JP2012100537A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来よりもさらに改良された、エタノールを含む基質を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供する。
【解決手段】腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌を、エタノールを炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。

Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられている。(特許文献１〜９）

一般的に、微生物を用いてアミノ酸生産を行う際には、炭素源に糖質を主成分として用いているが、エタノールも糖質と同様に炭素源として用いることが可能である（特許文献１０）。

リボヌクレアーゼGは、16SrRNAの5'末端の成熟に関わるリボヌクレアーゼとして見出された（非特許文献１、２）。また、リボヌクレアーゼGは一本鎖RNAのAUリッチな領域を切断するといわれているが、切断配列等の詳細に関しては解明されていない（非特許文献３〜５）。

リボヌクレアーゼGの生理学的役割に関する知見は乏しいが、リボヌクレアーゼGがeno mRNAやアルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhE mRNAの分解に関与していること、及び、マイクロアレイ解析の結果から、いくつかの解糖系酵素をコードする遺伝子をはじめ、複数の遺伝子のmRNAの特異的な分解に関与することが報告されている（非特許文献６〜８）。また、16S rRNAとadhE mRNAに対する分解活性を比較すると、rng:catでは両方が分解されなくなるのに対し、rng430 (G341S)ではadhE mRNAのみが分解されることが報告されている（非特許文献９）。

また、rng遺伝子とcra遺伝子の両方を欠損した株では、グルコースを炭素源として培養した際にピルピン酸が蓄積するという報告がなされている（非特許文献１０）。

しかしながら、リボヌクレアーゼGの活性を変えることがエタノールからのＬ−アミノ酸生産に効果があることは、全く知られていなかった。

欧州特許公開EP0643135B 欧州特許公開EP0733712B 欧州特許公開EP1477565A 欧州特許公開EP0796912A 欧州特許公開EP0837134A 国際公開WO01/53459 欧州特許公開EP1170376A 国際公開WO2005/010175 国際公開WO96/17930 WO2008/010565

EMBO J., 18 (1999) 2878-2885 Biochem. Biophys. Res. Commun., 259 (1999) 483-488 J. Biol. Chem., 269 (1994) 10797-10803 J. Biol. Chem., 269 (1994) 10790-10796 J. Biol. Chem., 275 (2000) 8726-8732 Mol. Microbiol., 43 (2002) 1445-1456 Genes Cell., 6 (2001) 403-410 Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (2002) 2216-2220 Biochem. Bioph. Res. Commun., 289 (2001) 1301-1306 Appl. Microbiol. Biotechnol., 76 (2007) 183-192

本発明は、従来よりもさらに改良された、エタノールを含む基質を用いた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、リボヌクレアーゼGの活性を低下させることによって、腸内細菌のエタノールからのＬ−アミノ酸生産能が大幅に向上することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、エタノールを炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である方法。
（２）リボヌクレアーゼGをコードするrng遺伝子が不活化されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下した、前記方法。
（３）前記rng遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記方法。
（４）前記細菌が、好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記方法。
（５）前記細菌が、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持し、それによって好気的にエタノールを資化できる、前記方法。
（６）前記細菌が、変異型adhE遺伝子を保持するように改変され、それによって好気的にエタノールを資化できる、前記方法。
（７）前記変異型adhE遺伝子が、568位のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換された以外は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントをコードする、前記方法。
（８）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-プロリン、及びＬ-システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ-アミノ酸である前記方法。
（９）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、
及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている前記方法。
（１０）前記Ｌ-アミノ酸がＬ-スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている前記方法。
（１１）前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記方法。
（１２）前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
（１３）エタノールが培地中に0.001w/v%以上含まれる前記方法。

本発明によれば、エタノールを炭素源として、効率よくＬ−アミノ酸を製造することができる。

＜１＞本発明で使用される腸内細菌科に属する細菌
本発明で使用される細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌であり、かつリボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である。本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変することによって取得することができる。以下に、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びＬ-アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。尚、本発明の細菌は、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌にＬ-アミノ酸生産能を付与するか、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された腸内細菌科に属する細菌のＬ-アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。

