JP5340599B2 - 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents

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Description

開示の内容
〔関連出願の相互参照〕
本明細書は、２００３年６月２７日に出願された米国仮出願第６０／４８３，２６４号の利益を請求する、２００４年６月２５日に出願された米国特許出願第１０／８７７，０１２号の一部継続出願であり、各出願の全開示内容は参照して本明細書に組み入れる。本明細書はまた、２００４年１２月２３日に出願された米国仮出願６０／６３９，０８８号の利益を請求するものであり、その全開示内も参照して本明細書に組み入れる。
〔発明の分野〕
本発明は、哺乳類、好ましくは、ヒトの細胞療法に関し、より詳しくは、産褥臍由来の単離細胞、このような細胞を誘導する方法、ならびにそれらの使用および血清を含有する、または血清を含まない培地を含む種々の培地での増殖の方法に関する。
〔発明の背景〕
近年、疾病に関する理解が深まってくるにつれ、苦しまされてきた疾病の予後を改善するための細胞療法の潜在的有用性により、治療目的に有用なヒト細胞の新たな供給源としてますます注目されるようになってきた。このようなヒト細胞の供給源の１つが産褥組織、特に、臍または臍帯である。
近年、例えば、出産時に臍帯血がバンク保管された個人が用いるための造血細胞の、可能性のある供給源として、臍帯血(umbilical cord blood)(または単に「臍帯血(cord blood)」)のバンク形成が注目されている。このような細胞は、例えば、免疫系の機能的部分を排除し得る治療放射線照射を必要とする個人に有用である。失われた免疫細胞を再構築し、免疫機能を回復させるために、拒絶反応を避けるために慎重に適合する骨髄ドナーを求めるのではなく、その個人独自の、バンク保管された臍帯血を使用することができる。
さらにもっと最近では、幹細胞の幅広い潜在的治療適用のため、臍帯血から幹細胞を得ることに注目が寄せられている。幹細胞は一般に、１）単一細胞から細胞***によって長期間自己再生能を有し、かつ、２）適切な条件が与えられると、特定の細胞種へ分化する能力を有する細胞として理解される。よって、幹細胞は、その臍帯血から最初に細胞が得られた個人のみならず、個々の集団を治療するのにも有用である可能性がある。
特に、臍帯血は造血系前駆幹細胞の供給源と考えられている。バンク保管された（または低温保存された）臍帯血、またはそれらから単離された幹細胞は、例えば、骨髄および関連の移植における造血系の再構成に有用であると考えられてきた(Boyseら, 米国特許第５，００４，６８１号および同第５，１９２，５５３号)。
臍帯血の他、ウォートン・ジェリー(Wharton's Jelly)、臍帯静脈または動脈組織、ならびに臍帯マトリックス自体から単離された細胞を含め、ヒト臍由来治療細胞の他の供給源も探索されている。このような細胞は大部分がまだ特性決定されていないか、または生理学的特性、生化学的特性、免疫学的特性および遺伝学的特性に関して最低限の特性決定しかなされていない。
例えば、Purchioら（米国特許第５，９１９，７０２号）は、ウォートン・ジェリーから軟骨形成前駆細胞（または軟骨前駆細胞）を単離した。彼らは、血液および血管を取り出し、軟骨前駆細胞を増殖させることを意図した条件下で当該組織をインキュベートすることによる、ヒト臍帯ウォートン・ジェリーからの細胞の単離を報告している。この方法はそれ自体、ウォートン・ジェリー中に存在する異なる細胞種から目的の細胞を区別することはできず、むしろ組織からの移動、または軟骨前駆細胞に好適な増殖条件を選択することに頼るものであった。軟骨前駆細胞は、確立された後に有糸***により拡大培養された。継代培養２〜４代目の細胞は、ＢＭＰ−１３またはＴＧＦ−βなどの外因性の増殖因子を添加することにより誘発させれば、軟骨の産生に有用であることが報告されている。当該細胞の直接注入もしくは移植のための使用、またはヒドロゲルもしくは組織マトリックスとの併用が提案された。しかしながら、当該細胞は集密度が約２５％を超えないことが重要であると考えられた。当該細胞はそれらの生化学的特性もしくは免疫学的特性に関して、またはそれらの遺伝子発現に関しては、特性決定されなかった。
Weissら（米国特許出願第ＵＳ２００３／０１６１８１８号）は、哺乳類ウォートン・ジェリーまたは非血液性臍帯マトリックス供給源から多能性(pluripotent)または系統決定細胞を単離するための手順を提案している。これらの単離細胞は、造血系、間葉または神経外胚葉系統へ分化することが報告されている。これらの細胞系統は、それらの識別特性に関しては特性決定されなかった。神経系への分化後、細胞に関しては限られた特性しか提供されていない。ＣＤ３４-、ＣＤ４５-であったウォートン・ジェリー由来ウシおよびブタ細胞が参照された。
Weissらはまた、ブタ臍帯マトリックス細胞のラット脳への移植の検討を報告している(Exp. Neur. 182: 288〜299, 2003)。単離手順には酵素処置は用いられなかった。彼らは、２つの異なる集団、すなわち、球形間葉細胞と扁平間葉細胞を得た。これらの細胞は、ＧＦＰを発現するように遺伝的に改変された。これらの細胞は、種間移植された場合でも免疫拒絶を刺激しないようであった。
Mitchellら(Stem Cells 21:50〜60, 2003)は、ブタ臍帯からのウォートン・ジェリーマトリックス細胞の採取を報告している。これらの未分化細胞はテロメラーゼ陽性であることが報告され、部分集団は、ｃ−ｋｉｔ発現陽性であることも報告された（すなわち、テロメラーゼ+、ＣＤ１１７+）。これらの細胞はまた、筋原繊維芽細胞様特性の指標となるα−平滑筋アクチンを産生することも報告されている。これらの細胞は、増殖因子の存在下で神経系統へ分化することができたとされている。しかしながら、分化細胞と未分化細胞の双方が、神経幹細胞のマーカーであるＮＳＥを発現することが見出された。クローン系統および増殖能、核型分析、およびＨＬＡ抗原の発現に関する特性決定の必要性が認識された。
Romanovら(Stem Cells 21(1): 105〜110, 2003)は、ヒト臍帯静脈から間葉幹細胞（ＭＳＣ）様細胞を単離するための手順を報告している。彼らの手順は、切り取った静脈組織をコラゲナーゼで処理することを含み、目的の細胞集団（静脈の内皮下層）を得るために短い（１５分間）酵素消化が必要とされる。特に、この手順は、より深層の組織を無傷なまま残し、述べられているところでは、それより外層を除去することによって平滑筋細胞（ＳＭＣ）と繊維芽細胞の混入を避けた。得られた「ほぼ均質な」細胞集団は、約０．５〜１％の内皮細胞（それらも避けたかったものである）を含むことが報告されている。これらの細胞は、主としてＣＤ３４-であること、また、α−平滑筋アクチンを産生することが報告されている。
臍帯マトリックスに見られる細胞集団の多様性のため、当技術分野では、哺乳類臍帯に由来する規定の非血液細胞およびそれらの集団を単離する方法の必要性、ならびにそれらの生化学（例えば、増殖因子の分泌）、免疫学（細胞表面マーカーおよび免疫応答を刺激する可能性）および種々の遺伝子の発現に関して特性決定された、哺乳類臍に由来する細胞系統の必要性がある。この必要性は特に、ヒト臍由来の細胞にとってはやむをえないことである。
細胞を培養するための培地に関しては、ほとんどの場合、少なくともいくらかの胎児ウシ血清またはウシ血清を含む。一般に、市販の培地処方には、約１０〜２０％（ｖ／ｖ）の血清添加物を用いられている。この血清成分は、多くの場合、細胞集団の生存および拡大に不可欠である。ウシ血清中には、例えば、細胞増殖ならびに幹細胞および前駆細胞の集団をはじめとする細胞集団への分化に重大な影響を持ち得る既知の増殖因子であるＰＤＧＦおよびＦＧＦを含む、無数のタンパク質が見られる。
しかしながら、ウシ血清（または他種の血清）を包含させる利点にもかかわらず、治療用細胞を培養する場合、または生物製品を生産する場合に、化学的に定義された、または血清を含まないの培地を用いる代わりに培地に動物血清を添加することにはいくつかの不都合がある。細胞および組織のホメオスタシスは、血液由来血清を欠く環境条件下で生じる。よって、細胞が長期間、血清または血液関連製剤に曝されると、組織損傷典型が刺激される。さらに、刺激タンパク質および阻害物質など血清組成のロット毎の変動により時間がかかり、各バッチを治療用製品の開発または生産の標準に適合するようにするために費用のかかる予備試験を必要とする。最後に、動物関連製品の使用による、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）などの疾病の伝播についての懸念の増大が、結局、外来血清を用いて開発された細胞に基づく療法のＦＤＡ認可を遅らせる、または妨げるおそれもある。
〔発明の概要〕
第１の態様において、本発明は、実質的に血液を含まない哺乳類臍帯組織に由来する単離された臍由来細胞（ＵＤＣ）を提供する。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能である。これらの臍由来細胞は他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。好ましい実施態様では、これらの細胞はヒト臍に由来する。
これらの細胞は、細胞特性、遺伝学的特性、免疫学的特性、および生化学的特性のいくつかについて特性決定されている。例えば、これらの細胞は、それらの培養における増殖特性、それらの細胞表面マーカー、それらの遺伝子発現、ある種の生化学的栄養因子を産生するそれらの能力、およびそれらの免疫学的特性により特性決定されている。
ある特定の実施態様では、この産褥由来細胞は臍由来細胞である。他の実施態様では、この産褥由来細胞は胎盤由来細胞である。特定の実施態様では、この細胞は、ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）；またはＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６８）のいずれかの細胞種の全ての識別特徴を有している。
別のいくつかの態様では、本発明の単離された臍由来細胞を含む細胞培養物が提供される。ある特定の好ましい実施態様では、臍帯細胞の培養物は母体細胞を含まない。
臍由来細胞および細胞培養物およびそれらを含む集団を培養および拡大する方法が提供される。
本発明の別の態様では、特定の細胞表面マーカータンパク質が産生される、特異的な細胞表面マーカー発現プロフィールを有する単離された臍由来細胞が提供される。特に、これらの細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの１以上を産生する。さらに、これらの細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱの１以上を産生しない。
本発明の細胞はまた、多様な遺伝子の発現に従っても特性決定されている。よって、本発明の別の態様は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞(iliac crest bone marrow cell)であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンβ７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；初期成長応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；およびシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうち１以上の遺伝子の発現が低減されている単離された臍由来細胞を提供する。さらに、これらの単離されたヒト臍由来細胞は、インターロイキン８；レティキュロン１(reticulon 1)；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各遺伝子を発現し、ここで、この発現は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、または胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現に比べて増大されている。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能であり、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。また、これらの単離されたヒト臍由来細胞を含む治療用細胞培養物も提供される。
別のいくつかの態様において、本発明は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する単離されたヒト臍由来細胞を提供し、ここで、これらの細胞は、混合リンパ球反応において同種異系リンパ球を刺激せず、ＰＤ−Ｌ２を発現するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＢ７−Ｈ２を発現しない。いくつかの好ましい実施態様では、これらの細胞は同種異系ＰＢＭＣを刺激しない。より好ましくは、これらの細胞は、同種異系リンパ球、同種異系のＴ細胞、またはナイーブＴ細胞を刺激しないか、あるいは適合レシピエントでも不適合レシピエントでも他の有害な免疫応答を生じない。これらの細胞はまた、ある特定の実施態様において、ビメンチン(vimentin)およびα−平滑筋アクチンを産生することができる。
別の態様では、本発明は、脈管形成因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１のうち１以上を分泌する単離されたヒト臍由来細胞を提供する。ある特定の実施態様では、これらの細胞は前記分子のいくつかまたは全てを分泌する。他の実施態様では、これらの細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出される脈管形成因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦのうち１以上を分泌しない。特定の実施態様では、これらの細胞は、これらの分子の少数しか分泌しないか、全く分泌しない。
本発明の別の態様では、治療用細胞培養物が提供され、これらの細胞培養物は、脈管形成刺激栄養因子を必要とする患者の治療において用いられる前述の単離細胞を含む。このような治療用細胞培養物はまた、神経増殖刺激栄養因子を必要とする患者の治療に用いるためにも提供される。
非血液ヒト臍帯組織から細胞を誘導する方法が提供される。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。この方法は、（ａ）ヒト臍帯組織を採取する工程と；（ｂ）実質的に全ての血液を除去して、実質的に血液を含まない臍帯組織を得る工程と；（ｃ）機械的処理もしくは酵素的処理、またはその双方により組織を解離させる工程と；（ｄ）前記組織を培養培地に再懸濁させる工程と；および（ｅ）自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有するヒト臍由来細胞の増殖を可能とする増殖条件を提供する工程と；を含む。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼとディスパーゼ、または、コラゲナーゼとディスパーゼとヒアルロニダーゼなどによる酵素処理を含み、このような方法が本明細書で提供される。
本明細書では、前記の方法により誘導された、単離されたヒト臍由来細胞も提供される。ある特定の実施態様では、これらの細胞は、繰り返し継代培養しても一定の正常な核型を維持する。また、前記の方法により誘導されたヒト臍由来細胞の培養物も提供され、これらの培養物は母体細胞を含まない。さらに、幅広い条件下で培養しても、種々の培地のいずれにおいても、種々の方法のいずれによって単離した細胞でも、実質的に一定な発現表面マーカープロフィール、または細胞を特性決定する実質的に一定な遺伝子発現プロフィール、例えば、その発現パターンがある特定の幹細胞および／またはある特定の産褥細胞に特異的なものを含む、「***遺伝子プロフィール」を維持することができ、このような細胞、およびこのような細胞の培養物が提供される。
本明細書では、本発明の細胞または培養物を他の哺乳類細胞を含む共存培養も提供される。好ましくは、これらの共存培養は、その増殖能または治療能が例えば臍由来細胞の存在により改善される。このような共存培養はインビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)における治療適用に有用である。
また、本明細書では、臍由来細胞と別の治療因子、因子、または生物活性薬を含む治療組成物も提供する。このような因子としては、限定されるものではないが、ＩＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ならびに抗血栓薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制薬または免疫調節薬、および抗酸化薬が挙げられる。このような治療組成物は、ＵＤＣおよび生物活性成分に加えて、１以上の付加的細胞種をさらに含むことができる。
本明細書では、前記のものに加え、これらの細胞に由来する組成物が提供される。本明細書では、細胞溶解物、可溶性細胞画分および膜富化細胞画分が提供される。例えば基底膜を含む、細胞に由来する細胞外マトリックスも有用であり、本明細書で提供される。
本発明の組成物はまた、本明細書で提供される細胞馴化培養培地(conditioned culture media)を含む。このような培地は、最初に本発明の細胞または培養物を増殖させるのに用いたものであり、これらの細胞または培養物は増殖中に１以上の有用な産物を培地中に分泌する。これらの新規細胞の細胞馴化培地は、例えば、本発明の細胞および培養物により培地中に分泌された増殖因子または栄養因子を必要とする他の哺乳類細胞の増殖を補助すること、および例えば脈管形成を促進することを含む、多くの目的で有用である。
細胞を、種々の細胞の前駆体へ向かう経路に沿って分化させるよう、または最終的に分化した細胞それ自体へ分化させるよう誘導する方法が提供される。このような細胞はある特定の症状、障害および病態の治療的処置に有用性を有する。このような細胞はまた、治療薬を同定するためのアッセイでの使用など、診断プロトコールにも有用性を有する。
本発明はまた、限定されるものではないが、脈管形成適用、神経適用、軟組織適用、眼用適用、ならびにこれらの細胞が心臓、腎臓、骨、軟骨、膵臓、肝臓、および他の組織の単独治療、または他の治療薬との組合せ治療に有用な適用を含む治療用途で、分化した臍由来細胞または前駆体を利用する方法も提供する。
本明細書ではまた、キットも提供される。 臍帯由来細胞の増殖、単離および使用に有用なキットが提供される。
別のいくつかの態様において、本発明は、起源の異なる他の細胞から、また、他の公知の全能性細胞および多能性細胞からＰＰＤＣを識別する「***遺伝子プロフィール」を含む単離された産褥由来細胞を提供する。好ましい***遺伝子プロフィールは、これらの細胞が血清含有培地で増殖されるか、血清を含まない培地で増殖されるかによらず、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡが存在する***遺伝子プロフィールを含む。また、血清を含まない培地で増殖させた場合に比べ、血清含有培地で増殖させた場合に、その細胞表面マーカーの発現を変更する能力をさらに含む、このような細胞も提供される。現在のところ、ＰＤＧＦ受容体αおよびＨＬＡ−ＡＢＣのマーカーを変更可能な細胞が特に注目されている。
また、治療用細胞または培養物を調製する方法において、細胞を単離すること；前記細胞を、まず、前記細胞の拡大培養を補助し、前記細胞が一定量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣを産生する血清含有培地中で有用な数まで拡大培養すること；前記細胞を、低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地に移行すること；および前記細胞を、前記細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地で継代培養することで、治療用細胞または培養物を調製することを含む方法が提供される。現在のところ好ましい実施態様では、これらの細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地は、血清を含まない培地である。これらの方法は、移植(implantation or grafting)用の治療用細胞または培養物の産生に特に有用である。
また、本発明によれば、産褥由来細胞の拡大用の血清を含まない培地も提供され、この培地には１以上の増殖因子が添加されている。現在のところ好ましい添加増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、またはＰＤＧＦである。
また、ゼラチンまたはＣＥＬＬＢＩＮＤまたは接着を可能とする他の処理剤でコートした表面上、β−メルカプトエタノールを含むまたは含まず、種々の増殖因子を含むまたは含まない血清含有培地および血清を含まない培地中で産褥細胞、特に臍由来細胞を単離および培養する方法も提供される。これらの細胞を培養する方法はまた、酸素および他の増殖パラメーターの条件の変更も含む。
別の態様において、本発明は、血清を含まない培地で拡大培養された産褥由来細胞を含む治療用培養物を適用する。これらの細胞が血清含有培地で増殖されるか、血清を含まない培地で増殖されるかによらず、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡが存在する***遺伝子プロフィールを有する培養物が好ましい。
また、本発明の産褥由来細胞および培養物を含む細胞培養バンクおよび寄託物なども提供される。
本発明のこれら、またさらなる態様は、以下にさらに詳細に記載される。
〔詳細な説明〕
定義
本明細書および特許請求の範囲に用いられている種々の用語は、次に示されるように定義される。
「幹細胞」は、自己再生中の前駆細胞、非再生中の前駆細胞、および最終的な分化細胞を含む、単一細胞の自己再生能と後代細胞産生のための分化能の双方により定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）からの様々な細胞系統の機能的細胞へとインビトロ(in vitro)で分化させる能力、ならびに移植後に複数の胚葉の組織を生じる能力、および胚盤胞へ注射した後に、全てではなくても、実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
幹細胞はそれらの発達能に従って、（１）「全能性」；（２）「多能性」；（３）「複能性」)；（４）「貧能性(oligopotent)」；および（５）「単能性(unipotent)」として分類される。「全能性」細胞は全ての胚細胞種および胚体外細胞種を形成し得る。「多能性」細胞は全ての胚細胞種を形成し得る。「複能性」細胞は細胞系統のサブセットを形成し得るが、全て特定の組織、器官または生理系の範囲内である（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞限定貧能性(oligopotent)、ならびに通常の血液成分である全ての細胞種および要素（例えば、血小板）を含む後代細胞を産生することができる。「貧能性」の細胞は複能性幹細胞よりも限定された細胞系統のレセプター部セットを生じ、「単能性」の細胞は単一の細胞系統（例えば、***形成性幹細胞）を生じ得る。
幹細胞はまた、幹細胞が採取可能な供給源に基づいても分類される。「成体幹細胞」は一般に、複数の分化細胞種を含む組織に見られる複能性の未分化細胞である。成体幹細胞はそれ自体再生可能である。通常の環境下で、成体幹細胞はまた、その起源である組織およびおそらく他の組織種の特化した細胞種に分化することができる。「胚幹細胞」は、胚盤胞段階の胚の内部細胞塊由来の多能性細胞である。「胎児」幹細胞は胎児組織またはメンブラン起源のものである。「産褥幹細胞」は、誕生後に利用可能な胚体外組織、すなわち、胎盤および臍帯に実質的に起源する複能性または多能性細胞である。これらの細胞は、速い増殖および多くの細胞系統へと分化する能力を含む多能性幹細胞の特徴を有することが分かっている。産褥幹細胞は血液由来（例えば、臍帯血から採取されるもの）または非血液組織（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から採取されるもの）であり得る。
「胚組織」は一般に、胚起源の組織として定義される（ヒトでは、受精から発達約６週までの期間をさす）。「胎児組織」は胎児起源の組織をさし、ヒトでは、発達約６週目から分娩までの期間をさす。「胚体外組織」は胚または胎児に関連しているが、胚または胎児起源ではない 組織である。胚体外組織は、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢および尿膜）、臍帯および胎盤（それ自体は絨毛膜および母体の基底脱落膜から形成される）。
「分化」は、非特化（「決定済みでない」）または特化性の低い細胞が、例えば、神経細胞または筋肉細胞などの特化細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化」細胞は、その細胞系統内でより特化性の高い（「決定済みの」）立場をとった細胞である。「決定済み」とは、分化の過程に用いる場合、通常の環境下で特定の細胞種または細胞種サブセットに分化し続けるが、通常の環境下で異なる細胞種に分化することができないか、または分化性の低い細胞種には後戻りすることができないポイントまで分化経路が進行した細胞をさす。「脱分化」は、細胞が、その細胞系統内の特化性の低い（または決定済みでない）状態に後戻りするプロセスをさす。本明細書において、その細胞「系統」はその細胞の遺伝性、すなわち、どの細胞に由来し、どの細胞を生じるかを規定する。その細胞系統は、その細胞を発達および分化の遺伝スキーム内に置く。
広義において、「前駆細胞」は、それ自体よりも分化した後代細胞を作り出す能力を有し、かつ、する前駆細胞のプールを満たす能力をなお保持する細胞である。この定義によれば幹細胞それ自体も、最終分化細胞へのより直接的な前駆細胞であるので、前駆細胞である。下記により詳細に記載するように、本発明の細胞に関しては、この「前駆細胞」のより広い定義が用いられる。狭義においては、前駆体細胞は、多くの場合、分化経路の中間体である細胞として定義され、幹細胞から生じ、成熟細胞種または細胞種のサブセットの産生における中間体となる。この種の前駆体細胞は一般に、自己再生不能である。よって、本明細書にこの種の細胞が言及される場合、「非再生前駆細胞」と呼ばれるか、または「中間的前駆体」もしくは「前駆細胞」と呼ばれる。
本明細書において「中胚葉、外胚葉または内胚葉への分化」とは、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉または内胚葉系統に決定付けられた細胞をさす。中胚葉系統へ分化する、または特定の中胚葉細胞を形成する細胞の例としては、限定されるものではないが、脂肪生成細胞、軟骨形成細胞、心臓形成細胞、皮膚形成細胞、造血系細胞、血管形成細胞、筋原性細胞、腎形成性細胞、泌尿生殖器形成細胞、骨形成細胞、心膜形成細胞または間質細胞が挙げられる。外胚葉系統へ分化する細胞の例としては、限定されるものではないが、上皮細胞、神経原性細胞、および神経膠原性細胞が挙げられる。内胚葉系統へ分化する細胞の例としては、限定されるものではないが、胸膜形成細胞、肝性細胞、腸の内面を形成する細胞、ならびに膵細胞および内臓細胞を形成する細胞が挙げられる。
本発明の細胞は一般に、「臍由来細胞」（またはＵＤＣ）と呼ばれる。本発明の細胞はまた、本明細書では、より一般的に「産褥由来細胞」または「産褥細胞」（ＰＰＤＣ）と呼ばれる場合もある。さらに、これらの細胞は幹細胞または前駆細胞と記載される場合もあり、当該用語は広義において用いられる。「由来」とは、それらの細胞が生物源から採取され、インビトロ(in vitro)で増殖、またはそうでなければ操作された（例えば、増殖培地で集団を拡大するまで、かつ／または細胞系統となるまで培養された）ことを示すのに用いる。インビトロ(in vitro)における臍帯幹細胞に操作および本発明の臍由来細胞のユニークな特徴を以下に詳細に記載する。
培養細胞を表すために様々な用語が用いられる。「細胞培養物」とは一般に、生物体から採取され、制御された条件下で増殖（培養）された細胞をさす。「一次細胞培養」とは、最初の植え継ぎ前に、生物から直接採取された細胞、組織または器官の培養物である。細胞増殖および／または***を促進する条件下で増殖培地に置かれた場合に「拡大培養」され、大きな細胞集団が得られる。細胞を拡大培養した場合、細胞増殖速度は細胞数が倍加するのに必要な時間量により測定される場合がある。これは「倍加時間」と呼ばれる。
「細胞系統」は、一次細胞培養物の１回以上の植え継ぎにより形成される細胞集団である。各回の植え継ぎは「継代培養」と呼ばれる。細胞を植え継がれる場合、その細胞は「継代培養」されたといわれる。特定の細胞集団または細胞系統は、継代培養回数に関して示され、あるいは特徴付けられる場合がある。例えば、１０回継代培養された培養細胞集団はＰ１０培養物と呼ぶことができる。一次培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の初代培養物はＰ０と呼ばれる。１回目の植え継ぎの後、当該細胞は二次培養物（Ｐ１または１代目）で表される。２回目の植え継ぎの後、当該細胞は三次培養物（Ｐ２または２第目）などとなる。当業者ならば、継代培養期間中は何回も集団倍加し得るので、ある培養物の集団倍加回数は継代培養回数よりも大きい場合があることが分かるであろう。継代培養間の期間の細胞の増殖（すなわち、集団倍加回数）は、限定されるものではないが、播種密度、支持体、培地、 増殖条件および継代培養間の時間を含む多くの因子によって異なる。
「細胞馴化培地(conditioned medium)」とは、その中で特定の細胞または細胞集団が培養された後、取り出された培地である。細胞をある培地中で培養した場合、当該細胞は他の細胞に栄養的支持体を提供することができる細胞因子を分泌する場合がある。このような栄養因子としては、限定されるものではないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒が挙げられる。これらの細胞因子を含む培地が細胞馴化培地である。
一般に、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖および／もしくは維持を促進する、または少なくとも補助する、あるいは細胞の活性増大を刺激する物質として定義される。
培養脊椎動物細胞に関して、「老化」（また、複製老化または細胞老化）とは、細胞培養の限定、すなわち、それらが集団倍加の現定数（ヘイフリック限界と呼ばれる場合もある）を超えては増殖できないことに関与する特性をさす。細胞老化は最初に繊維芽細胞様細胞を用いて記載されたが、培養系で首尾よく増殖可能なほとんどの正常ヒト細胞種は細胞老化を受ける。細胞種が異なればインビトロ(in vitro)での寿命も異なるが、最大寿命は典型的には集団倍加１００回より少ない（これは、全ての培養細胞が老化に至る、従って***できない培養物となる倍加回数である）。老化は生活期間には依存せず、むしろ培養が行われた細胞***、または集団倍加の回数を尺度とする。従って、必須増殖因子を取り除くことにより休止した細胞は、それらの増殖因子が再導入されれば成長および***を再開し、その後、継続的に増殖した等価の細胞と同じ回数倍加を行うことができる。同様に、細胞を様々な集団倍加回数後に液体窒素中で凍結させ、その後、解凍および培養すれば、それらの細胞は凍結させずに培養で維持した細胞と実質的に同じ回数倍加する。老化細胞は死細胞でも死に至りつつある細胞でもなく、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に実際に耐性があり、３年といった長期間***しない状態で維持された。これらの細胞はまさに生きており、代謝活性があるが、***しない。***しない状態の老化細胞は生物剤、化学剤またはウイルス剤によっても逆転できるということはまだ見出されていない。
本明細書において「増殖培地」とは一般に、臍由来細胞の培養に十分な培地をさす。特に、現在のところ、本明細書において本発明の細胞の培養に好ましい培地としては、ダルベッコの改変イーグル培地（本明細書ではＤＭＥＭとも略される）が挙げられる。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（本明細書では、ＤＭＥＭ−ＬＧとも）(Invitrogen, Carlsbad, CA)。このＤＭＥＭ−低グルコースには、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（例えば、定義済みウシ胎児血清，Hyclone, Logan UT）、抗生剤／抗真菌剤（好ましくは、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、およびアムホテリシンＢ(amphotericin B)（０．２５ｍｇ／ｍＬ）(Invitrogen, Carlsbad, CA))、および０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis MO)を添加することが好ましい。場合によっては、異なる増殖培地が用いられるか、または異なる添加が行われ、これらは通常、増殖培地への添加または増殖培地からの欠損として本明細書に示される。
他の実施態様では、増殖培地には血清を添加せず、より好ましくは、培地に動物由来タンパク質材料を添加しない。これは現在のところ、例えば、臨床使用または前臨床使用のために細胞を増殖させるのに好ましい。このような血清を欠く培地、いっそう好ましくは動物タンパク質添加物を欠く培地は、本発明の細胞の単離および増殖の双方に使用可能である。
また、本発明に関しても本明細書における「標準増殖条件」は、３７℃、,５％ＣＯ2を含む標準的大気下で細胞を培養することをさす。相対湿度は約１００％に維持する。前記の条件は培養には有用であるが、このような培養条件は、細胞を培養するために当技術分野で利用可能な選択肢を認識する当業者により変更可能であると理解され、例えば、温度、ＣＯ2、回転または振盪、相対湿度、酸素、および増殖培地などがある。
本明細書では次の省略形が用いられる：
ＡＮＧ２（またはＡｎｇ２）は、アンギオポエチン２(angiopoietin 2)；
ＡＰＣは、抗原提示細胞；
ＢＤＮＦは、脳由来神経栄養因子；
ｂＦＧＦは、塩基性繊維芽細胞増殖因子；
ｂｉｄ（またはＢＩＤ）は、「ｂｉｓ ｉｎ ｄｉｅ」（１日２回）；
ＢＭＥは、βメルカプトエタノール（または２−メルカプトエタノール）；
ＢＳＰは、骨シアロタンパク質(bone sialoprotein)；
ＣＫ１８は、サイトケラチン１８；
ＣＸＣリガンド３は、ケモカイン受容体リガンド３；
ＤＡＰＩは、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−２−ＨＣｌ(4'-6-diamidino-2-phenylindole-2-HCl)；
ＤＭＥＭは、ダルベッコの最小必須培地；また、本明細書では、ダルベッコの改変イーグル培地と同義としても使用される。当業者ならば、いずれの名称でもその組成が同じであることが分かるであろう。
ＤＭＥＭ：ｌｇ（またはＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は、低グルコースを含むＤＭＥＭ；
ＥＤＴＡは、エチレンジアミンテトラ酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid)；
ＥＧＦは、上皮細胞増殖因子；
ＥＲＧは、エレクトロレトマルグラム(Electroretmalgram)；
ＦＡＣＳは、蛍光活性細胞選別；
ＦＢＳは、ウシ胎児血清(fetal bovine serum)；
ＦＣＳは、ウシ胎児血清(fetal calf serum)；
ＧＣＰ−２は、顆粒球走化性タンパク質２；
ＧＦＡＰは、膠原繊維酸性タンパク質；
ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子；
ＨＣＡＥＣは、ヒト冠動脈内皮細胞；
ＨＧＦは、肝細胞増殖因子；
ｈＭＳＣは、ヒト間葉幹細胞；
ＨＮＦ−Ｉαは、肝細胞特異的転写因子；
ＨＵＶＥＣは、ヒト臍帯静脈内皮細胞；
Ｉ３０９は、ケモカインおよびＣＣＲ８受容体リガンドであり、ＴＨ２型Ｔ細胞の走化性に関与する。Ｉ３０９は、内皮細胞と結合し、これらの細胞の走化性および浸潤を刺激し、インビトロ(in vitro)マトリゲルアッセイにおいてＨＵＶＥＣの毛細血管様構造への分化を促進する。さらに、Ｉ３０９は、ウサギ角膜およびひな漿尿膜アッセイ（ＣＡＭ）の双方でインビボ(in vivo)において脈管形成のインデューサーである。
ＩＬ−６は、インターロイキン−６；
ＩＬ−８は、インターロイキン−８；
Ｋ１９は、ケラチン１９；
Ｋ８は、ケラチン８；
ＫＧＦは、ケラチノサイト増殖因子；
ＭＣＰ−１は、単球走化性タンパク質１；
ＭＤＣは、マクロファージ由来ケモカイン；
ＭＩＰ１αは、マクロファージ炎症性タンパク質１α；
ＭＩＰ１βは、マクロファージ炎症性タンパク質ｌβ；
ＭＳＣは、間葉幹細胞；
ＮＨＤＦは、正常ヒト表皮繊維芽細胞；
ＮＰＥは、神経前駆体拡大培地；
ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞；
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水；
ＰＤＧＦｂｂは、血小板由来増殖因子；
ＰＤＧＦｒ／αは、血小板由来増殖因子受容体α；
ＰＤ−Ｌ２は、プログラムされた細胞死リガンド２；
ＰＥは、フィコエリトリン；
ＰＯは、「ｐｅｒ ｏｓ」（経口）；
ＰＰＤＣは、産褥由来細胞；
Ｒａｎｔｅｓ（またはＲＡＮＴＥＳ）は、活性化時に調節される正常Ｔ細胞発現および分泌(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)；
ｒｈＧＤＦ−５は、組換えヒト増殖および分化因子５；
ＳＣは、皮下；
ＳＤＦ−１αは、間質由来因子１α；
ＳＨＨは、ソニック・ヘッジホッグ(sonic Hedgehog)；
ＳＯＰは、標準的操作手順；
ＴＡＲＣは、胸腺および活性化調節ケモカイン；
ＴＣＰは、組織培養プラスチック；
ＴＧＦβ２は、トランスフォーミング増殖因子β２；
ＴＧＦβ−３は、トランスフォーミング増殖因子β−３；
ＴＩＭＰ１は、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤；
ＴＰＯは、トロンボポエチン；
ＴｕＪ１は、βＩＩＩチューブリン；
ＵＤＣは、臍由来細胞；
ＶＥＧＦは、血管内皮増殖因子；
ｖＷＦは、フォン・ウィルブランド因子(von Willebrand factor)；
αＦＰは、α−フェトタンパク質。
〔説明〕
本明細書には種々の特許および他の刊行物が引用されているが、本明細書に通じてそれらの各々の全開示内容は参照して本明細書に組み入れる。
第１の態様において、本発明は、実質的に血液を含まないヒト臍帯組織に由来する細胞を含む単離された臍由来細胞を提供する。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能である。これらの臍由来細胞は他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。好ましい実施態様では、これらの細胞は、外胚葉、中胚葉、または内胚葉起源のいずれかの細胞へ分化することができる。本発明は、そのいくつかの態様の１つにおいて、ヒト臍帯組織から単離された細胞を提供する。本明細書に開示されるように、これらの細胞は、好ましくは臍帯血由来のものではない。また、それらは例えば血管由来の内皮細胞でもない。むしろ、これらの細胞は残りの臍組織に由来するものである。
これらの細胞は、細胞特性、遺伝学的特性、免疫学的特性、および生化学的特性のいくつかについて特性決定されている。例えば、これらの細胞は、それらの細胞表面マーカー、それらの遺伝子発現、ある種の生化学的栄養因子を産生するそれらの能力、およびそれらの免疫学的特性により十分特性決定されている。
別のいくつかの態様では、本発明の単離された臍由来細胞を含む細胞培養物が提供される。本明細書において好ましい実施態様では、これらの培養物は母体細胞を含まない。また、正常な核型を有する細胞および継代培養されてもそれらの核型を維持する培養物も好ましい。少なくとも老化後まで継代培養しても正常な核型を保有および維持する細胞が最も極めて好ましい。
臍由来細胞およびそれらを含む細胞培養物を培養および拡大する方法が提供される。増殖因子の添加の必要なく、多くの利用可能な培養培地、特に例えばウシ胎児血清を添加したもので拡大培養可能な細胞が現在のところ好ましい。細胞の培養および拡大に好ましい培地としては、ダルベッコの改変必須培地（本明細書ではＤＭＥＭとも省略）を含む培地と本明細書で定義される増殖培地が挙げられる。ＤＭＥＭ−低グルコース（本明細書では、ＤＭＥＭ−ＬＧとも）(Invitrogen, Carlsbad, CA)が好ましい。このＤＭＥＭ−低グルコースには、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（例えば、定義済みウシ胎児血清，Hyclone, Logan UT）、抗生剤／抗真菌剤（好ましくは、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ(Invitrogen, Carlsbad, CA)）、ならびに０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis MO)を添加することが最も好ましい。
当業者ならば、増殖培地に様々な添加を行うことができ、当業者に公知のいずれかの方法で変更することができ、特定の理由で至適化可能であることが分かるであろう。また、産褥組織からの細胞の単離またはそれらの細胞の増殖および培養のいずれかに、血清を添加しない培地、および血清を含まないおよび動物タンパク質を含まない培地が好ましい。このような培地は、前臨床使用または臨床使用のための細胞の単離または培養に用いるのに特に好ましい。また、添加物としてβ-メルカプトエタノールを欠く培地も有用である。さらに、これらの細胞は、付加的血清の不在下で、化学的に定義された培地を含む、多くの他の培養培地で増殖可能である。このような培地のいくつかが以下に例示される。これらの細胞の通常の培養および維持の他、このような能力のある細胞の、細胞の特定の細胞種または特定細胞の前駆体の分化に影響を与えるために多くの他の培地が当技術分野で公知である。当業者ならば、これらの培地は多くの目的で有用であり、本発明の範囲内に含まれるが、通常の培養および拡大には必ずしも好ましくはないことが分かるであろう。
培養培地に関するこれらの細胞の柔軟性に加え、これらの細胞は様々な環境条件下で増殖することができる。特に、これらの細胞は広範な雰囲気条件下で増殖することができる。約５％Ｏ2〜約２０％以上のＯ2の範囲にわたる雰囲気が現在のところ好ましい。これらの細胞は、これらの条件下、典型的には約５％ＣＯ2の存在下（雰囲気の残部は窒素）、増殖培地で十分増殖および拡大する。当業者ならば、これらの細胞が種々の培地でより広範な条件に耐え得ること、および特定の目的に関して至適化するのが適宜であり得ることが分かるであろう。
これらの細胞は特定の増殖因子に関して要求を示すことはなかったが、これらの細胞はＤ−バリンよりもＬ−バリン要求を示した。よって、好ましい培養培地には、このアミノ酸のＬ−イソ型が存在しなければならない。これらの細胞のそれらの増殖要件に関する柔軟性が示された他、コートまたは非コート組織培養容器のいずれかにおいて接着および培養可能な単離細胞が好ましい。組織培養容器としては、プレート、フラスコ、および試験管などが挙げられ、例えば、プラスチック、ポリスチレン、ガラスなど、当技術分野で公知のいずれの材料から製造されていてもよい。このような容器をコートする場合、当技術分野で公知のように、様々な化合物のいずれでコートしてもよい。現在のところ好ましいコート容器は、例えば、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン(polyornithine)、ポリリジン(polylysine)、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのよるコーティングを含む。
本発明の単離細胞はまた、約２％〜約１５％の血清、好ましくは、ウシ胎児血清、より好ましくは、定義済みのウシ胎児血清の存在下で拡大培養するのが好ましい。これらの細胞はまた、β−メルカプトエタノールの存在または不在下、およびＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＬＩＦのうち１以上を含む、付加的増殖因子の存在または不在下で拡大培養する。当業者ならば、これらの柔軟な増殖要件がこれらの細胞とともに培養または操作する場合に多くの選択肢を見込めることが分かるであろう。ある特定の実施態様では、細胞は、従前に記載した増殖因子のいずれか１つ、特にｂＦＧＦを含む改良型ＤＭＥＭ(Gibco)中で培養される。前記のように、現在のところ増殖培地が好ましいが、血清の絶対的要求はなく、増殖は血清を含まない培地で行われている。
これらの細胞はまた、様々な表面上で接着依存的培養物として増殖させることもできる。現在のところ好ましいのはゼラチンで処理した表面であり、培養物が完全に動物タンパク質を含まない必要があるＣＥＬＬＢＩＮＤがより好ましい。本明細書で提供されるものなど、他のコーティングも接着依存性培養物の増殖に適合している。
好ましい実施態様では、これらの細胞は優れた倍加と拡大能を有し、それらの数は容易にスケールアップ可能であるので、診断適用および治療適用に用いるのに好適である。これらの単離細胞は好ましくは、好適な培地に約１０3細胞／ｃｍ2で播種した場合に培養約８０日以内に約１０14細胞を超える収量を得るのに十分倍加することができる。約５，０００細胞／ｃｍ2で播種した場合に、培養約８０日以内に約１０15細胞を超える収量を得るのに十分倍加することができる細胞がより好ましい。約５，０００細胞／ｃｍ2で播種した場合に、培養約６５日以内に約１０17細胞を超える収量を得るのに十分倍加することができる単離細胞がよりいっそう好ましい。
