团Z11和Z12各自可为展现出荧光性的原子团,也可为氢原子或保护基。
本发明的核酸的结构如前所述,为含有至少一种下式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示结构的结构。此外,本发明的核酸可含有这些结构的互变异构体或立体异构体,或其盐。
[化43]
[化44]
[化45]
[化46]
[化47]
[化48]
式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中,
B、E、Z11、Z12、L1、L2、L3、D和b各自为所述式(1)、(1b)或(1c)中所示的结构,
式(16)、(17)和(18)中,E为所述式(1)、(1b)或(1c)中所述(i)的原子团,磷酸桥连中一个以上的O原子可被S原子替代,
式(16b)、(17b)和(18b)中,E为所述式(1)、(1b)或(1c)中所述(ii)的原子团。
式(17)和(17b)中,各B可相同或不同,各E可相同或不同。
所述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中,
Z11和Z12各自为展现出荧光性的原子团,可相同或不同。
本发明的核酸的基本骨架没有特别限制,例如可为DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA、LNA或PNA(肽核酸)中任一种,也可为其他结构。此外,本发明的核酸的碱基数没有特别限制,例如为10bp至10kb左右,优选为10bp至1kb左右。此外,本发明的核酸为寡核苷酸的情况下,其长度没有特别限制,例如为10-100bp左右,更优选为10-50bp左右,进一步优选为10-30bp左右。
包含在本发明的核酸中的所述式(1)、(1b)或(1c)的化合物的数量没有特别限制,可为1-100个左右,优选为1至20个左右。
本发明的化合物或核酸例如可具有下式(23)-(25)中任一个所示的结构。由此,其可有利地用作导入有染料的荧光探针。但是,适合用作荧光探针的本发明化合物不限于此。
[化49]
式(23)中,碱基B上连接有2个染料(Fluo)。碱基B与连接体键合的位置没有特别限制,例如在嘧啶的4位、5位或6位、嘌呤的2位、3位、6位、7位或8位中的一个位置与连接体连接。连接体具有一个碱基连接部位,其在途中分为2个以上分支,且末端与染料连接。与碱基或染料连接的方法除了可以使用通过针对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应或Michael加成反应等形成的键之外,还可使用酰胺键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等生成的键。对于连接体,其长度(l、m、n)自由选取,可含有单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。此外,优选不影响由二聚引起的激子效应。分支部分(X)为碳、硅、氮、磷、硼各原子,也可发生质子化(例如NH+)或氧化(例如P=O)。优选染料为利用通过二聚显示激子效应的物质,与连接体连接的位置可为染料的任何部分。式(23)中,虽然显示了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,但作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)之外,也可为2’-O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰的核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)核酸等磷酸修饰的核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
[化50]
式(24)中,碱基B上连接有2个染料(Fluo)。碱基B与连接体键合的位置没有特别限制,例如在嘧啶的4位、5位或6位、嘌呤的2位、3位、6位、7位或8位中的两个位置与连接体连接。两个连接体各自具有一个碱基连接部位,并在另一个末端与染料连接。与碱基或染料连接的方法除了可以使用通过针对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应或Michael加成反应等形成的键之外,还可使用酰胺键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等生成的键。对于连接体,其长度(l、m)自由选取,可含有单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。此外,优选不影响由二聚引起的激子效应。优选染料为利用通过二聚显示激子效应的物质,与连接体连接的位置可为染料的任何部分。式(24)中,虽然显示了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,但作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)之外,也可为2’-O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰的核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)核酸等磷酸修饰的核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
[化51]
式(25)中,连续的核苷酸的各碱基(B1、B2)上各自连接有一个染料(Fluo)。对各碱基与连接体键合的位置没有特别限制,例如在嘧啶的4位、5位或6位、嘌呤的2位、3位、6位、7位或8位中的一个位置与连接体连接。两个连接体各自具有一个碱基连接部位,并在另一个末端与染料连接。与碱基或染料连接的方法除了可以使用通过针对双键或三键的金属催化反应、成环缩合反应或Michael加成反应等形成的键之外,还可使用酰胺键、酯键、二硫键、通过亚胺形成反应等生成的键。对于连接体,其长度(l、m)自由选取,可含有单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、胺、亚胺、醚键、硫醚键、硫酯键等。此外,优选不影响由二聚引起的激子效应。优选染料为使用通过二聚显示激子效应的物质,与连接体连接的位置可为染料的任何部分。式(25)中,虽然显示了作为DNA部分结构的脱氧核糖核酸,但作为替代,核酸骨架除了为核糖核酸(RNA)之外,也可为2’-O-甲基RNA或2’-氟DNA等糖修饰的核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)核酸等磷酸修饰的核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。
此外,本发明化合物或核酸存在互变异构体或立体异构体(例如:几何异构体、构象异构体和光学异构体)等异构体的情况下,任何异构体均可用于本发明。此外,本发明化合物或核酸的盐可为酸加成盐也可为碱加成盐。并且,形成所述酸加成盐的酸可为无机酸也可为有机酸,形成所述碱加成盐的碱可为无机碱也可为有机碱。对所述无机酸没有特别限定,可列举例如硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸等。对所述有机酸也没有特别限定,可列举例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸等。对所述无机碱没有特别限定,可列举例如氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等,更具体而言,可列举例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙等。对所述有机碱也没有特别限定,可列举例如乙醇胺、三乙胺和三(羟甲基)氨基甲烷等。对所述盐的制造方法也没有特别限定,例如,通过公知的方法将所述酸或碱适宜地加成到所述电子供体/受体连接分子上而进行制造。此外,在取代基等存在异构体的情况下,可使用任何异构体,例如,在“萘基”的情况下,可以为1-萘基或2-萘基。
此外,在本发明中,对烷基没有特别限定,可列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基等,也可为结构中含有烷基的基团(烷基氨基、烷氧基等)。此外,对全氟烷基没有特别限制,可列举例如由甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基等衍生的全氟烷基,也可为结构中含有全氟烷基的基团(全氟烷基磺酰基、全氟酰基等)。本发明中,对酰基没有特别限定,可列举例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、环己酰基、苯甲酰基、乙氧基羰基等,也可为结构中含有酰基的基团(酰氧基、烷酰氧基等)。此外,在本发明中,羰基的碳原子数包含在酰基的碳原子数中,例如,碳原子数为1的烷酰氧基(酰基)指的是甲酰基。并且,在本发明中,“卤素”指任意卤族元素,例如可列举氟、氯、溴和碘。此外,在本发明中,对氨基保护基没有特别限制,例如可使用三氟乙酰基、甲酰基、C1-6烷基-羰基(例如乙酰基、乙基羰基等)、C1-6烷基-磺酰基、叔丁氧基羰基(以下称为Boc)、苄氧基羰基、烯丙氧基羰基、芴基甲氧基羰基、芳基羰基(例如苯基羰基、萘基羰基等)、芳基磺酰基(例如苯基磺酰基、萘基磺酰基等)、C1-6烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基等)、C7-10芳烷基羰基(例如苄基羰基等)、甲基、芳烷基(例如苄基、二苯基甲基、三苯甲基等)等。所述基团可被1至3个卤原子(例如氟、氯、溴等)、硝基等取代,其具体实例可列举对硝基苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、间氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基等。此外,在本发明中,对羟基保护基(包括能够用酸进行去保护的物质)没有特别的限制,可列举例如二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)等。
作为本发明的化合物或核酸,特别优选的为例如下文的实施例中记载的化合物或核酸,特别是化合物(核酸)102-106、110、113、114、116-118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)以及这些物质的几何异构体、立体异构体和盐。特别地,化合物110、113、114、116-118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)由于噻唑橙和DNA通过独特的结构而共价键合,因此核酸检出灵敏度特别优良。并且,1分子中含有2个噻唑橙结构的化合物110、113、117、118、120、121、122、123、124、ODN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN9、ODN(anti4.5S)和ODN(antiB1)作为可抑制单链状态的荧光,并通过与互补的DNA或RNA形成双螺旋而增加荧光强度的单链DNA的荧光探针,可以更有效地使用。
接下来,本发明的标记物如上文所述为,
(i)这样的标记物:一个分子内的两个平面化学结构不在同一平面内,而是以某一角度存在,但该分子在***或沟结合到核酸中时,所述两个平面化学结构在同一平面内排列配置,从而产生荧光发光;
(ii)由两个以上染料分子群形成的标记物,其中,虽然由于两个以上染料分子由于平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但这些分子在***或沟结合至核酸中时,通过所述聚集状态的解除会产生荧光发光;或者
(iii)一种复合体标记物,其以在同一分子内具有两个以上染料分子的化学结构为特征性化学结构,其中,虽然由于两个以上的染料分子平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但是这些分子在***或沟结合到核酸中时,通过所述聚集状态的解除会产生荧光发光。
在所述(ii)或(iii)的情况下,所述染料分子优选为所述(i)记载的分子。此外,在所述(iii)的情况下,优选具有两个以上染料分子键合到与应被标记核酸键合的连接体分子的结构,所述染料分子与所述连接体分子的键合借助于额外连接体分子以形成分枝结构,或者不借助于额外的连接体分子而直接键合。
本发明的标记物优选为其中所述原子团Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明化合物、其互变异构体或立体异构个体,或其盐,或者其中Z11和Z12为展现荧光性的原子团的所述本发明核酸、其互变异构体或立体异构体,或其盐。例如,在本发明的化合物或核酸中,由于Z11和Z12为展现出激子效应的原子团,因此在形成双螺旋结构时荧光的增加变大,可以更有效地检出双螺旋结构。然而,在本发明化合物或核酸中,即使Z11和Z12不是显示激子效应的原子团,或者1个分子中只导入1个展现出荧光性的原子团(染料),仍然能够用作核酸等的标记物,有效地检测出双螺旋结构。本发明的标记物的形态例如为作为单链核酸的荧光探针的形态,但不限于此,标记单核苷酸、标记寡核苷酸、双链核酸等任何形态均可。
此外,本发明的标记物例如,
为标记单核苷酸、标记寡核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物,
其中所述标记物由所述(i)-(iii)中任一项所记载的标记物、或者Z11和Z12为展现荧光性的原子团的所述本发明化合物、其互变异构体或立体异构体、或其盐、或者其中Z11和Z12为展现荧光性的原子团的所述本发明核酸、其互变异构体或立体异构体、或其盐标记。
或者,本发明的标记物例如,
为标记单核苷酸、标记寡核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物,
其中所述标记物借助于与单核苷酸、寡核苷酸、核酸或核酸类似物中的一个或一个以上的碱基分子或主链构成分子键合的连接体分子,由所述(i)-(iii)中任一项所记载的标记物、或者Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明化合物、其互变异构体或立体异构体、或其盐、或者Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明核酸、其互变异构体或立体异构体、或其盐标记。
或者,本发明的标记物例如
为标记单核苷酸、标记寡核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物,
其中所述标记物借助于与单核苷酸、寡核苷酸、核酸或核酸类似物中的一个或一个以上的碱基分子的嘧啶核的5位碳原子或嘌呤核的8位碳原子键合的连接体分子,由所述(i)-(iii)中任一项所记载的标记物、或者Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明化合物、其互变异构体或立体异构体、或其盐、或者Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明核酸、其互变异构体或立体异构体、或其盐标记。
本发明的化合物和核酸的制造方法
本发明的化合物和核酸的制造方法没有特别的限制,可以适宜地使用公知的合成方法(制造方法)。例如,在所述式(21)所示化合物的情况下,可通过包括以下步骤的制造方法进行制造:将下式(26)所示化合物的羧基活化后,使其与三(2-氨基乙基)胺反应;保护氨基;以及将上述所得的化合物中存在的羟基用保护基保护的反应,并在所得的化合物中存在的羟基上加成磷酸或亚磷酰胺基团的反应。
[化52]
式(26)中,A表示氢原子或羟基。B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的残基。
本发明的化合物或核酸的制造中可使用的制造方法(合成方法)例如以下方法。即,首先,作为简单地标记DNA的方法,广泛使用使DNA中的活性氨基与标记剂中被活化的羧基在缓冲溶液中反应的方法。这个方法也可用于本发明化合物或核酸中任一个的制造中,特别可用于连接体或染料的导入。氨基的导入法可为使用GLEN RESEARCH公司出售的Amino modifier亚磷酰胺的方法。
所述原子团Z11和Z12可例如由保护基变成氢原子(去除保护基),进而,将氢原子用具有荧光性的原子团(染料)取代。对去除保护基的方法没有特别限制,可适宜地使用公知的方法。对用具有荧光性的原子团(染料)取代的方法没有特别限制,例如使Z11和Z12为氢原子的本发明化合物或核酸与荧光性分子(染料)适宜地反应即可。例如,Z11和Z12中的至少一个为活性氨基时,容易与荧光性分子(染料)反应,因此是优选的,更优选Z11和Z12二者均为活性氨基。对荧光性分子(染料)也没有特别的限制,可为例如所述式(7)-(9)中任一个所示的化合物(其中,R11和R12中的任一个均可为氢原子或低级烷基或者羧基聚亚甲基)。此外,对于核酸(聚核苷酸、聚核苷、寡核苷酸或寡核苷)的情况,去除保护基的步骤以及用具有荧光性的原子团(染料)取代的步骤可以在聚合(核酸合成)前进行,也可以在其后进行。例如,考虑到防止合成步骤中染料部分受损,优选在聚合(核酸合成)后导入具有荧光性的原子团(染料)。
染料如前所述,没有特别的限制,可以使用所有染料,但优选例如花菁染料,特别优选噻唑橙。花菁染料例如为具有杂原子的两个杂环通过次甲基连接体连接的化学结构。通过改变杂环的种类和次甲基连接体的长度,或者在杂环上导入取代基等,可以合成具有各种激发/发射波长的荧光染料。此外,为了导入DNA而进行的连接体导入也比较容易。此外,噻唑橙在水中基本不发出荧光,但通过与DNA或RNA相互作用而发出强烈的荧光。现认为,染料分子之间的相互作用通过与核酸的相互作用被抑制,进而使围绕染料分子的两个杂环之间的次甲基连接体的旋转也被抑制,从而致使荧光强度的增加。此外,关于噻唑橙染料的使用方法已被熟知,可参照例如以下文献来使用:H.S.Rye,M.A.Quesada,K.Peck,R.A.Mathies and A.N.Glazer,High-sensitivity two-color detection ofdouble-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner usingethidium homodimer and thiazole orange,Nucleic Acids Res.,1991,19,327-33;和L.G.Lee,C.H.Chen and L.A.Chiu,Thiazole orange:a newdye for reticulocyte analysis,Cytometry,1986,7,508-17.