＜１−１＞本発明の親株として使用される細菌
本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌である。
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。

エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E.coli）が挙げられるが、これに限定されない。

本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O.
Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

本発明に用いる細菌は、エタノール資化性を有する細菌であり、元来エタノールの資化性を有する細菌、エタノールの資化性を付与された組換え株、又はエタノールの資化性が高まった変異株でもよい。
エシェリヒア・コリに関しては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下の反応を可逆的に触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するAdhEの存在が知られている。エシェリヒア・コリのAdhEをコードするadhE遺伝子の配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
アセチル-CoA + NADH + H⁺ → アセトアルデヒド + NAD⁺ + CoA
アセトアルデヒド + NADH + H⁺ → エタノール + NAD⁺

本発明においては、好気的にエタノールを資化できる細菌を用いることが好ましい。エシェリヒア・コリは、好気条件ではエタノールは資化できないが、好気的にエタノールを資化できるように改変された株を用いてもよい。元来好気的にエタノールを資化できない細菌を、好気的にエタノールを資化できるように改変するには、例えば、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持させること、又は、好気的にエタノールを資化できることを可能にする変異をコード領域内に有する変異型adhE遺伝子を保持させることが挙げられる。さらに、この変異型adhE遺伝子は、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するものであってもよい。

エシェリヒア・コリは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流のプロモーターを好気的に機能するプロモーターに置換することによって、好気条件でアルコールデヒドロゲナーゼが発現し、好気的にエタノールを資化できるようになる（WO2008/010565号パンフレット）。好気条件で機能する非天然型プロモーターとして、好気条件で或る特定レベルを超えてａｄｈＥ遺伝子を発現することができる任意のプロモーターを用いることができる。好気条件は、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。具体的には、好気条件で遺伝子を発現することが知られている任意のプロモーターを用いることができる。例えば、解糖、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、アミノ酸生合成経路等に関与する遺伝子のプロモーターを用いることができる。さらに、λファージのＰ_tacプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、又はＰ_Lプロモーターは全て、好気条件で機能する強いプロモーターであることが知られており、これらを用いることが好ましい。

また、前記したようにエシェリヒア・コリは好気条件ではエタノールは資化できないが、AdhEの変異によっても、好気的にエタノールを資化出来るようになることが知られている（Clark D. P., and Cronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。このような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン
酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された変異体（Glu568Lys、E568K）がある（国際公開パンフレットWO2008/010565号公報）。

さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばバリン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。

「好気的にエタノールを資化できる」とは、エタノールを単一炭素源とする最少液体培地もしくは固体培地にて、好気条件で生育可能であることを意味する。「好気条件」は前記と同様に、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。また、「好気的にエタノールを資化できる」とは、ＡｄｈＥタンパク質のレベルに関して、Clark及びCronan（J. Bacteriol., 141, 177-183 (1980））の方法によって測定された無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１．５ユニット以上、好ましくは５ユニット以上、及びより好ましくは１０ユニット以上であることを意味する。

また、本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい。ピルビン酸シンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性が増大するように改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。

本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO₂からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。

還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO₂ → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 +
ＣｏＡ

ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活
性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。

ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。

具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１０には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T. et al. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子からなるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。

エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1435284〜1438808に位置する、配列番号１１に示す塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。配列番号１２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子（ydbK）と高い相同性を有する、エシェリヒア属、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シゲラ属（Shigella）、サイトロバクター属（Citrobacter）などの腸内細菌群に属するピルビン酸シンターゼ遺伝子であってもよい。

メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）のピルビン酸シンターゼは、メタノコッカス・マリパルディスのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_005791）（Hendrickson, E. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186: 6956-6969）の塩基番号1462535〜1466397に位置するporCDABEFオペロンにコードされている（Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179: 444-456）。このピルビン酸シンターゼは、γ、α、β、及びδの４つのサブユニットを含んでおり、これらのサブユニットに加えて、PorE及びPorFもピルビン酸シンターゼの活性に重要であることが知られている（Lin, W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181: 68-73）。γサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1465867〜1466397（相補鎖）のporA遺伝子にコードされており、配列番号13にその塩基配列を、配列番号14に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988626）。δサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1465595〜1465852（相補鎖）porB遺伝子にコードされており、配列番号15にその塩基配列を、配列番号16に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988627）。αサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1464410〜1465573（相補鎖）のporC遺伝子にコードされており、配列番号17にはその塩基配列を、配列番号18に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988625）。βサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1463497〜1464393（相補鎖）のporD遺伝子にコードされており、配列番号19にはその塩基配列を、配列番号20に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988624）。PorEは、ゲノム配列の塩基番号1462970〜1463473（相補鎖）のporE遺伝子にコードされており、配列番号21にはその塩基配列を、配列番号22に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988623）。PorFは、ゲノム配列の塩基番号1462535〜1462951（相補鎖）のporF遺伝子にコードされており、配列番号23にはその塩基配列を、配列番号24に同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. NP_988622）。
独立栄養性のメタン生成古細菌のメタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）なども同じ遺伝子構造のピルビン酸シンターゼ遺伝子を有していることが知られており、これらを利用することが可能である。

本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO₂からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。

ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO₂ → ＮＡＤＰ⁺ + ピルビン酸 + CoA

ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって
、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。

ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479:
155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol.
Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在する
ことが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。

具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子として、配列番号25に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる（GenBank Accession No. AB021127）。配列番号26には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. BAB12024）。

本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。

「フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。

還元型フェレドキシン + NADP⁺ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H⁺

本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-19
15; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。

フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化
量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。

フェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ-アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem.
(Tokyo) 106: 831-836）。

エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、配列番号27に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。配列番号28にはFprのアミノ酸配列を示した（GenBank Accession No. AAC76906）。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。

ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。

本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。

なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシ
ン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。

フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular CloningA Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。

また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。

フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。

フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:
44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。

具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号29に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号31に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号30及び配列番号32
には、Fdx及びYfhLのアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC75578及びAAC75615）。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号33に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号35に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号34及び配列番号36には、fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。

クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置する配列番号37に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号39に示すフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。配列番号38及び配列番号40には、フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIがコードするアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490）。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。

上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ-アミノ酸生産能の付与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。

例えば、クロロビウム・テピダムのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号41、42に示すプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法（polymerase chain reaction）法（White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得することができる。
エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子は、配列番号11の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号43、44に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。

ユーグレナ・グラシリスのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子は、配列番号13に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号45、46に示すプライマーを用いて、ユーグレナ・グラシリスの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。

エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ遺伝子は、配列番号27の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号47、48に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができ
る。

エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子fdxは、配列番号29の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号49、50に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、取得することができる。

エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子fldAは、配列番号33の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フラボドキシン遺伝子fldBは、配列番号35の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。

また、クロロビウム・テピダムのフェレドキシンＩ遺伝子は、配列番号37の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、フェレドキシンII遺伝子は、配列番号39の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、クロロビウム・テピダムの染色体DNAを鋳型とするPCR法によって、各々取得することができる。

他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。

また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、マリックエンザイムの活性が低下していることが好ましい。本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合は、特にマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。

本発明において、マリックエンザイムの活性とは、リンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピルビン酸を生成する反応を可逆的触媒する活性を意味する。上記反応は、ＮＡＤＰを電子受容体とするＮＡＤＰ型マリックエンザイム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NADP⁺)とも表記される）（EC:1.1.1.40 b2463遺伝子（maeB遺伝子とも表記される）配列番号５１）、あるいは、ＮＡＤを電子受容体とするＮＡＤ型マリックエンザイム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NAD⁺) とも表記される）（EC:1.1.1.38 sfcA遺伝子（maeA遺伝子とも表記される）配列番号５３）の２種の酵素によって触媒される。マリックエンザイム活性の確認は、Bolognaらの方法（Bologna, F.
P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189: 5937-5946）に従って測定することができる。