本発明の単離細胞は徹底的に倍加を受けることができる。好ましくは、これらの細胞は老化に達するまでに少なくとも３０回の倍加を受ける。より好ましくは、培養において少なくとも４０回の倍加が得られる。老化するまでに４０回を超える倍加を達成することができる細胞がよりいっそう好ましい。本発明の細胞は、好ましくは、例えば、同じ条件下で培養されたヒト間葉細胞、またはヒト繊維芽細胞よりも長期間***を受け得る。
一実施態様では、臍帯細胞は１以上の酵素活性(enzyme activity)の存在下で単離される。当技術分野では、消化力が弱いと考えられるもの（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼ、ディスパーゼ(dispase)）から消化力が強いと考えられるもの（例えば、パパインおよびトリプシン）まで、組織から細胞を単離するために用いられる広範な消化酵素が知られている。粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなど）、およびデオキシリボヌクレアーゼが現在のところ好ましい。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよび粘液溶解活性から選択される酵素活性がより好ましい。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびディスパーゼの１以上の活性の存在下で単離された細胞が現在のところ好ましい。ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼと、ディスパーゼおよびサーモライシン(thermolysin)のいずれかのプロテアーゼ活性の存在下で単離された細胞がより好ましい。コラゲナーゼおよびディスパーゼ酵素活性を用いて単離された細胞がよりいっそう好ましい。また、コラゲナーゼおよびディスパーゼ活性に加えてヒアルロニダーゼ活性の存在下で単離された細胞も好ましい。
本発明の別の態様では、特異的細胞表面マーカー発現プロフィールを有する単離された臍由来細胞が提供される。好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＣおよびＨＬ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱから選択される１以上の細胞表面マーカーの産生または産生の欠如のいずれかで特徴付けられる。細胞のプロフィールを提供するため、前記のうち数種（例えば、２つ、４つ、５つもしくは８つ）、またはさらには１０、または全ての産生または産生の欠如に関して特徴付けられる細胞がより好ましい。好ましい実施態様では、これらの細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの１以上を産生する。前記のうち数種または全てを発現する細胞がより好ましい。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの各々を発現する細胞がよりいっそう好ましい。
好ましい細胞はまた、それらが産生しないマーカーに関して特性決定することもでき、このような情報は細胞の特性または免疫プロフィールの形成にも有用である。好ましくは、これらの細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱの１以上を産生しない。前記の数種以上を産生しない細胞がより好ましい。本明細書に記載の条件下でフローサイトメトリーによりＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱのいずれの産生も検出できない細胞がよりいっそう好ましい。
他の好ましい実施態様では、これらの細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの数種以上を産生すると同時に、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱのうち１つ、数種、またはそれ以上を産生しないことを示し得る。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの各々を産生すると同時に、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱをいずれも産生しない細胞がより極めて好ましい。
このような細胞はこれらの細胞表面タンパク質の産生に関して高度に特性決定される。好ましい実施態様では、このような産生に関するこれらの細胞の特性は、実質的に不変であり、単離手順の変動、継代培養、培養条件、または組織培養容器でのコーティングの有無によっても実質的に変化しない。
本発明の細胞はまた、多様な遺伝子の発現に従って特徴付けられている。よって、本発明の別の態様は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２(short stature homeobox 2)；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ならびにインターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の遺伝子の発現において特徴付けられている単離されたヒト臍由来細胞を提供する。
一実施態様では、好ましい細胞は、前記の細胞表面マーカー特性を有し、それらの相対的遺伝子発現においてさらに特徴付けられている。例えば、いくつかの好ましい細胞が前記の細胞表面特性を有し、インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の１以上の遺伝子を発現する。前記各々の数種の（例えば、少なくとも２つ、４つ、５つまたはそれを超える）遺伝子を発現する細胞がより好ましい。これらの細胞は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。また、単離されたヒト臍由来細胞を含む治療用細胞培養物も提供される。
細胞表面マーカー特性を含み、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａから選択される１以上の遺伝子の発現が低減されているＵＤＣも提供される。前記のうち数種（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超える、または全て）の遺伝子の発現が低減されている細胞が好ましい。
本明細書に記載の細胞表面マーカー特性を有し、また、インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各々の遺伝子も発現し、かつ、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａから選択される１以上の遺伝子の発現が低減されている細胞がよりいっそう極めて好ましい。
別の態様において、本発明は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤの各々の遺伝子の発現が低下しており、かつ、インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各々の遺伝子を発現し、その発現が繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞、または胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現に比べて増大されている、単離されたヒト臍由来細胞を提供する。このような細胞はそれらの細胞表面マーカーに関して特性決定される必要はないが、このような細胞は好ましくは、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、培養において分化能を有する。下記のように接着細胞として単離される細胞が最も好ましいが、このような細胞はまた単離した後にある特定の条件下で球形で増殖させることもできることから、このような細胞は必ずしも接着性でない。
ある特定の好ましい実施態様は、ビメンチンまたはα−平滑筋アクチンも産生する前記の細胞を含む。ビメンチンとα−平滑筋アクチンの双方を産生する細胞がより好ましい。これらのタンパク質の産生は、例えば、臍帯血から単離された造血系細胞から本発明の細胞を識別するものと考えられる。
好ましい実施態様では、前記の遺伝子発現プロフィールは実質的に安定であり、継代培養または通常の培養条件でも変化しない。もちろん、このようなプロフィールは、例えば、他の表現型への分化、または種々の遺伝子セットの発現を刺激または誘導する条件下で細胞を増殖させた場合に変更可能であると理解される。
本発明はまた、前記のような細胞表面産生または遺伝子発現プロフィール、またはその双方を有する細胞を含む治療用細胞培養物も提供する。治療用培養物を含む細胞バンクも同様に本発明の範囲内に含まれる。例えば、細胞バンクは、種々の継代数の本発明の培養細胞、ならびに種々の表現型へ分化するよう誘導(induce)された本発明の細胞を含み得る。他の細胞は、本発明の細胞と別に、または共存培養において首尾よくバンク保管することができる。最終的な細胞バンクは、多様な個体のバンク保管細胞を含み得る。好ましい実施態様では、バンク保管細胞は例えば−１８０℃で低温保存される。いくつかの実施態様では、−９０℃で保存するのが好ましい。本発明の細胞は、当技術分野で知られているものなど、様々な条件下で容易に低温保存される。
好ましい実施態様では、これらの細胞は、混合リンパ球反応において同種異系リンパ球を実質的に刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いている。より好ましい実施態様では、これらの細胞は、インビトロ(in vitro)評価、または同種異系、同系もしくは自己レシピエントのインビボ(in vivo)でＣＤ４+Ｔ細胞を実質的に刺激するのに必要な表面分子を欠いている。インビボ(in vivo)適用に関して実質的に有害な免疫学的結果をを生じない細胞がよりいっそう好ましい。治療用細胞培養物は、検出可能な量の、フローサイトメトリーにより同定される刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２のうち少なくとも２つ、または数種、または全てを欠いている。前記の全てを欠いているものが最も好ましい。また、検出可能な量の、フローサイトメトリーにより同定される免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の一方または双方をさらに欠いている治療用細胞培養物も好ましい。また、検出可能な量の、フローサイトメトリーにより同定される免疫調節タンパク質ＰＤ−Ｌ２を発現する治療用細胞培養物も好ましい。一実施態様では、治療用細胞培養物は、混合リンパ球反応における同種異系対照に比べて、インビトロ(in vitro)においてリンパ球により媒介される応答を実質的に刺激しない。
別のいくつかの態様では、本発明は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する単離されたヒト臍由来細胞を提供し、この場合、これらの細胞は混合リンパ球反応において同種異系リンパ球を実質的に刺激しない。実質的にＣＤ４+Ｔ細胞を刺激せず、かつ、ＰＤ−Ｌ２を産生するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＢ７−Ｈ２の１以上を産生しない細胞がより好ましい。ある特定の実施態様において、これらの細胞はまた、ビメンチンまたはα−平滑筋アクチンも産生することができる。ビメンチンとα−平滑筋アクチンの双方を産生する細胞がより好ましい。ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２をいずれも産生しない細胞がよりいっそう好ましい。
有用な分子、例えば、増殖因子を分泌する本発明の細胞が現在のところ好ましい。このような細胞は、それらの細胞特性についてだけでなく、例えば細胞馴化培地中の分泌分子、または無細胞溶解液についても有用性を有する。別の態様では、本発明は、脈管形成因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１の１以上のを分泌する単離されたヒト臍由来細胞を提供する。特定の実施態様では、これらの細胞は前記因子の全てを分泌する。これらの細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出される脈管形成因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦの１以上を分泌しない。ある特定の実施態様では、これらの細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出されるＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦをいずれも分泌しない。
別の態様では、本発明の細胞は、本明細書で提供される多くの特徴の組合せによって定義される。例えば、本発明は、実質的に血液を含まない哺乳類産褥組織に由来するＬ−バリン要求細胞を含む単離された臍由来細胞を提供する。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞、例えば、心筋細胞またはそれらの前駆体へ分化する能力を有する。本明細書で提供される技術により、目的の任意の哺乳類の臍組織から細胞を単離することができる。ヒト細胞が現在のところ好ましい。これらの細胞は、多様な培養培地および環境条件を含む、多様な条件下で増殖可能である。これらの細胞は少なくとも約３５℃〜約３９℃、おそらくは他の条件によってさらに広範囲で増殖可能である。これらの細胞は、化学的に定義された培地、または哺乳類血清、例えばウシ胎児血清を添加した培地で増殖可能である。これらの細胞はまた、種々の段階で低温保存にも耐える。細胞を、好ましくは−８０℃以下の温度で冷凍維持またはバンク保管することができる。他の好ましい温度は、約−９０℃〜約−１８０℃以下の範囲に及ぶ。専用の電気冷凍庫を使用することもできるし、あるいは液体窒素または気相窒素中で細胞を保存することもできる。また、細胞の単離前の組織をバンク保管することもできる。好ましくは、当技術分野で公知のものなどの優良バンク保管手順(Good Banking Procedures)に従う。
これらの細胞は、約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含む雰囲気下で増殖可能であり、次の特徴のうち少なくとも１つを含む：当該細胞は培養において少なくとも約４０回倍加する能力を有する；当該細胞は好ましくは接着性であり、従って、コートまたは非コート組織培養容器上で接着及び拡大することが好ましく、この場合、コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ポリリジン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む。
これらの細胞は好ましくは、組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの少なくとも１つを産生し、組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの各々を産生する細胞がより好ましく、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃのうち少なくとも１つの産生もまた好ましい。これらの細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱの少なくとも１つの産生の欠如で特徴付けられており、より好ましい細胞は、これらの表面マーカーの全ての産生を欠いている。また、インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の少なくとも１つを発現する細胞も好ましい。好ましい細胞はまた、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(ileac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａの少なくとも１つが低減されている発現を有し、当業者ならば、多様な遺伝子の発現が、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）の遺伝子アレイ上で便宜に特性決定されることが分かるであろう。
これらの細胞は増殖因子、ケモカインおよびサイトカインなどの様々な生化学的活性因子を分泌する。好ましい細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１β、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１の少なくとも１つを分泌し、あるいは好ましい細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１α、およびＶＥＧＦの少なくとも１つの分泌の欠如において特徴付けることができる。これら、および他の特徴は、細胞の同定および特性決定に、ならびに本発明の細胞を当技術分野で公知の他のものから識別するために利用可能である。
好ましい実施態様では、これらの細胞は、前記の特徴の２以上を含む。前記特徴のうち３つ、４つまたは５つまたはそれを超えるものを含む細胞がより好ましい。前記特徴のうり６つ、７つ、または８つを含む単離された産褥細胞がよりいっそう好ましい。特許請求される特徴の９つ全てを含む細胞が現在のところよりいっそう好ましい。
また、組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの少なくとも２つを産生する細胞も現在のところ好ましい。タンパク質組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンの３つ全てを産生する細胞がより好ましい。
当業者ならば、大きく異なる増殖条件下で細胞マーカーがいくらか変更を受けること、および本明細書に一般に記載されているものが増殖培地またはそのバリエーションにおける特徴であることが分かるであろう。ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃのうち少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つを産生する産褥由来細胞が好ましい。これらの細胞表面マーカーのうち５つ、６つまたは７つを産生する細胞がより好ましい。前記細胞表面マーカータンパク質の８つ全てを産生し得る産褥細胞がよりいっそう好ましい。
同様に、フローサイトメトリーにより検出されるタンパク質ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱのうち少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの産生を欠いている産褥細胞が現在のところ好ましい。これらのマーカーのうち少なくとも５つ、６つ、７つまたは８つまたはそれを超える産生を欠いている細胞もまた好ましい。これらの細胞表面マーカーのうち少なくとも９または１０の産生を欠いている細胞がより好ましい。前記識別タンパク質の１１全ての産生を欠いている細胞が最も極めて好ましい。
現在のところ好ましい細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの各々を産生し、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱをいずれも産生しない。
現在のところ、産褥由来細胞がインターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３のうち少なくとも１つ、２つまたは３つを発現することが好ましい。前記遺伝子のうち４つまたは５つを発現する細胞がより好ましく、６つ全てを発現し得る細胞がよりいっそう好ましい。
いくつかの実施態様では、繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ(Drosophila)）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒト(Homo sapiens)ｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒト(Homo sapiens)ｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ならびにインターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３に相当する遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現が低減されている細胞が好ましい。ヒト繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞に比べ、前記で挙げたものに相当する少なくとも５、１０、１５または２０の遺伝子の発現が低減されている細胞がより好ましい。挙げられた一覧に相当する少なくとも２５、３０または３５の遺伝子の発現が低減されている細胞が現在のところより好ましい。ヒト繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞に比べ、挙げられた一覧の３５以上、４０以上、または全てに相当する遺伝子の発現が低減されている産褥由来細胞もより好ましい。





ある特定の増殖因子および他の細胞タンパク質の分泌は本発明の細胞を特に有用なものとし得る。好ましい産褥由来細胞は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つを分泌する。挙げられたタンパク質のうち５つ、６つ、７つまたは８つを超えるものを分泌する細胞もまた有用であり、好ましい。これらの因子のうち少なくとも９、１０、１１またはそれを超えるものを分泌し得る細胞がより好ましく、前記リストのタンパク質うち１２以上、または１３全てを分泌し得る細胞も同様に好ましい。
このような因子の分泌は有用であるが、細胞はまた、培地への因子の分泌の欠如により特徴付けることもできる。ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１α、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの分泌を欠いている臍由来細胞が現在のところ使用するのに好ましい。前記タンパク質のうち５つまたは６つの分泌の欠如で特徴付けられている細胞がより好ましい。
本発明の別の態様では、治療用細胞培養物が提供され、当該細胞培養物は、脈管形成刺激栄養因子を必要とする患者を治療する際に用いられる前記のような単離細胞を含む。また、神経増殖刺激栄養因子を必要とする患者を治療する際に用いられるこのような治療用細胞培養物も提供される。
ヒト臍帯組織からＵＤＣを誘導する方法が提供される。これらの細胞は自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する。この方法は、（ａ）ヒト臍帯組織を採取する工程；（ｂ）実質的に全ての血液を除去して、実質的に血液を含まない臍帯組織を得る工程；（ｃ）機械的処理もしくは酵素的処理、またはその双方により組織を解離させる工程；（ｄ）前記組織を培養培地に再懸濁させる工程；および（ｅ）自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有するヒト臍由来細胞の増殖を可能とする増殖条件を提供する工程を含む。
経膣分娩であれ、例えば帝王切開などの他の経路であれ、妊娠満了期、満期妊娠または早産から採取することができる。組織バンクからの組織の採取も、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
これらの組織は、当技術分野で公知のいずれかの手段により、実質的に血液を含まないとされる。例えば、血液は、例えば、吸引または排液により多量の血液を除去する前または除去した後に、洗浄、すすぎ、および希釈などにより物理的に除去することができる。実質的に血液細胞を含まない組織を得る他の手段は、酵素処理または化学処理を含み得る。
臍帯組織の解離は機械的に破壊によるなど、当技術分野で公知の種々の技術のいずれかにより達成することができ、例えば、組織を無菌的にハサミもしくはメスで切断することもできるし、あるいはそうでなければこのような組織を、ヒト組織から無傷なまたは生存力のある細胞を回収するのに適合したいずれかの方法で、細断、ブレンド、摩砕、またはホモジナイズすることもできる。
現在のところ好ましい実施態様では、これらの単離手順において、酵素消化法も用いる。多くの酵素が、培養での増殖を促進するために複雑な組織マトリックスから個々の細胞を単離するのに有用であることが当技術分野で知られている。前述のように、組織からの細胞単離に用いられる広範な消化酵素が当業者に利用可能である。消化力の弱もの（例えば、デオキシリボヌクレアーゼおよび中性プロテアーゼ、ディスパーゼ）から消化力が強いもの（例えば、パパインおよびトリプシン）まであり、このような酵素は市販されている。ここで適合可能な酵素の非網羅的リストには、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼなど）、およびデオキシリボヌクレアーゼが含まれる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよび粘液溶解活性から選択される酵素活性が現在のところ好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から種々の細胞を単離するのに有用であることが知られている。デオキシリボヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集塊の形成を最小とすることができる。酵素は単独で使用しても組み合わせて使用してもよい。セリンプロテアーゼは、使用される他の酵素を分解し得るので、他の酵素の使用後に続けて用いるのが好ましい。温度およびセリンプロテアーゼとの接触時間をモニタリングしなければならない。セリンプロテアーゼは血清中のα２ミクログロブリンで阻害され得るので、消化に用いる媒体は血清を含まないことが好ましい。ＥＤＴＡおよびＤＮアーゼが一般に用いられ、収量または効率を向上させることができる。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼとディスパーゼ、またはコラゲナーゼとディスパーゼとヒアルロニダーゼを用いた酵素処理を含み、このような方法が提供され、ある特定の好ましい実施態様では、コラゲナーゼと中性プロテアーゼであるディスパーゼの混合物が解離工程に使用される。ヒストリチクス菌由来の少なくとも１種類のコラゲナーゼ、およびプロテアーゼ活性、ディスパーゼおよびサーモライシンのいずれかの存在下での消化を用いる方法がより好ましい。コラゲナーゼとディスパーゼ酵素活性の双方による消化を用いる方法がよりいっそう好ましい。また、コラゲナーゼおよびディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性による消化を含む方法も好ましい。当業者ならば、種々の組織供給源から細胞を単離するため、このような多くの酵素処理が当技術分野で知られていることが分かるであろう。例えば、リベラーゼブレンドザイム(LIBERASE Blendzyme)(Roche)系の酵素の組合せが極めて有用であり、本方法で使用可能である。他の酵素供給源も公知であり、当業者ならば、このような酵素もそれらの天然源から直接得ることができる。また、当業者ならば、新たな、または付加的な酵素または酵素の組合せを、本発明の細胞を単離する上でのそれらの有用性に関して十分評価することができる。好ましい酵素処理は、０．５、１、１．５、もしくは２時間、またはそれより長い。他の好ましい実施態様では、組織は解離工程の酵素処理中、３７℃でインキュベートされる。また、細胞が粘稠な消化物内に捕捉されることがあるので、消化物を希釈すると、細胞の収量が向上する場合がある。
酵素活性の使用が現在のところ好ましいが、酵素処理は本明細書で提供される単離方法に必要というわけではない。機械的分離だけに基づく方法で、前述のように臍から完全な細胞を首尾よく単離できる場合もある。
組織が解離された後、これらの細胞は本明細書において前述した培養培地のいずれかに再懸濁させることができる。細胞は、組織または他の残渣から細胞を分離するための遠心分離工程の後に再懸濁させることができる。再懸濁は、機械的に再懸濁させる方法、または単に細胞に培養培地を添加することを含み得る。
増殖条件を提供することで、細胞に対する培養培地、添加物、雰囲気条件、および相対湿度についての幅広い選択肢を見込める。好ましい温度は３７℃であるが、温度は、他の培養条件および細胞または培養物の所望の使用によって約３５℃〜３９℃の範囲であり得る。
増殖培地とともに提供される付加的血清において利用できる以外は、外因性増殖因子の必要のない細胞を提供する方法が現在のところ好ましい。また、本明細書では、特定の増殖因子の不在下で拡大可能な臍帯細胞を誘導する方法も提供される。これらの方法は前記の方法と同様であるが、特定の増殖因子が（細胞が要求しない）、それらの細胞が最終的に再懸濁され、増殖される培養培地に存在しないことを要する。この意味で、この方法は、特定の増殖因子の不在下で***可能な細胞に対して選択性である。いくつかの実施態様では、好ましい細胞は、血清が添加されない化学的に定義された増殖培地で増殖および拡大可能である。このような場合、これらの細胞は、ある特定の増殖因子を必要とし、これらの増殖因子を、細胞を補助および維持するために培地に添加することができる。血清を含まない培地での増殖のために添加される現在のところ好ましい因子は、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＰＤＧＦの１以上を含む。より好ましい実施態様では、これらの因子のうち２つ、３つまたは４つ全てが血清を含まない培地または化学的に定義された培地に添加される。他の実施態様では、細胞の増殖を補助または向上させるために血清を含まない培地にＬＩＦが添加される。
また、細胞が雰囲気中約５％〜約２０％の酸素の存在下で拡大培養可能な方法も提供される。Ｌ−バリンを必要とする細胞を得る方法では、細胞がＬ−バリンの存在下で培養される必要がある。細胞が得られた後、そのＬ−バリン要求性は、Ｌ−異性体を欠くＤ−バリン含有培地で増殖させることにより、試験および確認することができる。
細胞が老化状態に達するまでに少なくとも２５回、３０回、３５回または４０回の倍加を受け得る方法が提供される。１０14細胞またはそれ以上に達するまで倍加可能である細胞を誘導する方法が提供される。培養において約１０3〜約１０6細胞／ｃｍ2で播種された場合に、少なくとも約１０14、１０15、１０16、もしくは１０17またはそれを超える細胞を産生するに十分な倍加が可能である細胞を誘導する方法が提供される。好ましくは、これらの細胞数は、８０、７０、または６０日以内に産生される。
本明細書では、前記の方法により誘導された、単離されたヒト臍由来細胞も提供される。ある特定の実施態様では、これらの細胞は、繰り返し継代培養しても一定の正常な核型を維持する。また、前記の方法により誘導されたヒト臍由来細胞の培養物も提供され、これらの培養物は母体細胞を含まない。本発明方法により得られる治療用培養物が提供される。
本発明の細胞には多くの用途がある。例えば、これらの細胞により分泌される栄養因子のために、それらは、直接的または間接的に他の有用な細胞の増殖、維持、または補助などに有用であり得る。例えば、これらの細胞は、細胞馴化培地を作製するために使用することもできるし、あるいは自己レシピエントにおける治療的使用を意図した、直接的または間接的ex vivo共存培養を含む、別の対象細胞と共存培養することもできる。直接的共存培養では、これらの細胞を一緒に混合すればよく、間接的共存培養では、これらの細胞を、細胞の移動を排除する半透膜によって隔離されたコンパートメント中で培養すればよい。例えば、公称孔径約３μｍ未満のポリカーボネート、ポリエステル（ＰＥＴ）、およびコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン(collagen-coated polytetrafluoroethylene)（ＰＴＦＥ）膜は細胞の移動を排除し、このような目的で有用である。培養系のためのこのような膜は、例えば、臍帯由来細胞と他の細胞種との間で、可溶性増殖因子を交換することができる。例は当技術分野で公知であり、いくつかは市販されている（例えば、トランスウェル培養膜(Corning Inc, Corning NY))。
また、本明細書では、臍由来細胞と別の治療因子、または生物活性薬を含む治療組成物も提供する。このような因子としては、限定されるものではないが、ＩＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ならびに抗血栓薬および抗アポトーシス薬が挙げられる。このような治療組成物は、１以上の付加的細胞種をさらに含むことができる。
本明細書では、前記のものに加え、これらの細胞それ自体に由来する組成物が提供される。細胞溶解物、可溶性細胞画分および膜富化細胞画分は全て本明細書で提供される。細胞溶解物は、これらの細胞の実質的に全て、より好ましくは全てが、例えば、機械的剪断、酵素処理、および界面活性剤もしくは他の化学薬剤処理など、またはそれらの組合せにより溶解されている溶解物を含む。結果として得られる溶解物は、その細胞の全ての成分を含み、例えば本発明の細胞または他の対象細胞の増殖を補助または維持する上で多くの有用性を有する。さらに、細胞溶解物は、所望の細胞産物の精製または富化のための出発材料としても役立ち得る。好ましい実施態様では、細胞溶解物は、少なくとも可溶性細胞画分と膜富化細胞画分にさらに分離される。各々は特定の目的に有用であり得る。例えば、注射による投与などのインビボ(in vivo)使用が意図される場合には、同種異系ＰＢＭＣの刺激を最小化する上で可溶性細胞画分が特に有用であり得る。より詳しくは、可溶性細胞画分は、例えば、同種異系リンパ球、同種異系ＣＤ４+Ｔ細胞、またはさらにはナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の刺激など、有害な免疫反応を刺激するのに必要な抗原を欠いていることが好ましい。これらの細胞に由来する、例えば、基底膜を含む細胞外マトリックスも有用であり、本明細書で提供される。このような細胞外材料は、例えば、脈管形成アッセイなどのインビトロ(in vitro)アッセイに有用である。それらはまた、インビボ(in vivo)において治療計画の一部としても有用であり得る。例えば、細胞外マトリックス化合物は、急性および慢性創傷の治癒に関する適用などの増強および修復、または美容および再建手術における使用が知られている。細胞外マトリックス材料は、コラーゲン様の特性が望ましい場合に有用であることが多い。細胞外マトリックス材料は、弾性または粘度を要する適用に特に有用であるが、この細胞外マトリックスがこれらの属性を提供し得ると考えられるためである。細胞外マトリックスの別の適用は、移植可能な治療デバイスとの組合せである。細胞破壊のための技術は軽度のものから重度のものまであり、当業者ならば、このようにして得られた細胞溶解物の最終使用に基づき、細胞破壊の技術を十分選択することができる。
本発明の組成物はまた、本明細書で提供される細胞馴化培養培地を含む。このような培地は、最初に本発明の細胞または培養物を増殖させるのに用いたものであり、これらの細胞または培養物は増殖中に１以上の有用な産物を培地中に分泌する。これらの新規細胞の細胞馴化培地は、例えば、本発明の細胞および培養物により培地中に分泌された増殖因子または栄養因子を必要とする他の哺乳類細胞の増殖を補助すること、および例えば脈管形成を促進することを含む、多くの目的で有用である。細胞馴化培地は、それらが含む分泌された増殖因子のために有用であり、好ましくは、本発明の細胞馴化培地は、このような増殖因子を必要とする別の哺乳類細胞の増殖を補助するのに有用な１以上の増殖因子を含む。細胞馴化培地の使用は、当業者には十分に理解されている。本明細書では細胞馴化培地を作製するための連続培養系も意図され、本発明の細胞は、増殖因子などの分泌細胞産物の大規模または連続生産に有用である。
好ましくは、本発明の細胞馴化培地は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１のうち１以上を含む。前記のうち数種（例えば、少なくとも２つ、３つまたは４つ）を含む細胞馴化培地がより好ましい。挙げられている増殖因子のうち多く（例えば、少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれを超える）を含むものがよりいっそう好ましい。また、対象とする付加的分泌分子を含む細胞馴化培地も好ましい。
別の実施態様は、細胞馴化培地と、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１を必要とする哺乳類細胞とを含む哺乳類細胞培養物を提供する。細胞馴化培地での培養により、例えば、他の細胞の増殖または維持を補助する間接的方法が提供される。例えば、このような間接的方法は、増殖因子要求のために細胞馴化培地の不在下では拡大培養が困難である哺乳類細胞集団を拡大する方法を提供する。
本発明の別の態様は、臍由来細胞と任意の表現型の別の哺乳類細胞とを含む共存培養物を提供する。これらの共存培養物は、任意の表現型の細胞を含むことができ、例えば、増殖因子要求のために拡大が困難である哺乳類細胞集団を拡大する方法を提供する。これは、他の細胞の増殖を補助するために臍由来細胞の特性を間接的に用いる方法である。このような共存培養物はま、種々の適用、特にこのような細胞の使用が望ましくない免疫応答を生じない場合に、インビボ(in vivo)で使用される。臍由来細胞の存在により、例えば、移植足場中、または外科術修復部位における細胞の定着および増殖が促進され得る。好ましい実施態様では、これらの共存培養物は、臍由来細胞に加えてヒト細胞系統を含む。ドナーの家族またはドナーに近縁の人の細胞を使用するのがよりいっそう好ましい。それらの細胞が誘導された個体において使用するための共存培養物であることがより好ましい。
本発明の他の態様では、これらの培養物の使用が提供される。例えば、臍由来細胞の培養物は、脈管形成の促進に有用である。臍由来細胞の培養物はまた、軟組織の疾病または損傷の治療にも有用である。好ましい実施態様では、治療用細胞培養物は、足場またはマトリックス上で増殖される。足場またはマトリックスまたは同様の支持体上での増殖はインビボ(in vivo)におけるものでも、インビトロ(in vitro)におけるものでも、またはこれらの組合せにおけるものでもよい。インビボ(in vivo)適用では、例えば、軟組織損傷の修復として、この支持体を外科的に適用することができる。この支持体はＵＤＣとともに播種することもできるし、あるいは外科的使用の前に、ＵＤＣ−細胞馴化培地、または細胞溶解物もしくは可溶性細胞抽出物、または細胞外マトリックスを含む他の細胞画分で前処理することもできる。インビトロ(in vitro)適用では、これらの細胞は、支持体上またはその間隙内に他の細胞を定着させる助けをすることができる。例えば、皮膚または真皮の他の軟組織または皮下層を、その後の使用のために、インビトロ(in vitro)においてこのような支持体上で増殖させることができる。組合せ使用では、インビトロ(in vitro)において支持体または足場上に細胞集団を定着させた後、さらなる増殖のために外科的に接着、グラフトまたは移植することができる。ある細胞集団、特に脈管形成因子を分泌するものを予め定着させれば、はるかに速い治癒がもたらされ得る。このような足場(scaffolds)として現在のところ好ましいのは、非永久性、生体吸収性ポリマーマトリックスなどである。
様々な足場またはマトリックスが、例えば組織工学および創傷治癒の分野で知られており、本明細書の細胞および方法を用いる場合に有用である。例としては、限定されるものではないが、マット、発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。好ましいマットは、不織繊維である。不織マットは、例えば、ＶＩＣＲＹＬ(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)の商標で販売されている、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマーからなる繊維を用いて製造することができる。本明細書における使用のために好ましい発泡体としては、例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に開示されている、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含むものなど、多孔質発泡体が挙げられる。自己集合ペプチドおよびそれから形成されたヒドロゲルが当技術分野で公知であり、本明細書で例示されるＲＡＤ１６ヒドロゲルが含まれる。このような材料は、細胞または組織の増殖のための支持体として使用される場合が多い。
本明細書ではまた、限定されるものではないが、骨疾患または損傷の治療、膵臓疾患または損傷の治療、腎臓疾患または損傷の治療、神経疾患または損傷の治療、心疾患または損傷の治療、および肝疾患または損傷の治療における使用を含む、本発明の治療用細胞培養物のさらなる使用が提供される。
別の態様において、本発明は、本発明の細胞を含む移植可能な組織構造、当該細胞を含む移植可能なヒト組織マトリックス、当該細胞を含むヒト組織、およびこれらの細胞を含むヒト器官などの高次構造を提供する。
本発明はまた、別のいくつかの態様において、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する単離されたヒト臍由来細胞を含む注射可能な治療用細胞も提供し、これらの細胞は、混合リンパ球反応において同種異系リンパ球を実質的に刺激せず、ＰＤ−Ｌ２を産生するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＢ７−Ｈ２を産生しない。この注射可能な治療用細胞組成物は、未分化細胞が循環からある部位へ補充され得るいずれの適用においても治療的処置として有用である。好ましい実施態様では、この注射可能な細胞は、組織因子を不活性化するために処理される。このような処理には、細胞の完全性を損なうことなく組織因子を不活性化し得るいずれの処理も含まれる。生存能、倍加時間または拡大に影響を及ぼさない処理がより好ましい。現在のところ好ましいある実施態様においては、注射可能な細胞は、抗組織因子抗体で処理される。
治療用細胞とともに、抗血栓性薬、抗アポトーシス薬、および抗炎症薬などの他の生物学的に活性な分子が有用であり、これらの細胞とともに個々に、または組み合わせて、または２以上の化合物または薬剤と、順次投与することもできるし、あるいはこれらの細胞と同時投与することもできる。例えば、抗アポトーシス薬はプログラムされた細胞死を最小とするために有用であり得る。このような薬剤としては、限定されるものではないが、ＥＰＯ、ＥＰＯ誘導体および類似体、ならびにそれらの塩、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびカスパーゼ阻害剤が挙げられる。抗炎症薬としては、限定されるものではないが、Ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６およびＩＬ−Ｉ阻害剤、ペミロラスト(PEMIROLAST)、トラニラスト(TRANILAST)、レミケード(REMICADE)、シロリムス(Sirolimus)、非ステロイド系抗炎症性化合物、例えば、テポキサリン(TEPOXALIN)、トルメチン、およびスプロフェン(SUPROFEN)が挙げられる。
本発明の治療用細胞と同時投与可能な他の生物活性因子または治療薬としては、例えば、抗血栓因子、免疫抑制または免疫調節薬、および抗酸化薬が挙げられる。免疫抑制および免疫調節薬としては、カルシニュリン阻害剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤（シロリムスまたはエベロリムス(Everolimus)など）；アザチオプリンおよびミコフェノール酸モフェチルなどの抗増殖薬；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン；モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体、バシキリシマブ(Basiliximab)、ダクリズマブ(Daclizumab)などの抗体；抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、およびモノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３などのポリクローナル抗Ｔ細胞抗体が挙げられる。本発明の細胞とともに治療上提供可能な抗血栓化合物としては、例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼおよびＰＰａｃｋ（デキソトロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）；抗トロンビン 化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルディン、プロスタグランジン阻害剤、および血小板阻害剤が挙げられる。抗酸化薬はもちろん当技術分野で周知であり、製薬上許容される抗酸化薬も本発明の細胞とともに投与することができ、これらのものとして、プロブコール；ビタミンＡ、Ｃ、およびＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、または抗酸化薬誘導体、前記のものの類似体または塩が挙げられる。
