DE102004008445A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, die eine gegenüber dem Startorganismus erhöhte Konzentration oder Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, einer Aminosäuredehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweisen und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren unter Verwendung dieser Mikroorganismen.
Description
- Die Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, die eine gegenüber dem Startorganismus erhöhte Konzentration oder Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, einer L-Aminosäurdehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweisen und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren unter Verwendung dieser Mikroorganismen.
- Viele natürlichen Aminosäuren werden heute in enantiomerenreiner Form durch Fermentation mit genetisch optimierten Bakterien hergestellt (de Graaf AA, Eggeling L, Sahm H. 2001. Metabolic engineering for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum. Adv Biochem Eng Biotechnol 73: 9–29; Sahm H, Eggeling L, Eikmanns B, Kramer R. 1996. Construction of L-lysine-, L-threonine-, and L-isoleucineoverproducing strains of Corynebacterium glutamicum. Ann N Y Acad Sci 782: 25–39).
- Allerdings können nicht alle proteinogenen Aminosäuren und nur sehr wenige der unnatürlichen und der D-Aminosäuren auf diesem Weg hergestellt werden. Da chemische Synthesen für enantiomerenreine Aminosäuren sehr aufwendig sind, wurde eine Reihe von enzymatischen Prozessen entwickelt, von denen einige im Maßstab von mehreren Tonnen pro Jahr eingesetzt werden. Die Methoden reichen von kinetischen Racematspaltungen mit Hilfe von Acylasen, Amidasen, Esterasen, Hydantoinasen, Aminosäureoxidasen und Proteasen bis hin zu enantioselektiven Synthesen mittels Lyasen, Aminotransferasen und Dehydrogenasen (Schmid A. et al. (2002) „The use of enzymes in the chemical industry in Europe" Curr Opin Biotechnol 13(4): 359–66).
- Neben den enantioselektiven Synthesen sind dynamisch kinetische Racematspaltungen, bei denen das unerwünschte Enantiomer in situ razemisiert wird, besonders effizient. Wie bei einer dynamisch kinetischen Racematspaltung kann auch durch Kombination einer D- oder L-Aminosäureoxidase mit einer unselektiven chemischen Reduktion der entstehenden Iminosäure zurück zur Aminosäure prinzipiell 100% Ausbeute erreicht werden. Das Reduktionsmittel wie z. B. NaBH4 muss jedoch in einem Überschuss von mindestens 25 ägiv. eingesetzt werden, was diese Variante sehr teuer macht (Enright et al., „Stereoinversion of beta- and gamma-substituted alpha -amino acids using a chemo-enzymatic oxidation-reduction procedure", Chemical Communications (2003), (20), 2636–2637).
- Die Aminierung von α-Ketosäuren durch Aminosäuredehydrogenasen ist allgemein bekannt. Allerdings ist das Edukt um ein vielfaches teurer als z. B. die entsprechende racemische Aminosäure.
- Durch Kopplung einer Aminosäureoxidase mit einer Aminosäuredehydrogenase kann die entsprechende Ketosäure jedoch in situ aus einer Aminosäure erzeugt werden. Haben die beiden Enzyme die entgegengesetzte Enantioselektivität, kann eine D-Aminosäure vollständig in eine L-Aminosäure bzw. eine L-Aminosäure vollständig in eine D-Aminosäure umgewandelt werden. Geht man von einem Racemat aus, kann aus diesem eine enantiomerenreine Verbindung hergestellt werden.
- Das Cosubstrat NADH muss hierbei mittels eines Enzyms regeneriert werden, da es zu teuer ist um in stöchiometrischen Mengen eingesetzt zu werden. Besonders geeignet sind hierfür Enzyme wie Formiatdehydrogenase und Malatdehydrogenase (decarboxylierend), die aus ihrem Substrat Kohlendioxid freisetzen und die Reaktion damit irreversibel machen.
- (Hanson, R. L. et al. „Enzymatic synthesis of L-6-hydroxynorleucine", Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(10), 2247–2252 and Nakajima, N. et al., „Enzymatic conversion of racemic methionine to the L-enantiomer", Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1990), (13), 947–8).