本发明化合物或核酸的基本骨架如前所述没有特别限制,例如可为DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA、LNA或PNA(肽核酸)中的任一个,也可为其他结构。将DNA、修饰DNA、RNA或修饰RNA作为基本骨架时容易合成,用染料取代(染料分子的导入)等也很容易,因此是优选的。向LNA或PNA中导入染料分子的方法没有特别限制,可以适宜地使用公知的方法。具体而言,可参照例如以下文献等:AnalyticalBiochemistry 2000,281,26-35.Svanvik,N.,Westman,G.,Wang,D.,Kubista,M.(2000)Anal Biochem.281,26-35.Hrdlicka,P.J.,Babu,B.R.,Sorensen,M.D.,Harrit,N.,Wengel,J.(2005)J.Am.Chem.Soc.127,13293-13299。
将DNA、修饰DNA、RNA或修饰RNA作为基本骨架的核酸的合成方法已熟知,例如可通过所谓的亚磷酰胺法等进行合成。作为其原料的亚磷酰胺试剂也可以通过公知的方法简单地合成。在本发明的核酸为DNA、特别是短的寡聚DNA的情况下,例如可使用DNA自动合成仪等简单地合成。此外,例如通过PCR等,也可合成长链状的核酸(DNA)等。DNA与染料分子的键合位置如前所述没有特别限制,但特别优选例如胸苷的5位。已知从胸苷的5位伸出各种取代基的核苷酸衍生物的三磷酸通过DNA聚合酶进行导入的效率较高。因此,例如不仅在本发明的核酸为短的寡聚DNA的情况下能简单地合成,在其为长链DNA的情况下也能简单地合成。
特别地,本发明的荧光探针(标记物)使用例如噻唑橙的单链DNA例如具有诸如以下的优点:(1)可以仅通过在缓冲溶液中将染料添加到DNA自动合成仪合成的DNA中进行制备,合成较容易;(2)通过使经由酶法制备的长链DNA与染料反应,可制备长链荧光探针。此外,可用例如500nm附近较长波长的光进行激发。
核酸的检测方法和试剂盒
本发明的核酸检测方法如前所述,为
(I)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——标记单核苷酸或标记寡核苷酸作为底物进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现出荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测核酸合成;
(II)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——单链核酸作为第一核酸,将其与具有与所述第一核酸互补的序列或与所述互补序列类似的序列的第二核酸杂交来进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现出荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测所述第一核酸与所述第二核酸的杂交情况;
(III)包括以下步骤的核酸检测方法:
将本发明标记物——单链核酸作为第一核酸,将其与具有与所述第一核酸互补的序列或与所述互补序列类似的序列的第二核酸杂交来进行核酸合成,从而合成***有或沟结合有所述展现出荧光性的原子团或染料分子结构的双链核酸;
分别测定所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度;并
通过比较所述双链核酸合成步骤前后的荧光强度来检测所述第一核酸与所述第二核酸的杂交情况;
或者
(IV)核酸检测方法,其特征在于使用第三核酸来检测三链核酸或核酸类似物的形成情况,所述第三核酸具有所述第一核酸序列、所述第二核酸序列或与这些序列互补的序列、或者与所述的与这些序列互补的序列相似的序列,并且由本发明的标记物或复合体标记物标记或未被其标记。
优选地,(a)2分子以上的染料分子通过一个连接体键合于所述第一核酸中1分子的碱基上,(b)2分子以上的染料分子通过2个以上连接体键合于所述第一核酸中1分子的碱基上,或者(c)2分子以上的染料分子通过1个以上连接体键合于所述第一核酸中相邻的2分子的碱基上。
所述核酸合成优选通过例如酶法进行,但也可以通过其他方法进行。此外,所述本发明的核酸检测方法优选使用Z11和Z12为展现出荧光性的原子团的所述本发明化合物、其互变异构体或立体异构体,或其盐,或者具有所述本发明的核酸的结构的一部分的标记核酸,检测双链或三链核酸。
其次,本发明的试剂盒如前所述,包含核酸合成装置、标记物和荧光强度测定装置,其中所述标记物为所述本发明的标记物。即,本发明的试剂盒通过将所述本发明的标记物作为所述标记物,能够以高灵敏度检测核酸。除此之外,对本发明的试剂盒没有特别限制。例如,对所述核酸合成装置没有特别限制,例如可为公知的自动核酸合成仪等。此外,对所述荧光强度测定装置也没有特别限制,例如可为公知的荧光测定仪等。
本发明的试剂盒优选用于所述本发明的核酸检测方法,但不限于此,可用于任何用途。此外,本发明的试剂盒优选用作例如研究用、临床用或诊断用试剂盒。
以下,对本发明的核酸检测方法或试剂盒进行更具体的说明。然而,本发明的核酸检测方法和试剂盒不限于以下说明。
本发明的核酸检测方法中如前所述使用本发明的标记物。在这种情况下,本发明的标记物可以每1分子内只具有1个但优选具有2个以上具有荧光性的原子团(染料)。据此,例如所述具有荧光性的原子团(染料)具有了激子效应。通过激子效应,例如,可抑制单链状态下的荧光强度,从而能够更加有效地检测出双螺旋结构。此外,所谓的激子效应(excitoncoupling)是指例如通过多个染料平行聚集形成H聚集体(H-aggregate),几乎不发出荧光的效应。这种效应被认为是由于以下原因而产生的:染料的激发状态是通过Davydov splitting***为两个能级,向较高的能级激发→向较低能级进行的内部转换(internal conversion)→发光通过热力学方式被禁止。然而本发明不限于上述说明。发生激子效应可基于以下事实确认:形成H聚集体的染料的吸收带在比单个染料的吸收带短的波长处出现。作为显示这种效应的染料,可列举例如所述噻唑橙及其衍生物、噁唑黄及其衍生物、花菁及其衍生物、半花菁及其衍生物,甲基红及其衍生物,其他通常被称作花菁染料、偶氮染料的染料。
这些染料容易通过***键合于形成为双螺旋的DNA-DNA双链或DNA-RNA双链、或者硫代磷酸酯核酸、PNA(肽核酸)或LNA(BNA)这些人造核酸与DNA或RNA形成的双链。将多个这样的染料导入探针时,通常的单链状态(即杂交前只有探针的状态)由于激子效应而被强烈地淬灭,但与目的DNA或RNA杂交时,聚集体解除,各个染料纷纷***双链中。此时由于染料间没有电子相互作用,因此不产生激子效应,发出强烈的荧光。此时染料的吸收带与单个染料的吸收带相同,显示出染料间不产生激子效应。此外,染料***双链中时,染料本来具有的结构上的扭转消除,荧光发光变得更强。
从而,例如通过设计由于多个染料而展现出激子效应的探针,从而能够通过杂交至目标序列而使荧光的开启和关闭非常明确。此外,探针序列上只结合1分子染料时,不显示激子效应。例如,通过双链形成所致染料***使染料的结构平坦化等原因,能够产生比单链时更强的荧光。此外,即使2分子以上的染料键合,在各染料相距不显示电子相互影响的距离时,也不表现激子效应。即,为了发挥激子效应,必须将2分子以上的染料通过以下方式键合于本发明化合物或核酸的分子上,即所述染料被设置为足够接近的距离。即,本发明化合物或核酸用作荧光探针的情况下,优选将2个以上染料键合于探针内的一个核苷酸,或者将一个染料键合于每2个以上连续的核苷酸。
本发明的核酸检测方法可通过例如图1模型化地显示。该图(A)(左图为“非杂合体”的图)显示了借助激子效应而淬灭的探针,该图(B)(右图为“杂合体”的图)显示了通过双链形成进行了***并发出荧光的探针。图中,符号1表示本发明的核酸(荧光探针)。2表示展现出荧光性的原子团(染料)。1’表示核酸(荧光探针)1的互补链。3表示由1和1’形成的双链核酸。此外,图的上部是电子转移图。“允许”表示允许转移。“禁止”表示禁止转移。“可发射”表示可发出荧光。“不可发射”表示理论上不能发出荧光。即,认为在单链状态(图1(A))下,基底状态的染料2发生聚集,从而根据激子耦合理论相互作用,所述染料聚集体的激发状态分离为2个能级,从而抑制发光。由于来自低能级的发光理论上被禁止,因此聚集体的单重激发状态保留在低发射状态。另一方面,认为通过杂交形成双链时(图1(B)),染料2***或沟结合于双链核酸3,从而消除激子耦合,因此产生荧光。然而,图1是模型化地显示本发明的核酸检测机制的一个实例的示意图,本发明不限于图1和上述说明。激子效应中,通过控制2个染料间的距离,从而可以控制荧光发光。通过将该体系与用于辨别序列的DNA联系起来,能够获得序列选择性的荧光发光。本发明的核酸检测方法或试剂盒中,可通过例如用可见光自样本下方照射样本而进行杂交的检测,通过目测也可明确地判断。此外,本发明的核酸检测方法或试剂盒中,可在例如荧光室、微量板、凝胶、毛细管、塑料管等容器中观察杂交。并且,本发明的核酸检测方法或试剂盒中,例如可在与目标核酸混合后立刻观测杂交。
通过本发明的标记物、核酸检测方法或试剂盒,即使例如在实时PCR或细胞内这样难以进行洗涤的环境下,也易于进行序列特异性核酸的荧光检测。更具体而言,可以进行例如以下(1)-(7)的应用。此外,在下文中,“本发明的探针”是指作为上述本发明的标记物中的一种的荧光探针。如前所述,在本发明的核酸检测方法和试剂盒中使用本发明的标记物。此外,以下(1)-(7)是示例,本发明的标记物、核酸检测方法或试剂盒不限于这些说明。
(1)本发明的探针可用于液相均相检测(使用96孔微量板或毛细管等)。
(2)本发明的探针可用作PCR探针。可用作DNA扩增反应中扩增曲线的检测(实时PCR)、代替TaqMan探针的廉价方法。可用作引物标记或内部标记探针。
(3)本发明的探针可用作DNA芯片中的捕捉探针或标记探针。是不需要试剂的高通量体系,不需要标记过程、洗涤过程。可极大地避免人为产生的误差。可在玻璃或取而代之的固相载体材料(金、ITO、铜等的基板、金刚石或塑料等可附着多个样本的材料)上同时进行多个(高通量)分析。
(4)本发明的探针可固定于珠、纤维或水凝胶。可在半液体/半固体环境下检测基因。在具有液体检测环境的同时,也可以以固体形式输送。
(5)本发明的探针可用作印迹(DNA印迹、RNA印迹、斑点印迹等)用探针。可仅使目标基因片段发光而进行检测。通过本发明的方法,在杂交后不需要洗涤。
(6)本发明的探针可用作细胞核内核酸的检测和追踪用探针。由此,可以进行细胞内DNA/RNA的时空分析。可使用荧光显微镜或细胞分选仪。可应用于DNA标记、向RNA转录/剪接的追踪、RNAi的功能分析等。本发明的方法中不需要洗涤,因此适于追踪活细胞的功能。
(7)本发明的探针可用作荧光原位杂交(FISH)的探针。通过本发明的方法,可进行组织染色等。本发明的方法中不需要洗涤,因此人为产生的误差小。即,本发明的探针可用作在未识别目标生物分子时不发荧光的荧光染料,因此使用所述探针时能够建立不需要复杂的洗涤步骤的生物显像过程。这使得能够进行高可靠性、低工作量的实时荧光观测。
此外,本发明的荧光探针(标记物)的效果是,与现有的单链状态淬灭型荧光探针(分子信标等)相比,可列举例如以下优点。然而,这些也是示例性的,本发明不限于此。
(1)在只使用1种染料的情况下,容易合成。
(2)在本发明的DNA探针(标记物)的末端为自由端的情况下,易于用作PCR探针。
(3)不需要形成发夹结构等特殊的高级结构,因此不需要茎序列等与序列识别无关的序列(不存在无用序列,对序列也没有限制)。
(4)可在探针的多个位置(所希望的位置)导入荧光染料。
(5)在1分子中含有2个以上染料结构的情况下,染料间的位置关系受到限制,因此S/N比(杂交前后的荧光强度比)较大。
例如通过对键合的染料部分的激子相互作用进行控制,本发明的探针的荧光强度可有效地变化。在本发明中,特别是通过利用激子相互作用的方法中,由于能够作为开-关探针发挥作用,因此可得到足够高的淬灭性能,此外,例如如前所述,与现有的检测相比,可获得多个明显不同的优点。这样的开-关荧光核苷酸的设计可建立不需要例如洗涤的生物显像法,因此非常重要。利用激子效应的探针显示的光物理性质不仅非常有特点,而且适合在DNA测序(序列确定)、基因分型(基因型分析)、DNA结构转换的监测和基因表达观测中使用的新型荧光DNA探针设计。
此外,如果使用本发明的探针(核酸),通过对例如目标核酸序列进行定量,在即时检测到该序列的扩增、分解、蛋白质键合等现象产生的同时,还可对这些现象的量进行定量。所述检测和定量可通过下文说明,但这些说明只是示例性的,不限制本发明。即,首先,本发明的探针(核酸)与上述目标核酸序列以一定的物质量比进行杂交,形成双链。形成的双链的物质量与所述目标核酸序列的物质量成正比,因此通过测定所述双链的荧光强度可检测目标核酸序列,同时可对其物质量进行定量。在这种情况下,本发明的探针(核酸)的荧光发光被抑制,因此不妨碍所述双链的荧光强度测定,能够正确地进行测定。
实施例
通过以下实施例对本发明进行更具体的说明,然而本发明不限于以下实施例。此外,下文中的“ODN”的含义为寡聚DNA(DNA寡聚物)。
测定条件等
使用常规市售的试剂、溶剂。所使用的生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯由PIERCE公司生产。用于化合物提纯的硅胶使用Wako gel C-200(和光纯药)。1H、13C和31P NMR谱通过JEOL(日本电子公司)的JNM-α400(商品名)测定。耦合常数(J值)以赫兹(Hz)表示。化学位移以ppm表示,内部标准品使用二甲亚砜(1HNMR中δ=2.48,13CNMR中δ=39.5)以及甲醇(1HNMR中δ=3.30,13CNMR中δ=49.0)。在31P NMR的测定中,使用H3PO4(δ=0.00)作为外部标准品。ESI质谱使用Bruker公司的Bruker Daltonics APEC-II(商品名)进行测定。DNA自动合成仪使用Applied Biosystem公司的392DNA/RNA synthesizer(商品名)。反相HPLC使用Gilson公司的装置Gilson Chromatograph,Model 305(商品名)和Chemco公司的CHEMCOBOND 5-ODS-H制备型色谱柱(商品名,10×150mm)进行分离,通过UV检测器Model 118(商品名)在260nm波长进行检测。DNA质量通过MALDI-TOF MS进行测定。MALDI-TOF MS使用Applied Biosystems公司的PerSeptive VoyagerElite(商品名),在加速电压21kV、负电条件下进行测定,使用2’,3’,4’-三羟基苯乙酮作为基质,使用T8([M.H].2370.61)和T17([M.H].5108.37)作为内部标准品。UV和荧光谱各自使用岛津制作所公司的ShimadzuUV-2550(商品名)分光光度计和RF-5300PC(商品名)荧光分光光度计进行测定。荧光寿命通过由装备有NanoLED-05A(商品名)的堀场制作所公司的小型高性能荧光寿命测定仪HORIBA JOBIN YVONFluoroCube(商品名)进行测定。双链核酸的熔点(Tm)的测定在含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中在2.5μM的最终双链浓度下进行。样本的吸光度在260nm波长处测定,在10℃至90℃的范围内,以0.5℃/min的速度加热同时进行追踪。根据由此观测的特性,将最初发生变化的温度作为熔点Tm。
吸收谱、荧光谱和CD谱的测定除非特别说明,否则均在2.5μM的链浓度(单链或双链)下,在含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中,使用光路长1cm的测量池进行。激发和荧光发光的带宽为1.5nm。使用9,10-二苯基蒽作为对照物质,以在乙醇中9,10-二苯基蒽的量子收率ΦF=0.95为基准,计算荧光量子收率(ΦF)。发光谱面积使用设备软件通过积分算出。量子收率(ΦF)通过下式(1)算出。