本発明の別の態様では、臍帯由来細胞の増殖および維持、単離および使用のためのキットが提供される。これらの細胞、細胞溶解物、可溶性細胞画分、膜画分およびマトリックスは、便宜には、例えば、培養または移植のためのキットなど、キットの一部として使用することができる。本発明は、ＵＤＣと、例えば、マトリックス（例えば、足場）材料、水和剤（例えば、生理学上適合する生理食塩水、調製細胞培養培地）、細胞培養支持体（例えば、培養ディッシュ、プレート、バイアルなど）、細胞培養培地（液体であれ、脱水型であれ）、抗生物質化合物、ホルモンなどとともに、これらの細胞または細胞画分の増殖または維持、単離または使用に関する説明書を含む付加的成分とを含むキットを提供する。例えば、増殖用キットは、血清、例えば、ウシ胎児血清をはじめ、本明細書で使用される増殖培地の全ての成分を含み得る。キットはこのような成分のいずれを含んでもよいが、その意図される使用に必要な全成分を含むことが好ましい。所望により、キットはまた、本明細書に記載される格子へ播種することができる細胞（典型的には低温保存されたもの）を含み得る。単離用キットは、例えば、単離時に新鮮なものを、または組織バンクから冷凍したものを得なければならない臍組織を除き、本明細書で提供される単離法を実施するのに必要な全てのものを含む。前記に開示される方法に必要な、または好ましい、バッファーおよび培地、細胞濾過器などのような、組織の解離のための外科用器具、好ましい酵素、または酵素の選択肢が提供される。任意選択の工程および任意選択または代替の材料の供給者一覧を示した詳細な使用説明書も提供されるのが便宜である。例えば、ＡＴＣＣに寄託されたＵＤＣ培養物など、単離された細胞の比較のための対照細胞を含めることもできる。臍由来細胞を用いるキットは好ましくは、前記のように、これらの細胞の集団、またはこれらの細胞、成分および産物、または画分もしくはこれらの細胞に由来する細胞馴化培地を含む治療用組成物を含む。いくつかの実施態様では、これらのキットは、少なくともＵＤＣを含む１以上の細胞集団と製薬上許容される担体（液体、半固体または固体）とを含み得る。いくつかの実施態様では、これらの集団は均質であるか、またはＵＤＣのクローン細胞系統である場合もある。他の実施態様では、これらのキットは、共存培養に用いる他の細胞系統を含む。治療適用キットは、好ましくは、例えば、抗血栓薬、抗炎症薬、抗アポトーシス薬、および免疫抑制または免疫調節化合物など、所望により付加的な生物活性剤を含む。当該キットはまた、所望により、例えば注射などの細胞を投与する手段を含み得る。当該キットはさらに細胞の使用説明書を含んでもよい。軍用など野戦病院向けに製造されるキットは、組織足場、外科用縫合糸などを含む全手順提供を含んでもよく、そこでは、細胞は急性傷害の修復と組み合わせて用いられる。本明細書に記載のようなアッセイおよびインビトロ(in vitro)法向けのキットは、（１）ＵＤＣ、またはＵＤＣの画分、成分もしくは産物、（２）インビトロ（in vitro）法を実施するための試薬、（３）必要であれば、例えば共存培養用の他の細胞または細胞集団、および（４）インビトロ(in vitro)法を行うための説明書のうち１以上を含み得る。
本明細書ではまた、「***遺伝子プロフィール」を含む単離された産褥由来細胞も提供される。***遺伝子がレティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８である細胞が好ましい。好ましい実施態様では、これらの細胞は、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡを含むプロフィールを含む。最も好ましくは、このプロフィールは、それらの細胞が血清含有培地で増殖されるか、血清を含まない培地で増殖されるかによらずに存在する、かつ、全能性または多能性である他の細胞から産褥由来細胞をさらに識別する遺伝子を含む。ある特定の実施態様では、単離された産褥由来細胞はさらに、血清を含まない培地の場合に比べ、血清含有培地で増殖させた場合に、それらの細胞表面マーカーの発現を変化させる能力を含む。これらの単離された産褥由来細胞の他の実施態様では、ＰＤＧＦ受容体αおよびＨＬＡ−ＡＢＣのマーカーが変更される。細胞表面マーカーに関する細胞の可塑性により、ある特定の点に関して、細胞の望ましい特性の全部の利点が提供されるように、また、細胞表面マーカーに関する望ましくない、または有害な特性を最小とするために細胞を操作することが可能となる。これは、有害な免疫反応および拒絶反応が問題となる移植のため、またはグラフトに使用するための細胞を操作または調製する上で特に有用である。
別のいくつかの態様では、本発明は、治療用細胞または培養物を調製する方法において、細胞を単離すること；前記細胞を、まず、前記細胞の拡大培養を補助し、前記細胞が一定量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣを産生する血清含有培地中で有用な数まで拡大培養すること；前記細胞を、低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地に移行すること；および前記細胞を、前記細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地で継代培養することで、治療用細胞または培養物を調製することを含む方法が提供される。ある特定の実施態様では、細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地は、血清を含まない培地である。これは、特に、規制機関が必要とする場合などに、細胞および治療用培養物の製造および商業適用に有用である。このような方法は、移植(implantation or grafting)用の治療用細胞または培養物の産生に有益かつ望ましい。
本発明は、別の態様において、産褥由来細胞の拡大のための血清を含まない培地を提供する。好ましい培地は、１以上の外因性増殖因子が添加されている。１以上の付加的増殖因子がｂＦＧＦ、ＥＧＦ、またはＰＤＧＦである培地が現在のところ好ましい。１以上の付加的増殖因子がｂＦＧＦそれ自体、またはこれらの細胞の増殖のため、または特定の細胞表面マーカーの発現の至適化に有益な他の増殖因子と組み合わせて含む培地がよりいっそう好ましい。
好ましい実施態様では、本発明の血清を含まない培地は、細胞生存力の低下なく、かつ、老化なく、少なくとも５代の間、細胞拡大の補助を提供する。１０代、１５代、２０代またはそれを超える継代培養の間細胞を補助し、これらの集団がなおさらなる継代培養が可能な培地がより好ましい。２５代、２８代、３０代、３３代および３５代またはそれを超える継代培養の間補助する培地がいっそうより好ましい。約４０代以上の継代培養の間細胞を補助し得る培地が最も好ましい。
また、本発明と組み合わせて、血清を含まない培地で拡大された産褥由来細胞を含む治療用培養物も提供される。このような細胞は任意の有用な特性を有し、例えば、外来動物の血清またはタンパク質に関する疾病伝播のリスクの低い商業適用および規制認可に容易に適合する。ある特定の好ましい実施態様では、これらの治療用培養物は、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡが、それらの細胞が血清含有培地で増殖されるか、血清を含まない培地で増殖されるかによらずに存在する***遺伝子プロフィールを有する細胞を含む。このような培養物は単一細胞種を含んでもよいし、あるいは共存培養物または混合培養物中に存在する付加的細胞のように、ＰＰＤＣおよび他の細胞を含む、複数の細胞種からなってもよい。
また、本明細書では、産褥由来細胞と本発明の培養物を含む細胞培養バンクも提供する。
以下の実施例は本発明の実施態様のいくつかの態様を詳細に示す。これらの実施例は、本明細書に記載の本発明の態様をさらに説明することを意図したものであり、そのように例示された態様を限定するものではない。
実施例１
産褥臍組織からの細胞の単離
産褥臍組織は、満期妊娠または早産妊娠のいずれかの出産時に得た。細胞を臍組織の別の５ドナーから採取した。種々の細胞単離法を、１）幹細胞に共通の特徴である、表現型の異なる細胞へ分化する能力、または２）他の細胞および組織に有用な決定的な栄養因子を提供する能力、を有する細胞を得る能力に関して試験した。
方法および材料
臍帯細胞の単離
臍帯はNational Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)から入手した。これらの組織を通常分娩から得られたものであった。細胞単離プロトコールを層流フード内で無菌的に行った。血液および残渣を除去するため、臍帯を、ペニシリン１００単位／ｍＬおよびストレプトマイシン１００ｍｇｓ／ｍＬ、およびアムホテリシンＢ０．２５ｍｇｓ／ｍＬ(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen, Carlsbad, CA）で洗浄した。次に、これらの組織を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート中、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコースまたはＤＭＥＭ−高グルコース；Invitrogen）の存在下で、組織が微細チップ上に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を５０ｍＬのコニカルチューブ（１本当たり組織約５ｇ）を移した。
次に、この組織を、それぞれ１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ、およびアムホテリシンＢ０．２５ｍｇ／ｍＬおよび消化酵素を含有するＤＭＥＭ−低グルコース培地またはＤＭＥＭ高グルコース培地のいずれかの中で消化した。ある実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物を用いた（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、「Ｃ：Ｄ；」コラゲナーゼ(Sigma, St. Louis, MO)５００単位／ｍＬ；およびディスパーゼ(Invitrogen)５０単位／ｍＬ）。また別の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼ（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）の混合物を用いた（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ５０単位／ｍＬ；およびヒアルロニダーゼ(Sigma)５単位／ｍＬ）。この組織と培地と消化酵素を含むコニカルチューブを、３７℃、オービタルシェーカー(Environ, Brooklyn, NY)にて２２５ｒｐｍで２時間インキュベートした。
消化後、組織を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットを、２０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ：低グルコース(Invitrogen)、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；定義済みウシ胎児血清；Ｌｏｔ＃ＡＮＤ１８４７５；Hyclone, Logan, UT）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール(Sigma)、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｍｇｓ／ｍＬ、およびアムホテリシンＢ０．２５ｍｇｓ／ｍＬ；（各々Invitrogen, Carlsbad, CAから）に再懸濁させた。この細胞懸濁液を７０μｍナイロンＢＤ ＦＡＬＣＯＮ細胞濾過器(BD Biosciences, San Jose, CA)で濾過した。増殖培地を含むさらに５ｍＬの洗液も濾過器に通した。次に、この細胞懸濁液を４０μｍナイロン細胞濾過器(BD Biosciences, San Jose, CA)に通し、続けてさらに５ｍＬの増殖培地ですすいだ。
濾液を増殖培地（総量５０ｍＬ）に再懸濁させ、１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を５０ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。この過程をさらに２回繰り返した。
最終の遠心分離後、上清を吸引した、細胞ペレットを５ｍＬの新鮮増殖培地に再懸濁させた。トリパンプルー染色を用い、生細胞数を求めた。その後、標準条件下で細胞を培養した。
臍帯から単離した細胞を、ゼラチンコートＴ−７５フラスコ(Corning Inc., Corning, NY)の、前記のような抗生剤／抗真菌剤を含む増殖培地中に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。２日後、消耗培地と非接着細胞をフラスコから吸引した。接着細胞をＰＢＳで３回洗浄して残渣と血液由来細胞を除去した。次に、細胞を増殖培地に再懸濁させ、密集するまで（０第目から１０日間）増殖させ、継代培養１代目とした。その後の継代培養では（１代目から２代目など）、細胞は４〜５日で密集前（集密度７５〜８５％）に達する。これらのその後の継代培養では、細胞を５０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は、５％二酸化炭素を含む加湿インキュベーター内、３７℃で増殖させた。
リベラーゼブレンドザイムを用いた細胞単離
リベラーゼ（２．５ｍｇ／ｍＬ，ブレンドザイム(Blendzyme)３；Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)とヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ，Sigma）を含むＤＭＥＭ−低グルコース培地中で産褥組織から細胞を単離した。組織の消化および細胞の単離は、Ｃ：ＤまたはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりにリベラーゼ／ヒアルロニダーゼ混合物を用いたこと以外は、上記で他のプロテアーゼ消化に関する記載と同様であった。リベラーゼで組織を消化すると、拡大培養が容易な産褥組織由来の細胞集団が単離された。
他の酵素の組合せを用いた細胞単離
種々の酵素の組合せを用い、臍帯から細胞を単離する手順を比較した。消化に関して比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれた。これらの種々の酵素消化条件を用いたところ、細胞単離の違いが見られた（表１−１）。
臍帯中に残留する血液からの細胞の単離
種々のアプローチにより臍帯から細胞プールするため、他の試みを行った。ある場合には、臍帯をスライスし、増殖培地で洗浄して血餅とゼラチン質を押し出した。この血液とゼラチン質と増殖培地の混合物を回収し、１５０ｘｇで遠心分離した。このペレットを再懸濁させ、ゼラチンコートフラスコの増殖培地中に播種した。これらの実験から、拡大培養の容易な細胞集団が単離された。
臍帯血からの細胞の単離
ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも細胞を単離した。ここで用いた単離プロトコールは、Ｈｏらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２９９７１号のものであった。臍帯血（ＮＤＲＩ，Philadelphia PA）のサンプル（それぞれ５０ｍＬおよび１０．５ｍＬ）を溶解バッファー（濾過除菌１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、ｐＨ７．２に緩衝させた０．１ｍＭ ＥＤＴＡバッファー（全成分ともSigma, St. Louis, MOから））と混合した。細胞を臍帯血：溶解バッファー１：２０の比率で溶解させた。得られた細胞懸濁液を５秒間ボルテックスにかけ、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットを、１０％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan UT)、４ｍＭグルタミン(Mediatech Herndon, VA)、１００単位ペニシリン／１００ｍＬおよび１００ｍｇストレプトマイシン／１００ｍＬ(Gibco, Carlsbad, CA)を含有する完全最小必須培地(Gibco, Carlsbad CA)に再懸濁させた。再懸濁した細胞を遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、上清を吸引し、細胞ペレットを完全培地で洗浄した。細胞をＴ７５フラスコ(Corning, NY)、Ｔ７５ラミニンコートフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（双方ともBecton Dickinson, Bedford, MA）のいずれかに直接播種した。
種々の酵素の組合せと増殖条件を用いた細胞の単離
細胞集団が種々の条件下で単離され、単離直後に種々の条件下で拡大培養されるかどうかを決定するため、前記の手順に従い、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組合せを用い、０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を含むまたは含まない増殖培地中で細胞を消化した。全ての細胞をペニシリン１００単位／ｍＬおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬの存在下で増殖させた。全ての試験条件下で、細胞は継代培養０代目〜１代目の間、よく接着および拡大した（表１−２）。条件５〜８および１３〜１６の細胞は、播種後４代目までよく増殖することが示され、この時点でそれらの細胞を低温保存した。
結果
種々の酵素の組合せを用いた細胞の単離 Ｃ：Ｄ：Ｈの組合せは、単離後に最良の細胞収量をもたらし、他の条件よりも培養でより多い世代拡大される細胞を生じた（表１−１）。コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼ単独を用いても拡大培養可能な細胞集団は得られなかった。この結果が供試したコラーゲンに特異的なものであるかどうかを決定する試みは行わなかった。
Figure 0005340599
種々の酵素の組合せと増殖条件を用いた細胞の単離
酵素消化および増殖を試験した全ての条件下で、細胞は継代培養０〜１代目の間、よく接着および拡大培養された（表１−２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は播種後４代目までよく増殖し、この時点でそれらの細胞を低温保存した。さらなる検討のために全ての細胞を低温保存した。
Figure 0005340599
臍帯の残留血液からの細胞の単離
有核細胞は接着し、急速に増殖した。これらの細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、酵素消化により得られた細胞と同等であった。
臍帯血からの細胞の単離
これらの調製物は赤血球と血小板を含んだ。最初の３週間、接着および***する有核細胞は見られなかった。播種３週間後に培地を交換しても、接着および増殖が見られた細胞はなかった。
要約
酵素組合せコラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用い、臍帯組織から効率的に細胞集団を単離することができる。コラゲナーゼと中性プロテアーゼのブレンドであるリベラーゼも使用可能である。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）とサーモライシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）であるブレンドザイム３も、細胞を単離するため、ヒアルロニダーゼとともに用いた。これらの細胞は、ゼラチンコートプラスチック上の増殖拡大培地で培養したところ、多数回の継代培養で容易に拡大培養された。
また、臍帯の残留血液からも細胞が単離されたが、臍帯血ではなかった。この組織から洗い流した血餅中の、使用した条件下で接着および増殖する細胞の存在は、解剖過程で遊離した細胞によるものである可能性がある。
1. Ｈｏ， Ｔｏｎｙ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ２００３０２５１４９ Ａ２ “ＣＥＬＬ ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＷＨＩＣＨ ＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳ ＣＤ４９Ｃ ＡＮＤ ＣＤ９０” ＮＥＵＲＯＮＹＸ， ＩＮＣ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． USPCT/US2002/029971, Filed 20020920, A2 Published 20030327, A3 Published 20031218
実施例２
臍由来細胞の増殖の特徴
臍由来細胞の細胞拡大培養能を、単離された幹細胞の他の集団と比較した。老化までの細胞拡大培養過程はヘイフリック限界(Hayflick L. The longevity of cultured human cells. J. Am. Geriatr. Soc. 22(1):1〜12, 1974; Hayflick L. The strategy of senescence. Gerontologist 14(1):37〜45), 1974)と呼ばれる。
材料および方法
ゼラチンコーティングフラスコ 組織培養プラスチックフラスコは、２０分間室温でＴ７５フラスコ(Corning社, Corning, NY)に２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（タイプＢ：２２５ Ｂｌｏｏｍ；Sigma, St. Louis, MO）２０ｍＬを添加することによりコーティングした。ゼラチン溶液を除去した後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Invitrogen, Carlsbad, CA)を加え、その後、吸引した。
臍由来細胞と他の細胞集団の拡大培養能の比較
増殖拡大能の比較のため、次の細胞集団を用いた；ｉ）間葉幹細胞（ＭＳＣ；Cambrex, Walkersville, MD）；ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４ Ｂ１号；米国特許出願第ＵＳ２００４００５８４１２号）；ｉｉｉ）正常皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Cambrex, Walkersville, MD）；およびｉｖ）臍由来細胞。細胞をまず、ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。次の継代培養では、細胞培養物を次のように処理した。トリプシン処理後、生細胞をトリパンプルー染色の後に計数した。細胞懸濁液（５０μＬ）をトリパンプルー（５０ｍＬ，Sigma, St. Louis MO）と合わせた。生細胞数は血球計を用いて評価した。
計数後、細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの２５ｍＬ新鮮増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。３７℃の標準大気（５％二酸化炭素（ｖ／ｖ））で細胞を増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換した。細胞が集密度約８５％に達した際に継代培養し、細胞が老化するまでこの過程を繰り返した。
各継代培養時に、細胞をトリプシン処理し、計数した。生細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間／集団倍加）を算出した。至適細胞拡大を決定するため、継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。
低密度での細胞バンクの培養拡大能
継代培養１０代目の時点でバンク保管した細胞の拡大能もまた試験した。種々の条件セットを用いた。正常皮膚繊維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット＃９Ｆ０８４４；Cambrex, Walkersville, MD）、臍由来細胞、および胎盤由来細胞を試験した。これらの細胞集団はそれまでの継代培養１０代目の時点でバンク保管したものであり、５，０００細胞／ｃｍ2で培養され、その点まで各継代培養において増殖させたものであった。解凍した後、継代培養１０代目の細胞集団に対する低密度の効果を調べた。細胞を標準条件下で解凍し、トリパンプルー染色を用いて計数した。次に、解凍した細胞を増殖培地に１，０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は３７℃、標準的大気条件下で増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換した。細胞は集密度約８５％に達した際に継代培養した。その後、細胞を老化するまで、すなわち、それ以上拡大培養できなくなるまで継代培養した。各継代培養時に、細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間／集団倍加）を算出した。継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。
最初の細胞播種から低密度での臍由来細胞の拡大培養
別の実験において、新たに単離した臍由来細胞培養物の培養拡大能を低密度細胞播種条件下で試験した。臍由来細胞はこれまでの実施例に記載のように単離た。細胞を１，０００細胞／ｃｍ2で播種し、老化するまで前記のように継代培養した。細胞は３７℃、標準的大気条件下で増殖させた。増殖培地は１週間に２回交換した。細胞は集密度約８５％に達した際に継代培養した。各継代培養に対し、細胞をトリプシン処理し、トリパンプルー染色により計数した。細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］および倍加時間（培養時間／集団倍加）を算出した。継代培養ごとの全細胞収量を、それまでの継代培養の全収量に各継代培養の拡大倍率を掛けることにより求めた（すなわち、拡大倍率＝最終の細胞／最初の細胞）。細胞を、ゼラチンおよび非ゼラチンコートフラスコで増殖させた。
低酸素培養条件における細胞の拡大培養
低Ｏ2細胞培養条件はある特定の状況で細胞拡大を向上させ得ることが示されている(Csete, Marie; Doyle, John; Wold, Barbara J.; McKay, Ron; Studer, Lorenz. Low Oxygen culturing of central nervous system progenitor cells. US20040005704)。臍由来細胞の細胞拡大が細胞培養条件を変更することによって向上し得るかどうかを調べるため、臍由来細胞の培養物を低酸素条件で増殖させた。細胞を、ゼラチンコートフラスコの増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。まず。細胞を標準的大気条件下で５代まで継代培養し、その時点で低酸素（５％Ｏ2）培養条件に移行した。
他の増殖条件
他の実験において、細胞を、非コート、コラーゲンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコートおよびマトリゲルコートプレート上で拡大培養した。培養物はこれらの異なるマトリックス上で十分拡大培養することが示された。
結果
臍由来細胞と他の細胞集団との培養拡大能の比較
臍由来細胞臍を４０代以上拡大培養すると、６０日で細胞収量は＞１Ｅ１７細胞となった。これに対し、ＭＳＣおよび繊維芽細胞はそれぞれ＜２５日後および＜６０日後に老化した。脂肪由来細胞と大網細胞の双方をほぼ６０日間拡大培養したが、全細胞収量はそれぞれ４．５Ｅ１２と４．２４Ｅ１３であった。従って、用いた実験条件下、５，０００細胞／ｃｍ2で播種すると、臍由来細胞は同じ条件下で増殖した他の細胞種よりもはるかに良好に拡大培養された（表２−１）。
Figure 0005340599
低密度での細胞バンクの培養拡大能
臍由来細胞および繊維芽細胞は１０代以上拡大培養され、６０日で細胞収量は＞１Ｅ１１細胞となった（表２−２）。これらの条件下で繊維芽細胞と臍由来細胞集団の双方は８０日後に老化し、それぞれ＞５０倍および＞４０倍の集団倍加となった。
Figure 0005340599
低酸素培養条件増殖での細胞拡大
細胞は低酸素条件下で十分拡大したが、低酸素条件下での培養は産褥由来細胞の細胞拡大に対しては有意な効果が見られない。これらの結果は、低酸素の効果に関してもたらされる最終的な結論が、最初の単離から低酸素で増殖する細胞に対する実験から最良に引き出されるという点で予備的なものである。標準的大気条件はすでに十分な細胞数を増殖させるのに好結果が得られることが分かっており、低酸素培養は産褥由来細胞の増殖に必ずしも必要でない。
要約
単離された臍由来細胞を標準的大気酸素下、ゼラチンコートまたは非コートフラスコの増殖培地中、約５，０００細胞／ｃｍ2の密度で増殖させることを含む現行の細胞拡大条件は、継代培養１１代目において多数の細胞を形成するに十分である。さらに、このデータは、密度培養条件（例えば、１，０００細胞／ｃｍ2）を用いて容易に拡大培養可能であることを示唆する。低酸素条件での臍由来細胞の拡大培養はまた細胞の拡大培養も促進するが、これらの増殖条件を用いた場合の細胞拡大能の増加向上はまだ認められたことがなかった。現在のところ、大きな細胞プールを形成するには標準的大気条件での臍由来細胞の培養が好ましい。しかしながら、培養条件を変更すれば、臍由来細胞の拡大も同様に変化し得る。この戦略を用い、これらの細胞集団の増殖能および分化能を向上させることができる。
用いた条件下で、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の培養拡大能には限界があるが、臍由来細胞は容易に拡大培養され多数の細胞が得られる。
（参照文献）
Figure 0005340599
実施例３
Ｄ−バリンを含有する培地での臍由来細胞の増殖
通常のＬ−バリンイソ型の代わりにＤ−バリンを含有する培地を用いると、培養繊維芽細胞様細胞の増殖を選択的に阻害できることが報告されている(Hongpaisan, 2000; Sordilloら, 1988)。臍由来細胞がＤ−バリンを含有する培地で増殖可能かどうかを調べるために試験を行った。
方法および材料
臍由来細胞（Ｐ５）および繊維芽細胞（Ｐ９）をゼラチンコートＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)に５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。２４時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄して残留する培地を除去した。この培地を改変増殖培地（Ｄ−バリン（特注品Gibco）、１５％（ｖ／ｖ）透析済みウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール(Sigma)、ペニシリン５０単位／ｍおよびストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍＬ(Gibco)を含むＤＭＥＭ）に交換した。
結果
このＤ−バリン含有培地に播種した臍由来細胞も繊維芽細胞も、透析済み血清を含有する増殖培地に播種した細胞とは違い、増殖しなかった。繊維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが大きくなり、形状も変化した。全ての細胞が死滅し、やがて４週間後、フラスコ表面から剥離した。従って、臍由来細胞は細胞増殖のため、また、長期間生存力を維持するためにＬ−バリンを必要とすると結論付けることができる。
（参照文献）
Figure 0005340599
実施例４
臍由来細胞の核型分析
細胞療法に用いる細胞系統は均質であり、夾雑細胞種を含まないことが好ましい。細胞療法に用いるヒト細胞は、通常の構造を有する通常の染色体数（４６本）を持っていなければならない。均質であり、かつ、非臍組織起源の細胞を含まない臍由来細胞系統を同定するため、細胞サンプルの核型分析を行った。
材料および方法
新生男児の産褥組織由来のＰＰＤＣを増殖培地で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）間の識別が可能となるよう新生男児（Ｘ，Ｙ）由来の産褥組織を選択した。細胞を、Ｔ２５フラスコ(Corning, Corning, NY)の増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播種し、集密度８０％まで拡大培養した。細胞を含むＴ２５フラスコは、頚の部分まで増殖培地で満たされていた。細胞を臨床細胞遺伝学研究所に特別便で配送した（研究所間の推定輸送時間は１時間である）。染色体分析は、Center for Human & Molecular Genetics at the New Jersey Medical School, Newark, NJにより実施された。染色体が最もよく見える***中期中の細胞を分析した。計数した***中期の２０細胞のうち５細胞を正常な均質な核型数（２）であるかどうか分析した。細胞サンプルは、２つの核型が見られた場合に均質と特定した。２を超える核型が見られた場合を不均質と特定した。不均質な核型数（４）が見られた場合には、さらなる***中期細胞を計数し、分析した。
結果
染色体分析に送られた全ての細胞サンプルは、正常な様相を呈していると解釈された。各細胞サンプルは均質であるものと同定された（表４−１）。
Figure 0005340599
要約
染色体分析により臍由来ＰＰＤＣを同定したところ、その核型は臨床細胞遺伝学研究所により解釈されたとろでは正常を呈していた。また、核型分析により、均質な核型により判定されるように、母体細胞由来のものを含まない細胞系統も確認された。
実施例５
ヒト臍由来細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の同定を用い、細胞系統の属性を決定することができる。複数のドナーからの、また、種々の処理および培養条件に曝された細胞における発現の一貫性を判定することができる。臍から単離された産褥由来細胞系統がフローサイトメトリーにより同定され、これらの細胞系統の同定に関するプロフィールが得られた。
材料および方法
培地および培養容器
細胞を、血漿処理したＴ７５、Ｔ１５０、およびＴ２２５組織培養フラスコ(Corning, Corning, NY)での増殖培地で密集するまで培養した。細胞を、。これらのフラスコの増殖面は、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン(Sigma, St. Louis, MO)とともに室温で２０分間インキュベートすることによりゼラチンコートした。
抗体染色
フラスコ内の接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, MO)で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに１×１０7／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。製造業者の使用説明書に従い、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）１００ｍＬの細胞懸濁液に加え、混合物を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して結合していない抗体を除去した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて行った。
細胞表面マーカーに対する抗体
次のような細胞表面マーカーに対する抗体を用いた。
Figure 0005340599
継代培養間の比較
臍由来細胞を継代培養８代目、１５代目および２０代目において分析した。
ドナー間の比較
ドナー間の違いを比較するため、種々のドナーからの臍帯を互いに比較した。
表面コートの比較
ゼラチンコートフラスコで培養した臍由来細胞を、非コートフラスコで培養した臍と比較した。
結果
臍由来細胞の特徴
臍由来細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大により示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現が示された（データは示されていない）。これらの細胞は、ＩｇＧ対照に匹敵する蛍光値により示される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現に関して陰性であった（データは示されていない）。陽性曲線の蛍光値の変動を考慮した。陽性曲線の平均（すなわち、ＣＤ１３）および範囲（すなわち、ＣＤ９０）はいくらかの変動を示したが、これらの曲線は正常であるものと思われ、均質な集団であることが確認された。両曲線ともそれぞれＩｇＧ対照よりも高い値を示した。
継代培養間の比較
フローサイトメトリーにより、継代培養８代目、１５代目、および２０代目における臍帯細胞を分析したところ、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大により示されるように、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であった。陽性曲線の蛍光検出値の変動は予測された範囲内であった。陽性曲線の平均値（すなわち、ＣＤ１３）は変動したが、全ての曲線が個々にＩｇＧ対照よりも大きな値を示した。
ドナー間の比較
フローサイトメトリーにより分析された、個々のドナーから単離された臍由来細胞は各々、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。陽性曲線の蛍光検出値の変動を考慮した。陽性曲線の平均値（すなわち、ＣＤ１０）は変動したが、双方の曲線が個々にＩｇＧ対照よりも大きな値を示した。
ゼラチンによる表面コーティングの効果
ゼラチンおよび非コートフラスコで拡大培養した臍帯細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、全てＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して陽性であり、ＩｇＧ対照よりも高い蛍光値を有していた。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現については陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
要約
フローサイトメトリーによる臍由来産褥細胞の分析により、これらの細胞系統の同定に有用なプロフィールが確認された。臍由来産褥細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃについて陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱについては陰性である。この属性は、ドナー、継代培養、培養容器表面コーティング、ならびに細胞の単離および調製に用いられる消化酵素を含む変数における変動間で一致していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均および範囲にはある程度の変動が見られたが、全ての試験条件下で全ての陽性曲線が正常であり、発現した蛍光値はＩｇＧ対照よりも大きく、従って、これらの細胞はマーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
実施例６
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞の分析
オリゴヌクレオチドアレイを用い、臍由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロフィールを、繊維芽細胞、ヒト間葉幹細胞、およびヒト骨髄由来の別の細胞系統の場合と比較した。この分析により産褥由来細胞の特性決定ができ、これらの細胞に独特な分子マーカーが同定された。
材料および方法
細胞の単離および培養
産褥組織由来細胞
ヒト臍帯および胎盤は、National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)から、患者の同意を得て正常な満期分娩のものを入手した。これらの組織を受け取り、実施例１に記載のように細胞を単離した。細胞を、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコの増殖培地で培養した。これらの培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
繊維芽細胞
ヒト皮膚繊維芽細胞は、Cambrex Incorporated (Walkersville, MD;ロット番号９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。両系統を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清(Hyclone)およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen)を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチックで増殖させた。
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）
ｈＭＳＣは、Cambrex Incorporated (Walkersville, MD；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７)から購入し、製造業者の使用説明書に従い、ＭＳＣＧＭ培地(Cambrex)で培養した。これらの細胞は３７℃、５％ＣＯ2下、標準的な組織培養プラスチックで増殖させた。
ヒト腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞（ＩＣＢＭ）
ヒト腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞は、患者の同意を得てＮＤＲＩから得た。骨髄はＨｏら（ＷＯ０３／０２５１４９）が概略を示した方法に従って処理した。骨髄を溶解バッファー（１５５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ3、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、溶解バッファー２０部に対して骨髄１部の比率で混合した。この細胞懸濁液をボルテックスにかけ、周囲温度で２分間インキュベートし、５００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地−α(Invitrogen)に再懸濁させた。これらの細胞を再び遠心分離し、細胞ペレットを新鮮培地に再懸濁させた。生単核細胞を、トリパンブルー排除(Sigma, St. Louis, MO)を用いて計数した。これらの単核細胞を組織培養プラスチックフラスコに５×１０4細胞／ｃｍ2で播種した。これらの細胞を３７℃、標準的大気Ｏ2または５％Ｏ2のいずれかで５％ＣＯ2下、インキュベートした。細胞を、培地を交換せずに５日間培養した。培養５日後に培地と非接着細胞を除去した。接着細胞を培養維持した。
ｍＲＮＡの単離およびＧＥＮＥＣＨＩＰ分析
活発に増殖する細胞の培養物を、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて細胞スクレーパーを用いてフラスコから取り出した。これらの細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を新鮮なＰＢＳに再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをすぐに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させた。次にｃＤＮＡをｃＲＮＡへと転写させ、ビオチン標識した。このビオチン標識ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ ＨＧ−Ｕ１３３Ａオリゴヌクレオチドアレイ(Affymetrix, Santa Clara CA)とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集は、製造業者の使用説明書に従って行った。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集は、製造業者の使用説明書に従って行った。データ分析は”Significance Analysis of Microarrays”（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウエア(Tusher, V.G.ら, 2001, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 98: 5116-5121)を用いて行った。この分析ソフトウエアのライセンスはthe Office of Technology Licensing, Stanford University から取得でき。さらに詳しくは、the World Wide Webにて、the Dep't of Statistics, Stanford University のTibshirani教授のウェブサイトで得られる。
結果
本試験では、１４の異なる細胞集団を分析した。これらの細胞を、継代培養情報、培養支持体、および培養培地とともに表６−１に挙げる。