-
- Für eine schnelle und vollständige Umsetzung im zellfreien System muss jedoch zusätzlich eine Katalase zugegen sein, da bei dem oxidativen Teilschritt, der durch die Aminosäureoxidase katalysiert wird, Wasserstoffperoxid entsteht, das zur Decarboxylierung der Ketosäure und zur Inaktivierung der Enzyme führt (Trost, E. -M.; Fischer, L., Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalyzed racemate resolution of D/L-amino acids, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2002), 19–20 189–195). Die Umwandlung von razemischen in enantiomerenreine Aminosäuren ist mit diesem System mit > 99% ee und > 95% Ausbeute möglich.
- Dieses verfahren ist jedoch aufwendig, da vier verschiedene, Enzyme getrennt hergestellt und isoliert werden müssen.
- Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das die aufwendige Isolierung und Bereitstellung der für die Umsetzung von D-Aminosäuren in L-Aminosäuren notwendigen Enzyme vermeidet.
- Gegenstand der Erfindung sind bevorzugt ruhende Zellen eines rekombinanten Mikrooganismus, der eine gegenüber dem Startorganismus, beispielsweise dem Wildtyp, erhöhte Konzentrationen oder Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, Aminosäuredehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweist. Oxidase und Dehydrogenase werden dabei im Hinblick auf das umzusetzende Substrat und das Substratspektrum der genannten Enzyme kombiniert. Dabei muss der Startorganismus die genannten Enzyme nicht natürlich enthalten.
- Als regenerierende Enzyme für das Cosubstrat NADH können beispielsweise Formiatdehydrogenasen, Malatdehydrogenasen (
DE 102 40 603 ) oder Alkoholdehydrogenasen eingesetzt werden. - Die Herkunft der diese Enzyme kodierenden Polynukleotide ist im allgemeinen nicht auf Gattung oder Spezies des rekombinanten Mikroorganismus beschränkt.
- Die Gene können ohne Rücksicht auf die Herkunft zur Transformation des Host-Organismus ausgewählt werden.
- Der Ursprung der Gene kann in Mikroorganismen, Pilzen oder Hefen liegen, besonders Mikroorganismen, insbesondere Arthrobacter protophormiae oder Trigonopsis variablilis für D-AAO, Bacillus cereus für LeuDH.
- Als Host-Organismen dienen bevorzugt Mikroorganismen, für die es stabile Expressionssysteme gibt, wie z. B. Bacillus, verschiedene Hefen, Staphylococcus oder Streptomyces, insbesondere E. coli.
- Als Aminosäuredehydrogenasen sind insbesondere geeignet L-Leucindehydrogenase aus Bacillus species (
EP 0 792 933 ) Glutamatdehydrogenase, L-Phenylalanindehydrogenase aus Rhodococcus species, L-Alanindehydrogenase aus Thermoactinomyces intermedius oder Bacillus-Stämmen. - Diese werden in Abhängigkeit von der reduktiv zu aminierenden Ketosäure ausgewählt.
- D-Aminosäureoxidasen bzw. für sie kodierende Polynukleotide stammen gemäß Erfindung vor allem aus der Hefe Rhototorula gracilis (
US 6,187,574 ), aus Trigonopsis variabilis (Long-Liu Lin et al., Enzyme and Microbial Technol. 27 (2000), 482–491), Candida species, den Pilzen Neurospora crassa, Verlicullium luteoralbo und verschiedenen Fusarium species und D-Aminosäureoxidase aus Arthrobacter protophormiae (EP 1375649 ). - Eine Übersicht über die Substrate verschiedener D-AAOs findet sich bei Gabler et al. (Enzyme Microbiol. Technol. 27(8): 605–611 (2000)). In der
EP 0 897 006 A1 wird die D-AAO aus Rhodosporidium mit dazugehörigem Gen beschrieben. In Abhängigkeit vom umzusetzenden Substrat werden die für die D-Aminosäureoxidase und Aminosäuredehydrogenase kodierenden Gene ausgewählt und der vorgesehene Host-Stamm mit ihnen transformiert. - So werden z. B. für die Entracemisierung von DL-Methionin oder DL-Leucin bevorzugt D-Aminosäureoxidase aus Arthrobacter protophormiae (
EP 1 375 649 A ) und Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus kodierenden Gene in E. coli überexprimiert. - Die nachfolgenden Tabellen enthalten beispielhaft Gene und die dazugehörigen Enzyme, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können:
- Tabelle 1: D-Aminosäureoxidasen
- Tabelle 2: L-Aminosäuredehydrogenasen
- Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232(1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836(1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97(1998)) untersucht werden.
- Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
- Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von in den ausgewählten Host-Stämmen im allgemeinen autonom replizierbaren Vektoren, die miteinander kompatibel sind und mindestens ein Gen enthalten, das für ein erfindungsgemäß notwendiges Enzym kodiert.
- Vector DNA kann in eukaryotische oder prokaryotische Zellen durch bekannte Transformationstechniken eingeführt werden.
- Bevorzugt werden Vektoren, die für zwei Enzyme kodierende Nukleotidsequenzen enthalten, insbesondere z. B. für Malatdehydrogenase und Aminosäuredehydrogenase oder Malatdehydrogenase und D-Aminosäureoxidase.
- Vorteilhaft ist auch die Kombination von für Aminosäuredehydrogenase und D-Aminosäureoxidase kodierenden Nukleotidsequenzen auf dem Vektor.
- Die Nukleotidsequenz für das im System noch fehlende Enzym befindet sich dann auf einem weiteren Vektor.
- Im allgemeinen geht man so vor, dass man ein gut exprimierbares Gen in einen Vektor mit niedriger Kopienzahl, Gene mit schwächerer Expressionsleistung auf einem Vektor mit höherer Kopienzahl und/oder starkem Promotor kloniert. Die Wirtszellen sind mit diesen Vektoren in der Weise transformiert, dass sie im Vergleich zum Startorganismus mindestens jeweils eine zusätzlicher Kopie der für die Umsetzung von D- zu L-Aminosäuren notwendigen drei oder gegebenenfalls vier Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten.
- Durch diese Maßnahme gelingt es, die genannten Nukleotidsequenzen zu überexprimieren.
- Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
- Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
- Die Überexpression führt zur Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Enzyme.
- Die Steigerung liegt im allgemeinen bei mindestens 10 bis 500%, insbesondere 50 bis 500% oder 100 bis 500%, bis zu einem Maximum von 1000 oder 2000% verglichen mit der Konzentration oder Aktivität des Enzyms in dem der Transformation zugrunde liegenden Organismus (Startorganismus).
- Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren unter Verwendung einer enantioselektiven enzymatischen Syntheseroute, dadurch gekennzeichnet, dass man einen rekombinanten Mikroorganismus, der eine gegenüber dem zu transformierenden Startorganismus erhöhte Konzentration oder Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, einer L-Aminosäuredehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweist, mit einer D-Aminosäure(n) aufweisenden Lösung umsetzt und die entstandene L-Aminosäure isoliert.
- Vorteilhaft ist die Überexpression von Malic Enzyme als das das Cosubstrat regenerierende Enzym, wobei sich in der den Ganzzellkatalysator enthaltenden gepufferten wässrigen Lösung, die die umzusetzende D-Aminosäure enthält, gleichzeitig L-Malat oder L-Apfelsäure in einer zur umzusetzenden Menge der D-Aminosäure mindestens äquimolaren Menge, bevorzugt 1,5 bis 6-fach molar befinden.
- Gegebenenfalls wird auch eine Katalase als Peroxid- zersetzendem Enzym überexprimiert. Geeignet sind Katalasen aus verschiedsten Organismen, beispielsweise das Enzym aus Escherichia coli (Catalase HPII (Hydroxyperoxidase II) Accession number: gi115722)
- Die Umsetzung der D-Aminosäure erfolgt bevorzugt mit ruhenden Zellen. Darunter versteht man Zellen, die lebensfähig sind, sich aber unter gegebenen Bedingungen nicht vermehren.
- Unter Aminosäuren werden in diesem Zusammenhang natürlich und nicht-natürlich vorkommende α-Aminosäuren verstanden, wie sie beispielsweise beschrieben werden in Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 22nd edition, 1991, p. 822 ff.
- Bevorzugt eingesetzt werden Gemische von D- und L-Aminosäuren, ihre Racemate oder die reinen D-Enantiomeren, ausgewählt aus der Gruppe: Lysin, Arginin, Phenylalanin, Valin, Ornithin, Leucin, Histidin, Norleucin, Tyrosin, Alanin, Glutamat und Cephalosporin, insbesondere Methionin.