ΦF(S)/ΦF(R)=[A(S)/A(R)]×[(Abs)(R)/(Abs)(S)]×[n(S) 2/n(R) 2] (1)
上式(1)中,ΦF(S)为样本的荧光量子收率,ΦF(R)为对照物质的荧光量子收率。A(S)为样本的荧光谱面积,A(R)为对照物质的荧光谱面积。(Abs)(S)为激发波长下样本溶液的光密度,(Abs)(R)为激发波长下对照物质溶液的光密度。n(S)为样本溶液的折射率,n(R)为对照物质溶液的折射率,以n(S)=1.333,n(R)=1.383计算。
实施例1-3
根据以下方案1,合成(制造)了2个活性氨基各自被三氟乙酰基保护的化合物102和103,进而,合成了亚磷酰胺104。
[化53]
方案1
反应试剂和反应条件(a)(i)N-羟基琥珀酰亚胺,EDC/DMF,(ii)三(2-氨乙基)-胺/CH3CN,(iii)CF3COOEt,Et3N;(b)DMTrCl/吡啶;(c)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺,1H-四唑/CH3CN。
关于上述方案1,如下更详细地描述。
实施例1:2-[2-[N,N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基]-2’-脱氧尿苷(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2′-deoxyuridine,化合物102)的合成
起始原料(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷((E)-5-(2-carboxyvinyl)-2′-deoxyuridine,化合物101)根据Tetrahedron1987,43,20,4601-4607合成。即,首先,向430mg乙酸钯(II)(FW224.51)和1.05g三苯基膦(FW262.29)中添加71mL 1,4-二噁烷,再添加7.1mL三乙胺(FW 101.19,d=0.726),在70℃加热搅拌。反应溶液从红褐色变化到黑褐色时,加入14.2g 2’-脱氧-5-碘尿苷(FW354.10)和7.0mL丙烯酸甲酯(FW 86.09,d=0.956)在1,4-二噁烷中的悬浊液,在125℃加热回流1小时。之后,在仍较热时过滤,用甲醇洗涤剩余物,回收滤液。将该滤液的溶剂通过减压蒸馏去除后,用硅胶柱纯化生成物(5-10%甲醇/二氯甲烷)。减压蒸馏去除收集到的级分的溶剂,将剩余的白色固体减压干燥。向该干燥的固体中加入约100mL的超纯水,加入3.21g氢氧化钠(FW40.00),在25℃搅拌过夜。然后,加入浓盐酸酸化溶液,滤出生成的沉淀,用超纯水洗涤,减压干燥。由此获得作为白色粉末的8.10g(产率68%)目标化合物(化合物101)。此外,通过1H NMR测定值与参考值一致这一事实确认了所述白色粉末是目标化合物101。此外,13C NMR测定值如下记载。
(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷(化合物101):
13CNMR(DMSO-d6):δ168.1,161.8,149.3,143.5,137.5,117.8,108.4,87.6,84.8,69.7,60.8,40.1.
然后,将1.20g(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷101(分子量298.25)、925mg N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)和1.54g 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(分子量191.70)加入放入了搅拌子的回收烧瓶(ナスフラスコ)中,加入20mL DMF,在25℃搅拌16小时。加入约1mL乙酸,加入300mL二氯甲烷和100mL超纯水,剧烈搅拌。除去水层,再加入100mL超纯水,以同样的方式洗涤两次。滤出生成的沉淀,用二氯甲烷洗涤,减压干燥。蒸馏去除滤液中的溶剂,向生成的沉淀中加入二氯甲烷,与上文相同地回收沉淀。合并所有回收的沉淀,将其悬浮在80mL乙腈中,剧烈搅拌。向其中一次性加入3.0mL三(2-氨乙基)胺(分子量146.23,d=0.976),在25℃再搅拌10分钟。然后,加入4.8mL三氟乙酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),再加入5.6mL三乙胺(分子量101.19,d=0.726),在25℃搅拌3小时。蒸馏去除溶剂,用硅胶柱纯化(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸馏去除溶剂,用少量丙酮溶解,加入***即生成白色沉淀,过滤,用***洗涤后,减压干燥,获得884mg(33.5%)目标物质(化合物102)。
此外,在除了将原料、溶剂等的使用量,反应时间和步骤进行一些改变以外,以与上述方法相同的方法进行合成时,产率可提高至37%。即,将597mg(2.0mmol)(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2’-脱氧尿苷101(分子量298.25)、460mg(4.0mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)和767mg(4.0mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(分子量191.70)加入放入了搅拌子的烧瓶中,加入5.0mLDMF,在25℃搅拌3小时。加入约0.5mL乙酸,加入100mL二氯甲烷和100mL超纯水,剧烈搅拌。滤出生成的沉淀,用水洗涤,减压干燥过夜。将获得的白色剩余物悬浮在50mL乙腈中,剧烈搅拌。向其中一次性加入3.0mL(20mmol)三(2-氨乙基)胺(分子量146.23,d=0.976),在25℃再搅拌10分钟。然后,加入4.8mL三氟乙酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),再加入5.6mL(40mmol)三乙胺(分子量101.19,d=0.726),在25℃搅拌16小时。蒸馏去除溶剂,用硅胶柱纯化(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸馏去除溶剂,用少量丙酮溶解,加入***即生成白色沉淀,过滤,用***洗涤后,减压干燥,获得作为白色粉末的453mg(37%)目标物质(化合物102)。以下显示了化合物102的仪器分析值,此外,图2中显示了1H NMR谱图。
2-[2-[N,N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基]-2’-脱氧尿苷(化合物102):
1HNMR(CD3OD):δ8.35(s,1H),7.22(d,J=15.6Hz,1H),7.04(d,J=15.6Hz,1H),6.26(t,J=6.6Hz,1H),4.44-4.41(m,1H),3.96-3.94(m,1H),3.84(dd,J=12.2,2.9Hz,1H),3.76(dd,J=12.2,3.4Hz,1H),3.37-3.30(m,6H),2.72-2.66(m,6H),2.38-2.23(m,2H).13CNMR(CD3OD):δ169.3,163.7,159.1(q,J=36.4Hz),151.2,143.8,134.3,122.0,117.5(q,J=286Hz),110.9,89.1,87.0,71.9,62.5,54.4,53.9,41.7,38.9,38.7.C22H29F6N6O8([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为619.1951,实测值为619.1943。
实施例2:5’-O-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N,N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(5′-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2′-deoxyuridine,化合物103)的合成
将化合物102的5’-羟基用二甲氧基三苯甲基(DMTr)基保护,获得化合物103。即,首先,将618mg化合物102(分子量618.48)和373mg氯化4,4’-二甲氧基三苯甲基(分子量338.83)加入放入了搅拌子的烧瓶中,加入10mL吡啶,在25℃搅拌16小时。加入少量水,蒸馏去除溶剂,用硅胶柱进行纯化(2-4%MeOH,1%Et3N/CH2Cl2)。蒸馏除去含有目标化合物103的级分中的溶剂,获得735.2mg(79.8%)目标物质(化合物103)。以下显示了化合物103的仪器分析值,此外,图3中显示了1H NMR谱图。
5’-O-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N,N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷(化合物103):
1HNMR(CD3OD):δ7.91(s,1H),7.39-7.11(m,9H),7.02(d,J=15.6Hz,1H),6.93(d,J=15.6Hz,1H),6.80-6.78(m,4H),6.17(t,J=6.6Hz,1H),4.38-4.35(m,1H),4.06-4.04(m,1H),3.68(s,6H),3.32-3.22(m,8H),2.66-2.55(m,6H),2.40(ddd,J=13.7,5.9,2.9Hz,1H),2.33-2.26(m,1H).13CNMR(CD3OD):δ168.9,163.7,160.1,159.1(q,J=36.9Hz),151.0,146.1,143.0,137.0,136.9,134.1,131.24,131.16,129.2,128.9,128.0,122.5,117.5(q,J=286.7Hz),114.2,110.9,88.1,87.9,87.6,72.6,65.0,55.7,54.2,53.9,41.7,38.9,38.6.C43H47F6N6O10([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为921.3258,实测值为921.3265。
实施例3:’-O-(二甲氧基三苯甲基)-(2-[2-[N,N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2’-脱氧尿苷,3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5′-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2′-deoxyuridine,3′-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite,化合物104)的合成
将188mg(0.20mmol)化合物103(分子量920.85)与CH3CN共沸,加入28.6mg(0.40mmol)1H-四唑(分子量70.05),用真空泵吸气干燥过夜。加入5.1mL CH3CN,溶解试剂后搅拌,一次性加入194μL(0.60mmol)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(分子量301.41,d=0.949),在25℃搅拌2小时。加入50mL乙酸乙酯与50mL饱和碳酸氢钠水溶液的混合物,分液,将有机层用饱和食盐水洗涤后,用硫酸镁干燥。通过过滤去除硫酸镁之后,蒸馏去除溶剂。将该通过分液获得的粗产物与CH3CN共沸后,假设所获得生成物(化合物104)的产率为100%,从而制备0.1M的CH3CN溶液,用于DNA合成。此外,根据所述粗产物的31PNMR(CDCl3)和HRMS(ESI)确认获得了化合物104。其值如下所示。
化合物104:
31PNMR(CDCl3)δ149.686,149.430;C52H64F6N8O11P([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为1121.4336,实测值为1121.4342。
实施例4:DNA寡聚物的合成
[化54]
方案2
使用化合物104借助于DNA自动合成仪的寡聚DNA合成以1μmol规模的常规亚磷酰胺法(DMTr OFF)进行,合成了称为5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(13聚物,X的结构如化学式105所示)的序列(SEQ ID NO.1)的DNA寡聚物。去保护通过浓氨水(28质量%)在55℃进行16小时。用Speed Vac挥发氨,通过0.45μm过滤器后,将截留出的DNA寡聚物通过反相色谱进行分析,将约10.5分时出现的峰进行纯化(CHEMCOBOND 5-ODS-H(商品名);10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mM TEAA缓冲液pH7(20分钟),在260nm处检测)。纯化的生成物用MALDI TOF质谱的负模式测定分子量,确认具有由所述5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’序列(13聚物,X的结构如化学式105所示)预期的分子量(基于C134H176N52O76P12,计算值4102.8)([M-H]-实测值为4101.9,计算值为4101.8)。图4中显示了MALDI TOF质谱图。
此外,以与上述方法相同的方法可合成5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’序列(13聚物,X的结构如化学式105所示),所不同的是用浓氨水去保护或者在55℃进行4小时后再在25℃进行16小时,在反相HPLC中TEAA(三乙胺乙酸酯)缓冲液(pH7)的浓度为0.1M,并且在反相HPLC中使展开时间为30分钟以上。并且,用同样的方法,可合成表1所示作为各ODN原料的DNA(含有化学式105表示的核苷酸)。
为了测定合成的各DNA的浓度,将纯化的各DNA用牛小肠碱性磷酸酶(50U/mL)、蛇毒磷酸二酯酶(0.15U/mL)和P1核酸酶(50U/mL)在25℃用16小时完全消化。将得到的消化液用CHEMCOBOND5-ODS-H(商品名)柱(4.6×150mm)的HPLC分析。此时,使用0.1MTEAA(pH7.0)作为展开液,流速为1.0mL/min。所述合成的DNA的浓度通过与含有各自为0.1mM浓度的dA、dC、dG和dT的标准溶液的峰面积进行比较而确定。并且,所述合成的DNA也通过MALDI TOF质谱确定。以下显示该质量分析值。此外,[105]表示在该位置***有化学式105所示的核苷酸。
CGCAAT[105]TAACGC,C134H177N52O76P12([M+H]+)计算值4103.8,实测值4107.0;
TTTTTT[105]TTTTTT,C138H187N30O90P12([M+H]+)计算值4077.8,实测值4076.9;
TGAAGGGCTT[105]TGAACTCTG,C205H265N77O122P19([M+H]+)计算值6348.2,实测值6348.7;
GCCTCCT[105]CAGCAAATCC[105]ACCGGCGTG,C285H376N108O169P27([M+H]+)计算值8855.0,实测值8854.8;
CCTCCCAAG[105]GCTGGGAT[105]AAAGGCGTG,C289H376N116O168P27([M+H]+)计算值8999.1,实测值9002.2.