Figure 0005340599
このデータを、前記のようなＳＡＭソフトウエアを用い、主成分分析により評価した。分析によれば、これらの供試細胞で種々の相対量で発現された２９０の遺伝子が明らかになった。この分析は集団間の相対的比較を提供した。
表６−２は、細胞対の比較に関して算出されたユークリッド距離を示す。
類似性の相対的比較が可能となる。表９−２は、これらのユークリッド距離は、細胞種間で示差的に発現された２９０の遺伝子に基づく細胞も比較を基にしたものであった。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間の類似性と反比例する。
Figure 0005340599
表６−３、６−４、および６−５は、胎盤由来細胞において増大された遺伝子の発現（６−３）、臍帯由来細胞において増大された遺伝子の発現（表６−４）、および臍帯および胎盤由来細胞において低減された遺伝子の発現（表６−５）を示す。
Figure 0005340599
Figure 0005340599
Figure 0005340599
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表６−６、６−７、および６−８は、ヒト繊維芽細胞（表６−６）、ＩＣＢＭ細胞（表６−７）、およびＭＳＣ（表６−８）において増大されている遺伝子の発現を示す。
Figure 0005340599
Figure 0005340599
Figure 0005340599
要約
本試験は臍帯および胎盤に由来する産褥細胞の分子同定を得るために行った。この分析は３種類の異なる臍帯と３種類の異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この試験はまた、２種類の異なる皮膚繊維芽細胞系統と、３種類の間葉幹細胞系統と、３種類の腸骨稜(iliac crest)骨髄細胞系統も含んだ。これらの細胞によって発現されたｍＲＮＡを、２２，０００遺伝子のプローブを含んだＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにて分析した。
この分析によれば、これら５つの異なる細胞種で２９０の遺伝子の転写物が異なる量で存在することが示された。これらの遺伝子は、胎盤由来細胞で特異的に増大されている１０遺伝子と、臍帯由来細胞で特異的に増大されている７遺伝子を含む。５４遺伝子は、胎盤および臍帯で特異的に低い発現レベルを有することが分かった。
実施例７に示すように、選択された遺伝子の発現をＰＣＲで確認した（以下の実施例を参照）。一般に、産褥由来細胞、特に、臍帯由来細胞は、例えば、本明細書で供試した骨髄由来細胞および繊維芽細胞などの他のヒト細胞と比較して、明瞭な遺伝子発現プロフィールを有する。
実施例７
臍由来細胞の細胞マーカー
ヒト臍帯由来の細胞の遺伝子発現プロフィールを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰを用い、他の供給源に由来する細胞と比較した。６つの「***」遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体 １、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レニン、レティキュロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、および顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）を同定した。これらの「***」遺伝子は臍由来細胞では比較的高レベルで発現した。
本実施例に記載される手順を行い、マイクロアレイデータを立証し、遺伝子とタンパク質発現のデータを比較するとともに、臍由来細胞に独特な識別子の検出のための信頼できる一連のアッセイを確立した。
方法および材料
細胞
臍由来細胞（４つの単離物）、および正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児および成人）をゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で増殖させた。間葉幹細胞（ＭＳＣ）を間葉幹細胞増殖培地ブリットキット（ＭＳＣＧＭ；Cambrex, Walkerville, MD)で増殖させた。
ＩＬ−８プロトコールでは、細胞を液体窒素から解凍し、ゼラチンコートフラスコに５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングし、４８時間、増殖培地で増殖させ、その後、さらに８時間、１０ｍＬの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース(Gibco, Carlsbad, CA)、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）(Gibco)および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma, St. Louis, MO)］で増殖させた。次に、ＲＮＡを抽出し、上清みを１５０ｘｇで５分間遠心分離して細胞残渣を除去した。その後、上清みをＥＬＩＳＡ分析のため−８０℃で冷凍した。
ＥＬＩＳＡアッセイのための細胞培養
ヒト臍帯由来の細胞、ならびにヒト新生児***由来のヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で培養した。継代培養１１代目に液体窒素中で細胞を凍結させた。細胞を解凍し、１５ｍＬ容の遠心管に移した。１５０ｘｇで５分間遠心分離した後、上清みを廃棄した。細胞を４ｍＬの培養培地に再懸濁させ、計数した。細胞を、１５ｍＬの増殖培地が入った７５ｃｍ2フラスコ中、３７５，０００細胞／フラスコで２４時間増殖させた。この培地を血清飢餓培地に８時間交換した。インキュベーション終了時に血清飢餓培地を回収し、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した（−２０℃で保存）。
各フラスコ内の細胞の数を評価するため、２ｍＬのチルプシン(tyrpsin)／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, CA)を各フラスコに加えた。細胞をフラスコから解離させた後、トリプシン活性を８ｍＬの増殖培地で中和した。細胞を１５ｍＬの遠心管に移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上清みを除去し、各管に１ｍＬの増殖培地を加えて細胞を再懸濁させた。細胞数は血球計を用いて評価した。
ＥＬＩＳＡアッセイ
細胞により血清飢餓培地中へ分泌されたＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて分析した。アッセイは全て、製造業者が提供している使用説明書に従って行った。
全ＲＮＡの単離
密集状態の産褥由来細胞および繊維芽細胞から、またはＩＬ−８の発現に関しては前記のように処理した細胞から、ＲＮＡを抽出した。細胞を、β−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を含む３５０μＬのバッファーを用い、製造業者の使用説明書に従って溶解した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Qiagen, Valencia, CA)。ＲＮＡを製造業者の使用説明書に従って抽出し（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Qiagen, Valencia, CA）、ＤＮアーゼ処理（２．７Ｕ／サンプル）(Sigma St. Louis, MO)を施した。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出させ、−８０℃で保存した。また、ヒト臍帯からもＲＮＡを抽出した。組織（３０ｍｇ）を、β−メルカプトエタノールを含むバッファーＲＬＴ ７００μＬに懸濁させた。サンプルを機械的にホモジナイズし、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡ抽出を進めた。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で抽出し、−８０℃で保存した。
逆転写
ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともにランダムヘキサマーを用い、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
ｃＤＮＡマイクロアレイにより産褥細胞において独特な調節を受けていることが確認された遺伝子（***遺伝子−酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レニン(rennin)およびレティキュロン）を、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを用いてさらに調べた。
リアルタイムＰＣＲ
ＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤ(Applied Biosystems)遺伝子発現産物の商標で販売されている遺伝子発現産物を用いｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを行った。酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）；レニン（Ｈｓ００１６６９１５）；レティキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；およびＧＡＰＤＨを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウエア(Applied Biosystems)とともに７０００配列検出系を用い、製造業者の使用説明書に従い(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスと混合した。温度サイクル条件は、まず、５０℃２分および９５℃１０分の後、９５℃１５秒および６０℃１分の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは製造業者の使用説明書に従って分析した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出系の場合は、Applied BiosystemsのUser Bulletin #2）。
従来のＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するため、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００(Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, MA)を用いて従来のＰＣＲを行った。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液、１×Ｔａｑポリメラーゼ（商標ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応バッファー(Applied Biosystems)を用い、初期変性を９４℃５分間として行った。各プライマーセットに関して増幅を至適化した。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレティキュロンでは、９４℃１５秒、５５℃１５秒および７２℃３０秒の３０サイクル）；レニンでは、９４℃１５秒、５３℃１５秒および７２℃３０秒の３８サイクル）；酸化ＬＤＬ受容体およびＧＡＰＤＨでは、９４℃１５秒、５５℃１５秒および７２℃３０秒の３３サイクル。増幅に用いたプライマーは表７−１に一覧化されている。最終的なＰＣＲ反応液のプライマー濃度は１μＭとした（ただし、ＧＡＰＤＨの場合は０．５μＭとした）。ＧＡＰＤＨプライマーでは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブを最終的なＰＣＲ反応液に加えなかったこと以外はリアルタイムＰＣＲの場合と同様であった。サンプルを２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム(Sigma, St. Louis, MO)で染色した。６６７フィルム(Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield, NJ)を用い、固定焦点距離ポラロイドカメラ(VWR International, South Plainfield, NJ)で画像を取り込んだ。
Figure 0005340599
免疫蛍光
細胞を室温にて１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)で固定した。継代培養０代目（Ｐ０）（１単離物、単離後に直接）および継代培養１１代目（Ｐ１１）の臍由来細胞（臍由来細胞単離物２つ）ならびに繊維芽細胞（Ｐ１１）を用いた。免疫組織化学は、次のエピトープ：ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン（(Sigma)１：１５０；；ウサギで作製；または(Chemicon, Temecula)１：３００；, CA；マウスで作製）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Sigma）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。さらに、次のマーカーも１１代目の産褥細胞に対して試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Santa Cruz Biotech）、および抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Santa Cruz Biotech）。
培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma, St. Louis, MO）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。目的のエピトープが細胞表面に存在している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）、エピトープの損失を避けるために、当該手順の全ての工程からトリトン Ｘ−１００を除いた。さらに、一次抗体がヤギに対して作製された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体においてヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液（１番対照）の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
ＦＡＣＳ分析
フラスコに接着している細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, CA)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ｍＬの細胞濃度で再懸濁させた。１００μＬアリコートをコニカルチューブに分注した。細胞内抗原が染色された細胞をＰｅｒｍ／洗浄バッファー(BD Pharmingen, San Diego, CA)で透過性とした。製造業者の使用説明書に従い、アリコートに抗体を加え、これらの細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して余分な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞を１００μＬの３％ＦＢＳに再懸濁させた。二次抗体を製造業者の使用説明書に従って加え、細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して余分な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を０．５ｍＬ ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。次の抗体を使用した：酸化ＬＤＬ受容体 １（ｓｃ−５８１３；Santa Cruz, Biotech）、ＧＲＯａ（５５５０４２；BD Pharmingen, Bedford, MA）、マウスＩｇＧ１カッパ（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Sigma）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Santa Cruz, Biotech）。フローサイトメトリー分析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson San Jose, CA)を用いて行った。
結果
ヒト臍帯、成体および新生児繊維芽細胞および間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来の細胞のｃＤＮＡ に対して行った、選択された「***(signature)」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、他の細胞に比べて臍由来細胞では、レティキュロンおよび酸化ＬＤＬ受容体の双方の発現がより高いレベルであったことを示す。リアルタイムＰＣＲから得られたデータをΔΔＣＴ法（デルタデルタＣＴ法）により分析し、対数スケールで表した。産褥細胞と対照の間では、ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルにおいて有意差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果を従来のＰＣＲにより確認した。さらに、ＰＣＲ産物の配列決定によってもこれらの知見が確認された。表７−１に挙げた従来のＰＣＲ ＣＸＣリガンド３プライマーを用いたところ、産褥細胞と対照の間では、ＣＸＣリガンド３に発現レベルに有意差は見られなかった。
産褥におけるサイトカインＩＬ−８の発現を、増殖培地で培養した産褥由来細胞と血清飢餓状態の産褥由来細胞の双方で評価した。リアルタイムＰＣＲの全データを従来のＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定で確認した。
血清を含まない培地で増殖させた後、その細胞馴化培地をＩＬ−８の存在に関して調べた。臍帯細胞を増殖させた培地では、最高量のＩＬ−８が検出された（表７−２）。ヒト皮膚繊維芽細胞を増殖させた培地では、ＩＬ−８は検出されなかった。
Figure 0005340599
胎盤由来細胞はまた、免疫組織化学分析により、選択されたタンパク質の産生に関しても試験した。単離直後（継代培養０代目）、ヒト胎盤由来細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６種類のタンパク質：フォン・ウィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンに対する抗体に曝した。細胞はα−平滑筋アクチンとビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンは継代培養１１代目まで保持された。継代培養０代目の数細胞だけ（＜５％）がサイトケラチン１８に関して陽性染色された。
継代培養１１代目の臍由来細胞におけるＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬ受容体およびレティキュロンの発現を免疫細胞化学により検討した。
要約 マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイム型および従来型の双方）によって測定された遺伝子発現レベル間の一致が４つの遺伝子：酸化ＬＤＬ受容体１、レニン、レティキュロン、およびＩＬ−８で確立された。これらの遺伝子の発現は、産褥細胞においてｍＲＮＡレベルで調節された。ＩＬ−８はまたタンパク質レベルでも調節された。
継代培養０代目のヒト臍帯由来細胞を、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンの発現に関してプロービングしたところ、双方とも陽性であった。この染色パターンは、継代培養１１代目まで保存されたが、このことは、ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンの発現は、少なくとも用いた増殖培地では、継代培養中、細胞に保存されていることを示唆する。
実施例８
臍帯由来細胞表現型の免疫組織化学的同定
ヒト臍帯組織で見られる細胞の表現型を免疫組織化学により分析した。
材料および方法
組織の調製
ヒト臍帯組織を採取し、４℃にて一晩、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに浸漬固定した。免疫組織化学は、次のエピトープ（表８−１参照）：ビメンチン（１：５００；Sigma, St. Louis, MO）、デスミン(desmin）（１：１５０、ウサギで作製；Sigma；または１：３００、マウスで作製；Chemicon, Temecula, CA）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Sigma）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Sigma）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。さらに、次のマーカーも試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Santa Cruz Biotech）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Santa Cruz Biotech）。固定標本をメスでトリミングし、エタノールを含むドライアイス浴上、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ；Sakura, Torrance, CA）内に入れた。次に、凍結したブロックを標準的なクリオスタット (Leica Microsystems)を用いて切片とし（１０μｍ厚）、染色のためスライドグラスに置いた。
免疫組織化学
免疫組織化学は、従前の研究（例えば、Messinaら，(2003) Exper. Neurol. 184:816〜829）と同様に行った。組織切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、タンパク質を、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に１時間曝した。目的のエピトープ（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）が細胞表面に存在している場合には、エピトープの損失を避けるために、当該手順の全ての工程からトリトンを除いた。さらに、一次抗体がヤギに対して作製された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、手順全体においてヤギ血清の代わりに３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を用いた。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で４時間、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルにより表された。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
Figure 0005340599
結果
臍帯の特性決定
ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、およびＣＤ３４マーカーは臍帯内に見られた細胞のサブセットで発現された。特に、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は臍帯内に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は最内層（管腔側）に存在した。ビメンチンの発現は臍帯のマトリックスおよび血管の全域に見られた。ＳＭＡはマトリックスおよび動脈と静脈の外壁に限定されたが、血管それ自体とともに含まれていた。ＣＫ１８およびデスミンは血管内だけに見られ、デスミンは中層と外層に限定されていた。
要約
ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ウィルブランド因子、およびＣＤ３４はヒト臍帯の細胞で産生される。
実施例９
臍由来細胞による栄養因子の分泌
臍由来ＰＰＤＣからの選択された栄養因子の分泌を測定した。脈管形成活性を有する因子（すなわち、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）(Rosenら(1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26)、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）(Salcedoら(2000) Blood 96;34-40)、インターロイキン−８（ＩＬ−８）(Liら(2003) J. Immunol. 170:3369-76)、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）(Hughesら(2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812-8)、マトリックスメタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ１）、アンギオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α））、神経栄養／神経保護活性を有する因子（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(Chengら(2003) Dev. Biol. 258;319-33)、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２））、またはケモカイン活性を有する因子（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、Ｉ３０９、胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８））を選択した。
方法および材料
細胞培養
臍帯由来のＰＰＤＣならびにヒト新生児***に由来するヒト繊維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で培養した。細胞を継代培養１１代目に低温保存し、液体窒素中で保存した。細胞を解凍した後、それらの細胞に増殖培地を加えた後、１５ｍＬ容の遠沈管に移し、細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを４ｍＬの増殖培地に再懸濁させ、細胞を計数した。細胞を、各１５ｍＬの増殖培地を含有するＴ７５フラスコにつき５，０００細胞で播種し、２４時間培養した。この培地を、血清を含まない培地（ＤＭＥＭ−低グルコース(Gibco)、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン(Sigma)、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ，Gibco））と８時間交換した。インキュベーションの終了時に、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離することにより細胞馴化血清を含まない培地を回収し、−２０℃で保存した。
各フラスコ内の細胞数を評価するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)を用いて解離させた。トリプシン活性を、８ｍＬの増殖培地を加えことで阻害した。細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。上清みを除去し、細胞を１ｍＬの増殖培地に再懸濁させた。細胞数は血球計を用いて評価した。
ＥＬＩＳＡアッセイ
細胞を３７℃、５％二酸化炭素および大気酸素下で増殖させた。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８およびＴＧＦ−β２の量をＥＬＩＳＡアッセイ(R&D Systems, Minneapolis, MN)により測定した。アッセイは全て、製造業者の使用説明書に従って行った。示された値は、ｐｇ／ｍＬ／１０6細胞（ｎ＝２，ｓｅｍ）である。
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ
ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン(Eotaxin)、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および脈管形成因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦを、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔプロテオームアレイ(Pierce Biotechnology Inc.)を用いて測定した。プロテオームアレイは、ウェル当たり２〜１６のタンパク質の定量測定のための多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各アレイに、２×２、３×３、または４×４パターンの４〜１６の異なる捕捉抗体をスポットすることにより作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の後、プレートの各ウェル内の各スポットにおいて生成された化学発光を捕捉するため、プレート全体を画像化する。各スポットにおいて生成されたシグナルの量は、原標品またはサンプル中の標的タンパク質の量に比例する。
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＣＰ−１およびＩＬ−６は、臍由来ＰＰＤＣおよび皮膚繊維芽細胞により分泌された（表９−１）。ＳＤＦ−１およびＧＣＰ−２は繊維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣにより分泌された。ＴＧＦ−β２はＥＬＩＳＡによってはいずれの細胞種からも検出されなかった。
Figure 0005340599
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ
ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８は、臍由来ＰＰＤＣから分泌された（表９−２および表９−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦ−ｂｂは検出されなかった。
Figure 0005340599
Figure 0005340599
要約
臍由来細胞は複数の栄養因子を分泌した。ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８など、これらの栄養因子のうちいくつかは、脈管形成に重要な役割を果たす。ＢＤＮＦおよびＩＬ−６などの他の栄養因子は神経の再生または保護に重要な役割を持つ。
実施例１０
インビトロ(in vitro)免疫学
産褥細胞系統を、存在すれば、これらの細胞がインビトロ(in vivo)移植の際に誘発する免疫応答を推定する試みにおいてそれらの免疫学的特徴に関してインビトロ(in vitro)で評価した。産褥細胞系統を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の存在に関してフローサイトメトリーにより評価した。これらのタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる(Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)。これらの細胞系統をまた、ＨＬＡ−Ｇ(Abbas & Lichtman, 2003, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171）、ＣＤ１７８(Coumansら, (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185〜196)、およびＰＤ−Ｌ２(Abbas & Lichtman, 2003, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171; Brownら (2003) The Journal of Immunology 170, 1257〜1266)の発現に関してもフローサイトメトリーにより分析した。胎盤組織に残留する細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態(immuno-privileged status)を媒介すると考えられる。産褥臍由来細胞系統がインビボ(in vivo)で免疫応答を誘発する程度を推定するため、これらの細胞系統を一元配置混合リンパ球反応(one-way mixed lymphocyte reaction)（ＭＬＲ）で検定した。
材料および方法
細胞培養
細胞を、２％ゼラチン(Sigma, St. Louis, MO)でコートされたＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)の増殖培地で、密集するまで培養した。
抗体染色
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(Gibco, Carlsbad, CA)で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, MO)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。製造業者の使用説明書に従い、１００μＬの細胞懸濁液に抗体（表１０−１）を加え、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して結合していない抗体を除去した。細胞を５００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用い、フローサイトメトリーにより分析した。
Figure 0005340599
混合リンパ球反応
ＣＴＢＲ ＳＯＰ Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いた混合リンパ球反応を行うため、細胞系統「Ａ」と表示される継代培養１０代目の臍由来ＰＰＤＣの低温保存バイアルをドライアイス上でＣＴＢＲ(Senneville, Quebec)に送った。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の男性および女性ボランティアドナーから採取した。６人のヒトボランティアを、他の５人血液ドナーとの混合リンパ球反応において強い増殖応答を示した１人の同種異系ドナーを特定するためにスクリーニングした。このドナーは同種異系陽性対照ドナーとして選択された。刺激側（ドナー）同種異系ＰＢＭＣ、自己ＰＢＭＣ、および産褥細胞系統をマイトマイシンＣで処理した。自己の、マイトマイシンＣで処理した刺激細胞を応答側（レシピエント）ＰＢＭＣに加え、４日間培養した。インキュベーション後、［3Ｈ］−チミジンを各サンプルに加え、１８時間培養した。これらの細胞を採取した後、放射標識されたＤＮＡを抽出し、シンチレーションカウンター(scintillation counter)を用い、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。反応は、ツーセル培養プレートを用いて三反復で行い、プレート当たり３人の受容者とした。
同種異系ドナーに対する刺激指数（ＳＩＡＤ）は、受容側＋マイトマイシンＣで処理した同種異系ドナーの平均増殖を受容側の基本増殖で割って算出した。産褥細胞の刺激指数は、受容側＋マイトマイシンＣで処理した産褥細胞系統の平均増殖を受容側の基本増殖で割って算出した。
結果
混合リンパ球反応−臍由来細胞
結果は以下の表１０−２および表１０−３に示す。平均刺激指数は６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１０−３）。
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臍由来細胞によって産生される抗原提示細胞マーカー フローサイトメトリー分析のヒストグラムは、臍帯細胞は、蛍光値がＩｇＧ対照に匹敵するものであったことから、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の産生に関して陰性であったことを示す。これは、臍帯細胞系統が、ＣＤ４+Ｔ細胞の直接刺激に必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
臍由来細胞における免疫調節細胞マーカー
フローサイトメトリーにより分析された臍帯細胞は、ＩｇＧ対照よりも高い蛍光値により示されるように、ＰＤ−Ｌ２の発現に関して陽性であった。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの発現に関しては陰性であった。
要約 臍帯細胞系統で行った混合リンパ球反応において、平均刺激指数は６．５〜９の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４２．７５〜７０の範囲であった。臍帯細胞系統は、フローサイトメトリーにより測定されたように、検出可能な量の刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２は発現しなかった。臍帯細胞系統はまた、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８を発現しなかったが、ＰＤ−Ｌ２の発現はフローサイトメトリーにより検出された。同種異系ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それにより同種異系リンパ球の刺激が可能である。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の直接刺激に必要な抗原提示細胞表面分子が臍由来細胞上に存在しないこと、ならびに免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２が存在することは、同種異系対照に比べて、ＭＬＲにおいてこれらの細胞により発揮される刺激指数が低いことを説明し得る。
実施例１１
血漿凝固アッセイ
治療に有用な細胞は、それらの細胞が作用部位を標的化することができる、ある特定の適用では、全身注射することが可能である。注射細胞は、致命的となる場合もあるので、血栓を生じないことが重要である。組織因子、膜結合凝血原糖タンパク質は、主要なインビボ（in vivo）の血液凝固経路である外因性の凝固カスケードの開始剤である。組織因子はまた、例えば、基本血管壁の形成などの胚の血管形成に重要な役割を果たす(Brodskyら(2002) Exp. Nephrol. 10:299〜306)。血液凝固を誘発するＰＰＤＣの能力を調べるため、臍由来ＰＰＤＣを組織因子の発現および血漿凝固を誘発する能力に関して評価した。
方法および材料
ヒト組織因子
ヒト組織因子(SIMPLASTIN, Organon Teknika Corporation, Durham, NC)を２０ｍＬの蒸留水で再構成した。この原液を８本の試験管で連続希釈した（１：２）。正常ヒト血漿(George King Bio-Medical, Overland Park, KS)を３７℃の水浴中で解凍した後、使用まで氷中で保存した。１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０μＬの希釈SIMPLASTIN、３０μＬの０．１モル塩化カルシウム、および１００μＬの正常ヒト血漿を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。陰性対照ウェルにはSIMPLASTINを施さなかった。このプレートを即、温度制御マイクロプレートリーダーに入れ、４０秒間隔で３０分間、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
Ｊ−８２細胞および臍由来細胞 Ｊ−８２細胞（ＡＴＣＣ，ＭＤ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ； Hyclone, Logan UT）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Sigma Chemical, St. Louis, MO)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Mediatech Herndon, VA)、１×非必須アミノ酸(Mediatech Herndon, VA)を含有するイスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ； Gibco, Carlsbad, CA）で増殖させた。集密度約７０％時に、細胞を１００，０００、５０，０００および２５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートの各ウェルに移した。臍由来細胞をゼラチンコートＴ７５フラスコ(Corning, Corning, NY)の増殖培地で培養した。継代培養１８代目の臍由来細胞を、５０，０００細胞／ウェルの密度でウェルに移した。１５０ｘｇで５分間遠心分離した後、各ウェルから培養培地を除去した。細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳに懸濁させた。抗組織因子抗体とともにインキュベートした細胞を、３０分間、２０ｍｇ／ｍＬのＣＮＴＯ ８５９(Centocor, Malvern, PA)とともにインキュベートした。各ウェルに塩化カルシウム（３０μＬ）を加えた。このプレートを直ちに温度制御マイクロプレートリーダーに入れ、４０秒間隔で３０分間、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
抗体染色
細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad, MO)で解離させた。細胞を採取し、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ｍＬの細胞密度で再懸濁させた。製造業者の使用説明書に従い、１００μＬの細胞懸濁液に抗体を加えた。これらの細胞を、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１５０ｘｇで５分間遠心分離して結合していない抗体を除去した。細胞を１００μＬの３％ＰＢＳに再懸濁させ、製造業者の使用説明書に従い、二次抗体を添加した。細胞を、暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して結合していない二次抗体を除去した。洗浄した細胞を５００μＬのＰＢＳｊに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて実施した。
結果
フローサイトメトリー分析により、臍由来産褥細胞は、Ｊ−８２細胞よりも血漿凝固を促進する活性が弱いことが明らかになった。血漿凝固アッセイは、臍由来細胞中に存在する組織因子に活性があることを示したが、最大１／２吸光度（Ｔ最大１／２；表１１−１）までの時間が長いことで示されるように、Ｊ−８２の場合よりも血液凝固に時間がかかった。Ｔ最大１／２は、Ｊ−８２細胞数に反比例する。臍由来細胞は、Ｔ最大１／２により示される凝固速度を低下させた。凝固は初期の継代培養細胞（Ｐ５）でも後期の継代培養細胞（Ｐ１８）でも見られた。臍帯細胞を、組織因子の抗体であるＣＮＴＯ８５９とともにプレインキュベーションしたところ、凝固反応が阻害され、組織因子が凝固に関与することが確認された。
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要約
臍由来ＰＰＤＣは数種の組織因子を産生するが、組織因子に対する抗体を添加すると、組織因子の凝固活性を阻害することができる。組織因子は通常、細胞上に不活性なコンフォメーションで見られるが、機械的ストレスまたは化学的ストレス（例えば、ＬＰＳ）によって活性化される(Sakariassenら. (2001) Thromb. Res. 104:149〜74; Engstadら(2002) Int. Immunopharmacol. 2:1585〜97)。よって、ＰＰＤＣの調製工程中のストレスを最小限にすれば、組織因子の活性化を防ぐことができる。血栓形成活性の他、組織因子は脈管形成活性にも関連づけられている。このため、組織因子の活性は、臍由来ＰＰＤＣが組織に移植された場合に有益となり得るが、ＰＰＤＣが静注される場合には阻害しなければならない。
実施例１２
臍由来細胞の移植
産褥臍帯由来の細胞は、再生治療に有用である。臍由来細胞とともに、または伴わずに生分解性材料を移植した後にＳＣＩＤマウスにより産生された組織を評価した。評価した材料は、ＶＮＷ不織足場）、３５／６５ ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、および自己集合ペプチドヒドロゲルであった。