NADP-dependent malic enzyme : NADP⁺ + malate → NADPH + CO₂ + pyruvate
NAD-dependent malic enzyme：NAD⁺ + malate → NADH + CO₂ + pyruvate

酵素活性の低下は、後述のリボヌクレアーゼG活性の低下と同様にして行うことができる。

本発明においては、ＮＡＤＰ型マリックエンザイムとＮＡＤ型マリックエンザイムの両方の活性を低下させることがより好ましく、特に、本発明の微生物がエシェリヒア属、エ
ンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合に、両方の型のマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。

また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。

本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1
aceE遺伝子 配列番号55）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolipoyltransacetylase, EC:2.3.1.12 aceF遺伝子 配列番号57）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4 lpdA遺伝子 配列番号59）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をPDH活性という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 1982. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。

E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
→ [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine + CO₂
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine → acetyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD⁺ → protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H⁺

酵素活性の低下は、後述のリボヌクレアーゼG活性の低下と同様にして行うことができる。

また、本発明の細菌は、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（ａｃｅオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化されるように改変された菌株であってもよい。マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（ａｃｅオペロン）が構成的に発現するとは、ａｃｅオペロンのプロモーターが、リプレッサータンパク質であるiclＲにより抑制を受けないこと、抑制が解除されていることを意味する。

ａｃｅオペロンを構成的に発現していること、また同オペロンの発現が強化していることは、aceオペロンがコードするタンパク質であるマレートシンターゼ(aceB)、イソシトレートリアーゼ(aceA)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）の酵素活性が非改変株、あるいは野生株と比べて増大していることによって確認出来る。

酵素活性の測定は、マレートシンターゼに関してはグリオキシル酸に依存するアセチルCoAのチオエステル結合の分解をA232の減少で測定する方法(Dixon,G.H.,Kornberg,H.L., 1960, Biochem.J, 1;41:p217-233）、イソシトレートリアーゼに関してはイソシトレートから生じるグリオキシル酸を２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体として測定する方法(Roche,T.E..Williams J.O., 1970, Biochim.Biophys.Acta, 22;206(1):p193-195)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼに関してはイソシトレートデヒドロゲナーゼに対するリン酸の脱着を³²Pを使用して測定する方法（Wang, J.Y.J. and Koshland, D.E.,
Jr., 1982, Arch Biochem. Biophys., 218, p59-67）などで確認出来る。

抑制を解除するためには、例えば、ａｃｅオペロン上のリプレッサー（iclR）の結合部位を、iclRが結合できないように改変すればよい。また、同オペロンのプロモーターを、iclRによって発現抑制を受けない強力なプロモーター（lacプロモーターなど）に置換することによって、抑制を解除することもできる。

また、iclR遺伝子の発現が低下又は欠失するように細菌を改変することによって、ａｃｅオペロンの発現を構成的にすることもできる。具体的には、iclRをコードする遺伝子の発現調節配列を同遺伝子が発現しないように改変するか、同リプレッサーの機能が失われるようにコード領域を改変することによって、ａｃｅオペロンの発現の抑制を解除することができる。

本発明に用いる細菌の好ましい形態は、上記のｉ）好気的にエタノールを資化できる性質、ii）ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼの増大した活性、iii）ａｃｅオペロンの構成的な発現又は強化された発現、iv) ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の低下のいずれかを有するものであるが、ｉ）及びii）の性質を有することが好ましく、これら４つの性質を有することがより好ましい。

本発明において、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ-アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ-アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ-アミノ酸は、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アスパラギン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-リジン、Ｌ-メチオニン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン及びＬ-バリンを含む。これらの中では、Ｌ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファン、及びＬ-システインが好ましく、特に、Ｌ-スレオニン、Ｌ-リジン及びＬ-グルタミン酸が好ましい。
なお、本発明において、L-アミノ酸とは、フリー体のＬ-アミノ酸のみならず、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩も含む。