- Bestimmte Enzyme zeigen sich für die Umsetzung der verschiedenen D-Aminosäuren als besonders geeignet (s. a. Gabler et al., 2000). So ist die D-AAO aus Arthrobacter protophormiae z. B. besonders für die Umsetzung basischer und hydrophober Aminosäuren geeignet.
- Die geeigneten Enzyme und Nukleotidsequenzen sind im allgemeinen aus dem Stand der Technik bekannt.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Isolierung der einzelnen Enzyme vermieden. Ein weiterer Vorteil ergibt sich daraus, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen (Ganzzellkatalysator) nach der Reaktion leicht abgetrennt werden können.
- Bei der Umsetzung von D-Methionin zu L-Methionin mit den isolierten Enzymen nach dem Stand der Technik muss dagegen Katalase zugesetzt werden (Nakajima et al., 1990).
- Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder, repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, sie die logarithmische Wachstumsphase durchschritten hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 20 Stunden erreicht. Im Anschluss daran werden die Zellen bevorzugt geerntet, gewaschen und in einem Puffer als Suspension bei einem pH-Wert von 6–9, insbesondere von 6,8 bis 7,9 aufgenommen. Die Zellkonzentration beläuft sich auf 1–6%, insbesondere 1,5 bis 4% (Feuchtgewicht/v). Sie werden im allgemeinen mit physikalischen oder chemischen Methoden so permeabilisiert, z. B. mit Toluol wie bei Wilms et al., J. Biotechnol., vol. 86 (2001), 19–30 beschrieben, dass die umzuwandelnde D-Aminosäure die Zellwand durchdringen und L-Aminosäure austreten kann.
- Die Suspension wird dann mit einer D-Aminosäure und L-Malat oder L-Apfelsäure enthaltenden Lösung versetzt. Die Umsetzung findet bei 10 bis 40°C, insbesondere 25 bis 36°C bei einem pH-Wert zwischen 6,8 und 8,9 statt, bevorzugt 7,5 und 8,5. Sie wird durch Erhitzen auf 70 bis 100°C abgestoppt.
- Beispiel 1
- Konstruktion von Plasmiden
- Um das Reaktionsprinzip zu bestätigen, wurde eine Reihe von, Plasmiden konstruiert, die die Gene folgender Enzyme in verschiedenen Kombinationen tragen: Malic enzyme (MAE), Leucin-Dehydrogenase (LeuDH), D-AAO aus Arthrobacter protophormiae (ApD-AAO) und D-AAO aus Trigonopsis variabilis (TvD-AAO). Dazu wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Primer und Plasmide verwendet
- Zur Amplifikation der Gene der ApD-AAO (Apdao; gi:32140775), der TvD-AAO (Tvdao; gi:1616634) und des malic enzymes (mae; gi:1787752) wurde genomische DNA aus Arthrobacter protophormiae, Trigonopsis variabilis and E. coli K12 als Template verwendet. Das Gen der Leucin- Dehydrogenase (leudh; gi:6741938) wurde mit dem Plasmid pT1L (= pLeuB, (Ansorge MB, Kula MR. (2000), Investigating. expression systems for the stable large-scale production of recombinant L-leucine-dehydrogenase from Bacillus cereus in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 53: 668–73)) als Template amplifiziert.
- Mit geeigneten Primern, die in Tabelle 3 aufgeführt sind, wurde mittels PCR Restriktionsschnittstellen für Klonierungen eingefügt. Mit dem forward primer DAAOTvforNdeI wurde das Intron im Tvdao-Gen entfernt.
- Bei der Klonierung des Apdao-Gens in pH1M wurde eine Shine-Dalgarno Sequenz und zusätzliche Restriktionsschnittstellen (für EcoRV, PstI and NotI) mittels PCR eingefügt, indem der reverse primer ApNdeIrev (Tabelle 1) verwendet wurde.
-
- Beispiel 2
- Konstruktion von Expressions-Stämmen
- Durch geeignete Kombination von Plasmiden wurden die in Tabelle 4 aufgeführten rekombinanten E. coli-Stämme konstruiert, die jeweils Gene für eine Aminosäure-Oxidase, Leucin-Dehydrogenase und malic enzyme enthalten.