方法および材料
細胞培養
臍由来細胞をゼラチンコートフラスコの増殖培地で増殖させた。
マトリックスの調製
不織足場を下記のような従来の穿刺法を用いて調製した。グリコール酸および乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）からなる繊維をEthicon, Inc. (Somerville, NJ)から入手した。この繊維は約２０μｍ径の微細繊維である。この繊維を実質的に均一な２インチの長さに切断し、２インチのステープル繊維を形成した。このＰＧＡ／ＰＬＡステープル繊維を用いてドライレイ穿刺不織マトリックスを作製した（以下、「ＶＮＷ」）。このステープル繊維は中空で、標準的な不織機で毛羽立てた。得られたマットは、網目状のステープル繊維の形態であった。この網目状のステープル繊維を穿刺して、ドライレイ穿刺不織足場を形成した。この不織足場を水ですすいだ後、さらにエタノール中でインキュベーションして残留化学物質または製造工程中に用いた処理助剤を除去した。
３５／６５ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体は、米国特許第６，３５５，６９９号に記載のように凍結乾燥の工程によって形成された。
自己集合ペプチドヒドロゲル（ＲＡＤ１６自己集合ペプチド(3D Matrics, Cambridge, MA)）を無菌の１％（ｗ／ｖ）水溶液として得た。
サンプルの調製
１×１０6個の生細胞を、直径５ｍｍ、厚さ２．２５ｍｍのＶＮＷ足場（６４．３３ｍｇ／ｃｃ）または直径５ｍｍの３５／６５ ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体ディスク上の１５μＬ増殖培地に播種した。足場を覆うようにさらなる増殖培地を加える前に、細胞を２時間接着させた。細胞を足場上で一晩増殖させた。また、細胞を含まない対照足場も培地中でインキュベートした。
自己集合ペプチド溶液を、使用直前に、ダルベッコの改変培地（ＤＭＥＭ； Gibco）中、１０％（ｗ／ｖ）スクロース(Sigma, St Louis, MO)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ約７）中で１×１０6細胞と１：１混合した。自己集合ペプチドヒドロゲル中の細胞の終濃度は、１×１０6細胞／１００μＬであった。
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動物の準備
本試験に用いた動物は、動物福祉法の現行の要件に従って取扱いおよび維持した。前記公法の応諾は、動物福祉規則（９Ｃ．Ｆ．Ｒ）を遵守し、動物実験に関する指針(The Care and Use of Laboratory Animals)第７版に公布された現行標準に従うことにより遂行した。
動物：雄マウス（Mus musculus）／Fox Chase SCID；Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana)は５週齢のものを用いた。ＳＣＩＤマウスの取扱いは全てフード内で行った。マウスを個々に秤量し、６０ｍｇ／ｋｇ ＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン）(Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa)、１０ｍｇ／ｋｇ ＲＯＭＰＵＮ（キシラジン）(Mobay Corp., Shawnee, Kansas)、および生理食塩水の混合物の腹腔内注射により麻酔した。麻酔誘導後、動物用電気バリカンを用い、背側頸部領域から背側腰仙領域まで動物の背の毛を刈った。次に、これらの領域を二酢酸クロルヘキシジンでこすり洗いし、アルコールですすぎ、乾燥させ、利用可能ヨウ素１％のヨードフォア水溶液を塗布した。麻酔期間中、組織の乾燥を防ぐため、眼には眼用軟膏を塗布した。
皮下移植技術
マウスの背で各約１．０ｃｍ長の４つの皮膚切開部を作った。脊柱の左および右の２つの頭蓋移植部位を、背側部の胸部領域を横断するように、触診した肩胛骨の下端より５ｍｍ尾側に置いた。各々正中の各側のさらなる２つの移植片は、尾の仙腰レベルで臀筋領域を横断するように、触診した腸骨稜より約５ｍｍ尾側に置かれた。移植片をこれらの部位に無作為に置いた。皮膚を下層の結合組織から分離し、小さなポケットを作り、移植片をその切開部の約１ｃｍ尾側に置いた（または自己集合ペプチドの場合には注入した）。適当な供試材料を皮下空間に移植した。皮膚の切開部は金属クリップで閉じた。
動物の飼育
動物は実験過程では個々に小型隔離ケージで、温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で飼育し、（およそ）１２時間明期／１２時間暗期の周期で維持した。食餌はIrradiated Pico Mouse Chow 5058(Purina Co.)からなり、水は自由摂取とした。
マウスを、示された期間に二酸化炭素吸入により安楽死させた。皮下移植片を、覆われている皮膚とともに切り取り、組織学のために凍結させた。
組織学
移植片とともに切り取った皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン(Richard-Allan Kalamazoo, MI)で固定した。サンプルを、覆われている、または隣接する組織とともに中央で二分し、パラフィン処理を施し、常法を用いて切断面に包埋した。包埋組織をミクロトームで切片（５μｍの切片）とし、常法を用い、ヘマトキシリンおよびエオジン(Poly Scientific Bay Shore, NY)で染色した。
結果
３０日後、ＳＣＩＤマウスに皮下移植された、臍由来細胞を含まない対照発泡体には最小の組織内植しか見られなかった。これに対し、臍帯由来細胞とともに移植された発泡体には著しい組織充填が見られた。
ＶＮＷ足場では、ある程度の組織の内植が見られた。臍由来細胞を播種した不織足場は、高いマトリックス接着と成熟血管を示した。
要約
ヒト臍由来細胞は、生分解性足場において質の良い組織形成を劇的に高めることが示された。合成吸収性不織足場、発泡体ディスク（直径５．０ｍｍ×厚さ１．０ｍｍ）、または自己集合ペプチドヒドロゲルにヒト臍帯に由来する細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背棘領域の両側に皮下移植した。これらの臍由来細胞は、臍由来細胞が播種されていない足場の場合に比べ、免疫不全マウスにおいて足場上の、組織内植および血管形成を増強した。
実施例１３
腎小体下の臍由来細胞の移植
腎小体への膵島の移植は、糖尿病の治療のための移植法を評価するために通常実施されている(Refaieら, 1998)。膵島の他、他の細胞も、血糖のホメオスタシスを可能とするインスリン分泌細胞へ分化することができる。この目的で臍由来細胞の妥当性を評価した。
方法および材料
細胞培養
臍由来細胞（１つの単離物，Ｐ１０）を液体窒素保存から取り出し、ゼラチン(Sigma)コートＴ２２５(Corning, Corning, NY)フラスコの増殖培地で増殖させた。
臍由来細胞上の培養培地を、１０ｍＭニコチンアミド(Sigma)、２５ｍＭグルコース(Sigma)、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ(PeproTech, Rocky Hill, NJ)、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ(PeproTech)および１５ｍＭ ＧＬＰ−Ｉ(Sigma)を含有するハムのＦ１２培地(Gibco)に置き換え、細胞をさらに２週間培養した。
２本のフラスコからの細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)を用いて単細胞懸濁液を得た。低温保存ＧＭ−ＣＳＦ可動化ＣＤ３４+細胞は、Cambrex, Walkersville, MD（ロットＩＦ０１７４ドナー７９５６）から購入した。ＣＤ３４+細胞を解凍し、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。
この細胞懸濁液をＤＭＥＭで２回洗浄した。トリパンプルー(Sigma)染色後、血球計を用いて細胞数および生存率を評価した。約３００，０００の生細胞を含む細胞懸濁液のアリコートを１５０ｘｇで遠心分離し、細胞をおよそ６μＬのＤＭＥＭに再懸濁させ、１ｍＬシリンジに接続された２０μＬのピペットチップに吸い取った。これらの細胞を含有するピペットチップのチップをLigaclip(Ethicon Endosurgery, Cincinnati OH)を用いて留めた。
動物の準備
雄マウス（Mus musculus）（Fox Chase SCID；Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana)は８週齢のものを用いた。ＳＣＩＤマウスの取扱いは全てフード内で行った。マウスを個々に秤量し、６０ｍｇ／ｋｇ ＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン、Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa）および１０ｍｇ／ｋｇ ＲＯＭＰＵＮ（キシラジン、Mobay Corp., Shawnee, Kansas）および生理食塩水の混合物の腹腔内注射により麻酔した。麻酔誘導後、動物用電気バリカンを用い、背側頸部領域から背側腰仙領域まで動物の背全体の毛を刈った。次に、これらの領域を二酢酸クロルヘキシジンでこすり洗いし、アルコールですすぎ、乾燥させ、利用可能ヨウ素１％のヨードフォア水溶液を塗布した。麻酔期間中、組織の乾燥を防ぐため、眼には眼用軟膏を塗布した。麻酔し、外科的に準備した動物を所望の横臥位に置いた。動物の胸郭の約２ｃｍ尾側を左腹部を横に切開した。腎臓を露出し、２６ゲージニードルで小体を小片に分けた。小体ランセット（ガラスピペットチップを改良したもの）を用い、細胞が導入される腎小体の直下に空間を作った。細胞を、マイクロピペットチップを取り付けたシリンジで注入した。このポケットを、開口部を（腎臓に触れずに）眼科用焼灼ペンを通すことにより閉じた。腎臓を適切な解剖学的位置に戻し、筋肉層を縫合した。皮膚を創傷クリップで閉じた。
この試験計画は、各マウスにつき１回の細胞移植、各処理につきｎ値４での４回の処置、および３時点（１日目、１４日目および３０日目）からなった。
マウスを示された期間で、二酸化炭素吸入により安楽死させた。腎移植部位を摘出し、組織学のために冷凍した。
免疫組織化学
冷凍した腎移植部位をO.C.T. Compound (Sakura Inc., Torrance, CA)の端に包埋した。腎組織を、移植部位および隣接する組織の５μｍ切片が得られるように低温切片法によりトリミングした。得られた切片を、リン酸緩衝生理食塩水(Gibco)中、新しく調製した４％パラホルムアルデヒド(EM Sciences Gibbstown, NJ)中で１５分間固定した。切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ遮断溶液中３％のヤギ血清中で１時間インキュベートした。穏やかに吸引することで遮断溶液を除去した。切片を、遮断溶液中１：１００希釈した抗ヒト核抗体(Chemicon International, Temecula, CA)中で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、遮断溶液中１：２００希釈した蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体中、遮光下で３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で洗浄し、１０μｍのＤＡＰＩ(Molecular Probes)中で５分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で洗浄し、蛍光顕微鏡により調べた。
三クロム染色
冷凍した腎移植部位をO.C.T. Compound (Sakura Inc., Torrance, CA)の端に包埋した。腎組織を、移植部位および隣接する組織の５μｍ切片が得られるように低温切片法によりトリミングした。得られた切片を１０％中性緩衝ホルマリン(Richard- Allan Scientific)中で１５分間固定した。製造業者の方法を用い、切片を三クロム(Poly Scientific)染色した。
処理：
１．臍帯由来細胞１．３×１０3
２．臍帯由来細胞３×１０3＋ＣＤ３４+細胞３×１０3
さらに３個体の動物を対照とした（細胞を含まない）
結果
臍由来細胞の生存率は約７５％であり、ＣＤ３４+細胞の生存率は９５％であった。１×１０6生細胞を移植する最初の試みは、腎小体が細胞を収容するのに十分な大きさでなかったために上手くいかなかった。トリプシン処理から３時間以内に細胞を移植した。腎小体下の産褥細胞の局在を顕微鏡により観察した。各時点で、ＣＤ３４+細胞を含む場合と含まない場合で臍由来細胞の数および分布に明らかな違いは無かった。細胞数には経時的に明らかな減少が見られた。
腎小体下の細胞の染色は、移植細胞の保持を示した。ヒト細胞は、ヒト核抗原を用いて検出した。全ての細胞（ヒトおよびマウス）を、ＤＡＰＩを用いて検出した。
移植１４日後および３０日後に臍由来細胞を顕微鏡観察した。ヒト細胞はここでもヒト核抗原で染色された。三クロム染色を用い、コラーゲンの存在を検出した。
要約
腎小体への細胞の移植は成功した。この試験で見られた経時的な細胞数の減少は、移植時点での細胞の生存能、生得的免疫、および血管化の問題により栄養素の利用が不十分なことなどのいくつかの要因によるものであり得る。インビボ（in vivo）における細胞の長期生存、さらには増殖は特定の目的には有用であり得るが、多くの適用で使用される細胞には必要でなく、これらの結果は、長期間にわたって生存または増殖する細胞の能力を反映するものでもない。
（参照文献）
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実施例１４
臍由来細胞の短期的神経分化
臍由来細胞（ＰＰＤＣ）の、神経系統細胞へ分化する能力を調べた。
材料および方法
細胞の単離および増殖 実施例１および２で説明したように、臍由来ＰＰＤＣを単離し、拡大培養した。
改変ウッドバリー−ブラック(Woodbury-Black)プロトコール
（Ａ）このアッセイは、元は骨髄間質細胞の神経誘導能を試験するために実施されたアッセイから採用したものであった（１）。臍ＰＰＤＣ（Ｐ４）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、Titretek IIスライドガラス(VWR International, Bristol, CT)のウェルあたり６，０００細胞として播種した。対照として、間葉幹細胞（Ｐ３；１Ｆ２１５５；Cambrex, Walkersville, MD）、骨芽細胞（Ｐ５；ＣＣ２５３８；Cambrex）、大網細胞（Ｐ６）、脂肪由来細胞（ＵＳ６５５５３７４ Ｂ１）（Ｐ６）および新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ６；ＣＣ２５０９；Cambrex）も同じ条件下で播種した。
全ての細胞をまず、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Hyclone, Logan, UT）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, Rocky Hill, NJ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）(Invitrogen)を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)で４日間拡大培養した。４日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Invitrogen）ですすぎ、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン（５０単位／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）(Invitrogen)ペニシリン／ストレプトマイシン中で２４時間培養した。２４時間後、細胞をＰＢＳですすいだ。次に、細胞を、２００ｍＭブチル化ヒドロキシアニソール、１０μＭ塩化カリウム、５ｍｇ／ｍＬインスリン、１０μＭフォルスコリン、４μＭバルプロ酸、および２μＭヒドロコルチゾン（化学薬品は全てSigma, St. Louis, MOから入手）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（血清を含まない）からなる誘導培地中で１〜６時間培養した。その後、細胞を１００％冷（−２０℃）メタノール中で固定し、免疫細胞化学法を行い（下記方法を参照）、ヒトネスチンタンパク質の発現を評価した。
（Ｂ）ＰＰＤＣ（臍、Ｐ１１）および成体ヒト皮膚繊維芽細胞（１Ｆ１８５３，Ｐ１１）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、（Ａ）と同様の密度で、ただし、（１）２４ウェル組織培養処理プレート（ＴＣＰ，Ｆａｌｃｏｎブランド，VWR International）、（２）ＴＣＰウェル＋２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（室温で１時間吸着）、または（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ｍＬの吸着マウスラミニン（３７℃で最低２時間吸着；Invitrogen）に播種した。
前記の（Ａ）と同様に、細胞をまず培養拡大し、培地を前記の時間枠で切り替えた。１つの培養物セットを５日と６時間、室温で１０分間、冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。第２の培養物セットでは、培地を除去し、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント；Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）(Invitrogen)を含有する、Neurobasal-A培地(Invitrogen)からなる神経前駆体拡大培地（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培地にさらにレチノイン酸（ＲＡ；１μＭ；Sigma）を添加した。４日後、この培地を除去し、培養物を室温にて１０分間、冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した（表１４−１参照）。
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二段階分化プロトコール 臍由来ＰＰＤＣ（Ｐ１１）、成体ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１；１Ｆ１８５３；Cambrex）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞／ｃｍ2で、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を添加したＮＰＥ培地の存在下、ラミニン(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)でコーとした２４ウェルプレートに播種した（全培地組成物はＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅとも呼ばれる）。同時に、海馬から単離された成体ラット神経前駆体（Ｐ４；（０６２６０３）を２４ウェルラミニンコートプレートのＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地に培養プレーティングした。全ての培養物をこのような条件下で６日間維持し（この間一度細胞に補給した）、さらに７日間表１４−２に挙げられている分化条件に切り替えた。培養物を室温で１０分間氷冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ヒトまたはラットネスチン、ＧＦＡＰ、およびＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した。
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複数の増殖因子誘導プロトコール 臍由来ＰＰＤＣ（Ｐ１１）を解凍し、密集前（７５％）に達するまで増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下、２４ウェルラミニンコートプレート(BD Biosciences)に２，０００細胞／ｃｍ2で播種した。さらに、いくつかのウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳを含んだ。予備分化の４日後、全ての培地を除去し、サンプルを、ソニック・ヘッジホッグ(Sonic Hedgehog)（ＳＨＨ；２００ｎｇ／ｍＬ；Sigma, St. Louis, MO）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）、ＢＤＮＦ（４０ｎｇ／ｍＬ；Sigma）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Sigma）、およびレチノイン酸（１μＭ；Sigma）を添加したＮＰＥ培地に切り替えた。培地交換から７日後、培養物を室温で１０分間、氷冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ヒトネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１，デスミン、およびα−平滑筋アクチンの発現に関して染色した。
神経前駆体共存培養プロトコール 成体ラット海馬前駆体（０６２６０３）を、ラミニンコート２４ウェルディッシュ(BD Biosciences)のＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中に、ニューロスフェアまたは単細胞（１０，０００細胞／ウェル）としてプレーティングした。
臍由来ＰＰＤＣ（Ｐ１１）を解凍し、４８時間、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋Ｅ（２０ｎｇ／ｍＬ）中、５，０００細胞／ｃｍ2で拡大培養した。次に、細胞をトリプシン処理し、既存の神経前駆体培養物上に２，５００細胞／ウェルで播種した。既存の培地を新鮮培地に交換した。４日後、培養物を室温で１０分間氷冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、ＰＰＤＣを同定するため、ヒト核タンパク質（ｈＮｕｃ；Chemicon）に関して染色した（前記の表１４−１）。
免疫細胞化学
免疫細胞化学法を、表１４−１に挙げられた抗体を用いて行った。培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核の可視化を助けた。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
ウッドバリー−ブラックプロトコール
（Ａ）この神経誘導組成物中でインキュベーションすると、全ての細胞種が双極性の形態と突起の延長を伴う細胞へ形質転換した。他の、より大きな非双極性形態も見られた。さらに、これらの誘導細胞集団は、複能性神経幹細胞および前駆体細胞のマーカーであるネスチンに関して陽性染色された。
（Ｂ）組織培養プラスチック（ＴＣＰ）ディッシュ上で繰り返した場合、培養物表面に予めラミニンを吸着していなければ、ネスチンの発現は見られなかった。ネスチン発現細胞が次に成熟ニューロンの生成へ進むことができるかどうかをさらに評価するため、ＰＰＤＣおよび繊維芽細胞を、神経幹細胞および前駆細胞からこのような細胞への分化を誘導することが知られている培地組成であるＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝した（２、３、４）。細胞を、未熟および成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、および神経前駆体の指標となるマーカーであるネスチンに関して染色した。試験した条件下では、ＴｕＪ１発現は刺激されず、神経形態を有する細胞も見られなかったが、このことは、ニューロンは短期間には形成されなかったことを示唆する。さらに、ラミニンコート支持体上のＰＰＤＣおよび繊維芽細胞で見られたネスチンおよびＧＦＡＰ発現は、これらの条件下では産生されなかった。
二段階分化の結果 臍由来細胞単離物、ならびにヒト繊維芽細胞および齧歯類神経前駆体（それぞれ陰性対照細胞種および陽性対照細胞種としての）をラミニン（神経促進）コートディッシュにプレーティングし、神経前駆体からニューロンおよび星状細胞への分化を促進することが知られている１３の異なる増殖条件（および２つの対照条件）に曝した。さらに、ＰＰＤＣ分化に対するＧＤＦ５およびＢＭＰ７の影響を調べるために２つの条件を加えた。一般に、二段階分化アプローチが採られ、細胞をまず、６日間神経前駆体拡大培養条件に置いた後、７日間完全分化条件に置いた。形態学的には、臍帯細胞は、この手順の経過中、細胞形態に基本的な変化を示した。しかし、対照の神経前駆体プレーティング条件を除いては、神経細胞または星状細胞が見らた場合は無かった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、およびＧＦＡＰについて陰性の免疫細胞化学により形態学的所見が確認された。結果を以下の表１４−３にまとめる。
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複数の増殖因子の誘導結果 様々な神経分化剤に１週間曝した後、細胞を神経前駆体（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪ１）、および星状細胞（ＧＦＡＰ）の指標となるマーカーに関して染色した。第一段階において非血清含有培地で増殖させた細胞は血清含有（２％または１０％）培地の細胞よりも種々の形態を持っていたが、このことは潜在的神経分化を示す。具体的には、臍帯ＰＰＤＣをＥＧＦおよびｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、およびレチノイン酸に曝すという二段階法の後、細胞は、培養星状細胞の形態と類似の突起の長期延長を示した。第一段階の分化に２％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳが含まれた場合、細胞数が増え、細胞形態は高密度対照培養と変わらなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、またはＧＦＡＰに関する免疫細胞化学分析により、潜在的神経分化の証拠は得られなかった。
神経前駆体とＰＰＤＣの共存培養法
２日早く神経拡大培養条件（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に播種したラット神経前駆体の培養物の上に臍由来細胞をプレーティングした。プレーティングした臍細胞の視覚的検査は、これらの細胞が単一細胞としてプレーティングされたことを明らかにしたが、プレーティング４日後（全試験期間６日）のヒト特異的な核染色（ｈＮｕｃ）により、それらはもつれ、神経前駆体との接触を避ける傾向があることが示された。さらに、臍細胞が接着すると、これらの細胞は拡がり、ラット起源のものであった分化ニューロンにより神経支配されることが明らかになったが、このことは臍細胞が筋肉細胞に分化した可能性があることを示唆する。この所見は位相差顕微鏡下の形態に基づくものであった。別の所見として、典型的に大きな細胞体（神経前駆体よりも大きい）は、薄い突起が多方向に拡がっているという神経前駆体に似た形態を持っていた。ＨＮｕｃ染色（細胞核の半分に見られる）は、これらのヒト細胞がラット前駆体と融合し、それらの表現型をとる場合があることを示唆している。神経前駆体のみを含む対照ウェルは前駆体総数が少なく、臍細胞を含むウェルを共存培養した場合よりも明らかに明らかに分化した細胞が見られたが、このことは、臍由来細胞が、ケモカインおよびサイトカインの放出によるか、または接触により媒介される効果により、神経前駆体の分化および挙動に影響を及ぼしたことを示す。
要約 臍由来ＰＰＤＣが神経系統細胞へ分化する短期的能力を調べるため、複数のプロトコールを実施した。これらには、それぞれ複能性神経幹細胞および前駆体細胞、未熟および成熟ニューロン、および星状細胞に関連するタンパク質ネスチン、ＴｕＪ２１、およびＧＦＡＰに関する免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相差画像法を含んだ。これらの短期プロトコールのある場合に、神経分化が見られたことを示す証拠が認められた。
ＰＰＤＣと神経前駆体の共存培養においていくつかの顕著な所見が得られた。異種細胞種とともにヒトＰＰＤＣを用いるこのアプローチにより、これらの培養物中の各細胞の起源の絶対的決定が可能となる。第一に、これらの培養物において、細胞質が拡大し、細胞体から神経突起様の構造が伸びており、さらに細胞体の半分だけがｈＮｕｃタンパク質で染色されたいくつかの細胞を観察した。これらの細胞は、神経系統細胞へ分化したヒトＰＰＤＣであった可能性があるか、またはこれらの細胞はラット起源の神経前駆体と融合したＰＰＤＣであった可能性もある。第二に、神経前駆体がＰＰＤＣに向かって神経突起を伸ばしているのが見られ、これらの神経前駆体がニューロンへ分化し、ＰＰＤＣを神経支配したことを示す。第三に、神経前駆体とＰＰＤＣの培養物はラット起源の細胞が多く、神経前駆体単独の対照培養物よりも分化が多量であるが、このことは、プレーティングされたＰＰＤＣが可溶性因子、および／または神経前駆体の生存、増殖および／または分化を刺激した接触依存性機構を提供したことをさらに示している。
（参照文献）
Figure 0005340599
実施例１５
臍由来細胞の長期神経分化
臍由来細胞が神経系統細胞へと長期的に分化を受ける能力を評価した。
材料および方法
産褥細胞（ＰＰＤＣ）の単離および拡大
臍由来ＰＰＤＣ実施例１および２に記載のように、ＰＰＤＣを単離し、拡大培養した。
臍由来細胞の解凍およびプレーティング
従前に増殖培地で増殖させた臍由来細胞Ｐ１１およびＰ１２の冷凍アリコート（臍（０２２８０３）Ｐ１１；（０４２２０３）Ｐ１１；（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（１０１５０３）Ｐ７）を解凍し、ラミニン(BD, Franklin Lakes, NJ)コートしたＴ−７５フラスコにて、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント，Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬｓ）を含有するNeurobasal-A培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)（これらの組合せを本明細書では神経前駆体拡大（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）中、５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした。ＮＰＥ培地にはさらにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ）を添加した（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと表す）。
対照細胞のプレーティング
さらに、成体ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｐ１１，Cambrex, Walkersville, MD）および間葉幹細胞（Ｐ５，Cambrex）を解凍し、ラミニンコートＴ−７５フラスコのＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、同じ細胞播種密度でプレーティングした。さらなる対照として、繊維芽細胞および臍細胞を全ての培養物に対して特定の期間増殖培地で増殖させた。
細胞の拡大培養
全ての培養物からの培地を１週間に１回新鮮な培地に置き換え、細胞の拡大を観察した。一般に、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦでの増殖には限りがあるので、１か月に１回各培養を継代した。
免疫細胞化学
１か月後、全フラスコを室温で１０分間、冷（４℃）（４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。免疫細胞化学法は、ＴｕＪ１（ΒＩＩＩチューブリン；１：５００；Sigma, St. Louis, MO）およびＧＦＡＰ（膠原繊維酸性タンパク質；１：２０００；DakoCytomation, Carpinteria, CA）に対する抗体を用いて行った。要するに、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともにブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣの増殖を遅くし、形態を変化させる プレーティング直後、臍帯細胞の一部は、ラミニンコートした培養フラスコに接着した。これは凍結／解凍に関する細胞死のため、または新たな増殖条件のためであると考えられた。接着した細胞は増殖条件中に見られるものとは異なる形態をとっていた。
密集した際、培養を継代培養し、増殖を観察した。継代培養で生存した細胞の拡大は極めて小さかった。この時点で、臍帯細胞の培養物では、拡がった形態を持たず、色相の明るい特徴を有する非常に小さな細胞が見られ始めた。このようなフラスコの領域は経時的に増えた。これらの小細胞から、それらの長手方向に沿って結節状構造とともに出現した分岐突起は、従前に記載されている脳および脊髄由来のＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経前駆体およびＴｕＪ１＋未熟ニューロンと極めて類似した特徴を有する（１、２）。時間が経つにつれ、これらの細胞はさらに多くなり、やはりクローンにおいてのみ見られた。
臍帯細胞のクローンは神経タンパク質を発現するが、神経膠タンパク質は発現しない 解凍／プレーティング後１か月で培養物を固定し、神経タンパク質ＴｕＪ１および星状細胞で見られる中間体微細繊維であるＧＦＡＰに関して染色した。増殖培地で増殖させた全ての対照培養物、ならびにＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地で増殖させたヒト繊維芽細胞およびＭＳＣはＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが分かったが、臍帯細胞ではＴｕＪ１に発現は刺激されなかった。神経様形態を持つ細胞でも持たない細胞でも拡大が見られた。いずれの培養物でもＧＦＡＰの発現は見られなかった。神経様形態を持つＴｕＪ１を発現する細胞のパーセンテージは全集団の１％以下であった（ｎ＝供試した臍由来細胞単離物３個）。
要約
臍由来細胞から分化ニューロン（ＴｕＪ１の発現および神経形態学に基づく）を形成する方法が開発された。ＴｕＪ１の発現はインビトロ（in vitro）では１か月より早い時点では調べなかったが、臍由来細胞の少なくとも小さな集団が、誤った分化により、またはＬ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、およびＥＧＦを添加した最小培地に１か月曝した後の長期誘導により、ニューロンを生じ得ることは明らかである。
（参照文献）

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実施例１６
神経前駆体分化の臍帯由来細胞栄養因子
非接触依存性（栄養性）機構による成体神経幹細胞および前駆細胞の生存および分化に対する臍由来産褥細胞（ＰＰＤＣ）の影響を調べた。
材料および方法
成体神経幹細胞および前駆細胞の単離
Fisher 344成体ラットをＣＯ2窒息とその後の頸脱臼により犠牲にした。骨鉗子を用いて全脳を無傷な状態で取り出し、脳の運動および体性感覚領域後方の冠状切開により海馬組織を摘出した（１）。組織を、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント；Invitrogen）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ；Invitrogen）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）(Invitrogen)を含有するNeurobasal-A培地(Invitrogen, Carlsbad, CA) （これらの組合せを本明細書では神経前駆体拡大（ＮＰＥ）培地と呼ぶ）で洗浄した。ＮＰＥ培地にはさらにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ)およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Peprotech, Rocky Hill, NJ)を添加し、これを本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ。
洗浄後、覆われている髄膜を除去し、組織をメスで細断した。細断した組織を集め、トリプシン／ＥＤＴＡ(Invitrogen)を全量の７５％として添加した。ＤＮアーゼ（１００μＬ／全量８ｍＬ，Sigma, St. Louis, MO）も加えた。次に、この組織／培地を１８ゲージニードル、２０ゲージニードル、最後に２５ゲージニードルに各１回順次通した（ニードルは全てBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJから）。この混合物を２５０ｇで３分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを加え、ペレットを再懸濁させた。得られた細胞懸濁液を４０μｍ細胞濾過器(Becton Dickinson)に通し、ラミニンコートＴ−７５フラスコ(Becton Dickinson)または低クラスター２４ウェルプレート(Becton Dickinson)に入れ、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で、概略を示した研究に十分な細胞数が得られるまで増殖させた。
ＰＰＤＣプレーティング
従前に増殖培地で増殖させた産褥由来細胞（Ｐ１２）を５，０００細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレートの大きさ）で入れ、インサート中の増殖培地にて、密集するまで１週間増殖させた。
成体神経前駆体のプレーティング
ニューロスフェアとして、または単細胞として増殖させた神経前駆体を、細胞接着を促進するために１日、ラミニンコート２４ウェルプレートのＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、およそ密度２，０００細胞／ウェルで播種した。１日後、産褥細胞を含むトランスウェルインサートを次のスキームに従って加えた。
（１）トランスウェル（増殖培地２００μＬ中の臍由来細胞）＋神経前駆体（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（２）トランスウェル（成体ヒト皮膚繊維芽細胞［増殖培地２００μＬ中の１Ｆ１８５３；Cambrex, Walkersville, MD］Ｐ１２）＋神経前駆体（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（３）対照：神経前駆体単独（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ，１ｍＬ）
（４）対照：神経前駆体単独（ＮＰＥ単独，１ｍＬ）
免疫細胞化学
共存培養７日後、全ての条件を室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma)で固定した。免疫細胞化学法は、表１６−１に一覧化されているエピトープに対する抗体を用いて行った。要するに、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で１時間、培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）および／またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。全ての場合で陽性染色は、対照染色を超える蛍光シグナルを表し、その場合には、一次抗体溶液の適用を除き、前記で概略を示した全手順を続けた。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
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神経前駆体分化の定量分析
海馬神経前駆体分化を調べ、定量化した。各条件につき最低１０００細胞を計数し、少ない場合には、その条件で見られた細胞の総数とした。所与の染色について陽性の細胞のパーセンテージを、陽性細胞数をＤＡＰＩ（核）染色により判定された細胞総数で割ることにより評価した。
質量分析および２Ｄゲル電気泳動
共存培養の結果としてユニークな分泌因子を同定するため、細胞馴化培地サンプルを採取した後、培養し、固定物を−８０℃で一晩凍結させた。次に、サンプルを限外濾過スピンデバイス（公称カットオフ分子量３０ｋＤ）に適用した。保持液に対して免疫アフィニティークロマトグラフィー（抗Ｈｕ−アルブミン；ＩｇＹ）を行った（免疫アフィニティーはこれらのサンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦで分析した。溶出物をCibachron Blueアフィニティークロマトグラフィーに適用した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２Ｄゲル電気泳動により分析した。
結果
臍帯共存培養は成体神経前駆体分化を刺激する
臍由来産褥細胞とともに培養した後、成体ラット海馬由来の共存培養神経前駆細胞は、中枢神経系の主要な３つの系統全てへ有意な分化を示した。この効果は共存培養５日後に明らかに見られ、多くの細胞が複雑な突起を作り出し、***中の前駆細胞の特徴である色相の明るさが失われていた。ｂＦＧＦおよびＥＧＦの不在下で単独で増殖した神経前駆体は健康さを欠き、生存も限られていた。
この手順が完了した後、培養物を未分化幹細胞および前駆細胞（ネスチン）、未熟および成熟ニューロン（ＴｕＪ１）、星状細胞（ＧＦＡＰ）、および成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の指標となるマーカーに関して染色した。３つ全ての系統への分化が確認されたが、対照条件は、大多数の細胞にネスチン陽性染色が保持されていたことを証拠として、有意な分化を呈していなかった。
臍由来ＰＰＤＣと共存培養した後の、分化した神経前駆体のパーセンテージを定量化した（表１６−２）。臍由来細胞は成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の数を有意に増加させた（両対照条件の０％に対し、２４．０％）。さらに、共存培養は、培養ＧＦＡＰ＋星状細胞およびＴｕＪ１＋ニューロンの数を増加させた（それぞれ４７．２％および８．７％）。これらの結果はネスチン染色により確認されたが、このことは共存培養後に前駆体状態が失われたことを示す（対照条件３の７１．４％に対し、１３．４％）。
分化はまた、成体ヒト繊維芽細胞によっても影響を受けるものと思われたが、このような細胞は成熟乏突起神経膠細胞の分化を促進することはできず、感知できる量のニューロンを生成することもできなかった。しかしながら、定量しなかったものの、臍由来産褥細胞に関する知見と同様に、繊維芽細胞は神経前駆体およびそれらの前駆体の生存を高めるものと思われた。
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ユニークな化合物の同定 臍帯試験条件からの細胞馴化培地と、適当な対照（ＮＰＥ培地±１．７％血清、繊維芽細胞との共存培養からの培地）との違いを検討した。潜在的にユニークな化合物が同定され、個々の２Ｄゲルから切り出された。
要約 本実施例に示されている結果は、臍由来産褥細胞と共存培養した後の成体神経前駆細胞の分化が特に顕著であることを示す。特に、有意なパーセンテージの成熟乏突起神経膠細胞が、臍由来細胞の共存培養において生じた。臍由来細胞と神経前駆体の間には接触が見られないという点で、この結果は臍由来細胞から放出された可溶性因子の働きであるものと思われる（栄養作用）。
他の所見もいくつか得られた。第一に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが除かれた対照条件では極めて少数の細胞しか存在しなかった。ほとんどの細胞が死滅し、平均してウェル当たりに約１００細胞以下しか存在しなかった。第二に、ＥＧＦおよびｂＦＧＦが培地に保持された対照条件では、これは通常、拡大培地であることから、ごく少数の分化しか見られないと予測される。約７０％の細胞がそれらの前駆体状態（ネスチン＋）を保持していることが観察され、約３０％がＧＦＡＰ＋（星状細胞の指標）であった。これは、この手順の過程で見られるこのような有意な拡大が前駆体どうしを接触させ、このような分化を誘導したことによるものである可能性がある。同様の知見が文献（２）でも報告されている。
実施例１６の参照文献
(1) Paxinos, G. & Watsonm C. (1997). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.