实施例5:含有具有2个氨基的核苷酸的DNA寡聚物的生物素修饰
[化55]
方案3
通过使合成的DNA寡聚物5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(化合物105,使用所述化合物4作为X)与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应,从而使2个氨基用2个生物素标记(上述方案3)。即,首先,将30μL5’-d(CGCAATXTAACGC)-3’(化合物105,链浓度320μM)、10μLNa2CO3/NaHCO3缓冲液(1M,pH9.0)与60μL H2O混合,加入100μL生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液(20mM),充分混合。在25℃静置16小时后,加入800μL H2O,通过0.45μm的过滤器,将在反相HPLC约14分钟处出现的峰进行纯化(CHEMCOBOND 5-ODS-H;10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mM TEAA缓冲(20分),在260nm处检测)。将通过该HPLC纯化得到的生成物通过MALDI TOF质谱进行测定,结果在4554.3处观察到峰。该峰值与通过2个氨基与2个生物素分子反应得到的目标生成物6的分子量4555.4(由C154H204N56O80P12S2得到的计算值)求得的[M-H]-计算值4554.4相符。图5中显示了MALDI TOF质谱。
使用该化合物6(单链状态)合成了双链DNA和RNA,并比较了单链状态和双链状态的荧光强度。结果确认,在单链状态的DNA荧光探针(化合物6)的荧光发光被抑制,而与互补的核酸形成双螺旋时发出强烈的荧光。
以下实施例6-13中,合成了具有以下化学式b和c所示的羧基亚甲基连接体的噻唑橙衍生物,并将其活化为N-羟基琥珀酸酯,通过使其与具有活性氨基的DNA寡聚物(寡核苷酸)反应,制备了各种具有荧光性的寡核苷酸(荧光DNA探针)。即,制造了在从染料延伸出的亚甲基连接体的长度和含有从胸苷的5位延伸出的氨基的连接体方面具有各种改变的各种寡核苷酸(荧光DNA探针)。结果是,在任一所述各种荧光DNA探针中,单链状态的DNA荧光探针的荧光发光均可被抑制,并能够在与互补的核酸形成双螺旋时发出强烈荧光。此外,以下化学式b和c中,n表示连接体长度(桥连原子数)。
[化56]
实施例6:在1分子中2个位置上具有噻唑橙衍生的结构的化合物的合成
[化57]
方案4
如上述方案4,合成了在1分子中的2个位置上具有噻唑橙衍生的结构的DNA寡聚物(寡核苷酸)110。更详细的如下文所述。
噻唑橙衍生物107的合成参考Organic Letters 2000,6,517-519,如下述方案5所述进行。
[化58]
方案5
(1)碘化N-甲基喹啉鎓(化合物111)的合成
首先,根据上述文献的记载合成了碘化N-甲基喹啉鎓(化合物111)。具体而言,在42mL无水二噁烷中加入喹啉2.4mL和碘甲烷4mL,在150℃搅拌1小时后,通过过滤收集沉淀物,用***和石油醚洗涤,干燥,获得碘化N-甲基喹啉鎓(化合物111)。
(2)溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓(化合物112)的合成
将8mL 2-甲基苯并噻唑(FW149.21,d=1.173)和9.4g 5-溴戊酸(FW181.03)在110℃搅拌16小时。将粗产物冷却至室温,将生成的固体悬浮在20mL甲醇中,再加入40mL***。滤出生成的沉淀,用二噁烷进行洗涤直至2-甲基苯并噻唑的气味消失,再用***洗涤,减压干燥获得9.8g白色粉末。测定该白色粉末的1H NMR,结果为2位被烷基化的目标物溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓(化合物112)和2位未被烷基化的溴化3-(4-羧丁基)-苯并噻唑鎓的混合物。质子峰之比为:未烷基化的物质∶烷基化的物质=10∶3。该粗产物直接用于后续反应。
(3)溴化1-甲基-4-[{3-(4-羧丁基)-2(3H)-苯并亚噻唑基}甲基]喹啉(化合物107)的合成
在3.6ml三乙胺(FW101.19,d=0.726)的存在下,将在上述(2)中获得的含有溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓(化合物112)的粗产物2.18g与700mg的碘化N-甲基喹啉(化合物111)(FW271.10)在10mL的二氯甲烷中于25℃搅拌2个小时。随后,加入50ml***,过滤生成的沉淀,***洗涤,减压干燥。将该沉淀悬浮于50mL超纯水中、过滤、超纯水洗涤、减压干燥。再将上述沉淀悬浮于50mL乙腈中,过滤、用乙腈洗涤,减压干燥从而获得307.5mg的红色粉末(产率为25.3%)。将1HNMR谱与参考值相对比确定,此红色粉末即为目的产物(化合物107)。
此外,溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓(化合物112)以及溴化1-甲基-4-[{3-(4-羧丁基)-2(3H)-苯并亚噻唑基}甲基]喹啉(化合物107)还能够通过以下方式合成。即,首先,将11.7mL(92mmol)的2-甲基苯并噻唑(FW149.21,d=1.173)和13.7g(76mmol)的5-溴戊酸(FW181.03)在150℃下搅拌1个小时。在室温下冷却粗产物,将生成的固体悬浮于50ml甲醇中,再加入200ml***。生成的沉淀经过滤、***洗涤、减压干燥从而获得19.2g淡紫色粉末。该粉末为目的化合物112(溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓)和溴化2-甲基苯并噻唑鎓的混合物。1H NMR(在DMSO-d6中)测定该混合物,由8.5ppm处的峰(来自于目的化合物112)和8.0ppm处的峰(来自于溴化2-甲基苯并噻唑鎓)的峰面积比计算出目的化合物112的产量为9.82g(14mmol,32%)。该混合物(粗产物)无需提纯即可在随后的反应中使用。另外,将5-溴戊酸换成4-溴丁酸,以相同的方法合成具有碳原子数n=3的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化3-(4-羧丙基)-2-甲基苯并噻唑鎓,所得产率为4%。此外,将5-溴戊酸换成6-溴己酸,以相同的方法合成具有碳原子数n=5的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化3-(4-羧戊基)-2-甲基苯并噻唑鎓,所得产率为35%。再者,将5-溴戊酸换成7-溴庚酸,以相同的方法合成具有碳原子数n=6的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化3-(4-羧己基)-2-甲基苯并噻唑鎓,所得产率为22%。
随后,向3.24g含有化合物112(溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎓)和溴化2-甲基苯并噻唑鎓的上述混合物(粗产物)中添加1.36g(5.0mmol)的碘化N-甲基喹啉(化合物111)(FW271.10)、7.0mL(50mmol)的三乙胺(FW101.19,d=0.726)以及100mL的二氯甲烷,从而得到透明的溶液。于25℃将该溶液搅拌16小时。随后,减压蒸馏除去溶剂。向残留物中加入丙酮(200mL),过滤所得沉淀,随后丙酮洗涤。减压干燥由此获得的残留物,用蒸馏水(50mL)洗涤干燥后的红色残留物。再次过滤此残留物,蒸馏水洗涤,减压干燥,获得了红色粉末状目的产物(化合物107)(654mg,1.39mmol,28%)。将1H NMR谱与参考值相比较确认了该红色粉末即为目的产物(化合物107)。下文示出了1H NMR和13C NMR(DMSO-d6)的峰值以及HRMS(ESI)的测量值。此外,图6示出了化合物107的1HNMR谱(DMSO-d6)。
化合物107:1HNMR(DMSO-d6):δ8.74(d,J=8.3Hz,1H),8.51(d,J=7.3Hz,1H),7.94-7.89(m,3H),7.74-7.70(m,1H),7.65(d,J=8.3Hz,1H),7.55-7.51(m,1H),7.36-7.32(m,1H),7.21(d,J=7.3Hz,1H),6.83(s,1H),4.47(t,J=7.1Hz,2H),4.07(s,3H),2.22(t,J=6.6Hz,1H),1.77-1.63(m,4H);13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.6,158.8,148.4,144.5,139.5,137.6,132.7,127.9,126.8,125.5,124.1,123.7,123.6,122.4,117.5,112.6,107.6,87.4,45.6,42.0,35.5,26.2,22.3;C23H23N2O2S([M.Br]+)的HRMS(ESI)计算值为391.1480,实测值为391.1475。
此外,采用与制备上述化合物107相同的方法,由上述溴化3-(4-羧丙基)-2-甲基苯并噻唑鎓和溴化2-甲基苯并噻唑鎓的混合物合成了具有碳原子数n=3的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化4-((3-(3-羧丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉,所得产率为43%。下文示出了仪器分析值。
溴化4-((3-(3-羧丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.85(d,J=8.3Hz,1H),8.59(d,J=7.3Hz,1H),8.02.7.93(m,3H),7.78.7.70(m,2H),7.61.7.57(m,1H),7.42.7.38(m,1H),7.31(d,J=6.8Hz,1H),7.04(s,1H),4.47(t,J=8.1Hz,2H),4.13(s,3H),2.52.2.48(m,2H),1.99.1.92(m,2H);13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.3,158.9,148.6,144.5,139.5,137.7,132.7,127.9,126.7,125.6,124.1,124.0,123.7,122.5,117.5,112.5,107.6,87.7,45.6,42.0,31.6,22.4;C22H21N2O2S([M.Br]+)的HRMS(ESI)计算值为377.1324,实测值为377.1316。
此外,采用与制备上述化合物107相同的方法,由上述溴化3-(4-羧戊基)-2-甲基苯并噻唑鎓和溴化2-甲基苯并噻唑鎓的混合物合成了具有碳原子数n=5的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化4-((3-(3-羧戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉,所得产率为26%。下文示出了仪器分析值。
溴化4-((3-(3-羧戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.70(d,J=8.3Hz,1H),8.61(d,J=6.8Hz,1H),8.05.8.00(m,3H),7.80.7.73(m,2H),7.60.7.56(m,1H),7.41.7.35(m,2H),6.89(s,1H),4.59(t,J=7.3Hz,2H),4.16(s,3H),2.19(t,J=7.3Hz,1H),1.82.1.75(m,2H),1.62.1.43(m,4H);13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.5,159.0,148.6,144.7,139.7,137.8,132.9,127.9,126.9,125.2,124.2,123.8,123.6,122.6,117.8,112.6,107.7,87.4,45.6,42.1,36.0,26.3,25.9,24.9;C24H25N2O2S([M.Br]+)的HRMS(ESI)计算值为405.1637,实测值为405.1632。
此外,采用与制备上述化合物107相同的方法,由上述溴化3-(4-羧己基)-2-甲基苯并噻唑鎓和溴化2-甲基苯并噻唑鎓的混合物合成了具有碳原子数n=6的连接体(连接于羧基的聚亚甲基链)的溴化4-((3-(3-羧己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉,所得产率为22%。下文示出了仪器分析值。
溴化4-((3-(3-羧己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉:
1HNMR(DMSO-d6)δ8.72(d,J=8.3Hz,1H),8.62(d,J=6.8Hz,1H),8.07.8.01(m,3H),7.81.7.75(m,2H),7.62.7.58(m,1H),7.42.7.38(m,2H),6.92(s,1H),4.61(t,J=7.3Hz,2H),4.17(s,3H),2.18(t,J=7.3Hz,1H),1.82.1.75(m,2H),1.51.1.32(m,6H);13CNMR(DMSO-d6,60℃)δ174.0,159.1,148.6,144.7,139.8,137.8,132.9,127.9,126.8,125.0,124.2,123.8,123.6,122.6,118.0,112.7,107.8,87.4,45.5,42.1,33.4,27.9,26.4,25.5,24.1;C25H27N2O2S([M.Br]+)的HRMS(ESI)计算值为419.1793,实测值为419.1788。
(4)N-羟基琥珀酰亚胺酯109的合成
将9.4mg(20μmol)的溴化1-甲基-4-[{3-(4-羧丁基)-2(3H)-苯并亚噻唑基}甲基]喹啉(化合物107)(FW471.41)、4.6mg(40μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(化合物108)(FW115.09)和7.6mg(40μmol)的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)(FW191.70)在1mL的DMF中于25℃搅拌16小时,获得了染料(化合物107)的羧基被活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)。此反应产物无需纯化,将反应溶液(染料20mM)直接用于与寡聚DNA(寡核苷酸)的反应。