以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌Ｌ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。

Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、か
つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。

上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。

以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。

Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。

スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝
子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。

このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。

また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するた
めの親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。

Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解
除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。

好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027
が付与されている。

pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。

Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾール
カルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。

hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。

シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランス
アセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。

具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。

パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。

また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。

さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株
は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。

Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)
から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。

Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。

Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。

遺伝子組換えにより本発明に用いる細菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子のバリアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好まし
くは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。

保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。

また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

上記した遺伝子のバリアントに関する記載は、下記のrng遺伝子及び本明細書に記載した他の遺伝子についても同様に適用される。

＜１−２＞リボヌクレアーゼG活性の低下
次に、腸内細菌科の属する細菌のリボヌクレアーゼGの活性を低下させる改変について説明する。

本発明において「リボヌクレアーゼG（RNaseG）活性」とは、RNaseGの基質となるRNAを分解する活性をいう。
RNaseGの基質となるRNAとしては、例えば、エノラーゼをコードする遺伝子eno（GenBank Accession No.X82400）やアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhE（GenBank Accession No.M33504）から転写されたRNAなどを挙げることができる。活性測定は、例えば、リファンピシンによりRNA合成を抑制した菌株よりRNAを抽出し、eno遺伝子又はadhE遺伝子のmRNAの分解半減期を測定することで、その活性を間接的に知ることができる。また、RNaseGを単離精製し、RNaseG切断部位を含むオリゴリボヌクレオチドのような人工基質の切断反応を測定することにより、その活性を知ることもできる。このような活性測定方法は既に開示されている（J. Biol. Chem., 275, 8726-8732, 2000）。

「RNaseG活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのRNaseG活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのRNaseGの分子数が低下した場合や、分子あたりのRNaseG活性が低下した場合等が該当する。細胞あたりのRNaseG活性の比較は、例えば、同じ条件で培養した細菌の細胞抽出液に含まれるRNaseG活性を比較することによって、行うことができる。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。比較の対照となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリMG1655株などが挙げられる。

RNaseGの活性の低下は、RNaseGをコードする遺伝子（rng）を不活化することによって達成される。rng遺伝子の「不活化」とは、同遺伝子によってコードされるRNaseGの活性が低下又は消失するように、同遺伝子を遺伝子組換えにより改変するか、又は、同遺伝子に変異を導入することをいう。

rng遺伝子としては、GenBankに登録されているエシェリヒア・コリのrng遺伝子（GenBank Accession No. NC_000913.2の塩基番号3394348〜3395817の相補鎖：配列番号１）が挙げられる。このrng遺伝子がコードするRNaseGのアミノ酸配列を配列番号２に示す。rng遺伝子は、これらの配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、エシェリヒア・コリの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングすることができる。また、相同組換えによってrng遺伝子を欠損させる場合には、染色体上のrng遺伝子と一定以上の相同性、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。また、染色体上のrng遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

rng遺伝子の不活化は、具体的には例えば、染色体上のrng遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、コード領域中に他の配列を挿入することによって達成される。これらの手法は、遺伝子破壊とも呼ばれる。
また、rng遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することなどによって、rng遺伝子の発現を低下させることによっても、rng遺伝子を不活化することができる。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。

さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、rng遺伝子の不活化は、染色体上のrng遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the
National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。

各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することが挙げられる。

発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。

コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ-グルタミン酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。

染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。

標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％
以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。

標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。

また、rng遺伝子を変異処理して、低活性のRNaseGをコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhEの発現はrng遺伝子の機能に依存するため（Biochem. Biophys. Res. Commun., 295 (2002) 92-97）、adhEとβガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を結合した融合タンパク質を発現するプラスミドを細胞内で変異型rng遺伝子と共存させ、βガラクトシダーゼ活性を測定することにより、活性低下型のrng遺伝子をスクリーニングすることもできる。