(2) Song, H. et al. (2002). Nature. 417(6884): 34-44.
実施例１７
脈管形成に対する栄養因子の効果
脈管形成、すなわち、新血管の形成は新しい組織の増殖に不可欠である。脈管形成の誘導は多くの病態の重要な治療目標である。インビトロ（in vitro）アッセイにおける臍由来細胞の脈管形成活性を調べた。底膜抽出物(Nicosia and Ottinetti (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26(2): 119〜28)をコートした培養プレートに内皮細胞を播種することを含む脈管形成活性を評価する十分確立された方法を用いた。脈管形成因子を含むこのような基底膜または細胞外マトリックス材料上で内皮細胞を処理することは、細胞を、毛細血管と同様のネットワークを形成するよう刺激する。これらの種のアッセイは血管形成の刺激剤および阻害剤を試験するための一般的なインビトロ（in vitro）アッセイである(Itoら(1996) Int. J. Cancer 67(1):148〜52)。本実施例に用いられるプロトコールでは、培養ウェルインサート上に播種された臍由来細胞との共存培養系を使用する。これらの透過性インサートは、内皮細胞培地と臍由来細胞培養培地の間での、培地成分の受動的交換を可能とする。
材料および方法
細胞培養
臍由来細胞
ヒト臍帯を受け取り、従前に記載（実施例１）のように細胞を単離した。細胞を、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコの増殖培地で培養した。これらの培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。実験に用いた細胞は継代培養４代〜１２代の間のものであった。
活発に増殖しているＵＤＣをトリプシン処理し、計数し、６．５ｍｍ径組織培養インサート(COSTAR TRANSWELL, Corning, Corning, NY)上にインサート１つ当たり１５，０００細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ2で、増殖培地中のこのインサート上で、４８〜７２時間細胞を培養した。
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）
ｈＭＳＣは、Cambrex(Walkersville, MD)から購入し、ＭＳＣＧＭ培地(Cambrex)で培養した。これらの培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
活発に増殖しているＭＳＣをトリプシン処理し、計数し、６．５ｍｍ径組織培養インサート(Corning, Corning, NY)上にインサート１つ当たり１５，０００細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ2で、増殖培地中のこのインサート上で、４８〜７２時間細胞を培養した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
ＨＶＥＣはCambrex (Walkersville, MD)から入手した。細胞を、ＥＢＭまたはＥＧＭ内皮細胞培地(Cambrex)のいずれかで個別の培養物として増殖させた。細胞を、標準的な組織培養プラスチック上、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。アッセイに用いた細胞は継代培養４代〜１０代の範囲であった。
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）
ＨＣＡＥＣはCambrex Incorporated (Walkersville, MD)から購入した。これらの細胞はまた、ＥＢＭまたはＥＧＭ培地処方物のいずれかで個別の培養物として維持された。細胞を、標準的な組織培養プラスチック上、３７℃、５％ＣＯ2で増殖させた。実験に用いた細胞は継代培養４代〜８代の範囲であった。
細胞外マトリックス上での脈管形成アッセイ
培養プレートを、製造業者の使用説明書に従い、細胞外マトリックス材料でコートした。要するに、細胞外マトリックス材料(MATRIGEL, BD Discovery Labware, Bedford, MA)を４℃で解凍し、約２５０μＬを、冷却した２４ウェル培養プレート(Corning)の各ウェルに分注した。次に、このプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、材料を固化させた。活発に増殖している内皮細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞を、遠心分離、再懸濁、および上清の吸引により、２％ＦＢＳのみを添加した増殖培地で２回洗浄した。細胞をコート済みウェルに、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳのみを添加した約０．５ｍＬの増殖培地中、ウェル当たり２０，０００細胞として播種した。次に、細胞を約３０分間インキュベートし、細胞を定着させた。
次に、内皮細胞応答の陽性対照とするため、反応内皮細胞培養物を１０ｎＭのヒトｂＦＧＦ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)または１０ｎＭのヒトＶＥＧＦ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)のいずれかで処理した。産褥細胞を播種したトランスウェルインサートを、インサートチャンバー内に、２％ＦＢＳのみを添加した増殖培地とともに適当なウェルに添加した。培養物を３７℃、５％ＣＯ2下で約２４時間インキュベートした。このウェルプレートをインキュベーターから取り出し、内皮細胞培養物の画像をオリンパス倒立顕微鏡(Olympus, Melville, NY)を用いて採取した。
結果
臍由来細胞との共存培養系では、ＨＵＶＥＣは細胞ネットワークを形成する。ＨＵＶＥＣ細胞は、ｈＭＳＣおよび１０ｎＭ ｂＦＧＦとの共存培養実験では限られた細胞ネットワークしか形成しない。いずれの処理も伴わないＨＵＶＥＣ細胞は、極めてわずかなネットワークしか形成しないか、または全く形成しない。これらの結果は、産褥由来細胞が、ＨＵＶＥＣを刺激する脈管形成因子を放出することを示唆する。同様に、ＨＣＡＥＣも、臍由来細胞との共存培養の場合にのみ、細胞ネットワークを形成した。
表１７−１は、大気酸素条件の増殖培地において、ＵＤＣにより放出された既知の脈管形成因子の量を示す。ＵＤＣは前記のようにインサート上に播種された。これらの細胞を３７℃、大気酸素下で４８時間、インサート上で培養し、その後、２％ＦＢＳ培地に切り替え、３７℃で２４時間戻した。培地を除去し、即、凍結させ、−８０℃で保存し、Searchlight多重ＥＬＩＳＡアッセイ(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)により分析した。示されている結果は、２回の測定の平均である。これらの結果は、ＵＤＣが検出可能なレベルの血小板由来増殖因子−ｂｂ（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を放出しないことを示している。検出されたアンギオポエチン２（ＡＮＧ２）の量は、細胞を含まない培養培地対照の場合よりも少なかった。臍由来細胞は、測定可能な量の、メタリノプロテアーゼ−１(metallinoprotease-1)（ＴＩＭＰ−Ｉ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の組織阻害剤を放出した。ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量は極めて少なく、対照培地の場合よりもわずかに多いだけであった。
Figure 0005340599
表１７−２は、５％Ｏ2下でＵＤＣにより放出される既知の脈管形成因子のレベルを示す。ＵＤＣは前記のようにインサート上に播種された。これらの細胞を、５％酸素下で４８時間、インサート上、増殖培地中で培養した後、２％ＦＢＳ培地に切り替え、５％Ｏ2に戻して２４時間インキュベートした。培地を除去し、即、凍結させ、−８０℃で保存し、Searchlight多重ＥＬＩＳＡアッセイ(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)により分析した。示されている結果は、２回の測定の平均である。これらの結果は、ＵＤＣが大気酸素条件下の場合に匹敵することを示す。ＵＤＣによるＡＮＧ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦの産生には本質的な変化はないが、ＴＩＭＰ１、ＫＧＦ、およびＨＧＦの産生には明らかな若干の増加が、また、ＴＰＯの産生には明らかな若干の減少があった。これらの生値における明らかな差は、統計学的有意性に関して検定を行わなかった。
Figure 0005340599
要約
本試験の結果は、臍由来細胞がヒト臍帯静脈および冠動脈双方の内皮細胞を刺激して、脈管形成のインビトロ（in vitro）アッセイにおいてネットワークを形成させ得ることを示す。この効果はこのアッセイ系で既知の脈管形成因子で見られたものと同様である。これらの結果は、ＵＤＣがインビボ（in vivo）の脈管形成の刺激に有用であることを示唆する。
実施例１８
臍由来細胞の肝細胞への分化
臍由来細胞の肝細胞への分化に好適な基本培地と増殖因子の組合せを決定するため、様々な条件を検討した。肝細胞特異的転写因子であるＨＮＦ−１α、上皮細胞のマーカーであるケラチン１９（Ｋ１９）、ケラチン８（Ｋ８）、およびサイトケラチン１８（ＣＫ１８）などの細胞質中間体フィラメントタンパク質、ならびに２つの肝特異的分泌タンパク質であるアルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６を肝細胞分化のマーカーとして選択した(Schwartzら(2002) J. Clin. Invest. 109(10):1291〜1302; Okumotoら(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304(4):691〜695; Chagraouiら(2003) Blood 101(8): 2973〜2982)。
方法および材料
実施例１の方法に従って得た臍由来細胞、ならびに新生児または成体正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で増殖させた。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、オンコスタチンＭ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および繊維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）はPeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ)から入手した。血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦｂｂ）はR&D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。
次の条件を試験した。
方法１
臍由来細胞（Ｐ５）、新生児および成体正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ） 細胞を、血清を含まない培地（１×インスリン／トランスフェリン／セレン、４．７ｍｇ／ｍＬリノール酸、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、１０ｎＭデキサメタゾン、１００μＭリン酸アスコルビン酸（全てSigma）、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン(Gibco)、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ(Hyclone Laboratories, Logan, UT)、および各１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよびＰＤＧＦｂｂを添加した６０％（ｖ／ｖ）低グルコースＤＭＥＭ(DMEM-LG; Gibco, Carlsbad, CA)、４０％（ｖ／ｖ）ＭＣＤＢ−２０１(Sigma, St. Louis, MO)）中、１％マトリゲル(Becton-Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ)上に２２．５×１０3細胞／ｃｍ2でプレーティングした。８〜１２時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ(Gibco)で２回洗浄し、ＥＧＦおよびＰＤＧＦｂｂを含まず、２０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦおよび／または１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−４を添加した前記培地で培養した(Schwartzら(2002) J. Clin. Invest. 109(10):1291〜1302)。
方法２
臍由来細胞（Ｐ５）、新生児および成体ＮＨＤＦ 細胞を、ゼラチンをコートした２４ウェルプレート中、低密度（２２，５００細胞／ｃｍ2）で播種し、前記のように増殖させた。
方法３
臍由来細胞（Ｐ１７）、臍由来細胞（Ｐ１５）、臍由来細胞（Ｐ１０）、成体ＮＨＤＦ 細胞を、２４ウェルＴＣＰプレート中、高密度（５０，０００細胞／ｃｍ2）で播種し、ＤＭＥＭ(Gibco)、Ｂ２７添加物(Gibco)、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦおよび／または１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−４中で増殖させた。細胞をこれらの条件で４週間増殖させた。
方法４
臍由来細胞（Ｐ４）、臍由来細胞（Ｐ９）、新生児および成体ＮＨＤＦ 細胞を、Ｔ２５フラスコのChang C培地(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)中、フィブロネクチン(PeproTech, Rocky Hill, NJ)またはゼラチン(Sigma)のいずれかの上で、５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種し、密集するまで２代増殖させた。次に、細胞を２４ウェルＴＣＰプレートに１，０００細胞／ｃｍ2で播種し、集密度が約４０〜６０％に達するまで前記のように増殖させた。
方法５
臍由来細胞（Ｐ５）および成体ＮＨＤＦ
細胞を、２４ウェルプレートの、１ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬオンコスタチンＭ(Chagraoui (2003) Blood 101(8): 2973〜2982)を添加した増殖培地中、ゼラチン上にプレーティングした。細胞をこれらの条件で４週間増殖させた。
方法６
臍由来細胞（Ｐ５）および成体ＮＨＤＦ
細胞を、２４ウェルプレートの、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦを添加した増殖培地中、ゼラチン上にプレーティングした。細胞をこれらの条件で４週間増殖させた(Okumotoら(2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304(4):691〜695.)。
全ＲＮＡ単離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを、各プロトコールに記載のように臍由来細胞および繊維芽細胞から抽出した。細胞を、製造業者の使用説明書に従い(RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA)、β−メルカプトエタノール(Sigma St. Louis, MO)を含有する３５０μＬのバッファーＲＬＴで溶解し、ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従い(RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA)、２．７単位／サンプルのＤＮアーゼ処理(Sigma)を用いて抽出した。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶離させ、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともにランダムヘキサマーを用い、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
リアルタイムＰＣＲ
ＡＢＩプリズム7000ＳＤＳソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）による7000配列検知システムを用いて、アルブミン（Ｈｓ００６０９４１１）、シトクロムｐ４５０ ２Ｂ６（Ｈｓ００１６７９３７）のAssays-on-Demand遺伝子発現産物、ＧＡＰＤＨ(Applied Biosystems, Foster City, CA)およびＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスを製造業者の使用説明書(Applied Biosystems, Foster City, CA)に従って用い、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを行った。温度サイクル条件は、まず、５０℃２分および９５℃１０分の後、９５℃１５秒および６０℃１分の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは製造業者の使用説明書に従って分析した（ABI Prism 7700配列検出系の場合は、Applied BiosystemsのUser Bulletin #2）。
免疫蛍光
細胞培養物を室温で１０分間、冷（４℃）４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。免疫細胞化学を次のエピトープ：ケラチン９（Ｋ９；１：４００；Chemicon, Temecula, CA）、ケラチン１９（Ｋ１９；１：４００；Chemicon）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma, St. Louis, MO）、ビメンチン（１：５００；Sigma）、デスミン（１：１５０；Sigma）、アルブミン（１：２００；Sigma）、c-met（１：４００；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、およびＨＮＦ−１α（１：４００；Santa Cruz Biotech）に対する抗体を用いて行った。一般に、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原に接近するため、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００，Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に３０分間曝した。目的のエピトープ（例えば、c-met）が細胞表面に存在する場合には、エピトープの損失を避けるために当該手順の全ての工程からトリトンを除いた。次に、遮断溶液に希釈した一次抗体を、室温で１時間、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、Ｋ８、Ｋ１９、ＣＫ１８、ビメンチン、およびアルブミン染色の場合にはヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、デスミンおよびc-met染色の場合にはヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）、またはＨＮＦ−１α染色の場合にはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
臍由来細胞が上皮マーカーを発現するかどうかを判定するため、細胞をChang C培地で培養した。臍由来細胞（Ｐ２）をChang C培地で１１日間増殖させた。臍由来細胞は免疫組織化学分析によれば、サイトケラチン１８およびケラチン８に関して陰性染色であった。増殖培地で増殖させたサンプルは両マーカーに関して陰性であった。
継代培養、ならびにゼラチンおよびフィブロネクチン支持体の効果を調べた。細胞をChang C培地で１１日間増殖させた。上皮／肝細胞特異的タンパク質のＲＮＡおよびタンパク質発現を分析した。サイトケラチン１８、ケラチン８、ケラチン１９、c-met、アルブミン、デスミン、およびＨＮＦ−１αに対する免疫細胞化学染色は全ての条件で陰性であった。細胞はビメンチンに関して陽性染色された。ASSAYS-ON-DEMANDプライマーを用いたところ、ヒトＨｅｐＧ２細胞の場合より低いレベルのアルブミンおよびシトクロム ｐ４５０ ２Ｂ６の両発現が検出された。アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の発現は、増殖培地で増殖させた細胞でも検出された。
臍由来細胞を、Schwartzら(2002) J Clin. Invest. 109(10):1291〜1302により開発さされたプロトコールに従い、方法１に記載のように処理した。アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の双方が、ASSAYS-ON-DEMANDプライマーを用い、ＨｅｐＧ２陽性対照よりも低いレベルで検出された。適用された条件と遺伝子発現レベルの間に明瞭なパターンは現れず、すなわち、アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の発現はそれぞれ対照サンプルにおいても検出された。ASSAYS-ON-DEMANDプライマーを用い、アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の発現がいくらか検出されたが、それらのレベルはＨｅｐＧ２細胞で見られたものよりも有意に低かった。
１ｎｇ／ｍＬという低濃度のオンコスタチンＭは、ゼラチンコートフラスコの増殖培地で増殖させた臍由来細胞において、シトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の発現レベルを上昇させた（データは示されていない）。ＦＧＦ−４およびＨＧＦ処理の効果はほとんどなく、アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６の発現を低下させる場合もあった。
要約 ６つのプロトコールを、臍由来細胞を肝細胞表現型へと分化させる能力に関して試験した。アルブミンおよびシトクロムｐ４５０ ２Ｂ６などの肝細胞特異的マーカーの発現が検出され、それにより、これらの細胞が肝細胞へといくらか分化を受けていることが示唆される。
実施例１９
臍由来細胞の脂肪生成分化
幹細胞の集団が脂肪生成表現型に分化することは立証されている(Janderovaら(2003) Obes. Res. 11(1):65〜74; Zanganiら(1999) Differentiation 64(2):91〜101; Liuら(2003) Curr. Mol. Med. 3(4):325〜40)。臍由来細胞が脂肪生成表現型に分化する可能性を評価した。
方法および材料
脂肪分化 臍由来細胞（Ｐ４）を、増殖培地の入った６ウェル組織培養処理プレートに、２００，０００細胞／ウェルで播種した。間葉幹細胞（Ｐ３，ＩＦ２１５５）、骨芽細胞（Ｐ５，ＣＣ２５３８；Cambrex, Walkerville, MD）、大網細胞（Ｐ６）（実施例１において産褥由来細胞の単離に使用したプロトコールに従って、ＮＤＲＩからの大網組織から単離されたもの）、脂肪由来細胞（ＵＳ６５５５３７４ Ｂ１）（Ｐ６）、および繊維芽細胞（Ｐ６，ＣＣ２５０９）(Cambrex, Walkerville, MD)も同じ条件下で播種した。脂肪生成の開始前に、間葉幹細胞を間葉幹細胞増殖培地ブリットキット(Cambrex, Walkerville, MD)で増殖させた。２日後、使用した培地を吸引除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、培養培地を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ，Hyclone, Logan UT）、０．０２ｍｇインスリン／ｍＬ(Sigma, St. Louis, MO)、および１００単位ペニシリン／ｍＬ、１００ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ、０．２５ｍｇアムホテリシンＢ／ｍＬ；(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含有するダルベッコの最少必須培地−高グルコース（ＤＭＥＭ−Ｈｇ；Invitrogen, Carlsbad, CA）に交換した。一度、細胞が集密に達したら、使用した培地を吸引した。その後、細胞を、１０％特定ウシ胎児血清((v/v), Hyclone, Logan, UT)、０．０２ｍｇ／ｍＬインスリン(Sigma, St. Louis, MO)および１００単位ペニシリン／ｍＬ、１００ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ、０．２５ｍｇアムホテリシンＢ／ｍＬ、５μＭのイソブチルメチルキサンチン(Sigma, St. Louis, MO)、１００μＭのデキサメタゾン(Sigma, St. Louis, MO)、および２．５μＭのインドメタシン(Sigma, St. Louis, MO)を含有する脂肪分化培地（ＤＭＥＭ−Ｈｇ(Invitrogen, Carlsbad, CA)）で最大４週間培養した。細胞をオイルレッドＯで染色して、脂肪滴形成の存在を確認した。
オイルレッドＯ染色
細胞を１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン(Richard-Allan Kalamazoo, MI)で固定した。固定後、細胞を脱イオン水で洗浄し、プロピレングリコール（無水；Poly Scientific, Bay Shore, NY）中で２分間インキュベートした。プロピレングリコールを吸引除去し、サンプルをオイルレッドＯ(Poly Scientific)中で１時間インキュベートした。染色液を吸引除去し、その後、染色されたサンプルを８５％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール溶液(Poly Scientific)中で１分間インキュベートした。染色されたサンプルを、２回脱イオン水を替えて洗浄した。染色されたサンプルをMayerのヘマトキシリン(Poly Scientific)で対比染色し、光学顕微鏡を用いて観察した。画像は倍率２０×で撮影した。
レプチンアッセイ
脂肪由来細胞および臍由来細胞を、６ウェル組織培養処理プレートに２００，０００細胞／ウェルで播種した。最初、細胞を増殖培地に播種し、その増殖培地を、１μＭのデキサメタゾン(Sigma, St. Louis, MO)、０．２ｍＭのインドメタゾン(indomethasone)(Sigma)、０．０１ｍｇ／ｍＬインスリン(Sigma)、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン(Sigma)、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３；Hyclone, Logan, UT）、１００単位ペニシリン／ｍＬおよび１００ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ(Gibco)を含有する脂肪生成分化培地（ＤＭＥＭ−Ｈｇ培地；Invitrogen, Carlsbad, CA）に変更した。アッセイ終了時に、細胞馴化培地を集め、レプチンレベルを、ＥＬＩＳＡキット(Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて測定した。
結果
脂肪分化
形態学的には、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞は、このアッセイで早くも５日で脂肪形成を示した。これらの培養物では培養１５日までに大量の脂肪滴形成が観察された。骨芽細胞の培養物でもこれらの条件下で培養の１０日後、広くは、第１５日目に大量の脂質が沈積した。臍由来細胞および大網細胞培養物では脂肪滴形成が培養の１５日後に観察された。繊維芽細胞培養物では脂肪生成誘導条件で低レベルの脂肪滴形成が２０日後に観察された。
レプチン 臍由来細胞馴化培地ではレプチンはＥＬＩＳＡにより検出されなかった。
要約 臍由来細胞では、用いた脂肪生成分化プロトコールに従うＥＬＩＳＡによりレプチンは検出されなかったが、データは、臍由来細胞が、間葉幹細胞、脂肪由来細胞、または骨芽細胞の培養物と比べて、脂肪細胞表現型への低レベルの分化を受けるということをはっきりと示している。
実施例２０
β細胞表現型への分化
膵臓は内分泌細胞を含み、それらの内分泌細胞によりランゲルハンス島が構成されており、ランゲルハンス島でインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）が産生される。臍由来細胞の、インスリン産生表現型を有する細胞へと分化する能力を８つの異なる誘導プロトコールに従って試験した。
方法および材料
ゼラチンコートＴ７５フラスコの増殖培地で、異なるβ細胞分化促進条件で増殖させた臍由来細胞（様々な単離物下記参照）、ならびに新生児または成体正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）。フラスコを２％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液(Sigma, St. Louis, MO)で室温で２０分間コーティングした。ゼラチン溶液を吸引除去し、フラスコをＰＢＳで洗浄した。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）および繊維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）はPeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ)から購入した。ＧＬＰ−ＩはSigma(St. Louis, MO)から購入した。
次のプロトコールを検証した：
プロトコール１：
細胞：脂肪由来細胞（ＵＳ ６，５５５，３７４）および大網由来細胞、臍由来細胞、（Ｐ１５）、（Ｐ１７）、（Ｐ３）、および成体正常ヒト表皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）（Ｐ１０）を用いた。細胞は、通常または５％Ｏ2条件のいずれかで維持した。細胞をゼラチンコートＴ７５フラスコのゼラチン上に低密度（５，０００細胞／ｃｍ2）で播種し、集密までハムのＦ１２培地(Clonetics, Santa Rosa, CA)、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで増殖させた。密集細胞をトリプシン処理し、ゼラチンまたはコラーゲンコーティングを施したまたは施していない２４ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ；BD Biosciences, Bedford, MA）プレートに、５０，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした。細胞をハムのＦ１２培地、２％ＦＢＳ、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦおよび１５ｎＭのＧＬＰ−１（７−３７ イソ型）で最大３週間増殖させた。
プロトコール２：
細胞：臍由来細胞、単離物２（Ｐ１７）、単離物１（Ｐ１５）、単離物４（Ｐ１０）および成体ＮＨＤＦ Ｐ１０を用いた。細胞を２４ウェルＴＣＰプレートに５０，０００細胞／ｃｍ2で播種し、ＤＭＥＭ：ハムのＦ１２（１：１）培地、Ｂ−２７サプリメント(Gibco, Carlsbad, CA)、５０単位のペニシリン／ｍＬ、５０ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで増殖させ、球状クラスターを生成させた通常４〜６日。その期間後、その球状クラスターを集め、遠心分離し、ラミニンコート２４ウェルプレート(BD Biosciences, Bedford, MA)に再度プレーティングし、１０ｎＭのＧＬＰ−１（７−３７）を含有しているが、他の増殖因子を含有しない（すなわち、ｂＦＧＦもＥＧＦも含有しない）Ｂ−２７添加培地で最大３週間培養した。
プロトコール３：
細胞：臍由来細胞、単離物２（Ｐ１７）、単離物１（Ｐ１５）、単離物４（Ｐ１０）、および成体ＮＨＤＦ（Ｐ１０）を用いた。細胞を２４ウェルＴＣＰＳプレートに高密度（５０，０００細胞／ｃｍ2）で播種し、ＤＭＥＭ：ハムのＦ１２（１：１）培地、Ｂ−２７サプリメント、Ｐ／Ｓ、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで増殖させ、球状クラスターを生成させた−通常４〜６日。その期間後、その球状クラスターを集め、遠心分離し、ラミニンコート２４ウェルプレートに再度プレーティングし、１０ｎＭのＧＬＰ−１（１−３７ イソ型）を含有しているが、他の増殖因子を含有しない（すなわち、ｂＦＧＦもＥＧＦも含有しない）Ｂ−２７添加培地で最大３週間培養した。
プロトコール４：
細胞：成体ＮＨＤＦ（Ｐ１５）、臍由来の、単離物１（Ｐ１８）、単離物２（Ｐ２１）、単離物３（Ｐ５）、単離物３（Ｐ４）は、Mitchellらによる方法（２）に従って単離された。細胞を２４ウェルＴＣＰＳゼラチンコートプレートに５０，０００細胞／ｃｍ2で播種し、ＤＭＥＭ：ハムのＦ１２（１：１）培地、Ｂ−２７サプリメント、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−１０、および／または４０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦαで２週間より長く増殖させた。
プロトコール５：
細胞：成体ＮＨＤＦ、臍由来の、単離物１（Ｐ１８）、単離物２（Ｐ２１）、単離物３（Ｐ５）、単離物３（Ｐ４）は、Mitchellらによる方法（２）に従って単離された。細胞を２４ウェルＴＣＰＳゼラチンコートプレートに５０，０００細胞／ｃｍ2で播種し、ＥＢＭ−２培地、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−１０、および／または４０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦαで２週間より長く増殖させた。
プロトコール６：
細胞：臍由来の、単離物３（Ｐ２）を用いた。細胞をＴ７５フラスコのゼラチン上に５，０００細胞／ｃｍ2で播種し、増殖培地、またはハムのＦ１２培地、２％ＦＢＳ、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦのいずれかで集密まで増殖させた。密集細胞をトリプシン処理し、ゼラチンコーティングを施したまたは施していない２４ウェルＴＣＰＳプレートに５０，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングした。３種類の基本培地を最大３週間使用した：
βＩ培地：ハムのＦ１２培地、２％ＦＢＳ、１０ｍＭのニコチンアミド、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、２５ｍＭのグルコース；
βII培地：等量のＤＭＥＭ／ハムのＦ１２培地、２％ＦＢＳ、１０ｍＭのニコチンアミド、２５ｍＭのグルコース；および
内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ）、(Clonetics, Santa Rosa, CA)。
次の増殖因子を各培地に加えた：１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１０ｎＭのＧＬＰ−Ｉ（７−３７ イソ型）。
全ＲＮＡ単離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ 各プロトコールに記載のとおりに増殖させた臍由来細胞および繊維芽細胞から、ＲＮＡを抽出した。細胞を、β−メルカプトエタノール(Sigma, St. Louis, MO)を含む３５０μＬのバッファーＲＬＴを用い、製造業者の使用説明書に従って溶解し（RNeasy Mini kit，Qiagen, Valencia, CA）、ＲＮＡを製造業者の使用説明書に従って抽出し（RNeasy Mini Kit；Qiagen, Valencia, CA）、ＤＮアーゼ処理（２．７Ｕ／サンプル）(Sigma St. Louis, MO)を施した。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出させ、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともにランダムヘキサマーを用い、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
リアルタイムＰＣＲ