- Als Ausgangsstämme werden eingesetzt
BL21 (DE3) von Novagen
und JM109 von Stratgene. -
- Beispiel 3
- Nachweis intrazellulärer Enzymaktivitäten
- Die Stämme entsprechend Tabelle 4 werden unter Standardbedingungen in Luria-Bertani (LB)-Medium bei pH 7,5 angezogen. Abhängig vom transformierten Plasmid wurden dem Medium 100 μg ml–1 Ampicillin und/oder 34 μg ml–1 Chloramphenicol zugesetzt. Für die Enzym-Expression wurden die rekombinanten E. coli Stämme unter aeroben Bedingungen in 100 ml Schüttelkolben mit 20 ml Medium angezogen. Die Zellen wurden bei 37°C auf der Rundschüttelmaschine bei 200 rpm inkubiert und bei einer OD550 von ca. 0,5 mit 100 μM IPTG und/oder 0.2% Rhamnose induziert. Nach dieser Induktion wurden die Stämme dann bei 30°C weiter inkubiert.
- In
2 ist die gemessene Enzymaktivität dargestellt.
weiss: D-AAO; grau: MAE; MAE; schwarz: LeuDH
Stamm 6 zeigt die Wirksamkeit des Rhamnosepromoters. - Beispiel 4
- Biotransformations-Reaktionen mit ganzen rekombinanten Stämmen
- A) D,L-Methionin
- Als Beispiel für eine Entracemisierung wird das Racemat von Methionin als Substrat eingesetzt und durch ganze rekombinante E. coli-Zellen Stamm 1 entsprechend Tabelle 2), die die beiden Plasmide pAD3LM (trägt Gene für Leucin-Dehydrogenase und Malic Enzym) und pE1D (trägt das Gen für die Arthrobacter protophormiae-D-Aminosäure-Oxidase) enthalten, umgesetzt. Mittels HPLC kann der durch die Oxidase katalysierte Abbau von D-Met und die durch die reduktive Aminierung katalysierte Synthese von L-Met verfolgt werden. Im einzelnen werden eingesetzt:
25 mM D,L-Met, 100 mM L-Malat, 0,7 M NH4Cl, 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, End-pH 8,0. Die Zellen sind in 50 mM TEA/HCl Puffer pH 7,6 suspendiert und mit 10 μl/ml Toluol versetzt, worden, diese Suspension wird 30 min bei 30°C gerührt und dann für die Umsetzung eingesetzt. Die Zellkonzentration in der Umsetzung beträgt 3,3% (Feuchtgewicht/v) in einem Endvolumen von 1 ml. Die Umsetzung findet bei 30°C unter Schütteln bei 1000 rpm in einem Thermomixer 5436 (Fa. Eppendorf) statt. Proben werden durch Erhitzen für 5 min bei 95°C abgestoppt und der klare Überstand mittels HPLC analysiert. - Zur Konzentrationsbestimmung von D- und L-Met werden die Proben nach Verdünnung derivatisiert. Dazu werden 20 μl einer Lösung von 260 mM Isobuturyl-L-cystein and 170 mM o-Phthaldialdehyd in 100 mM Natrium-borat-Puffer pH 10,4 zugesetzt. Die HPLC-Trennbedingungen werden wie publiziert eingehalten (Krieg L, et al. (2002) Screening for amidases: isolation and characterization of a novel D-amidase from Variovorax paradoxus. Adv Synth Catal 344(9): 965–73).
- Der Abbau von D-Met und die Bildung von L-Met sind in
3 zusammenfassend aufgeführt. Man erhält ein enantiomerenreines Produkt von L-Met mit einer Endkonzentration von 25 mM. - B) D,L-Leucin
- In analoger Weise wie in Teil A beschrieben wird eine Lösung von 25 mM D,L-Leucin mit denselben Mikroorganismen wie vorab beschrieben umgesetzt. Einzelheiten der Umsetzung selbst und der HPLC-Analytik entsprechen dem vorab beschriebenen Beispiel.
- Der Abbau von D-Leu und die Bildung von L-Leu sind in
4 zusammenfassend aufgeführt. Man erhält ein enantiomerenreines Produkt von L-Leu mit einer Endkonzentration von 25 mM.