RNaseGの活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、RNaseGの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。RNaseG活性が低下した変異株としては、16S rRNAの5'末端の成熟活性は残存しながらmRNAの分解活性のみが低下したような株、例えば、変異株DC430株やGM1430株など（Biochem. Biophys. Res. Commun., 289(5),1301-1306, 201） が挙げられる。

＜２＞本発明のＬ-アミノ酸の製造法
本発明のＬ-アミノ酸の製造法においては、エタノールを炭素源として含む培地で、腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有し、かつ、RNaseGの活性が低下するように改変された細菌を培養して、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取する。

使用するエタノールは、Ｌ-アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、エタノールは培地中に炭素源として資化できるだけ含まれていればいずれでもよいが、0.001w/v%以上、好ましくは0.05w/v％以上、さらに好ましくは0.1w/v%以上含まれていることが望ましい。また、培地中のエタノール濃度は、20w/V％以下、好ましくは10w/ｖ％以下、さらに好ましくは2w/v%以下であることが好ましい。

また流加培地として使用する場合は、エタノールは培地中に0.001w/v%以上、好ましくは0.05w/v％以上、さらに好ましくは0.1w/v%以上含まれていることが望ましく、10w/v%以下、好ましくは5w/v%以下、さらに好ましくは1w/v%以下含むことが好ましい。
なお、エタノールの濃度は、様々な方法で測定することが可能であるが、酵素法による測定が、簡便かつ一般的である（Swift, R. 2003. Addiction 98: 73-80）。脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィやHPLCなどの一般的な方法で測定することが可能である（Lehotay, S. J. and Hajslova, J. TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21: 686-697; Lin, J.
T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）。

さらに、本発明の方法に使用する培地には、エタノールに加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセロールなどの多価アルコール類、フマ
ル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸類を用いることが出来る。炭素源は1種でもよく、2種以上の混合物であってもよい。

エタノールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のエタノールの比率は、２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上、より好ましくは３７重量％であることが望ましい。特に、ピルビン酸シンターゼ活性、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性が強化されていない細菌を用いる場合は、生産されるアミノ酸の収率の観点から、エタノールの割合は上記範囲が好ましい。

本発明において、ピルビン酸シンターゼ活性、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ活性を強化した細菌を用いる場合には、エタノールと他の炭素源との混合比率は、エタノール濃度が高いほうが好ましく、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは100％である。

なお、本発明において、エタノールは、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間エタノールが不足している期間があってもよい。一時的とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％以下、又は２０％以下、最大で３０％の時間でエタノールが不足していてもよい。

培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。

本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。

また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。

また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ-リジン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地
は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。

培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ-アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。

目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。

本発明においては、Ｌ-アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。

本発明において、流加培養、あるいは連続培養を行う際には、一時的にエタノールあるいは脂肪酸またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。

流加培養に用いられる流加培地は、エタノールまたその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。ここで一定濃度以下とは、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下になるように添加する培地を調製することを意味する。

培養液からのＬ-アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ-アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ-アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ-アミノ酸は、フリー体のＬ-アミノ酸であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。

また、本発明において採取されるL-アミノ酸は、目的とするL-アミノ酸以外に微生物菌
体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたL-アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878)。

また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

〔実施例１〕リボヌクレアーゼG活性が低下したＬ−リジン生産菌の構築
＜１−１＞WC196ΔcadAΔldcC株へのエタノール資化性の付与
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhE*）の導入を行った。変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子として、MG1655::P_L-tacadhE*（WO2008/010565）由来の遺伝子を用いた。MG1655::P_L-tacadhE*株は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）と、PL-tacプロモーターにより制御される変異型adhE遺伝子が連結したＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに挿入して得た株である。cat遺伝子をゲノムから除去できるようにするため、cat遺伝子を、ラムダファージのアタッチメントサイトとテトラサイクリン耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片（att-tet）へ置き換えた。

cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置き換えは、WO2005/010175に記載の、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）を組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマーとして、配列番号５及び６のプライマーを使用して行った。こうして、MG1655::P_L-tacadhE*のcat遺伝子がatt-tet遺伝子に置き換えられたMG1655-att-tet-P_L-tacadhE*株を得た。