ASSAYS-ON-DEMAND遺伝子発現産物、ＰＤＸ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、プロインスリン（Ｈｓ００３５５７７３）、Ｎｇｎ−３（Ｈｓ００３６０７００）およびＧｌｕｔ−２（Ｈｓ００１６５７７５）、ＧＡＰＤＨ(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ならびにＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスを用い、ABI Prism 7000 ＳＤＳソフトウエア(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともに７０００配列検出系を用い、製造業者の使用説明書に従い(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを行った。温度サイクル条件は、まず、５０℃２分および９５℃１０分の後、９５℃１５秒および６０℃１分の４０サイクルとした。さらに、ＰＤＸ−１およびＮｇｎ−３について社内で設計された別のプライマーセットを試験した。表２０−１では、プライマー配列を示している。これらのプライマーを用いたＰＣＲは、前記のように行った。膵臓全ＲＮＡ(Ambion, Austin, TX)を対照として使用した。ＰＣＲデータはApplied Biosystems推奨のΔΔＣＴ法に従って分析した（１）。
Figure 0005340599
免疫蛍光
成体ヒト膵臓組織を摘出し、４℃にて一晩、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド(Sigma, St. Louis, MO)で浸漬固定した。免疫組織化学は、次のエピトープ：インスリン（インスリン血清；１：５０；LINCO Research, St. Charles, MO）、ＰＤＸ−１（１：５０；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）、グルカゴン（１：１００；Santa Cruz Biotech）、ソマトスタチン（１：１００；DAKOCytomation, Carpinteria, CA）、およびサイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Sigma, St. Louis, MO）に対する抗体を用いて行った。要するに、固定標本をメスで遮断し、エタノールを含むドライアイス浴上、ＯＣＴ包理化合物（Tissue-Tek OCT；Sakura, Torrance, CA）内に入れた。次に、凍結したブロックを標準的なクリオスタット(Leica Microsystems)を用いて切片とし（１０μｍ厚）、染色のためスライドグラスに置いた。
組織切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清(Chemicon, Temecula, CA)、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトン Ｘ−１００；Sigma）を含有するタンパク質遮断溶液に１時間曝した。遮断溶液に希釈した一次抗体を、次に、室温で４時間、これらのサンプルに適用した。一次抗体溶液を除去し、サンプルをＰＢＳで洗浄した後、ＣＫｌ８に対するヤギ抗マウスＩｇＧ−テキサスレッド（１：２５０；Molecular Probes, Eugene, OR）、グルカゴンおよびソマトスタチンに対するヤギ抗ウサギＩｇＧ−アレキサ(Alexa)４８８（１：２５０；Molecular Probes）、インスリンに対するヤギ抗モルモットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）、またはＰＤＸ−１染色に対するロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Santa Cruz Biotech）とともに遮断溶液を含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。その後、サンプルを洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ(Molecular Probes)を１０分間適用し、細胞核を可視化した。
免疫染色後、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡(Olympus, Melville, NY)にて、適当な蛍光フィルターを用い、蛍光を可視化した。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラとイメージプロ(ImagePro)ソフトウエア(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)を用いて取り込んだ。三重染色サンプルについては、１回に放射フィルターを１つだけ用いて各画像を採取した。次に、アドビ・フォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウエア(Adobe, San Jose, CA)を用いて層状モンタージュを作製した。
結果
プロトコール１〜６に従って処置した臍由来細胞では、リアルタイムＰＣＲおよびASSAYS-ON-DEMANDプライマーを用いて、プロトコール６の細胞で低レベルのＮｇｎ−３が検出されたことの他に、膵臓特異的マーカーの発現は検出されなかった。膵臓組織ＲＮＡ由来ｃＤＮＡでは、同じプライマーで陽性結果を得た。
ｎｇｎ−３に関するリアルタイムＰＣＲは、プロトコール６に従って増殖させたヒト臍帯由来のｃＤＮＡサンプルに対して行った。ASSAYS-ON-DEMAND Ｎｇｎ−３プライマー（Ｈｓ００３６０７００）を用いてもＰＣＲを行った。ヒト膵臓由来ｃＤＮＡを対照として使用した。ASSAYS-ON-DEMANDプライマーを用いて他の膵臓特異的マーカー（ＰＤＸ−１、プロインスリンまたはＧｌｕｔ−２）は検出されなかった。
繊維芽細胞ではなく臍由来組織に適用したプロトコール２および６の実験条件により、膵臓上皮細胞の島への細胞集合体に類似した構造が生じた。これらの構造は、プロトコールの実施の３〜５日後に現れた。しかしながら、島とは違い、これらの構造は、膵臓マーカー（ＰＤＸ−１、Ｎｇｎ３、Ｇｌｕｔ−２およびプロインスリン）発現に対して陰性であった（リアルタイムＰＣＲによる試験）。
膵臓特異的マーカーは免疫蛍光技術および抗体のアレイを用いてヒト膵臓由来の組織で検出された（材料および方法参照）。ヒト膵臓組織において膵臓特異的マーカー（例えば、インスリン、ＰＤＸ−１、グルカゴン、ソマトスタチン、およびサイトケラチン１８）の発現は容易に検出できた。
要約
様々な実験プロトコールで処置した臍由来細胞においてＰＤＸ−１およびＮｇｎ−３の限定発現が観察された。社内で設計されたプライマーと市販のプライマーとでは結果に違いがあった。例えば、プロトコール番号１では、社内で設計されたプライマーを用いてＰＤＸ−１およびＮｇｎ−３に対して陽性のデータを得たが、同じ遺伝子に対するASSAYS-ON-DEMANDプライマーでは陰性データを得た。これらの結果は免疫学的技術では直接確認されなかった。そのような違いがあるにもかかわらず、いくつかの膵臓マーカーの発現はなし遂げられ、臍由来細胞の、膵臓表現型へと分化する可能性が示唆された。
実施例２０の参照文献

Figure 0005340599
実施例２１
臍由来細胞の軟骨細胞分化
軟骨損傷および欠損により、米国だけでも毎年およそ６００，０００件の外科手術が行われている（１）。これらの状態を治療するために、数多くの戦略が開発されてきたが、これらでは限られた成果しか上がっていない。１つのアプローチ、Cartecel(Genzyme)では、患者から採取し、インビトロ（in vitro）で拡大した後、患者に移植される自己軟骨細胞を用いる（１）。このアプローチには、健康な軟骨を採取し、培養細胞を移植するのに別の方法が必要であるという欠点がある。代替可能性は幹細胞に基づく療法であり、その療法では細胞が、損傷組織を直接取り替えるために、欠損部位にまたはその近くに置かれる。細胞は軟骨細胞に分化させた後に適用してよいし、または元の位置（in situ）で分化する可能性がある前駆細胞を用いてもよい。そのような移植細胞は欠損で失われた軟骨細胞の代わりとなるであろう。
この適用に関する候補細胞は、インビトロ（in vitro）で軟骨細胞に分化するそれらの能力について評価されなければならない。細胞の軟骨細胞マーカー遺伝子を分化および発現する能力を検査するために、数多くのプロトコールが開発されている。臍由来細胞を、２つの異なるアッセイ系によりインビトロ（in vitro）で軟骨細胞に分化するそれらの能力について検査した：ペレットアッセイ培養系およびコラーゲンゲル培養系である。ペレット培養系は、選択されたロットのヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）での使用に成功している。このアッセイで増殖させ、トランスフォーミング増殖因子−β３で処置したＭＳＣは、軟骨細胞に分化することが証明されている（２）。コラーゲンゲル系は、インビトロ（in vitro）で軟骨細胞を培養するのに用いられている（３）。これら条件下で増殖させた軟骨細胞は軟骨様構造を形成する。
材料および方法
細胞培養
ヒト臍帯を受け取り、上記実施例１に記載のとおり臍由来細胞を調製した。細胞を、ゼラチンコートＴＣＰフラスコの増殖培地で培養した。これらの培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。実験に用いた細胞は４代〜１２代の間のものであった。
ヒト関節軟骨細胞は、Cambrex(Walkersville, MD)から購入し、産褥細胞と同じ培地で培養した。実験の２４時間前に、培養培地を１％ＦＢＳ含有培地に変えた。
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Cambrex(Walkersville, MD)から購入し、ＭＳＣＧＭ(Cambrex)で培養した。実験に用いた細胞は２代〜４代の間のものであった。
コラーゲンゲルアッセイ
培養細胞をトリプシン処理して、培養プレートから除去した。細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで、３００ｘｇで５分間２回の遠心分離により洗浄し、計数した。細胞を次の成分（記載した終濃度のもの）と混合した。ラットテールコラーゲン（１ｍｇ／ｍＬ，BD DiscoveryLabware, Bedford, MA）、０．０１Ｎ ＮａＯＨおよび軟骨細胞培地 ＤＭＥＭ、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＭの−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．３５ｍＭのＬ−プロリン、１００ｎＭのデキサメタゾン、０．１７ｍＭのＬ−アスコルビン酸、１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン(transferring)、セレン）（全ての成分はSigma Chemical Company製）。これらの細胞を培地とゆっくりと混合し、サンプルを、１ウェルにつき２×１０5または１ウェルにつき５×１０5のいずれかの濃度にて、２４ウェル超低クラスタープレート(Corning, Corning, NY)の各ウェルに等分した。培養物をインキュベーターに入れ、２４〜４８時間そのままにしておいた。２４〜４８時間おきに、培地を、適当な増殖因子を補給した新鮮軟骨細胞培地と交換した。サンプルを最大２８日培養し、その時点でそれらを除去し、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン(VWR Scientific, West Chester, PA)で固定し、組織学的検査のために処理した。評価のため、サンプルをサフラニンＯまたはヘマトキシリン／エオジンで染色した。
ペレット培養アッセイ
培養細胞をトリプシン処理して、培養プレートから除去した。細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで、３００ｘｇで５分間２回の遠心分離により洗浄し、計数した。細胞を、新鮮軟骨細胞培地（上記）に濃度５×１０5細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を、１チューブにつき２．５×１０5細胞にて新しいポリプロピレンチューブに等分した。次いで、適当なサンプルをＴＧＦ−β３（１０ｎｇ／ｍＬ，Sigma）またはＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍＬ；R&D Systems, Minneapolis, MN）で処置した。その後、細胞を１５０ｘｇで３分間遠心分離した。次いで、チューブをインキュベーターに移し、３７℃、５％ＣＯ2で２４〜４８時間そのままにしておいた。必要に応じて２〜３日おきに、培地を、新鮮軟骨細胞培地および増殖因子と取り替えた。サンプルを最大２８日培養し、その時点でそれらを除去し、前記のように固定し、染色した。
結果
ペレットを調製、培養し、方法に記載した。ペレットを、培地（対照）、またはＴＧＦ β３（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくはＧＤＦ−５（１００ｎｇ／ｍＬ）を補給した培地で増殖させ、それらの培地を２〜３日おきに交換した。培養の２１日後にペレットを集め、グリコソアミノグリカン(glycosoaminoglycans)の存在について検証するために、サフラニンＯで染色した。ＴＧＦβ３およびＧＤＦ−５で処置したペレットは、対照細胞と比べて、一部サフラニンＯ染色陽性を示した。臍帯細胞の形態学では、いくつかの限られた軟骨細胞様形態学を示した。
要約
臍由来細胞は、ペレット培養系およびコラーゲンゲルアッセイ系によりインビトロ（in vitro）で軟骨細胞に部分的に分化した。臍由来細胞は、細胞によるグリコサミノグリカン発現のいくつかの徴候を示した。形態学では、軟骨組織との限られた類似性を示した。これらの結果は、臍由来細胞のより完全な軟骨細胞分化を刺激するように、条件を最適化することができるということを示唆する。
実施例２１の参照文献

Figure 0005340599
実施例２２
インビトロ（In Vitro）ペレット培養に基づくアッセイによる臍帯組織由来細胞の軟骨形成可能性のさらなる評価
臍帯組織由来細胞の軟骨形成可能性の評価をインビトロ（in vitro）ペレット培養に基づくアッセイを用いて行った。初期継代（Ｐ３）および後期継代（Ｐ１２）の臍帯由来細胞を用いた。それらの細胞の軟骨形成可能性を、ペレット培養アッセイにより軟骨形成誘導条件下、トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ−３）、組換えヒト増殖および分化因子５（ｒｈＧＤＦ−５）、または両方の組合せを補給した培地で評価した。
材料および方法
試薬
ダルベッコの改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、Invitrogen, Carlsbad, CAから入手した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、Hyclone(Logan, UT)から入手した。間葉幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）およびｈＭＳＣ軟骨細胞分化ブリットキットは、Biowhittaker, Walkersville, MDから入手した。ＴＧＦβ−３は、Oncogene research products, San Diego, CAから入手した。ｒｈＧＤＦ−５は、Biopharm, Heidelberg, Germany（ＷＯ９６０１３１６ Ａ１、ＵＳ５９９４０９４ Ａ）から入手した。
細胞
ヒト間葉幹細胞（ロット番号２Ｆ１６５６）は、Biowhittaker, Walkersville, MDから入手し、製造業者の使用説明書に従い、ＭＳＣＧＭで培養した。このロットは、予め試験し、軟骨形成アッセイでは陽性であることが分かっている。ヒト成体および新生児繊維芽細胞は、American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VAから入手し、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコの増殖培地で培養した。産褥組織由来細胞は、上記実施例に記載のとおり、ヒト臍帯から単離されたものを用いた。細胞は、繊維芽細胞の培養と同様の方法で、増殖培地で培養した。これらの細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。実験に用いた細胞は継代培養３代および１２代のものであった。
ペレット培養アッセイ
ペレット培養では、Biowhittakerの軟骨形成アッセイについてのプロトコールに従って、０．２５×１０6細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに入れ、室温にて１５０ｘｇで５分間遠心分離して、ペレット球を作製した。ペレットをＴＧＦβ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＧＤＦ−５（５００ｎｇ／ｍＬ）、またはＴＧＦβ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）とｒｈＧＤＦ−５（５００ｎｇ／ｍＬ）の組合せを含む軟骨形成誘導培地で３週間培養した。非処置対照は増殖培地で培養した。培養中、ペレットには１日おきに新鮮培地を再補充した。処置群には以下を含めた：
処置群
Ａ．臍由来細胞 初期継代（Ｕ ＥＰ）＋ｒｈＧＤＦ−５
Ｂ．臍由来細胞 後期継代（Ｕ ＬＰ）＋ｒｈＧＤＦ−５，ｎ＝２
Ｃ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＦ−５
Ｄ．ヒト成体繊維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＦ−５
Ｅ．臍由来細胞 初期継代（Ｕ ＥＰ）＋ＴＧＦβ−３
Ｆ．臍由来細胞 後期継代（Ｕ ＬＰ）＋ＴＧＦβ−３，ｎ＝２
Ｇ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ＴＧＦβ−３
Ｈ．ヒト成体繊維芽細胞（ＨＡＦ）＋ＴＧＦβ−３
Ｉ．臍由来細胞 初期継代（Ｕ ＥＰ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｊ．臍由来細胞 後期継代（Ｕ ＬＰ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３，ｎ＝２
Ｋ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｌ．ヒト成体繊維芽細胞（ＨＡＦ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｍ．ヒト新生児繊維芽細胞（ＨＮＦ）＋ｒｈＧＤＦ−５＋ＴＧＦβ−３
Ｎ．臍由来細胞 初期継代（Ｕ ＥＰ）
Ｏ．臍由来細胞 後期継代（Ｕ ＬＰ）
Ｐ．ヒト間葉幹細胞（ＨＭＳＣ）
Ｑ．ヒト成体繊維芽細胞（ＨＡＦ）
インビトロ（in vitro）サンプルの組織学 培養期間終了時に、ペレットを１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包理、切片作製、およびヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）ならびにサフラニンＯ（ＳＯ）染色による染色のために、MPI Research (Mattawan, MI)に送った。
結果
臍由来細胞、ＭＳＣおよび繊維芽細胞は、異なる増殖因子を含む軟骨形成誘導培地で細胞ペレットを形成した。培養期間終了時のペレットのサイズは、異なる細胞種間では異なった。臍帯細胞より形成されたペレットは、ＭＳＣや繊維芽細胞で形成されたものよりも大きく、ゆるい傾向があった。全ての細胞種より形成され、対照培地で培養されたペレットは、軟骨形成誘導培地で培養されたペレットよりも小さかった。
Ｈ＆ＥおよびサフラニンＯで染色したペレットの断面図の検査から、初期継代の臍由来細胞が軟骨細胞分化を受ける可能性があることが分かった。細胞濃縮、細胞形態学およびマトリックスのサフラニンＯ陽性染色により評価した場合、軟骨形成はＴＧＦβ−３、ｒｈＧＤＦ−５または両方を補給した軟骨形成誘導培地で培養した臍帯細胞ペレットで観察された。ＴＧＦβ−３、ｒｈＧＤＦ−５および併用処置でのペレットにおける軟骨形成は同様であった。増殖培地で培養した対照ペレットは、軟骨形成の徴候を一切示さなかった。臍由来細胞の軟骨形成可能性は、Biowhittakerから入手したＭＳＣで観察されたものよりもわずかに低かった。
後期継代の臍由来細胞は、初期継代臍帯由来細胞が示したほどはっきりと異なった軟骨形成可能性は示さなかった。しかしながら、これは、軟骨形成誘導条件が産褥由来細胞ではなくＭＳＣに対して最適化されたという事実による可能性がある。繊維芽細胞ではある程度の細胞濃縮が観察されたが、サフラニンＯ染色はなかった。
実施例２３
心筋細胞表現型への分化
虚血性心疾患および鬱血性心不全などの心疾患の進行を遅らせ、かつ／または治癒する療法に対して非常に大きなニーズがある。不整脈を伴わずに、患者の心筋中に完全に組み込まれ得る心筋細胞に分化し得る細胞が非常に望ましい。５−アザシチジンで処置した齧歯類間葉幹細胞は心筋細胞のマーカーを発現することが分かっている(Fukudaら(2002) C. R. Biol. 325:1027〜38)。しかし、成体ヒト幹細胞ではこれについてまだわかっていない。幹細胞分化を向上させるためには、低酸素(Storch (1990) Biochim. Biophys. Acta 1055:126〜9)、レチノイン酸(Wobusら(1997) J. Mol. Cell Cardiol. 29:1525〜39)、ＤＭＳＯ(Xuら(2002) Circ. Res. 91:501〜8)、および塩化ケレリトリン（国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０２５１４９）（ＰＫＣの、サイトゾルから原形質膜への輸送をもたらす、ＰＫＣ活性の阻害剤である）を含む付加的因子が用いられている。
この実施例では、臍由来細胞を、５−アザシチジン単独またはＤＭＳＯもしくは塩化ケレリトリンの組合せのいずれかと、リアルタイムＰＣＲによって測定される心筋細胞のマーカーとで処置した。
方法および材料
細胞 低温保存した臍由来細胞（Ｐ１０）を、ゼラチンコートフラスコの増殖培地で増殖させた。細胞を、９６ウェルプレートにて、増殖培地中、５×１０4細胞／ウェルで２４時間播種した。培地を、ＭＥＭ−α(Sigma)、インスリン、トランスフェリン、およびセレン（ＩＴＳ；Sigma）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリンならびにストレプトマイシン中０μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭの５−アザシチジン(Sigma, St. Louis, MO)単独または５μＭ塩化ケレリトリン(Sigma)、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(Sigma)、もしくは１μＭのレチノイン酸(Sigma)も含むものに交換した。細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ2で４８〜７２時間インキュベートした。培地を、ＭＥＭ−α、インスリン、トランスフェリン、およびセレン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）ならびにストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）に交換し、細胞を３７℃、５％（ｖ／ｖ）Ｏ2で１４日間インキュベートした。
ＲＮＡ抽出および逆転写 細胞を、β−メルカプトエタノール(Sigma St. Louis, MO)を含む１５０μＬのバッファーＲＬＴを用い、製造業者の使用説明書に従って溶解し（RNeasy 96 kit， Qiagen, Valencia, CA）、−８０℃で保存した。細胞溶解物を融解し、ＲＮＡを製造業者の使用説明書に従って抽出し（RNeasy 96 kit，Qiagen, Valencia, CA）ＤＮアーゼ処理（２．７単位／サンプル）(Sigma St. Louis, MO)を施した。ＲＮＡを５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出させ、−８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬(Applied Biosystems, Foster City, CA)とともにランダムヘキサマーを用い、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写させた。サンプルを−２０℃で保存した。
ＰＣＲ ASSAYS-ON-DEMAND遺伝子発現産物、心臓ミオシン（Ｈｓ００１６５２７６ｍｌ）、骨格筋ミオシン（Ｈｓ００４２８６００）、ＧＡＴＡ ４（Ｈｓ００１７１４０３ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ(Applied Biosystems, Foster City, CA)、およびＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスを用い、ABI Prism 7000 ＳＤＳソフトウエア(Applied Biosystems)とともに７０００配列検出系を用い、製造業者の使用説明書に従い(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを行った。温度サイクル条件は、まず、５０℃２分および９５℃１０分の後、９５℃１５秒および６０℃１分の４０サイクルとした。心臓および骨格筋由来のｃＤＮＡ(Ambion, Austin TX)を対照として用いた。
結果
心筋由来の対照ＲＮＡは心臓ミオシンおよびＧＡＴＡ ４の発現を示し、骨格筋ＲＮＡは骨格筋ミオシンおよび心臓ミオシンの発現を示したが、ＧＡＴＡ ４の発現は示さなかった。因子で４８時間処置し、さらに１４日間培養した臍由来細胞（Ｐ１２）は、低レベルのＧＡＴＡ ４を発現したが、骨格筋ミオシンも心臓ミオシンも発現しなかった。臍由来細胞の追加サンプルでもＧＡＴＡ ４の発現を示した。
要約 非処置臍由来細胞は、心筋細胞、セルトリ細胞、および肝細胞における核転写因子であるＧＡＴＡ ４を構成的に発現する。
実施例２４
齧歯類冠動脈結紮モデルにおける心血管療法での臍由来細胞の評価
心不全の動物モデルは、疾患の病態生理学を理解しやすくし、鬱血性心不全（ＣＨＦ）に対する新しい治療法の開発に役立ってきた。ラットにおける冠動脈結紮（すなわち、心臓組織に供給する血管を遮断すること）は、ヒトにおける急性心筋梗塞の病態生理学に非常に類似しており、ＣＨＦの場合の薬理学的介入を研究するための使用に成功している。ヒト細胞の心臓病変部への細胞移植は、ＣＨＦに対して実行可能な潜在的治療的処置である。
心筋虚血／梗塞の齧歯類モデルにおいて、心内ヒト臍由来細胞処置の、冠動脈閉塞の１５分間後に施与したときの有効性を評価した。
方法および材料
Charles River Worcester, MA試験施設は、実験動物において研究を行うために、国際実験動物管理公認協会(the Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International)（ＡＡＡＬＡＣ）から認定を受けており、米国農務省(the United States Department of Agriculture)に登録されている。試験の全ての条件は、動物福祉法（９ＣＦＲ）およびその修正条項に従った。調査開始前に、プロトコールを再検討し、規則の遵守に関し、試験施設内動物実験委員会(the Institutional Animal Care１ and Use Committee)（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。
表２４−１に規定した特徴を有する動物を個々に小型隔離ケージで、オートクレーブにかけた敷き藁上で飼育した。それらのケージは、実験動物の管理と使用に関する指針(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に記載された標準に従った。
Figure 0005340599
動物にはPURINA製の標準の食餌（照射）を自由に与えた。この食餌は、製造業者によって栄養成分および環境汚染物について定期的に分析された。製造業者の分析の結果は、試験施設の記録に残される。
オートクレーブにかけた濾過水道水を自由に与えた。濾過水のサンプルを、全蒸発残留物、硬度、特定微生物含量、および特定環境汚染物について分析した。これらの分析の結果は、試験施設の記録に残される。
環境制御は、温度１８〜２６℃（６４〜７９°Ｆ）、相対湿度３０％〜７０％に維持するようにを設定した。１２：１２時間の明暗周期を維持した。動物飼育室内では１時間に１０回以上換気を維持した。受領次第、研究に使用する前に、実験動物の試験施設標準操作手順書、受領、コンディショニング、および検疫(the Test Facility Standard Operating Procedure, Receipt, Conditioning, and Quarantine of Laboratory Animals)に記載のとおり、試験施設メーカー管理プログラム(the Test Facility Vendor Management Program)に従い、コンディショニングのために最低４日間動物を留置した。
各動物を、耳パンチにより示された独自の番号により個体識別した。動物を、無作為に、個々の体重が平均体重の±２０％を超えないように、体重秩序分布により群に割り当てた。
動物に、ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）およびブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）で、単一カクテルとして筋肉内投与（ＩＭ）により麻酔した。麻酔確立後、動物に１８〜１６ゲージ、２インチ長の血管カテーテル、または適当なサイズの血管カテーテルを用いて挿管し、外科手術中は室内空気呼吸（酸素補給）および陽圧換気装置で維持した。必要に応じて、増加的に追加麻酔を行った。ベンザチン／プロカインペニシリンＧ、４０，０００単位／ｋｇの術前抗生剤療法も、ＩＭにより行った。４８時間おきに追加抗生剤療法を行った。
電極パッドを、使用可能ＥＣＧシグナルを受けるのに適した動物の足に巻いた。処置の間、体温を維持するのを助けるために、動物を加温パッド上に置いた。体温をモニタリングするために、動物に直腸温度プローブを挿入した。各眼には眼用軟膏を塗布した。無菌手術のため、余分な毛を取り除いて手術部位（胸郭領域）を準備し、その領域を７０％イソプロピルアルコールに浸漬したスポンジで優しく拭き、乾燥させた。その後、Iodone（ＭＥＤＩＳＥＰＰＳ、または同様の溶液）をその領域に塗布し、乾燥させた。完全無菌手術のため、その領域を適切に覆った。
第４肋間の皮膚を外科的に切開した。筋層を通しての鈍的切開を用いて、胸腔にアクセスした。開創器を第４肋間内に慎重に挿入し、開いて、内部空洞へのアクセスを可能にした。心膜を、滅菌生理食塩水溶液で湿らせた綿棒でゆっくりと裂くことにより慎重に開いた。心臓の操作のため、湿った綿棒を使用して、心尖部を開口部へとゆっくりと押し、そこで６−０絹縫合糸を心筋層内に結び付けた。心臓を回復させた後、心尖部にある縫合糸を使用して、胸腔から心臓をそっと離し、心臓に、心臓上部および左冠動脈前下降枝（ＬＡＤ）へのアクセスを可能にするのに十分な張力をかけた。別の６−０絹縫合糸を心筋層内に置いて、ＬＡＤを取り囲んだ。心尖部縫合糸への圧力を解除し、心臓を胸腔の内部に戻した。
一度、心拍数およびＥＣＧが基礎値に戻ったら、ＬＡＤの周りの結紮糸を縛り、ＬＡＤを閉塞した。これは永久閉塞とし、結紮糸を縛り、末端を切り取った。結紮糸を縛った後、外科医は、閉塞に成功したかどうかの次の指標を調べた：結紮糸の真下の心臓領域の色の、その領域への血流が途絶えた結果としての白／灰白色への変化、およびＬＡＤの閉塞に対応するＥＣＧの大きな変化。閉塞の最初の１０分間は、不整脈が発現する可能性があった。蘇生が必要な事象ではこの期間中、ラットを厳密にモニタリングした。重症の不整脈およびラットが自力で正常洞調律に転換し得ない事象では、心臓マッサージによって援助した。ＬＡＤ閉塞開始のおよそ１５分間後、虚血にした左心室領域を、ビヒクルまたは被験物質のいずれかで、虚血心筋への直接注射により処置した。処置は、心筋層の虚血領域への３〜１０回の心筋内注射（１００μＬ／注射）からなる。
ヒト細胞をゼラチンコートＴ３００フラスコの増殖培地で増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Gibco, Carlsbad CA）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco, Carlsbad CA)を用いてトリプシン処理した。トリプシン処理を、増殖培地を添加することで停止させた。これらの細胞を１５０ｘｇで遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを、細胞１００万個当たりおよそ１ｍＬの増殖培地に再懸濁させた。細胞のアリコートを取り出し、トリパンブルー(Sigma, St. Louis, MO)に加えた。血球計を用い、生細胞数を評価した。この細胞懸濁液を遠心分離し、細胞５００万個当たり、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ(Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO)を含む増殖培地１ｍＬに再懸濁させ、クリオバイアル(Cryovial)(Nalgene)に移した。「ミスターフロスティ(Mr. Frosty)」冷凍容器(Nalgene, Rochester, NY)を用い、−８０℃の冷凍庫で一晩、およそ１℃／分で細胞を冷却した。細胞のバイアルを液体窒素中に移した。バイアルをドライアイス上でCBAT, Somerville, NJからCharles River, Worcester, MAに送り、−８０℃で保存した。細胞を動物に注射するおよそ１〜２時間前に、細胞のバイアルを３７℃の水浴で急速解凍した。ＢＳＬ２バイオセーフティーキャビネット内での無菌条件下、マグネシウムおよびカルシウムを含むＰＢＳ(Sigma St. Louis, MO)４０ｍＬに細胞を加え、１５０ｘｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。細胞数および生存率を、前記のように評価した。これらの細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳに終濃度１０6生細胞／１００μＬで再懸濁させた。この細胞懸濁液を３ＯＧ注射針付の１ｍＬシリンジに入れ、氷上で維持した。生存率も氷上で最大５時間評価した。
処置を実施し（表２４−２）、心臓が安定した後、外科医は外科的切開の閉鎖を開始した。開創器を取り出した。肺は３〜４回の呼吸の間に過膨張し、それらが完全に再膨張するように可能な限り視覚的に検査した。これにより回復後の気胸を防ぐために必要な陰圧が生じた。空洞を閉鎖した後、胸腔から液体および過剰な空気を抜くため、静脈内カテーテル（すなわち、２０ゲージ、長さ２ｍｍ）を、先端が胸腔内部に留まるように、皮膚および筋層を通した。先端が肺または心臓に入らないように注意した。分離した肋骨および関連筋肉を一緒に適当な縫合糸で縫合した。筋肉の上層を単純な連続パターンを用いて縫合した。皮膚は４−０絹で、水平マットレスパターンを用いて閉鎖した。１０ｍＬシリンジを、胸腔内に予め設置しておいた静脈内カテーテルと結合し、プランジャーをゆっくりと後方に引いて、空洞から液体および空気を抜いた。同時に、カテーテルを挿入部位からゆっくりと引き抜き、そうすることによって、周囲の筋肉および皮膚が刺し穴を密閉した。外科用ドレープを取り除き、液体（すなわち、乳酸リンゲル液、２５ｍＬ／ｋｇ 皮下［ＳＣ］または腹膜内［ＩＰ］）を与えた。
Figure 0005340599
各ラットが被験物質による処置を受け、切開を縫合した直後に、動物に心エコー図法（ＥＣＧ）検査を行った。エコー検査が完了するまで麻酔状態を維持した。エコー検査が完了したら、換気を中止し、ラットを回収領域に戻して、加熱酸素供給回復ケージ内で回復させた。
各生存動物の第２回目のエコー検査は、研究の終わり（処置のおよそ２８日後）、終了前、に完了した。第２回目の検査中、それらの動物を前記のように麻酔した。
各エコー検査では、左胸部領域を剃り、温め、皮膚に超音波ゲルを塗布して、振動子との接触を高めた。電極パッドを、ＥＣＧシグナルを受けるのに適した肢部に巻いた。心エコー検査画像には短軸像および長軸像が含まれ、心室腔径、収縮性、血管系を通る血流、および肉厚が測定可能であった。これらの画像を以降の分析のために光ディスクに保存した。検査後、ガーゼまたはペーパータオルで皮膚からゲル媒質を除去した。ラットを換気装置から外し、移動まで加温回復ケージ内に入れた。
外科手術の終わりに、呼吸換気を止めた。これらの動物を足反射について観察した。続いて、直腸プローブおよびＥＣＧ電極を取り出し、動物から管状器官を取り除き、加温酸素供給回復ケージ内に入れた。麻酔から完全に回復させた後、動物にブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ）を与えた。動物が完全移動性ならびに食物および水への関心を示すまで定期的に観察した。その後、動物を清浄な収容ケージ内に入れ、動物収容室に戻した。術後、動物を外科的切開の完全性について１日２回モニタリングした。
鎮痛薬（すなわち、ブプレノルフィン、０．０５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ．）を、術後および必要に応じてその後も、１日２回４日間与えた。術後の痛みの目に見える指標には、正常な***および動きの欠如（例えば、動物が円背状態にある）、対立、飲食の欠如、身づくろいの欠如などが含まれる。
各動物の体重は、最初の処置の前、その後週に１回、および剖検当日に記録した。死亡しているのが見つかった動物は体重を量り、剖検した。