此外,除了使用具有碳原子数不同的连接体(聚亚甲基链)的化合物替代化合物107用作原料外,采用同制备化合物109相同的方法,合成具有碳原子数n=3的连接体(聚亚甲基链)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亚胺氧基)-4-氧代丁基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉。另外,还以同样的方式合成了具有碳原子数n=5的连接体(聚亚甲基链)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亚胺氧基)-4-氧代己基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉和具有碳原子数n=6的连接体(聚亚甲基链)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亚胺氧基)-4-氧代庚基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-甲基喹啉。
(5)以2个噻唑橙分子修饰的DNA寡聚物(寡核苷酸110)的合成
采用同上述实施例4一样借助于DNA自动合成仪的常规方法合成了具有两个活性氨基的DNA寡聚物(寡核苷酸)105。化合物105的序列为与实施例4相同的5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′(X为前述化合物104)。随后,使该DNA寡聚物(寡核苷酸)105与N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)反应,合成了在一个分子的两个位置具有由噻唑橙衍生的结构的DNA寡聚物(寡核苷酸)110。即,首先,将30μL的5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′(化合物105,链浓度为320μM)、10μL的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(1M,pH9.0)与60μL的H2O混合,然后加入100μLN-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)的DMF溶液(20mM),充分混合。于25℃静置16小时,然后加入800μL H2O,通过0.45μm的滤器,并纯化反向色谱中大约14.5分钟出现的峰(CHEMCOBOND 5-ODS-H 10×150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mM TEAA缓冲液(20分钟),于260nm检测)。图7示出了反向HPLC图。分离出并纯化以箭头所示峰表示的级分。通过MALDI TOF质谱的负模式测定该HPLC纯化所得生成物,发现在4848.8处的峰,确定其为DNA寡聚物(寡核苷酸)110。图8示出了DNA寡聚物(寡核苷酸)110的MALDI TOF MASS谱。在该图中,箭头示出由上述纯化所得生成物产生的质量峰(4848.8)。该峰值与[M2+-3H+]-的计算值4848.8相一致,所述[M2+-3H+]-由具有2个正电荷的DNA寡聚物(寡核苷酸)110的分子M(C180H220N56O78P12S2)除去3个质子获得。此外,左右两侧的峰为由作为标准品加入的DNA T8聚体和T18聚体产生的峰。
实施例7:DNA寡聚物(寡核苷酸)110作为荧光探针的使用
将实施例6纯化得到的DNA寡聚物(寡核苷酸)110(具有2个染料分子的DNA)脱盐、冷冻干燥,随后制备为水溶液,通过UV吸收测定浓度(X与T近似)。此后,在链浓度为2.5μM、磷酸缓冲液为50mM(pH7.0)并且NaCl为100mM的条件下,在荧光探针(DNA寡聚物110)为单链状态时、为DNA-DNA双螺旋时以及为DNA-RNA双螺旋时,分别进行UV测量。图9示出了这三个样本的谱。在该图中,虚线表示荧光探针为单链状态的谱,粗线表示DNA-DNA双螺旋的谱,细线表示DNA-RNA双螺旋的谱。由图示可知,由于形成了双螺旋,因而500nm附近的UV吸收的最大波长发生了移动。此外,在图9以及全部其他UV吸收图谱中,横轴表示波长(nm),纵轴表示吸光度。
随后,同样在链浓度为2.5μM、磷酸缓冲液为50mM(pH7.0)并且NaCl为100mM的条件下,通过488nm的激发光(带宽1.5nm)激发,随后进行荧光测量。图10分别示出了荧光探针为单链状态(虚线)、DNA-DNA双螺旋(粗线)和DNA-RNA双螺旋(细线)的三个样本的谱。由图示可知,与单链状态的荧光探针在530nm的荧光强度相比,DNA-DNA的荧光强度增加了15倍,DNA-RNA的增加了22倍。此外,图10以及全部其他荧光发光图谱以及激发图谱中,横轴表示波长(nm),纵轴表示发光强度。
另外,采用510nm的激发光来代替488nm的激发光,也获得了相同的结果。图11示出其谱。
实施例8:具有长度发生种种变化的连接体的化合物的合成以及作为荧光探针的使用
合成了连接体长度n发生种种变化的下述化学式113表示的化合物(DNA寡聚物)。合成同上述实施例1-4和6,所不同的是为满足连接体的长度,而将原料5-溴戊酸换成碳原子数(链长)发生改变的化合物。在本实施例中,下述化合物113的序列为5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′(X为染料引入部分)。此外,同实施例7一样,将它们分别用作荧光探针,通过荧光测定来评价性能。结果证实,若在下文所示连接体的长度范围内,则与单链探针相比,通过与目标核酸杂交,荧光增加大约10倍或者10倍以上。另外,通过探针与目标核酸杂交所得双链与天然序列的双链相比具有更高的热稳定性。
化59
表1
5′-d(CGCAATTTAACGC)-3′/5′-d(GCGTTAAATTGCG)-3′Tm(℃) 58
5′-d(CGCAATTTAACGC)-3′/5′-r(GCGUUAAAUUGCG)-3′Tm(℃) 46
测定条件:探针(化合物113)2.5μM、磷酸缓冲液50mM(pH7.0)、NaCl100mM、互补链2.5μM
荧光的最大波长是用488nm(带宽1.5nm)的光激发时的值。
量子收率为将9,10-二苯基蒽用作参照物计算得到的。
图12示出了实施例8中连接体长度n=4时的吸收谱。虚线为单链的谱,实线为DNA-DNA链的谱,点划线为DNA-RNA链的谱。观察到在400-600nm的吸收时,单链状态时的吸收带与杂交后的吸收带相比出现在短波长侧,明确表明通过单链状态的染料二聚体形成了H-聚集体。
另外,图13一并示出了实施例8中连接体长度n=4时的激发谱和荧光发谱。在该图中,左侧(短波长侧)的曲线表示激发谱,右侧(长波长侧)的曲线表示荧光发光谱。另外,在该图中,图例的括号内分别表示激发谱中的参照荧光发光的波长(荧光的λmax)、荧光发光谱中的激发波长。在激发谱和荧光发光谱中,单链的发光强度最弱,DNA-DNA链的与之相比稍强,DNA-RNA链的最强。由激发谱可知,与荧光发光相关的吸收只有图12中的长波长侧的吸收带,而短波长侧的吸收不与荧光发光相关。换言之,明确表明,通过激子效应,可以对荧光发光进行控制。因此,荧光发光在杂交后增强,而在单链状态下则极其微弱。因此,可以清楚地区分杂交前后的状态。
实施例9
合成了连接体长度n发生种种变化的以下述化学式114表示的一个分子中仅含有一个染料结构的化合物(DNA寡聚物)。合成同上述实施例1-4和6,所不同的是为满足连接体的长度,将原料5-溴戊酸换成碳原子数(链长)发生改变的化合物,并且在化合物102的合成中,使用双(2-氨乙基)甲胺代替三(2-氨乙基)胺。能够以同样的方式分别合成n=3、4、5、6的化合物。
化60
更具体而言,依据下述方案合成。下述方案虽为n=4的情况,但是在n为其他数值的情况下同样也可以合成。
化61
(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙基)氨基)乙基氨基)-3-氧代丙-1-烯基)-2′-脱氧尿苷((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-2′-deoxyuridine)(102’)的合成
将1.19g(4.0mmol)的(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2′-脱氧尿苷101(分子量298.25)和921mg(8.0mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺(分子量115.09)和1.53g(8.0mmol)的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(分子量191.70)加入已放入搅拌子的回收烧瓶中,再加入1.0mL的DMF,于25℃搅拌8小时。加入大约1mL的乙酸,并加入250mL的二氯甲烷和250mL的超纯水,随后剧烈搅拌。过滤所生成的沉淀,并用水洗涤,减压条件下过夜干燥。将所得白色残留物悬浮于100mL的乙腈,并剧烈搅拌。向其中一次性加入2.34g(20mmol)的N-甲基-2,2′-二氨基二乙胺(分子量146.23,d=0.976),并于25℃再搅拌10分钟。此后,加入4.8mL(40mmol)的三氟乙酸乙酯(分子量142.08,d=1.194)、5.6mL(40mmol)的三乙胺(分子量101.19,d=0.726)以及50mL的乙醇,并于25℃搅拌16小时。从所得混合物中减压蒸馏除去溶剂,并用硅胶柱纯化(10-20%MeOH/CH2Cl2)。从含有目的产物的级分中减压蒸馏除去溶剂,使其溶解于少量的丙酮,一加入***就生成了白色沉淀。过滤、***洗涤后进行减压干燥,从而获得了白色粉末状750mg(76%)的目的产物(化合物102’)。下文示出了仪器分析值。化合物102’:
1HNMR(CD3OD)δ8.29(s,1H),7.17(d,J=15.6Hz,1H),6.97(d,J=15.6Hz,1H),6.21(t,J=6.3Hz,1H),4.40.4.36(m,1H),3.92.3.90(m,1H),3.80(dd,J=11.7,2.9Hz,1H),3.72(dd,J=11.7,3.4Hz,1H),3.37.3.25(m,5H),2.60.2.53(m,5H),2.33.2.19(m,5H);13CNMR(CD3OD)δ169.2,158.7(q,J=36.4Hz),151.2,143.7,143.6,134.1,122.2,117.5(q,J=286.2Hz),111.0,89.2,87.0,72.1,62.6,57.4,56.7,42.4,41.8,38.5,38.3;C19H27F3N5O7([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为494.1863,实测值为494.1854。
(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙基)氨基)乙基氨基)-3-氧代丙-1-烯基)-5′O-(4,4′-二甲氧基三苯基)-2′-脱氧尿苷3′O-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1-enyl)-5′O-(4,4′-dimethoxytrityl)-2′-deoxyuridine3′O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidite)(化合物104’)的合成
首先,将296mg(0.60mmol)的化合物102’(分子量494.19)和224mg(0.66mmol)的4,4′-二甲氧基三苯甲基氯化物(分子量338.83)加入放入了搅拌子的回收烧瓶中,加入4mL的吡啶,并于25℃搅拌2小时。加入1ml的水,减压蒸馏除去溶剂,并用硅胶柱纯化(1.5%MeOH以及1%Et3N/CH2Cl2)。将含有目的化合物102’的三苯基化物(化合物104’的中间体)的级分浓缩,并向残留物中加入饱和碳酸氢钠水溶液。用乙酸乙酯萃取该混合物,用饱和盐水洗涤,并进行加压干燥,从而获得白色泡状的三苯基化物(366mg,77%)。
1HNMR(CD3OD)δ7.94(s,1H),7.42.7.17(m,9H),7.01(d,J=15.6Hz,1H),6.95(d,J=15.6Hz,1H),6.86.6.83(m,4H),6.21(t,J=6.3Hz,1H),4.41.4.38(m,1H),4.09.4.06(m,1H),3.75(s,6H),3.40.3.30(m,6H),2.59(t,J=6.8Hz,2H),2.53(t,J=6.8Hz,2H),2.46.2.31(m,5H);13CNMR(CD3OD)δ169.2,158.7(q,J=36.4Hz),151.2,143.7,143.6,134.1,122.2,117.5(q,J=286.2Hz),111.0,89.2,87.0,72.1,62.6,57.4,56.7,42.4,41.8,38.5,38.3;C40H45F3N5O9([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为796.3169,实测值为796.3166。
将159mg(0.20mmol)前述化合物102’的三苯基化物(分子量920.85)以及28.6mg(0.40mmol)1H-四唑(分子量70.05)放入圆底烧瓶内,并用真空泵进行过夜真空干燥。这时加入4.0mL的CH3CN溶解试剂,随后搅拌,并一次性加入191μL(0.60mmol)的2-氰乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰胺(分子量301.41,d=0.949),并在25℃搅拌2小时。用TLC确定反应结束后,加入饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯萃取,并用饱和盐水洗涤有机层,随后用硫酸镁干燥。通过过滤除去硫酸镁后,减压蒸馏除去溶剂,从而得到含有目的化合物104’的粗产物。该组合物无需纯化即可直接用于DNA合成。此外,化合物104’的获得可由前述粗产物的31PNMR(CDCl3)和HRMS(ESI)确定。下文示出了这些数值。
化合物104’:
31PNMR(CDCl3)δ149.686,149.393;C49H61F3N7O10P([M+H]+)的HRMS(ESI)计算值为996.4248,实测值为996.4243。
同前述化合物105那样进行DNA105’的合成。下文示出了仪器分析值。DNA105’:CGCAAT[105’]TAACGC,C133H174N51O76P12([M+H]+)的计算值为4074.8,实测值为4072.0;CGCAAT[105’][105’]AACGC,C140H187N54O77P12([M+H]+)的计算值为4230.0,实测值为4228.9。
同前述化合物113那样进行引入有噻唑橙的DNA 114的合成。下文示出了仪器分析值。CGCAAT[114](4)TAACGC,C156H194N53O77P12S(M+)的计算值为4447.3,实测值为4445.6;CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC,C186H228N58O79P12S2([M.H]+)的计算值为4976.0,实测值为4976.9。