L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655-att-tet-P_L-tacadhE*をドナーとして、L-リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC株にP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcC-att-tet-P_L-tacadhE*株を得た。

次に、P_L-tacプロモーター上流に導入されたatt-tet遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-ts（米国特許出願公開20060141586）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。

上記で得られたWC196ΔcadAΔldcC-att-tet-P_L-tacadhE*株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地上、42℃で培養し、得られたコロニー
のアンピシリン耐性、及びテトラサイクリン耐性を試験し、att-tet及びpMW-intxis-tsが脱落しているP_L-tacadhE*導入株であるテトラサイクリン、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*株と名づけた。

＜１−２＞WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*株からのリボヌクレアーゼG非産生株（rng遺伝子欠損株WC196ΔcadAΔldcΔrng P_L-tacadhE*株）の構築
MG1655株に対して、「Red-driven integration」方法により、rng遺伝子の欠失を行った。ｒｎｇ遺伝子の欠失用プライマーとして、配列番号７及び８のプライマーを使用して行うことができる。これによって、MG1655Δrng::Cm株を得た。MG1655Δrng::Cm株をドナーとして、L-リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*株にP1トランスダクションを行い、リボヌクレアーゼG非産生株WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*Δrng::Cm株を得た。

WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*株、WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*Δrng::Cm株を、dapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*/pCABD2株、及び、WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*Δrng::Cm/pCABD2を得た。これらの株を20mg/Lのストレプトマイシンを含むＬ培地にて終ＯＤ600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。

〔実施例２〕リボヌクレアーゼG非産生株のＬ−リジン生産能の評価
前記の株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて15時間培養した。得られた菌体を0.85%の食塩水に懸濁し、初発OD=0.25となるように、太試験管(内径18 mm)の、20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地の5 mLに接種し、往復振とう培養装置で、攪拌120rpmの条件下、37℃において16時間培養した。培養後、培地中に蓄積したリジンの量を公知の方法（サクラ精機 バイオテックアナライザーAS210）により測定した。
発酵培地の組成を以下に示す。

［Ｌ−リジン発酵培地組成］
エタノール 10 ml/L
(NH₄)₂SO₄ 24 g/L
K₂HPO₄ 1.0 g/L
MgSO₄・7H₂O 1.0 g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01 g/L
MnSO₄・5H₂O 0.01 g/L
イーストエキストラクト 2.0 g/L
CaCO₃（日本薬局方） 30 g/L
蒸留水 最終量1L
KOHでpH5.7に調整し、115℃で10分オートクレーブを行った。但しMgSO₄・7H₂Oは別に殺菌し、エタノールはフィルターろ過により滅菌した。CaCO₃は、180℃で２時間乾熱滅菌したものを入れた。
抗生物質として、20mg/Lのストレプトマイシンを添加した。

結果を表１に示す。収率(%)は、エタノールからのＬ−リジン収率(w/w)を示す。表１から分かるように、WC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*Δrng::Cm/pCABD2株は、rng遺伝子を欠損していないWC196ΔcadAΔldcC P_L-tacadhE*/pCABD2株と比較して多量のＬ−リジンを蓄積した。