Claims (20)
- Rekombinanter Mikroorganismus, der eine gegenüber dem Startorganismus erhöhte Konzentration oder Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, einer L-Aminosäuredehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss Anspruch 1, der aus ruhenden Zellen besteht.
- Mikroorganismus gemäss Anspruch 1 oder 2, der eine erhöhte Konzentration oder Aktivität der Formiatdehydrogenase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss Anspruch 1 oder 2, der eine erhöhte Konzentration oder Aktivität der Malatdehydrogenase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss Anspruch 1 oder 2, der eine erhöhte Konzentration oder Aktivität einer Alkoholdehydrogenase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, der eine erhöhte Konzentration oder Aktivität der L-Leucindehydrogenase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, der eine erhöhte Konzentration oder Aktivität einer L-Aminosäuredehydrogenase, ausgewählt aus der Gruppe Phenylalanindehydrogenase, Alanindehydrogenase, Glutamatdehydrogenase aufweist.
- Mikroorganismus gemäss den Ansprüchen 1 bis 4, in dem ein mehrere der für genannten Enzyme kodierenden Gene aus Mikroorganismen anderer Gattungen, Pilzen oder Hefen stammen.
- Mikroorganismus gemäss den Ansprüchen 1 bis 8, in dem die intrazelluläre Aktivität einer D-Aminosäureoxidase, L-Aminosäuredehydrogenase, eines das Coenzym NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase gegenüber dem Startorganismus angehoben wird, indem man die Kopienzahl der für diese Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen erhöht oder einen starken Promotor benutzt oder beides kombiniert.
- Vector, der eine oder mehrere der für eine D-Aminosäureoxidase, Aminosäuredehydrogenase oder eines für das Cosubstrat NADH regenerierendes Enzym kodierenden Nukleotidsequenzen aufweist.
- Vektor gemäss Anspruch 10, der eine für eine D-Aminosäuredehydrogenase und eine für Malatdehydrogenase kodierende Nukleotidsequenz enthält.
- Vektor gemäss Anspruch 10, der eine für eine Aminosäuredehydrogenase und eine für Malatdehydrogenase kodierende Nukleotidsequenz enthält.
- Vektor gemäss Anspruch 10, der eine für eine Aminosäuredehydrogenase und eine für eine D-Aminosäureoxidase kodierende Nukleotidsequenz enthält.
- Mit Vektoren gemäss den Ansprüchen 10 bis 13 in der Weise transformierte Mikroorganismen, dass sie im Vergleich zum Startorganismus mindestens jeweils eine zusätzliche Kopie der für die genannten Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten.
- Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus D-Aminosäuren unter Verwendung einer enantioselektiven enzymatischen Syntheseroute, dadurch gekennzeichnet, dass man einen rekombinanten Mikroorganismus, der eine gegenüber dem Startorganismus (z. B. Wildtyp) erhöhte Konzentration oder Aktivität einer Aminosäureoxidase, einer Aminosäuredehydrogenase, eines das Cosubstrat NADH regenerierenden Enzyms und gegebenenfalls einer Katalase aufweist, mit einer D-Aminosäure(n) aufweisenden Lösung umsetzt und die entstandene L-Aminosäure isoliert.
- Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 und 14 einsetzt.
- Verfahren gemäss den Ansprüchen 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als das Cosubstrat NADH regenerierendes Enzym Malatdehydrogenase auswählt und der D-Aminosäure enthaltenden Lösung L-Malat oder L-Äpfelsäure zusetzt.
- Verfahren gemäss den Ansprüchen 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man ruhende Zellen des Mikroorganismus einsetzt.
- Verfahren gemäss den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellwände der eingesetzten Zellen durch chemische oder physikalische Maßnahmen durchlässig für die Aufnahme der D-Aminosäure aus der Lösung sind.
- Verfahren gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass man eine D-Aminosäure oder eine racemische DL-Aminosäure einsetzt, ausgewählt aus der Gruppe Lysin, Arginin, Phenylalanin, Valin, Ornithin, Leucin, Histidin, Norleucin, Tyrosin, Alanin, Glutamat, Cephalosporin, insbesondere Methionin.
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