在合成的DNA寡聚物(ODN)中,对于具有5′-d(CGCAAT[114](n)TAACGC)-3′序列的ODN(仅含有一个染料的探针),同实施例7以及8那样观察了荧光变化情况。下表2、图14以及15示出其结果。图14示出吸收谱(虚线为单链的谱,实线为DNA-DNA链的谱,点划线为DNA-RNA链的谱),图15示出激发谱和发光谱。在图15中,左侧(短波长侧)的曲线表示激发谱,右侧(长波长侧)的曲线表示荧光发光谱。另外,在该图中,图例中的波长分别表示激发谱中的参照荧光发光的波长(荧光的λmax)、荧光发光谱中的激发波长。在激发谱和荧光发光谱中,单链的发光强度最弱,DNA-DNA链的与之相比稍强,DNA-RNA链的最强。由图可知,化合物114在1分子中仅具有一个染料结构,不会形成H聚集体,因而不会出现激子效应(在吸收谱中,没有观察到向短波长侧的位移)。因此,与具有2个染料结构的化合物相比,单链状态的荧光淬灭较弱,双链与单链的荧光强度比Ids/Iss相对较小。但是,由于双链形成所致染料***使染料结构平坦化,因而正如下表2所示,与单链相比,双链状态得到了更大的荧光强度。此外,在单链中,将UV吸收谱中的激发波长从488nm改变为λmax(λmax为2个时指长波长侧的),结果获得了量子收率ΦF=0.120的测量结果。另外,在DNA-DNA双链中,将UV吸收谱中的激发波长从488nm改变为λmax(λmax为2个时指长波长侧的),结果获得了量子收率ΦF=0.307、双链和单链的荧光强度比Ids/Iss=3.4的测定结果。
表2
测定条件:探针2.5μM、磷酸缓冲液50mM(pH 7.0)、NaCl 100mM、互补链2.5μM
荧光的最大波长是用488nm(带宽1.5nm)的光激发时的值。
量子收率为将9,10-二苯基蒽用作参照物计算得到的。
实施例10
采用同实施例9相同的方法,合成在1个分子中仅含有1个染料结构的化合物(DNA寡聚物),所不同的是将用作染料的前述化合物107替换为下述化学式115表示的化合物。使连接体长度n在1-4之间进行种种变化来进行合成。序列为与前述化合物105相同的5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′(X为染料引入部分)。
化62
下述化合物116为n=2的情况。对于化合物116,采用同实施例7-9相同的方式来评价荧光强度,结果发现,与单链相比,DNA-RNA双链的荧光强度有所增加。
化63
荧光寿命测定
对于实施例8(2个染料)和实施例9(1个染料)的DNA寡聚物(寡核苷酸),分别在单链的情况下和双链DNA的情况下对其荧光寿命进行了测定。测定对照DNA寡聚物包含在下述序列的位置X中的染料引入核苷酸。
5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′ (SEQ ID NO.1)
5′-d(GCGTTAAATTGCG)-3′ (SEQ ID NO.2)
下表3示出了前述荧光寿命测定的结果。表中,T为荧光寿命(ns)。CHISQ为测定误差。T1表示从激发刚结束随即经过的时间。对于实施例8的含2个染料的探针,T2表示在经过时间T1之后再经过的时间,对于实施例9的含有1个染料的探针,T2则表示从激发刚结束随即经过的时间。T3表示经过时间T2后再经过的时间。表中,用“%”表示的数值为在分别经过时间T1、T2或T3期间的荧光衰减率(将激发刚结束时的荧光强度当作100%),对于各个探针(DNA寡聚物)而言,总量为100%。如表3所示,含有2个染料的探针(实施例8)在单链状态下有着极其短暂的淬灭过程(激发后0.0210ns,荧光衰减率为81.54%),表明存在激子效应。在其他情况下没有观察到此现象。在该以2个染料标记的ODN的单链状态中,荧光淬灭在荧光强度的杂交特异性以及迅猛变化中起着重要的作用。另外,由表3可知,荧光淬灭特性与二次或者三次函数特性相一致。此外,对于下表3中含有2个染料的双链,再度在相同条件下进行了测定(但是,略去了T1测定),结果发现,在T2=2.05时荧光衰减率为44%,T3=4.38时荧光衰减率为56%,T=3.33(ns),CHISQ=1.09,获得了与下表3极其接近的数值。即,本实施例的探针在此荧光寿命测定中有着良好的再现性。
表3
一个染料单链 | 一个染料双链 | 两个染料单链 | 两个染料双链 | |
T1 | - | - | 0.0210ns(81.54%) | 0.551ns(2.73%) |
T2 | 0.934ns(39.19%) | 1.58ns(24.63%) | 1.28ns(8.99%) | 2.33ns(50.30%) |
T3 | 3.12ns(60.81%) | 3.60ns(75.37%) | 3.76ns(9.48%) | 4.57ns(46.97%) |
T | 2.26 | 3.10 | 0.489 | 3.33 |
CHISQ | 1.32 | 0.96 | 1.11 | 1.04 |
链2.5μM
磷酸缓冲液50mM(pH7.0)
NaCl 100mM
在455nm(增强)和600nm(衰减)进行测定。
实施例11
采用同实施例8相同的方法,合成下述化学式117表示的DNA寡聚物,所不同的是将用作染料的前述化合物107替换为下述化学式115’所示化合物。可以相同的方式分别合成n=3、4、5、6的化合物。另外,同实施例8一样,将其用作荧光探针,通过荧光测定来评价性能。下表4示出其结果。由表4可知,化合物117与实施例8的DNA寡聚物(化合物113)相比有着不同的吸收带,但却表现出同样良好的激子效应。这表明,在本发明中,可以使用吸收带不同的荧光探针进行多色检测。
化64
化65
表4
实施例12
合成了以下述序列表示的DNA寡聚物(化合物118)。X为具有同实施例9一样的染料结构的核苷酸(下式:为化学式118)。如下述序列所示,该DNA寡聚物将2个染料引入核苷酸连续排列在一起。染料的引入以及DNA寡聚物的合成通过与前述各实施例相同的方式进行。
5′-d(TTTTTTXXTTTTT)-3′ (SEQ ID NO.3)
化66
另外,同前述各实施例一样,将此DNA寡聚物用作荧光探针,并通过荧光测定评价性能。
探针2.5μM(链浓度)
磷酸缓冲液50mM(pH7.0)
NaCl 100mM
互补链2.5μM(链浓度)
图16和17示出其结果。图16为示出吸收谱的图(虚线为单链的谱,实线为DNA-DNA链的谱,点划线为DNA-RNA链的谱),图17为一并示出激发谱和荧光发光谱的图。在图17中,左侧(短波长侧)曲线表示激发谱,右侧(长波长侧)曲线表示荧光发光谱。在激发谱和荧光发光谱中,单链的发光强度最弱,DNA-RNA链的与之相比稍强,DNA-DNA链的最强。如图所示,即便是在以此方式将2个染料引入核苷酸连续排列在一起时,由于染料间的距离被缩短,因而也可表现出激子效应,藉此可通过荧光强度明确区分目的核酸杂交前后的状态。
实施例13
合成了连接体长度n和核酸序列发生种种变化的以前述化学式113或者114表示的化合物(DNA寡聚物),即下表5所示各ODN。此外,“ODN”如前所述意指寡聚DNA(DNA寡聚物)。同前述实施例1-4、6、8、9或12那样进行合成,所不同的是为满足连接体的长度,将原料5-溴戊酸换成碳原子数(链长)发生改变的化合物,并在寡聚DNA合成中适当改变序列。此外,ODN1与实施例8中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同,ODN4和ODN5与实施例9中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同。在合成中,使用活性氨基在50当量或者50当量以上的噻唑橙的N-羟基琥珀酰亚胺酯(化合物109)。合成之后,在反向HPLC中的展开时间根据需要为20-30分钟或20-30分钟以上。此外,在下表5中,例如,[113](n)或者[114](n)表示在该位置***以化学式113或者114表示的核苷酸,n为连接体长度。另外,在下表5中,ODN1′表示与ODN1互补的DNA链。同样地,ODN2′表示与ODN2互补的DNA链,ODN3′表示与ODN3互补的DNA链。
表5
序列(5’→3’)
ODN1 CGCAAT[113](n)TAACGC SEQ ID NO.1
ODN1’ GCGTTAAATTGCG SEQ ID NO.2
ODN2 TTTTTT[113](4)TTTTTT SEQ ID NO.4
ODN2’ AAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO.5
ODN3 TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG SEQ ID NO.6
ODN3’ CAGAGTTCAAAAGCCCTTCA SEQ ID NO.7
ODN4 CGCAAT[114](4)TAACGC SEQ ID NO.1
ODN5 CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC SEQ ID NO.8
ODN(anti4.5S) GCCTCCT[113](4)CAGCAAATCC[113](4)ACCGGCGTG SEQ ID NO.9
ODN(antiB1) CCTCCCAAG[113](4)GCTGGGAT[113](4)AAAGGCGTG SEQ ID NO.10
同前述实施例4一样,通过酶消化来测定合成的各ODN的浓度。另外,通过MALDI TOF质谱来鉴定合成的各ODN。下文示出了其质量分析值。
ODN1(n=3),CGCAAT[113](3)TAACGC,C178H213N56O78P12S2([M.H]+)的计算值为4820.7,实测值为4818.9;ODN1(n=4),CGCAAT[113](4)TAACGC,C180H217N56O78P12S2([M.H]+)的计算值为4848.8,实测值为4751.4;
ODN1(n=5),CGCAAT[113](5)TAACGC,C182H221N56O78P12S2([M.H]+)的计算值为4876.8,实测值为4875.6;
ODN1(n=6),CGCAAT[113](6)TAACGC,C184H225N56O78P12S2(([M.H]+)的计算值为4904.9,实测值为4903.6;
ODN2,TTTTTT[113](4)TTTTTT,C184H227N34O92P12S2([M.H]+)的计算值为4822.8,实测值为4821.4;
ODN3,TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG,C251H305N81O124P19S2([M.H]+)的计算值为7093.2,实测值为7092.3;
ODN(anti4.5S),GCCTCCT[113](4)CAGCAAATCC[113](4)ACCGGCGTG,C377H456N116O173P27S4([M.3H]+)的计算值为10344.9,实测值为10342.7;
ODN(antiB1),CCTCCCAAG[113](4)GCTGGGAT[113](4)AAAGGCGTG,C381H456N124O172P27S4([M.3H]+)的计算值为10489.0,实测值为10489.8。
在前述表5的ODN中,对于含有序列和连接体长度发生种种变化的[113](n)的ODN(ODN1、ODN2、ODN3),在与互补链杂交前后,分别测定其吸光谱、激发谱和发光谱。结果一并示于下表6、图18和图19。
表6
测定条件:2.5μM DNA、50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)、100mM氯化钠
b用488nm激发
c用λmax激发(λmax有两个时,用长波长侧的λmax激发)
d双链状态和单链状态在λem处的荧光强度比
此外,在表6中,ODN1(n=3-6)与前述实施例8的寡聚DNA(5′-d(CGCAATXTAACGC)-3′,X为染料113引入部分)有着相同的结构。但是,在实施例8中,荧光量子收率ΦF以及双链状态和单链状态的荧光强度比(Ids/Iss)用波长488nm激发来测定,而在本实施例(实施例13)中,如上所述,用UV吸收谱中的λmax激发来测定。因此,在前述表1(实施例8)和前述表6(实施例13)中,即便物质相同ΦF和Ids/Iss也不同。
图18为示出含有[113](4)的ODN的吸收谱、激发谱和发光谱的图。图(a)、(b)和(c)各图中,左图均表示吸收谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。右图均表示激发谱和发光谱,横轴表示波长,纵轴表示发光强度。将含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的含有[113](4)的ODN作为样本,于25℃进行各个测定。在图18的各图中,黑线表示单链ODN(ss)的测定结果,灰线表示与相应互补链DNA杂交的ODN(ds)的测定结果。
图18(a)示出ODN1(n=4)(2.5μM)的测定结果。测定激发谱,对于ss,在波长534nm处测定发光强度,对于ds,在波长528nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长519nm激发,对于ds则用波长514nm激发。
图18(b)示出ODN2的测定结果。左图中链浓度为2.5μM,右图中链浓度为1μM。测定激发谱,对于ss,在波长534nm处测定发光强度,对于ds,在波长537nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长517nm激发,对于ds用波长519nm激发。
图18(c)示出ODN3的测定结果。链浓度为2.5μM。测定激发谱,对于ss,在波长535nm处测定发光强度,对于ds,在波长530nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长518nm激发,对于ds用波长516nm激发。
图19为示出ODN1(n=3、5和6)的吸收谱、激发谱和发光谱的图。图(a)、(b)和(c)各图中,左图均示出吸收谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。右图均示出激发谱和发光谱,横轴为波长,纵轴为发光强度。将含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的ODN1(n=3、5或6)作为样本,于25℃进行各个测定。在图19的各图中,黑线表示单链ODN(ss)的测定结果,灰线表示与相应互补链DNA杂交的ODN(ds)的测定结果。
图19(a)示出ODN1(n=3)(2.5μM)的测定结果。测定激发谱,对于ss,在波长537nm处测定发光强度,对于ds,在波长529nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长521nm激发,对于ds用波长511nm激发。
图19(b)示出ODN1(n=5)(2.5μM)的测定结果。测定激发谱,对于ss,在波长538nm处测定发光强度,对于ds,在波长529nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长520nm激发,对于ds用波长512nm激发。