〔配列表の説明〕
配列番号１：Escherichia coiのリボヌクレアーゼG遺伝子(rng)の塩基配列
配列番号２：Escherichia coiのリボヌクレアーゼGのアミノ酸配列
配列番号３：Escherichia coliのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)の塩基配列
配列番号４：Escherichia coliのアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号５：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号６：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号７：rng遺伝子の欠失用プライマー
配列番号８：rng遺伝子の欠失用プライマー
配列番号９：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号10：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号11：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子(ydbK)の塩基配列
配列番号12：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ(YdbK)のアミノ酸配列
配列番号13：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼγサブユニット遺伝子（porA）の塩基配列
配列番号14：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼγサブユニットのアミノ酸配列
配列番号15：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼδサブユニット遺伝子（porB）の塩基配列
配列番号16：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼδサブユニットのアミノ酸配列
配列番号17：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼαサブユニット遺伝子（porC）の塩基配列
配列番号18：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号19：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼβサブユニット遺伝子（porD）の塩基配列
配列番号20：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号21：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼporE遺伝子の塩基配列
配列番号22：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼPorEのアミノ酸配列
配列番号23：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼporF遺伝子の塩基配列
配列番号24：Methanococcus maripaludisのピルビン酸シンターゼPorFのアミノ酸配列
配列番号25：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号26：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼのアミノ酸配列
配列番号27：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ遺伝子(fpr)の塩基配列
配列番号28：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺レダクターゼ遺伝子(fpr)がコードするアミノ酸配列
配列番号29：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(fdx)の塩基配列
配列番号30：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(fdx)がコードするアミノ酸配列
配列番号31：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(yfhL)の塩基配列
配列番号32：Escherichia coliのフェレドキシン遺伝子(yhfL)がコードするアミノ酸配列配列番号33：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldA)の塩基配列
配列番号34：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldA)がコードするアミノ酸配列配列番号35：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldB)の塩基配列
配列番号36：Escherichia coliのフラボドキシン遺伝子(fldB)がコードするアミノ酸配列配列番号37：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号38：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号39：Chlorobium tepidumのフェレドキシンII遺伝子の塩基配列
配列番号40：Chlorobium tepidumのフェレドキシンII遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号41：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号42：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号43：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号44：Escherichia coliのピルビン酸シンターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号45：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー１
配列番号46：Euglena gracilisのピルビン酸：ＮＡＤＰ⁺オキシドレダクターゼ遺伝子増幅プライマー２
配列番号47：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー１
配列番号48：Escherichia coliのフラボドキシン-ＮＡＤＰ⁺リダクターゼ遺伝子増幅用プライマー２
配列番号49：Escherichia coliのfdx遺伝子増幅用プライマー１
配列番号50：Escherichia coliのfdx遺伝子増幅用プライマー２
配列番号51：Escherichia coliのＮＡＤＰ型マリックエンザイムをコードする遺伝子（b2463）の塩基配列
配列番号53：Escherichia coliのＮＡＤ型マリックエンザイムをコードする遺伝子（sfcA）の塩基配列
配列番号55：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニット遺伝子（aceE）の塩基配列
配列番号56：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼEp1サブユニットのアミノ酸配列
配列番号57：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニット遺伝子（aceF）の塩基配列
配列番号58：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE2サブユニットのアミノ酸配列
配列番号59：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニット遺伝子（lpdA）の塩基配列
配列番号60：Escherichia coliのピルビン酸デヒドロゲナーゼE3サブユニットのアミノ酸配列

Claims (13)

1. 腸内細菌科に属し、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、エタノールを炭素源として含む培地に培養し、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変された細菌である方法。
2. リボヌクレアーゼGをコードするrng遺伝子が不活化されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下した、請求項１に記載の方法。
3. 前記rng遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項２に記載の方法。
4. 前記細菌が、好気的にエタノールを資化できるように改変された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細菌が、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持し、それによって好気的にエタノールを資化できる、請求項４に記載の方法。
6. 前記細菌が、変異型adhE遺伝子を保持するように改変され、それによって好気的にエタノールを資化できる、請求項４又は５に記載の方法。
7. 前記変異型adhE遺伝子が、568位のグルタミン酸残基が他のアミノ酸残基に置換された以外は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントをコードする、請求項６に記載の方法。
8. 前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-プロリン、及びＬ-システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ-アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記Ｌ-アミノ酸がＬ-リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている請求項８に記載の方法。
10. 前記Ｌ-アミノ酸がＬ-スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている請求項８に記載の方法。
11. 前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記細菌が、エシェリヒア・コリである請求項１１に記載の方法。
13. エタノールが培地中に0.001w/v%以上含まれる請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。