图19(c)示出ODN1(n=6)的测定结果。链浓度为2.5μM。测定激发谱,对于ss,在波长536nm处测定发光强度,对于ds,在波长528nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长523nm激发,对于ds用波长514nm激发。
如表6、图18和图19所示,对于各含有[113](n)的ODN样本,在400-550nm的范围内观察到两个吸收带。在含有1(n)的ODN样本为单链状态时,短波长侧(~480nm)的吸收带稍强,而在含有1(n)的ODN样本与互补链杂交时,长波长侧(~510nm)的吸收带显著(明显)显现。长波长侧(~510nm)的吸收带是噻唑橙单体的典型吸收带。在发光谱中,在~530nm处观察到单个宽吸收带。含有[113](n)的ODN样本通过与互补链杂交,发光强度发生了明显的变化。即,与目的DNA链杂交的含有[113](n)的ODN样本展现出强的荧光,而杂交前的含有[113](n)的ODN样本与杂交后相比展现出极其微弱的荧光。特别是由多聚嘧啶序列形成的ODN2的荧光在单链状态下几乎完全淬灭。最大发光波长时,ODN2的二重链(双链)状态与单链状态的荧光强度比(Ids/Iss)达160。在作为20聚体的ODN链的ODN3’同一般序列的ODN3杂交的情况下,杂交前后发光强度明显不同。另外,由表6、图18(a)和图19可知,在本实施例的ODN1中,在将连接体长度在3-6之间改变的情况下,无论哪个连接体长度均能获得大的Ids/Iss值。如上所述,尽管表6所示ODN因探针序列和连接体长度导致淬灭性能有所差异,但是无论哪一个都表现出良好的淬灭性能。
此外,如前述表6所示,ODN1(n=4)/ODN1′的融点(Tm)与天然双链5′-CGCAATTTAACGC-3′/ODN1′相比上升7-9℃。该Tm值上升表明,探针中的2个阳离子性染料与同目的序列形成的双链有效地结合在一起。此外,从图18和19可知,激发谱与化合物的结构无关,而是示出了510nm附近单个宽峰。显示出该波长同吸收带的一个波长很好地吻合在一起。即认为,与荧光发光相关的吸收只是510nm附近的吸收带,480nm附近的吸收带对发光几乎没有影响。另外,由于因染料聚集使得吸收带从510nm附近迁移到480nm附近,因此估计激子耦合能量为1230cm-1。这等同于针对花菁染料的H聚集体所报道的耦合能量。但是,这类理论认识不是对本发明进行限制。
吸收谱
在各温度和浓度下测定前述ODN1(n=4)的吸收谱,确定温度和浓度对吸收带的影响。图20的吸收谱图示出了其结果。图(a)和(b)各图中,横轴为波长,纵轴为吸光度。将含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中的ODN1(n=4)作为样本,进行各个测定。
图20(a)示出改变溶液温度时的吸收谱变化情况。ODN浓度为2.5μM。谱在10℃-90℃之间以10℃间隔测定。
图20(b)示出改变溶液浓度时的吸收谱变化情况。测定温度为25℃。ODN浓度为0.5、0.75、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0μM。
另外,插图为示出波长为479nm时的吸光度的对数(纵轴)同波长为509nm时的吸光度的对数(横轴)的关系的图。
如图20(a)所示,改变样本温度进行测定,结果发现2个吸收带的吸光度比略微有些变化。即,随着样本温度的上升,479nm的吸收带逐渐减小,509nm的吸收带增大。但是,由图可知,此变化极其微弱。这表明,本发明的探针ODN1(n=4)的结构随温度变化的变化非常微弱,因而可以使用而几乎不受温度的影响。另外,如图所示,在487nm处,观察到指示存在2个谱构成要素的等吸收点。
另一方面,如图20(b)所示,增加ODN1(n=4)的样本浓度时,可观察到两侧吸收带的吸光度增加。另外,如插图所示,log(Abs479)对log(Abs509)的图即各吸收带的吸光度的对数的比表现为直线。这显示出表示2个谱的构成要素的比值与ODN浓度无关,几乎是恒定的。即,即便改变溶液中的浓度,本发明的探针ODN1(n=4)的结构也几乎不发生变化,因而可以使用而不会受到浓度的影响。
另外,图20(a)和(b)谱变化的原因可解释如下,但这些解释是理论认识的一个实例,而不是对本发明作出限制。即,首先,ODN1(n=4)通过二色性***形成分子内H聚集体。据推测,图20(a)中的谱变化是由于因温度上升导致的H聚集体的结构略微松散所致。另外,认为前述分子内H聚集体的形成在分子内结束,因此即便浓度上升,分子间相互作用等所引起的结构变化也几乎没有,所以如图20(b)和插图所示,2个谱构成要素的比几乎是恒定的。另外,认为在ODN1(n=4)的样本溶液中,存在分子内H聚集体和染料单体(染料部分不聚集)的2个构象模型。推测短波长侧(479nm)的吸收带来自于分子内H聚集体。长波长侧的吸收带(509nm)因加热会增大,因此推测来自于染料单体。
CD谱
测定了ODN1(n=4)/ODN1′的CD谱。链浓度为2.5μM,在含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中于25℃测定。图21的CD谱图示出其测定结果。在此图中,横轴为波长(nm),纵轴为角度θ。如图所示,ODN1(n=4)/ODN1′双链在450-550nm间表现出***型Cotton效应(split-Cotton effect)。即,所测定的CD对在噻唑橙染料***到DNA双链中时表现出典型的模式。即,认为ODN1(n=4)的染料部分***到所形成的双链DNA中,因而大大地妨碍了二色性聚集体(H聚集体)的形成。此CD测定结果与前述Tm测定结果一起表明,ODN1(n=4)中的染料部分与双链DNA结合时,2个染料部分均***大沟中,从而形成热稳定的双链结构。但是,此理论认识不是对本发明进行限制。所形成的双链结果具有热稳定性,这表明本发明的探针(核酸)可以在互补序列的检测中有效地使用。
实施例14
针对前述ODN5(CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC),测定了双链状态和单链状态的吸收谱、激发谱和发光谱。下表7和图22示出其结果。
表7
测定条件:2.5μM DNA,50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0),100mM氯化钠
b用488nm激发
c用λmax激发(λmax有2个时,用长波长侧的λmax激发)
d双链状态和单链状态在λem处的荧光强度比
图22为示出ODN5即含有[114](4)的ODN的吸收谱、激发谱和发光谱的图。ODN5的链浓度为2.5μM,在含有100mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH=7.0)中于25℃进行测定。黑线表示单链ODN5(ss)的测定结果,灰线表示与ODN1′杂交的双链的ODN5(ds)的测定结果。(a)为吸收谱,横轴为波长,纵轴为吸光度。(b)为激发谱(短波长侧的曲线)和发光谱(长波长侧的曲线),横轴为波长,纵轴为发光强度。测定激发谱,对于ss,在波长534nm处测定发光强度,对于ds,在波长514nm处测定发光强度。测定发光谱,对于ss用波长528nm激发,对于ds用波长519nm激发。
如前述表7和图22所示,同仅含一个[114](4)核苷酸的单链ODN4的发光抑制(前述实施例9的表2)相比,2个[114](4)核苷酸连接在一起的序列ODN5表现出更为有效的荧光淬灭。单链状态的ODN5的吸收谱中,其吸收带朝向短波长侧迁移。这表明ODN5中所含2个[114](4)核苷酸形成了分子内H聚集体。同在含有[113](n)的ODN中所观察到的一样,此聚集引发了单链ODN5的淬灭。也就是说,认为由于ODN5内的2个[114](4)核苷酸的染料部分发生了H聚集,因而在前述染料间发生激子耦合,这正是荧光发光抑制(淬灭)的原因所在。这表明,同含有[113](n)的ODN一样,含有2个[114](4)核苷酸的ODN5可用于互补链检测中。
实施例15
通过肉眼测定ODN1(n=4)同互补ODN1′杂交时的荧光。图23示出了其测定结果。在该图中,左侧样本槽为装有ODN1(n=4)单链的样本槽,在该图中,右侧样本槽为装有ODN1(n=4)/ODN1′双链的样本槽,分别示出在150W卤素灯照射后的状态。各个样本槽中的链浓度为2.5μM,装有50mM磷酸缓冲液(磷酸钠缓冲液)(pH7.0)和100mM NaCl。如图所示,在150W卤素灯照射后,装有ODN1(n=4)单链的图左侧样本槽几乎没有荧光发光,而装有ODN1(n=4)/ODN1′双链的图右侧样本槽表现出极其明显的浅绿色荧光。另外,将互补DNA链ODN1′替换为相应互补RNA链也获得了同样的结果。另外,在ODN2和ODN2’中也获得了相同的结果。另外,对于ODN2和ODN2’,将ODN2’替换为相应互补RNA(A13聚体)也获得了相同的结果。另外,在这些情形下,链浓度为5μM。另外,对于前述表6中的全部其他ODN也获得了相同的结果。因此,通过本实施例的ODN,荧光强度因杂交而发生明显的变化,因而,对于有可能杂交的目标序列可通过肉眼简单判断。这表明,这些ODN可用于直观的基因分析。
实施例16
同实施例8一样,合成了下述化学式120表示的DNA寡聚物,所不同的是,将用作染料的前述化合物107替换为下述化学式119表示的化合物。
化67
化68
能够以同样的方法分别合成上述式120中n=3、4、5和6的化合物(寡聚DNA)。另外,使用序列5′-d(CGCAAT[120](5)TAACGC)-3′表示的ODN(为ODN6(n=5))作为荧光探针,测定吸收谱和荧光发光谱并评价性能。测定条件同实施例7。图24示出其测定结果。图24(a)为吸收谱,横轴为波长(nm),纵轴为吸光度。图24(b)为荧光发光谱,横轴为波长(nm),纵轴为发光强度。每一幅图中,黑线均表示单链ODN的谱,灰线均表示与互补ODN杂交的双链ODN的谱。如图24(a)所示,在双链ODN中,由于形成了双螺旋,因而600nm附近的UV吸收的最大波长朝向长波长侧移动。另外,如图24(b)所示,在双链ODN中,同单链相比,其荧光强度大幅增加。因此,认为在单链状态表现出激子效应。也就是说,虽然本实施例的ODN(化合物120)与实施例8的ODN(化合物113)和实施例11的ODN(化合物117)相比,有着不同的吸收带,但是也能表现出良好的激子效应。这表明,在本发明中,使用吸收带不同的荧光探针可以进行多色检测。
实施例17:与RNA形成双链
在比色杯中,使前述ODN2(序列5′-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3′)和与之相应的互补RNA链(RNA A13聚体)形成双链ODN,并测定荧光发光谱。另外,向其中添加RNase H,并观察谱的变化情况。图25示出其结果。在该图中,横轴为时间,纵轴为荧光强度。图中,黑线表示中途添加RNase H的前述双链ODN的谱变化情况,灰线表示对照即没有添加RNaseH的前述双链ODN的谱变化情况。在37℃搅拌的同时使用前述荧光分光光度计进行测定。如图所示,若添加RNase H,则同前述ODN2杂交的RNA会被消化掉,前述ODN2会恢复为单链,因而荧光强度逐渐减少。这一事实也表明本发明的探针(核酸)可用于通过荧光检测互补RNA。
实施例18
改变前述ODN1(n=4)(序列5′-d(CGCAAT[113](4)TAACGC)-3′)的互补DNA链ODN1′(序列5′-d(GCGTTAAATTGCG)-3′)的浓度比来观察荧光发光强度的变化情况。测定条件为将ODN1(n=4)的链浓度固定为1.0μM,而磷酸缓冲液为50mM(pH7.0),NaCl为100mM,激发波长为488nm(带宽为1.5nm)。分别在互补链ODN1′的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0或3.0μM的各浓度下进行测定。图26示出其测定结果。在该图中,横轴表示相对于ODN1(n=4)的ODN1′的当量数。纵轴表示荧光λmax(529nm)处的荧光发光强度(相对值)。如图所示,在ODN1′的当量数在1以下时,荧光发光强度以极高的精确性呈现出相对于前述当量数的正比关系,然而前述当量数超过1时,却没有变化。这表明ODN1(n=4)与ODN1′以1∶1的物质量比(分子数比)正确杂交。
如上所述,ODN1′(目的DNA)的物质量与ODN1(n=4)(探针)的量相同或更少时,荧光强度与目的DNA的浓度成比例增大。也就是说,在ODN1′(目的DNA)存在的体系中,若添加过量的ODN1(n=4)(探针),则可通过荧光强度测定来对前述目的DNA进行定量。另外,通过示踪前述荧光强度的增减情况,也可以测定前述目的DNA的增减情况。
为了对体系中的前述目的DNA进行定量,例如如图26那样,也可以事先作成标准曲线。例如,若ODN1′(目的DNA)浓度未知的样本在与本实施例相同的条件下进行测量时的荧光强度为80,那么由图26可知,前述ODN1′(目的DNA)的浓度为约0.55μM。
事实上,通过上述方法对核酸中的ODN1′(目的DNA)序列进行定量,在立即检测出该目标序列的扩增、分解和蛋白结合等现象发生情况的同时,也可以对这些现象的量进行定量。
实施例19:点印迹分析
为了观察此时合成的新探针(核酸)因杂交所致荧光性质的变化情况,通过使用前述ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S)的点印迹对DNA进行了分析。所使用的目的DNA序列为含有B1 RNA序列的短链DNA片段。此序列为啮齿类基因组中的短分散型核内反复序列之一。另外,前述短链DNA片段含有4.5S RNA序列。此序列为分离自啮齿类细胞的低分子核内RNA之一,并与B1家族具有广泛的同源性。在本实施例中,通过制备印迹探针ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S),并向其中引入2个[113](4)核苷酸,可赋予高的敏感度和高的荧光强度。另外,ODN(antiB1)和ODN(anti4.5S)的结构如前述实施例13中的表5所述。
更具体而言,本实施例的点印迹分析的进行如下。即,首先,通过前述DNA自动合成仪制备下述(1)和(2)两个DNA片段。
(1)下述含有4.5S RNA序列及其互补DNA的DNA双链。
5′-d(GCCGGTAGTGGTGGCGCACGCCGGTAGGATTTGCTGAAGGAGGCAGAGGCAGGAGGATCACGAGTTCGAGGCCAGCCTGGGCTACACATTTTTTT)-3′(SEQ ID NO.11)
(2)下述含有B1RNA序列及其互补DNA的DNA双链。
5′-d(GCCGGGCATGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAG)-3′(SEQ ID NO.12)
使前述DNA双链在含有0.5M氢氧化钠和1M氯化钠的水溶液中变性。将此变性DNA的等分式样在正电荷尼龙膜(Roche社)上进行点(斑点)印迹。将此正电荷尼龙膜片用含有0.5M磷酸钠和1M氯化钠的水溶液润湿之后,在含有0.5M磷酸钠、1M氯化钠和100μg/mL鲑精DNA的水溶液中于50℃孵育30分钟。随后,将前述正电荷尼龙膜片在含有0.5M磷酸钠和1M氯化钠的探针水溶液(探针为150pmol的ODN(anti4.5S)或ODN(antiB1))中于50℃孵育1小时。将其在室温下冷却后,除去杂交缓冲液,加入新的磷酸缓冲液,并通过BioRad公司的VersaDoc成像***(商品名)观察前述正电荷尼龙膜片发出的荧光。所使用的激发光为使自和研药株式会社的UV透射仪Model-2270(商品名)发出的光通过UV/青色光转换板(UVP)变化得到的光。
图27示出测定结果。
图27(a)为示出尼龙膜上不同序列的DNA印迹的状态的模式图。上排的4个点表示含有4.5S RNA序列的DNA,下排的4个点表示含有B1 RNA的DNA。
图27(b)为示出在含有ODN(anti4.5S)的溶液中孵育之后的荧光发光的图。
图27(c)为示出在含有ODN(antiB1)的溶液中孵育之后的荧光发光的图。
如图27所示,印迹斑点的荧光在印迹分析之后,无需反复洗涤即可在室温下用荧光成像装置读出。若添加ODN(anti4.5S),则用前述探针孵育的结果是,获得了由4.5S序列的斑点发出的强荧光发光,但是由B1序列的斑点发出的荧光发光可以忽略不计。相比之下,若添加ODN(antiB1),则B1斑点表现出强的荧光,而在4.5S斑点仅观察到极其微弱的荧光。因此,本发明的探针能够实现明显不同于以往的印记分析的分析,而不必在印记之后进行繁琐的多步洗涤处理,也无需抗体或酶处理。另外,与分子信标等on-off探针不同,本发明的探针容易引入多个荧光染料标记部分,因而能够进一步增强荧光强度。这是本发明很有利的一点。前述荧光染料标记部分也可以例如如本实施例所述包含在[113](4)核苷酸中。
实施例20
通过使用玻璃微管的显微注射法将含有实施例8中的连接体长度n=4的染料的多聚T探针(前述ODN2)引入细胞,并通过配有水银灯、冷却CCD照相机和荧光滤器装置(用于YFP)的倒置显微镜来测定荧光发光。图28~30示出了其结果。图28为差分干涉时的照片,图29为荧光观察时的照片,图30为图28和图29的叠加图。如图所示,本发明的荧光探针(标记物)与细胞内表现的mRNA的多聚A末端序列结合而发光。换言之,本发明的荧光探针(标记物)不仅能有效地在体外检测基因,也能有效地在体内检测基因。
实施例21
另外,通过常规方法将普通荧光染料Cy5与前述ODN2(序列5′-d(TTTTTT[113](4))TTTTTT)-3′)相结合,再通过前述方法将其引入细胞。此处,Cy5在合成前述ODN2的过程中,通过DNA自动合成仪通过被添加到前述ODN2的5′末端而与其结合(序列5′-Cy5-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3′)。荧光发光通过激光扫描共聚焦显微镜测定。图31示出其结果。图31A示出用633nm激发所获得的650nm以上的荧光,为Cy5发出的荧光。图31B示出用488nm激发所获得的505-550nm的荧光,为2个噻唑橙部分发出的荧光。如图所示,ODN2与细胞内表达的mRNA的多聚A末端序列结合而发光。因此,可以示踪细胞内mRNA的分布。也可以此方式在本发明的化合物或核酸中引入多个种类的染料(表现出荧光性的原子团)。如此的话,例如由于各染料的荧光λmax不同,可以进行多色检测。
实施例22
通过前述方法将前述ODN2(序列5′-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3′)引入细胞核内,注射一结束(0秒后)至约4分半后,用前述激光扫描共聚焦显微镜示踪荧光发光(488nm激发,505-550nm获得荧光)。图32示出其结果。在该图中,分为11幅图,从左至右,以及从上排到下排,示出ODN2注入后的经过。在各图中,经过时间(ODN2注入后)如下表8所示。如图所示,表明探针ODN2在注射后立即集中于细胞核内,但在与mRNA(多聚A)杂交的同时,逐渐分散在整个细胞内。通过本发明可以以此方式示踪mRNA。
【表8】
0秒 | 8秒 | 38秒 | 68秒 |
98秒 | 128秒 | 158秒 | 188秒 |
218秒 | 248秒 | 278秒 | - |
实施例23
合成了将在前述ODN2中[113](4)两侧的T分别增加至24个的ODN。将其称为ODN7。合成同ODN2的合成方法一样进行。另外,ODN7的序列为
5′-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[113](4)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3′)(SEQ ID NO.13)。以同实施例22一样的方法将其注入细胞核内,并测定荧光强度。图33示出经过一定时间后的荧光照片。ODN7在注射后立即集中在细胞核内,但是同实施例22一样,在与mRNA(多聚A)杂交的同时,逐渐分散在整个细胞内,最终如图33所示,呈现出分散在细胞核周围的状态。
实施例24:多色检测
如实施例11、16等所述,通过改变吸收波长、发光波长等,本发明的荧光探针可以进行多色互补链检测。此多色检测例如可如前述化合物113、117和120那样改变染料(表现出荧光性的原子团)部分的结构达成。在本实施例中,再合成(制造)多个种类的荧光探针,并进行多色互补链检测
首先,使染料(表现出荧光性的原子团)部分的结构发生种种改变来合成含有下述式(121)表示的核苷酸结构的DNA链(探针)。下述式(121)中,“Dye”表示染料部分。
化69
具体而言,合成了在前述式(121)中“Dye”部分分别由下述式表示的化合物(DNA链)113、120、122、123和124。n分别为连接体长度(碳原子数)。对于化合物113、120、122、123和124,分别合成了n=3、4、5和6的化合物。合成方法同前述实施例1~4、6、8、9、12、13或16,所不同的是使用具有相应结构的染料替代前述染料107。也可同前述染料107的合成(前期实施例6的方案5)那样进行替代前述染料107的染料的合成,所不同的是适当改变原料的结构。另外,化合物113和120分别同前述各实施例的化合物113和120的结构相同。
化70
化72
化73
化74
对于上述化合物113、120、122、123和124,分别合成用序列5′-d(CGCAATX(n)TAACGC)-3′表示的ODN。X为113、120、122、123或124。n为连接体长度。序列5′-d(CGCAAT[113](n)TAACGC)-3′表示的ODN与前述ODN1相同。序列5′-d(CGCAAT[120](n)TAACGC)-3′表示的ODN与前述ODN6相同。序列5′-d(CGCAAT[122](n)TAACGC)-3′表示的ODN为ODN8。序列5′-d(CGCAAT[123](n)TAACGC)-3′表示的ODN为ODN9。序列5′-d(CGCAAT[124](n)TAACGC)-3′表示的ODN为ODN10。对于ODN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10,分别合成n=3、4、5和6的ODN。
对于ODN1(n=4)、ODN6(n=4)、ODN8(n=4)、ODN9(n=4)和ODN10(n=4),使其分别与互补链ODN1’形成双链之后测定荧光发光谱。激发波长以外的测定条件同前述各实施例。其结果示于下表9。下表9中,Ex表示激发波长,Em表示荧光发光的最大波长。另外,激发波长Ex几乎等于吸收的最大波长λmax。
表9
双链的结构 Ex Em
5’-d(CGCAAT[113](4)TAACGC-3’(ODN1(n=4)/ODN1’ 514nm 528nm
5’-d(CGCAAT[120](4)TAACGC-3’(ODN6(n=4)/ODN1’ 650nm 654nm
5’-d(CGCAAT[122](4)TAACGC-3’(ODN8(n=4)/ODN1’ 436nm 456nm
5’-d(CGCAAT[123](4)TAACGC-3’(ODN9(n=4)/ODN1’ 534nm 550nm
5’-d(CGCAAT[124](4)TAACGC-3’(ODN10(n=4)/ODN1’ 541nm 563nm
由表9可知,在456nm-654nm的宽波长范围内,各ODN在形成双链时分别展现出不同的荧光发光的最大波长Em。即,使用本实施例(实施例24)合成的ODN,能够进行多色互补链DNA检测。另外,对于本实施例的化合物(DNA链)113、120、122、123和124、ODN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10,确定了可同前述各实施例一样使用,全都可以多色方式进行互补链RNA检测、点印迹分析、细胞内mRNA检测等。
产业上利用的可能性
由上可知,本发明提供了能够有效地检测例如核酸双螺旋结构的标记物。另外,本发明提供了使用前述标记物的核酸检测方法和试剂盒。本发明的化合物或者核酸、前述本发明的本发明化合物和核酸具有前述式(1)、(1b)、(1c)、(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示特征性结构,因而可用作例如有效地检测核酸双螺旋结构的标记物。本发明的标记物在核酸的检测灵敏度方面很出色,因而可用于研究用、临床用、诊断用、体外基因检测、体内基因检测等广泛应用中。另外,对于本发明的化合物和核酸的用途没有限制,无论哪种用途均可。
Claims (11)
1.一种核酸或其盐,其含有至少一个下述式(16)、(16b)、(17)或(17b)表示的结构,
在式(16)、(16b)、(17)和(17b)中,
B为具有如下结构的原子团:选自如下的天然核酸碱基骨架:腺嘌呤骨架、鸟嘌呤骨架、胞嘧啶骨架、胸腺嘧啶骨架和尿嘧啶骨架,或者选自如下的人工核酸碱基骨架:Py、Py der.、Pu和Pu der.,
其中,
所述Py为在下述式(11)表示的六元环中在1位具有与E键合的共价键、并且在5位具有与连接体部分发生键合的共价键的原子团,
所述Py der.为由所述Py的六元环的全部原子中至少有一个由N、C、S或O原子替代的原子团,所述N、C、S或O原子任选可以具有电荷、氢原子或取代基,
所述Pu为在下述式(12)表示的稠环中在9位具有与E键合的共价键、并且在8位具有与连接体部分发生键合的共价键的原子团,
所述Pu der.为所述Pu的五元环的全部原子中至少有一个由N、C、S或O原子替代的原子团,所述N、C、S或O原子任选可以具有电荷、氢原子或取代基,
Z11和Z12分别表示展现出激子效应的荧光性原子团,
L1、L2和L3各自为连接体,主链长任意,在主链中,各自均可以含有或不含C、N、O、S、P和Si,在主链中,各自均可以含有或不含单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、亚胺基、醚键、硫醚键和硫酯键,L1、L2和L3彼此之间可以相同或不同,
D为CR、N、P、P=O、B或SiR,R为氢原子或烷基,
b为单键、双键或三键,
或者,在所述式(16)和(16b)中,L1和L2为所述连接体,L3、D和b不存在,L1和L2直接连接于B,
其中,在所述式(16)和(17)中,
E为具有脱氧核糖骨架、核糖骨架或由这其中的任一骨架衍生的结构的原子团,磷酸桥连中至少一个O原子可以由S原子所替代,
在式(16b)和(17b)中,
E为具有肽结构或拟肽结构的原子团,并且
在式(17)和(17b)中,各B可以相同或不同,各E也可以相同或者不同。
2.权利要求1所述的核酸或其盐,其中在所述式(16)和(17)中,E为具有DNA、修饰DNA、RNA、修饰RNA或LNA的主链结构的原子团,在所述式(16b)和(17b)中,E为具有PNA的主链结构的原子团。
3.权利要求1所述的核酸或其盐,其中在所述式(16)、(16b)、(17)和(17b)中,L1、L2和L3的主链长各自为2以上的整数。
4.权利要求1所述的核酸或其盐,其中Z11和Z12各自独立地为衍生自噻唑橙、噁唑黄、花菁、半花菁、其他花菁染料、甲基红、偶氮染料或其衍生物的一价基团。
5.权利要求1所述的核酸或其盐,其中Z11和Z12各自独立地为以下式(7)-(9)中的任一个表示的原子团:
其中在式(7)-(9)中,
X1和X2各自为S或O,可以相同或不同,
n为0或正整数,
R1-R10、R13-R21各自独立地为氢原子、卤原子、碳数为1-6的直链或支链烷基、碳数为1-6的直链或支链烷氧基、硝基或氨基,
R11和R12中,一者为与所述式(16)、(16b)、(17)或(17b)中的L1或L2、所述式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)或(17b-1)中的NH键合的连接基团,另一者为氢原子或碳数为1-6的直链或支链烷基,
多个R15存在于式(7)、(8)或(9)中的情况下,它们可以相同或者不同,
多个R16存在于式(7)、(8)或(9)中的情况下,它们可以相同或者不同,
Z11中的X1、X2和R1-R21与Z12中的X1、X2和R1-R21彼此之间可以相同或者不同。
6.权利要求5所述的核酸或其盐,其中在式(7)-(9)中,R11和R12中,所述连接基团为碳原子数为2以上的聚亚甲基羰基,通过羰基部分与所述式(16)、(16b)、(17)或(17b)中的L1或L2、所述式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)或(17b-1)中的NH键合。
7.权利要求1所述的核酸或其盐,其中在所述式(16)、(16b)、(17)和(17b)中,B为所述Py、所述Py der.、所述Pu或所述Pu der.。
8.一种标记物,其中一个分子内的两个平面化学结构不在同一平面内,而是以某一角度存在,但该分子在***或沟结合至核酸中时,所述两个平面化学结构在同一平面内排列配置,从而产生荧光发光,
其中所述标记物由两个以上的染料分子群形成,其中,虽然由于两个以上的染料分子平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但这些分子在***或沟结合至核酸中时,通过所述聚集状态的解除会产生荧光发光,
其中所述标记物为:
权利要求1的核酸或其盐,其中Z11和Z12各自为展现出激子效应的荧光性原子团。
9.一种复合体标记物,其以在同一分子内具有两个以上染料分子的化学结构作为特征性化学结构,其中,虽然由于两个以上的染料分子平行聚集所产生的激子效应不会展现出荧光发光,但是这些分子在***或沟结合至核酸中时,通过所述集合状态的解除会产生荧光,
所述复合体标记物任选地具有两个以上的染料分子键合到与应被标记核酸键合的连接体分子的结构,所述染料分子与所述连接体分子的键合借助于额外连接体分子以形成分枝结构,或者不借助于额外的连接体分子而直接键合,
其中任选地,所述染料分子各自为权利要求8所述的分子。
10.一种标记物,为标记单核苷酸、标记寡核苷酸、标记核酸或标记核酸类似物,其中所述标记物由权利要求8所述的标记物、或具有展现出激子效应的荧光性原子团Z11和Z12的权利要求1所述的核酸或其盐标记,所述核酸任选地具有与单核苷酸、寡核苷酸、核酸或核酸类似物含有的至少一个碱基分子的嘧啶核的5位碳原子键合或嘌呤核的8位碳原子键合的连接体分子。
11.一种试剂盒,含有核酸合成装置、标记物和荧光强度测定装置,其中所述标记物为权利要求8所述的标记物。
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