心臓を摘出するために、手術のために行ったように、各ラットに麻酔をした。頚静脈にカニューレを挿入した。心臓を、頚静脈カニューレを通じて注入されるＫＣｌで拡張期で停止させた。その後、胸腔から心臓を取り出した。次いで、心臓に対して限定された剖検を行い、その後、その心臓を１０％中性緩衝ホルマリン中に入れた。各死体の残りのものは、その後、廃棄し、それ以上の評価は行わなかった。
死亡しているのが見つかったか、または安楽死させた瀕死の全ての動物の心臓を、評価まで４％パラホルムアルデヒド中に入れた。各死体の残りのものは、その後、廃棄し、それ以上の評価は行わなかった。
組織学および画像解析
固定した組織をステンレス鋼コロナルハートマトリックス(Harvard Apparatus, Holliston, MA)で切断し、２ｍｍ厚の４連続組織切片を得た。切片を処理し、ルーチン法を用いてパラフィンに連続包埋した。マイクロトームにより５μｍの切片を得、結合組織のマッソン三色染色法(Poly Scientific, Bay Shore, NY)で製造業者の手順を用いて染色した。電子顕微鏡写真を保存し、Phase 3 Imaging System(Glen Mills, PA)により開発された画像解析法を用いて解析した。三色染色法により染色された切片の顕微鏡写真を、電子的に比色定量分析して、心室および自由壁の全領域、ならびに分別染色領域を確認した。
結果
氷上で維持した場合、ビヒクル中５時間での細胞の生存率の低下はなかった。細胞を、１〜３つの注射針挿入ポイントで、注射針定位の方向を複数変化させて梗塞部に注射した。
短縮率の値を、Sahnら(1978) Circulation 58:1072〜1083により記載されているように算出した。ビヒクル処置動物の短縮率は、第０日目の４７．７％±８．３％から第２８日目の２３．５％±３０．２％まで大幅に低下した（ｐ＜０．０５）。臍由来細胞で処置した動物は、第０日目および第２８日目で、有意ではないが小さな短縮率の差を示した。第０日目には処置群間で短縮率に有意な差はなかった。
研究終了時点に、心臓を集め、組織学的分析に供した。心臓を拡張期で停止させ、固定した。それらの結果はアルゴリズムから算出して、梗塞部を含む心臓総面積の割合を評価した。ビヒクル処置動物における梗塞範囲は心臓面積の２２．９％±６．７％であったが、一方、臍帯細胞で処置した心臓の梗塞範囲は１２．５％±２．５％であり、胎盤由来細胞（単離物２）で処置した心臓の梗塞範囲は１２．９％±３．４％であり、繊維芽細胞で処置した心臓の梗塞範囲は１９．３％±８．０％であった。ビヒクル処置動物に対する細胞処置動物の梗塞範囲の差は、スチューデントｔ検定に基づき、統計的に有意ではなかった。
要約 本研究の結果は、ラットでは、臍由来細胞が、手術に起因する心筋梗塞の損傷を減少させることにおいてある程度の効果があることを示唆する。短縮率から分かるように、ビヒクル処置動物は第０日目〜第２８日目に心臓機能の大幅な低下を示したが、一方、臍由来細胞処置動物は２８日の研究期間中ほとんど変化を示さなかった。繊維芽細胞処置動物はほとんど変化を示さなかったが、この研究で生き延びたのは２匹の動物だけであった。梗塞範囲の評価は、第２８日目の時点で、産褥由来細胞処置動物では、ビヒクル対照に対して、統計的に有意ではないが幾分小幅な梗塞範囲の縮小があることを示唆した。総合すれば、これらのデータは、臍由来細胞の、心筋梗塞の損傷を減少させることにおける有効性を立証する。
実施例２５
臍由来細胞の網膜色素変性症の治療における利用
網膜の細胞変性から生じる失明障害に対する真の治療は、現在存在しない。アポトーシスもしくは二次変性の結果としての光受容体の喪失は、進行性の視力低下、そして最終的には失明を引き起こす。このような疾患が生じるのは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）などである。ＲＰは、光受容体の細胞死の原因となる単一遺伝子変異に関連するものが最も一般的である。
網膜の光受容器と周辺の網膜色素上皮は、一つの機能単位を形成する。英国外科医師会（ＲＣＳ）ラット(Royal College of Surgeons (RCS) rat)は、外側部の食作用に影響し、光受容体の細胞死を引き起こすチロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｔｋ）欠損を示す（１）。ＲＣＳラットの網膜下腔への網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の移植は、光受容体損失を抑制し、視覚機能を保つことが見いだされた（２）。この実施例では、臍由来細胞がＲＣＳモデルにおいて光受容体の救出に利用されることもできることが示される。
方法と材料
細胞移植。
ヒト成人の臍帯細胞および線維芽細胞（１０代継代）の培養を１代増殖させる。全細胞は最初にゼラチン被覆したＴ７５フラスコ上に、増殖培地中に５，０００細胞／ｃｍ2で播種された。それに続く継代のために、全ての細胞は以下のように処理された。トリプシン処理後、トリパンブルー染色の後に生存細胞が計数された。簡潔に述べれば、細胞懸濁液５０μＬが５０μＬの０．０４％ｗ／ｖトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）と混合され、血球計を用いて生存細胞数が推定された。細胞はトリプシン処理され、添加物を含まないＤＭＥＭ低グルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で３回洗浄された。ヒトの臍帯細胞および線維芽細胞の１１代継代培養がトリプシン処理され、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ'ｓ Ｌ-１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で２回洗浄された。
移植処置のために、ジストロフィーのＲＣＳラットはキシラジン・ケタミン（２０ｍｇ／ｍＬのキシラジン２．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのケタミン５ｍＬ、および０．５ｍＬの蒸留水の混合後、１ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与）で麻酔され、ノーズバー(nose bar)で頭を固定された。血清が欠乏した細胞が２μＬのＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ-１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に懸濁され（注射１回当たり２ｘ１０5細胞）、微細ガラスピペット（内径７５〜１５０μｍ）を用いて経強膜的に移植された。
細胞は、麻酔した３週齢の色素沈着したジストロフィーのＲＣＳラット（合計Ｎ＝１０／細胞タイプ）の背側頭部の網膜下腔に送達された。細胞は右目一方のみに注入され、左目には担体媒体のみが注入された（模擬コントロール、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ'ｓ Ｌ-１５培地）。移植セッション終了時にトリパンブルーによる除外により評価された残りの移植細胞の生存率は依然９５％以上だった。細胞の注入を行った後、動物は移植後１０日間、デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）を注射された。研究中、動物は移植２日前から研究終了まで、経口シクロスポリンＡ（２１０ｍｇ／Ｌの飲み水、その結果の血中濃度：２５０〜３００μｇ／Ｌ）（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｏｈｉｏ）で飼育された。餌と水は自由摂取させた。動物は、術後６０日もしくは９０日目に屠殺され、一部の動物は細胞移植に伴う短期変化の組織学的評価のために、より早い時点で安楽死された。
ＥＲＧの記録。
過去に述べられたように（３）、動物は一晩の暗順応の後、弱い赤色光下でＥＲＧ記録のために準備が行われた。簡単に述べると（ケタミン１５０ｍｇ／ｋｇとキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ混合の腹腔内投与による）麻酔下で、定位頭固定装置で動物の頭が固定され、直腸温度計で体温が監視され、恒温毛布で３８℃に維持された。等量の２．５％フェニレフリンと１％トロピカミドを用いて瞳孔が拡張された。角膜反射を防止するために、０．７５％ブピバカインを用いて局所麻酔が用いられ、乾燥を防ぎ記録電極（金のワイヤーループ）と電気接触させるために、角膜に０．９％生理食塩水が頻繁に滴下された。二つの目の間の頭皮下に挿入された２５ゲージの針が参照電極の役割を果たした。増幅（１〜１，０００Ｈｚ帯域にてノッチ・フィルターなし）、刺激提示、およびデータ収集は、ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）のＵＴＡＳ-３０００システムにより提供された。ＥＧＲは、臍帯細胞群の日齢６０日目と９０日目に、繊維芽細胞群の日齢６０日目に記録された。
ａ波とｂ波の混合波の記録。
暗順応させたｂ波定量のために、必要であれば反応信頼性を評価し信号対雑音比を向上させるために、単回フラッシュ提示（１０μ秒間）からなる記録を３から５回反復した。輝度-３．６から１．４ｌｏｇカンデラ／ｍ2まで様々な１ｌｏｇ単位ステップで強度が増加する６回の刺激が提示された。桿体の退色の可能性を最低限にするために、刺激間の間隔は、刺激輝度が最低刺激強度で１０秒から最高刺激強度で２分まで増加された。ｂ波の最大振幅は、刺激の強度に関わらず、フラッシュ強度シリーズから得られたものとして定義された。Ｎａｋａ-Ｒｕｓｈｔｏｎ曲線との適合データからの真のＶｍａｘは、ジストロフィー動物においてＥＲＧ反応が高輝度レベルで不安定で、約０．４と１．４ｌｏｇカンデラ／ｍ2で反応低下の傾向を示したため用いられなかった。ＥＲＧ要素が得られた、あるいは消失した日齢を特定するために、ａ波とｂ波では２０μＶ、ＳＴＲ用反応では１０μＶの基準振幅が用いられた。ｂ波の振幅は、ａ波の負のピークから、ｂ波のピーク頂点を上回る場合もある振動の頂点までではなく、ｂ波の正のピーク頂点までが測定された（４）。
桿体反応と錐体反応の分離。
桿体反応と錐体反応の分離判定のために、ダブルフラッシュ・プロトコルが用いられた（５）。較正された全体野を持つＵＴＡＳ-３０００システム（ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）特有の機能を用いて、使用した条件下での刺激装置の完全な再充電を確保して、条件付けフラッシュの１秒後に試験フラッシュが提示された。この処置における条件付けフラッシュの役割は、試験フラッシュに対して無反応になるように一時的に桿体を飽和させるためだった。試験フラッシュに対する反応は、錐体で駆動された反応を反映していると解釈された。桿体で駆動されたｂ波は、混合した反応から錐体で駆動された反応を差し引くことによって得られた（試験フラッシュ単独の提示後に得られた、即ち条件付けフラッシュに先行することはない）。
機能的評価。
薄明かりでの網膜の反応を示すために網膜の生理的感受性試験を行った。動物は、回復用量である１．２５ｇ／ｋｇでのウレタン腹腔内投与で麻酔された。動物における生理的評価は、９０日目の動物で、上丘における照射に対する各視覚受容野の複合単位の細胞外活性を記録することで移植後に試験された（６）。この処置は視覚野を対象に、独立した２０ポイントに対して繰り返された（視覚野の約１０〜１５０置換に相当する各ステップを、２００ｍｍ離して間隔をあける）。直径にして光点３°の上丘の２００μｍ表面の活性化単位に必要とされる視覚的閾値は、バックグラウンドを上回って０．０２カンデラ／ｍ2（発光単位）［桿体飽和より下で少なくとも２．６ｌｏｇ単位（７）］で維持された強度の増加として測定された。反応パラメーターは、移植された目と媒体単独を受けた模擬コントロールの目の間で比較された。
組織学。
動物はウレタンの過剰投与（１２．５ｇ／ｋｇ）で屠殺された。摘出の前に上直筋に６．０の縫合を施し、目の方向が維持された。角膜を切開した後、目は２．５％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、０．０１％ピクリン酸の０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）で固定された。固定後、毛様体の周囲を切ることで角膜とレンズが除去された。方向性を維持するために上直筋の除去前に網膜背面の周囲に小さな切り傷がつけられた。網膜はその後、１％四酸化オスミウムで１時間固定された。アルコールからエポキシプロパンへのシリーズでの脱水後、網膜はＴＡＡＢ包埋樹脂（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｌｄｅｍａｒｓｔｏｎ， ＵＫ）に包埋された。やや薄い切片は１％ホウ酸塩緩衝液中に１％のトルイジンブルーで染色され、超薄切片は酢酸ウランと酢酸鉛でコントラストがつけられた
ニッスル染色のために、切片は０．７５％クレシルバイオレット（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で染色された後、７０％、９５％、１００％の段階的なアルコールで２回脱水され、キシレン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に入れられ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）でリンスされ、カバーグラスをかけてＤＰＸマウント剤（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と共にマウントされた。
結果
ＥＲＧの記録。
臍由来細胞の注入を受けた動物は、手術後６０日目と９０日目の視覚反応の相対的な保存を示した（表２５−１）。これらの動物で観察された反応は、線維芽細胞処理もしくは模擬処理した動物で見られた反応よりも大きかった。
臍由来細胞移植動物（ｎ＝６）は、６０日目に試験された全ての測定結果で、ａ波（２７±１１）対模擬コントロール（０）、混合ｂ波（１１７±６７）対模擬コントロール（１８±１３）、錐体ｂ波（５５±２５）対模擬コントロール（２８±１１）で、桿体寄与分（４９±１６％）対模擬コントロール（６±７％）で良好な改善を示した（表２５−１）。更に９０日目では、改善された反応は２匹の動物で測定され、ａ波（１５±７）対模擬コントロール（０）、混合ｂ波（３７±１５）対模擬コントロール（０）、錐体ｂ波（１６±１１）対模擬コントロール（７±５）で、桿体寄与分（５８±３９％）対模擬コントロール（０％）等の測定結果であった。これらの結果は、光受容体の救出に関する証拠により視覚反応が臍由来細胞を移植された動物で改善されたことを示す。９０日目の試験動物でＥＲＧに対する反応性の減少が観察されたものの、模擬処理コントロールと比較して視覚機能の保存は良好だった。
臍由来細胞と対照的に、線維芽細胞移植は、試験されたいずれのパラメーターでも改善を示さなかった。
Figure 0005340599
組織学。
移植後、炎症反応の組織学的証拠はなく、ニッスル染色した切片では、産褥細胞において免疫細胞の浸潤は観察されなかった。しかし、線維芽細胞移植は、動物の死亡（ｎ＝７）と炎症反応の初期段階の徴候をもたらした。９０日タイムポイントでは、臍由来細胞を移植した動物では、光受容体の解剖学的な救出が組織学的に明らかに示された。光受容体は、内側の核層から間隙で隔てられた、その他の網膜細胞で作られた厚い層を形成した。ちなみ模擬コントロールでの外層の幅は、良くても移植された目の約５細胞厚と対照的に不連続な単層だった。正常な動物と比較して、これは正常に観察される光受容体細胞層の半分の厚さより辛うじて厚い。
機能的評価。
視覚喪失防止における移植の有効性は、２匹の動物における電気生理学的反応性の評価によって監視された。模擬注入コントロールの目と臍由来細胞を移植した目における視野救出の領域を定義するために、光に対する閾値感度反応が用いられた。非ジストロフィーラットにおいて、視覚閾値は決して０．５ｌｏｇカンデラ／ｍ2のバックグラウンドを越えなかった。手術を行わなかったジストロフィーラットでは、閾値は通常４ｌｏｇカンデラ／ｍ2単位の規模だった（８）。一方、手術を行わなかった模擬注入したジストロフィーラットでは、一部の例で記録ができず、閾値は２．９〜４．９ｌｏｇカンデラ／ｍ2単位で平均閾値は４．０ｌｏｇカンデラ／ｍ2単位だった。従って、模擬注射したラットは、ある程度高度に局在した一時的な網膜の機能的救出を示した。しかし、ヒト臍由来細胞を移植したラットは、閾値範囲０．８から２．１ｌｏｇカンデラ／ｍ2単位、平均閾値１．３ｌｏｇカンデラ／ｍ2単位で、実質的に高レベルの視覚保存を示した。
要約。
臍由来細胞のジストロフィーＲＣＳラットへの移植は、光受容体を保存することができる。この変性モデルでは、ａ波が３０から６０日以内に消失し、ｂ波が３ヶ月以内に消失すると予測される。従って、基本的に維持されたａ波は、真の正常な桿体機能が保存されていることを示す。ｂ波への桿体の寄与は、異常な桿体機能が依然あり得ることを示唆している。持続した非桿体ｂ波は、視覚の真の尺度である錐体機能がどれだけ維持されているかの指標である。従って、臍由来細胞の移植後に生理学的および解剖学的の両方で評価された改善のレベルが、本発明では十分に特徴づけられている。ＥＲＧの測定は、網膜における電気的活性の変化を示す、光受容体喪失後の視覚機能の評価をもたらす。しかし、ＥＲＧは結像能力に関しては直接的な情報はもたらさない。本研究で用いられた小丘閾値感度の測定は、視野の相対的な保存の指標をもたらした。この測定の重要性は、機能救出と解剖学的な保存の量の間の一致に基づいており、取得されたデータをヒトでの視野検査と比較する点である（９）。移植は、試験動物における疾患過程の遅延を示した。従って、本明細書で提示された結果は、ヒト臍由来細胞の網膜下腔への移植の機能的な有効性の明確な証拠と、移植細胞が局在する全体領域で光受容体の保存が起こることを示している。
実施例２５の参考文献
Figure 0005340599
実施例２６
ＳＣＩＤマウスにおける移植に対する産褥由来細胞の軟骨形成能
生体吸収性増殖因子含有の足場上に播種とＳＣＩＤマウスへの移植後に、臍もしくは胎盤組織由来の細胞の軟骨系性能が評価された。
材料と方法
試薬。
ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから入手された。仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）はＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）から入手された。間葉系幹細胞増殖因子（ＭＳＣＧＭ）は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手された。ＴＧＦβ−３はＯｎｃｏｇｅｎｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから入手された。ｒｈＧＤＦ-５は、Ｂｉｏｐｈａｒｍ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ（国際公開第ＷＯ９６／０１３１６Ａ１号、米国特許第５，９９４，０９４Ａ号）から入手された。軟骨細胞増殖培地は、１０％仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍｍｏｌ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍｍｏｌ 非必須アミノ酸、２０μｇ／ｍＬ Ｌ-プロリン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢを添加した高グルコースＤＭＥＭからなった。ウシフィブリノゲンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手された。
細胞。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、Ｌｏｔ＃２Ｆ１６５６）はＢｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手され、メーカーの取扱説明書に従ってＭＳＣＧＭ中で培養された。このロットは、予め研究室でインビトロ実験が行われ、軟骨形成アッセイで陽性が示された。ヒト成人線維芽細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手され、ゼラチンで被覆された組織培養用プラスチックフラスコ上に増殖培地中で培養された。ヒトの臍帯（Ｌｏｔ＃０２２７０３Ｕｍｂ）と胎盤（Ｌｏｔ＃０７１００３Ｐｌａｃ）より単離された産褥由来細胞は、以前述べられたように調製された（実施例１）。細胞はゼラチンで被覆された組織培養用プラスチックフラスコ上に増殖培地中で培養された。細胞培養は、３７℃で５％ＣＯ2でインキュベートされた。実験に用いられた細胞は、５代継代（「低継代」）と１４代継代（「高継代」）だった。
足場。
米国特許第６，３５５，６９９号に述べられたように、ポリジオキサノン(Polydioxanone)（ＰＤＳ）メッシュで強化された３５／６５ポリ（イプシロン-カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）（３５／６５ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体（ＰＧＡ／ＰＣＬ発泡体-ＰＤＳメッシュ）が、凍結乾燥の過程で作られた。発泡体は１ｍｍ厚の４ｃｍ ｘ ５ｃｍだった。発泡体はエチレンオキシド（ＥＴＯ）処理によって滅菌された。足場から作られたパンチ（３．５ｍｍ）にｒｈＧＤＦ-５（３．４μｇ／足場）、ＴＧＦβ−３（１０ｎｇ／足場）、ｒｈＧＤＦ−５とＴＧＦβ−３の組合せ、もしくはコントロール媒体のいずかを含ませ、凍結乾燥された。
足場上への細胞播種。
胎盤由来細胞と臍由来細胞はトリプシン処理され、細胞数と生存率を測定した。７．５ｘ１０5細胞が１５μＬの増殖培地に再懸濁され、細胞培養皿中の３．５ｍｍ足場パンチ上に播種された。足場上に播種された細胞は、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で、軟骨外植リング内に置いた後、２時間インキュベートされた。
ウシ軟骨外植片。
若いウシの肩から得た軟骨から直径５ｍｍの軟骨外植片が作成された。外植片の中央からパンチ（３ｍｍ）が切り出され、３．５ｍｍの再吸収可能な足場上に播種された細胞と置き換えられた。細胞が付着した足場は、フィブリン糊（３ｍｇ／ｍＬのウシフィブリノゲン６０μＬ）を用いて外植片中で保持された。試料は、軟骨増殖培地中で一晩維持され、翌日リン酸緩衝生理食塩水でリンスされ、ＳＣＩＤマウスに移植された。
動物。
５週齢のＳＣＩＤマウス（（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ／オス）は、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏｒｔａｇｅ， Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から入手された。研究に用いられた動物は、明確な組織的バイアスなしに選択された。個別の動物ケージに、受入番号、移植手法、動物番号、種／系統、手術日、インビボ期間、および安楽死の日付を記載した札がつけられた。動物は、消えないインクマーカーで耳に印を付けた連続番号で識別された。
実験計画。
合計４２匹のマウスが試験された。皮下移植にマウス４２匹、処理当たりｎ値３で２８処理で、二つの足場が各マウスの皮下に移植された。本件研究はＩＡＣＵＣ承認番号：Ｓｌｉｌｌｍａｎ ＩＡＣＵＣ０１-０３７に相当する。研究は６週間継続された。
ＳＣＩＤ移植。
Ａ．体重
各動物は、麻酔前と解剖時に体重が計測された。
Ｂ．麻酔および手術準備
ＳＣＩＤマウスの全ての取扱いは、フード下で行った。マウスは個別に秤量され、ＫＥＴＡＳＥＴ（登録商標）（塩酸ケタミン［６０ｍｇ／ｋｇ］）、ＲＯＭＰＵＮ（登録商標）（キシラジン［１０ｍｇ／ｋｇ］）、および生理食塩水の腹腔内投与で麻酔された。
麻酔の導入後、動物の背側頸部から背側腰仙部までの背部全体は、動物用電気バリカンを用いて毛を残さず刈り込まれた。この部分はクロルヘキシジン二酢酸で擦られ、アルコールでリンスされ、乾燥され、利用可能ヨウ素１％の水溶性ヨードフォア溶液が塗布された。麻酔中の組織の乾燥を防ぐために、眼軟膏が目に適用された。麻酔し、手術準備をした動物は、望ましい臥位に置かれた。
Ｃ．皮下移植手法
脊柱と平行に、胸椎のすぐ側部に約２ｃｍの皮膚切開が行われた。鈍的切開により、下にある結合組織から皮膚が分離された。各ＳＣＩＤマウスは、１回の皮膚切開を通じて各半胸郭に鈍的切開によって作られた皮下ポケットに置かれる処置を、２回を受けた（表２６−１）。皮下移動を防ぐため、各足場の周りで皮膚を筋肉組織に縫い付けるために５-０ＥＴＨＩＢＯＮＤ ＥＸＣＥＬ（ポリエステル）（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ， Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＮＪ）の仕付け縫合糸が用いられた。足場は６週間埋め込まれ、その後回収された。実験計画は、表２６−１に概略が述べられている。
Figure 0005340599
Ｄ．解剖および組織学的準備
研究過程の間に死んだ動物もしくは瀕死状態で安楽死させた動物で、肉眼的検査が行われた。研究責任者および／または病理学者の判断で選択された組織が保存された。
マウスは、指定された間隔のＣＯ2吸引によって安楽死させられた。移植部位の肉眼的検査が記録された。皮下移植部位の試料は覆っている皮膚と共に切り取られ、１０％の緩衝ホルマリン液中で固定された。各移植片は二等分され、半分はパラフィン包埋、切片化、ヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）およびサフラニンＯ（ＳＯ）による染色のためにＭＰＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｍａｔｔａｗａｎ， ＭＩ）に送られた。
結果
新規の軟骨と骨の形成が、増殖因子含有の細胞が播種された足場、細胞が播種されたコントロールの足場、および増殖因子を単独で含む足場の大部分の試料で観察された。新規の軟骨と骨の形成の程度は、処理とコントロール群内で様々だった。
足場に播種された初期継代および後期継代の胎盤由来細胞は、足場内での新規の軟骨と骨の形成を示した。異なる増殖因子を含んだ細胞が播種された足場と細胞単独で播種された足場の間では、新規の軟骨と骨の形成に明らかな違いは観察されなかった。コントロールの足場(増殖因子なし、かつ、細胞なし)と比較した場合、増殖因子無しと増殖因子を含んだ両方の、細胞を播種した足場内で、および、増殖因子を含んだ足場単独内で、より大きな程度の新規軟骨形成があったように見える。胎盤由来細胞を播種した足場での新規の軟骨の形成は、ＭＣＳおよび線維芽細胞を播種した足場と類似していた。
臍由来細胞を初期継代と後期継代で播種した、増殖因子処理した足場とコントロールの足場では、新規の軟骨と骨の形成が観察された。軟骨形成の程度は、胎盤由来細胞で見られたものより少ないようであった。いずれの試料も、胎盤由来細胞で見られたような程度の軟骨形成を示さなかった。骨形成は、ＴＧＦβ−３およびｒｈＧＤＦ-５の両方を含む足場上に播種された臍由来細胞の足場で高かったようである。
ｈＭＳＣを含む足場も新規軟骨形成と骨形成を示した。新規軟骨形成と骨形成の程度は、ｈＭＳＣ処理群の全てと同様だった。ヒト成人線維芽細胞が播種された足場も、新規の軟骨形成と骨形成を示した。結果は、胎盤由来細胞とｈＭＳＣで得られた結果と同様だった。
増殖因子を含む足場、もしくは足場単独が軟骨リングにおいて移植されたコントロール群では、新規軟骨形成と骨形成も観察された。当然のことながら、新規軟骨形成の程度は増殖因子無しの足場よりも増殖因子を含む足場の方がより大きかった。試験された二つの増殖因子の組合せのコントロールでより一層の骨形成があった。
新規軟骨形成は、足場内だけでなく軟骨外植リングの近傍にも観察された。軟骨リングに隣接した足場内の新規軟骨形成は、軟骨細胞の移動の結果である可能性がある。足場内の島として見える軟骨形成は、足場内の軟骨細胞の移動か播種された細胞の分化、もしくはマウスの内因性前駆細胞の分化のいずれかの結果である可能性がある。この観察は、細胞を播種されていないコントロールの増殖因子を含む足場において軟骨細胞分化の島が観察されたという事実から生じている。新規骨形成は、独立して、また軟骨細胞に付随して足場内に観察された。骨形成は軟骨内骨化だけでなく骨芽細胞の分化から生じた可能性もある。
播種された細胞で生じた可能性がある軟骨細胞分化および骨芽細胞分化と、移動した軟骨細胞に関連した新規の軟骨および骨形成を分けるのは困難である。特異的なヒト抗体での切片の染色が、観察された軟骨形成と骨形成への、播種された細胞の寄与を識別する可能性もある。また、胎盤由来細胞と臍由来細胞が軟骨細胞移動を刺激した可能性もある。
豊富な新しい血管が胎盤由来細胞と臍由来細胞を含む足場に観察された。血管は、骨形成の領域で豊富だった。また新規血管は、新規骨形成に付随するｈＭＳＣおよび線維芽細胞が播種された足場内にも観察された。
新規の軟骨形成および骨形成の促進におけるコントロールの足場（増殖因子なし、細胞なし）に対する隣接する足場（増殖因子あり）の全身性の影響を除外することはできない。ＳＣＩＤマウスにおいて近傍に移植された足場を考慮した足場内の新規の軟骨形成および骨形成の解析は、隣接する足場由来の増殖因子の全身的な作用の明確なパターンを示さなかった。
要約。
結果は、新規の軟骨および骨形成が、胎盤由来細胞および臍由来細胞が播種された、増殖因子およびコントロールの足場で観察されたことを示した。胎盤由来細胞による結果は、ヒト間葉系幹細胞で見られた結果と同様だったが、新規の軟骨様組織の形成は、臍由来細胞よりもやや弱かった。細胞無しで移植された増殖因子を含む足場も新規の軟骨形成および骨形成を示した。これらのデータは、足場内の新規軟骨形成は、ウシの移植片から移動してきた軟骨細胞、内因的な前駆細胞の軟骨分化、もしくは播種された細胞の軟骨分化から生じた可能性を示す。
これらの結果は、胎盤由来細胞および臍由来細胞が軟骨分化および骨分化することを示唆する。またこれらの結果は、胎盤由来細胞および臍由来細胞が軟骨細胞の軟骨外植片から足場への移動を促進する可能性も示唆している。豊富な新規血管も足場内に、特に新規の骨形成に付随して観察された。
実施例２７
産褥由来細胞の単離と増殖のための無血清培地の同定と開発
要約：現在、長期間培養のためにヒトの一次細胞を増殖させる最も一般的なアプローチは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の利用である。インビトロでの細胞増殖に好適な基質または添加物となるＦＢＳが含むタンパク質のために、ＦＢＳは細胞増殖を顕著に刺激する。しかし、化学的に明確な、あるいは少なくとも無血清培地の代わりに動物製品を含む培地を用いるのは数多くの不都合な点がある。生物学的製品が全てそうであるように、血清組成のタンパク質は、ロットごとの変動と牛海綿状脳症などの疾患感染の懸念の増大が血清組成を含むもしくは血清組成から製造された細胞に関連した製品の商業化もしくは規制認可に対する深刻な障害をもたらす。
血清を含まない、さらに商業的応用にも十分な細胞集団の増殖を依然維持することができる細胞培地の処方の開発が研究されている。有用性の指標として、産褥由来の臍帯細胞の短期もしくは長期の細胞増殖を用いて数多くの培地処方が試験された。
産褥由来細胞の無血清増殖を至適化するための基本培地として、改良型ＤＭＥＭ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が用いられてきた。血清を含まないものの、改良型ＤＭＥＭは全ての動物性タンパク質を欠いているわけではない。改良型ＤＭＥＭに含まれるアルブミンやインスリンといった動物性タンパク質成分は、商業化された治療用の細胞または生物工学製品を作成するために使用する前に、組み換えで生成された代替物で置き換え可能である。改良型ＤＭＥＭでの、単離から増殖された産褥由来細胞（ＰＰＤＣ）の特性が明らかにされ、ＰＤＧＦｒ-αおよびＨＬＡ-ＡＢＣの発現が血清を含む培地と比較して減少していることが示された。
序論：心筋梗塞、脳梗塞、網膜色素変性症や黄斑変性症などの眼疾患、および糖尿病といった、広範囲にわたる疾患の患者治療のための細胞に基づく治療法が開発されてきた。当該の細胞を迅速に、効果的に単離し増殖するための上述のような刺激的な取り組みには、かなりの量の細胞が必要である。
ヒト細胞の一次培養を増殖させるほとんどの培地が、多少のウシ胎児血清もしくは仔ウシ血清を含んでいる。一般的に、市販の培地の処方には、多数の細胞集団の生存と増殖を助けるため、約１０〜２０％（ｖ／ｖ）の血清の添加が必要である。幹細胞集団および前駆細胞集団の細胞の増殖と分化に重要な影響を及ぼし得るＰＤＧＦやＦＧＦといった既知の増殖因子などの無数のタンパク質がウシ血清中に見いだされている。ヒトの治療薬に外来の血清産物を利用する上で不都合な点は、前記で議論された。
ウシ胎児血清の不都合な点を克服するため、細胞増殖を助成するとして知られる様々なヒト組み換え増殖因子を含む、あるいは含まない数多くの培地処方が評価されてきた。産褥由来細胞の短期および長期、両方の増殖プロフィールが検討され、その結果は本明細書に報告される。数多くの培地処方が顕著な短期間での利点をもたらし、いくつかの処方が複数継代に渡る細胞の増殖に有用だった。
材料と方法
ＰＰＤＣの単離
ＰＰＤＣは、前記の実施例のように単離された。
ＰＰＣ細胞のプレーティング
予め増殖培地で増殖させた産褥由来細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃｕｓ０２２８０３（Ｐ１２））が、１平方ｃｍあたり５，０００細胞でプレーティングされ、１週間に渡って１５％から２％に血清濃度を減らすことによって血清を断った。次に細胞は、継代と短期のＭＴＳアッセイのためにプレーティング前に血清を含まない増殖培地に移された。
短期増殖を評価するＭＴＳアッセイ
幅広い増殖条件を評価するために、細胞数つまり細胞増殖の間接的な測定である、比色分析でＤＮＡ含量を定量するＭＴＳアッセイが用いられた。臍由来細胞（０２２８０３（Ｐ１１））は１，０００細胞／ウェル（９６ウェルプレートフォーマット、１００μＬの培地中に５，０００細胞／平方ｃｍ相当）の密度で試験された各条件につき４つ組でプレーティングされた。添加物を含む基礎培地組成とアミノ酸添加物不要の完全培地処方の両方が試験された。全条件の一覧として表２７−１を参照（全ての培地は有効量でペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいたことに注意）。４日後、試料はメーカーの取扱い説明書に従って処理された（Ｐｒｏｍｅｇａ ＭＴＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）。
簡単に述べると、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が各ウェルにピペットで分取された。プレートは加湿インキュベーター（５％の二酸化炭素を含む）で１〜２時間３７℃でインキュベートされた。インキュベーション後、ＭＴＳの細胞還元によって生成される可溶性のホルマジン産物の形成を停止するために２５μＬの１０％ＳＤＳが各ウェルに添加された。次に、比色吸光測光（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４９０ｎｍと７００ｎｍの両方で吸光度が記録された。
濃度の標準曲線が作成され、一次方程式が曲線に当てはめられ、４つ組で行った試料の平均値に基づいて細胞数の推定に用いられた。次に試料の値と各標準誤差を描くグラフが作成された。
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長期増殖アッセイ
ＭＴＳアッセイで試験された約１５０の異なる増殖条件のうち、複数継代にわたる細胞集団の増殖を維持することができるかどうか、最良の増殖条件９つとコントロール（増殖培地）が試験された。この分析のために、臍由来細胞（０２２８０３（Ｐ１０））が冷凍保存から解凍され（細胞は予め増殖培地中で培養された）、実験条件に直接培養された（表２７−２参照）。全ての条件下で用いられた培地は、増殖培地のようにペニシリン／ストレプトマイシンを含んでいた（前述の実施例を参照）。細胞は３〜４日ごとに継代され、増殖条件に用いられた基礎培地（例えば、ｂＦＧＦを加えた改良型ＤＭＥＭ）中で同じように継代／トリプシン処理された。１０継代以上にわたって臍由来ＰＰＣの増殖を支えた条件の増殖曲線が作成された。増殖を支えなかった培地は、今回は今後の解析対象とは見なされなかった。
Figure 0005340599
フローサイトメトリー
改良型ＤＭＥＭ＋Ｌグルタミン＋ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）での増殖が増殖培地（１５％ウシ胎児血清含有）での同等の細胞増殖と比較して表面マーカーの発現が変化したかどうかを証明するため、臍由来ＰＰＣの性質決定で用いたマーカー（前述の実施例を参照）のフローサイトメトリー分析が行われた。陽性の染色とバックグラウンドの間の蛍光レベルの差を明らかにするために、一次抗体なしのコントロールと染色した試料の結果が比較された。これらの実験のために、いくつかの提供者からの臍由来細胞０９０３０４Ａ（Ｐ４とＰ１０）、０９１５０４Ａ（Ｐ４）、０６３００４Ｂ（Ｐ４）、および０４２３０３（Ｐ３３）が用いられた。
冷凍保存解析
ゼラチン被覆したＴ２２５フラスコで増殖培地もしくは改良型ＤＭＥＭのいずれかと、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）で培養された臍帯由来細胞（０４２８０３ Ｐ２１）および胎盤由来細胞（０７１５０３ Ｐ１０）は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄され、１ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトリプシン処理された。トリプシン反応液は２０ｍＬの改良型ＤＭＥＭを加えることで希釈された。細胞は１５０ｘｇで遠心され、上澄みが吸引除去された。細胞は改良型ＤＭＥＭで洗浄された。６０μＬの細胞の小分注を取り、各小分注に６０μＬトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）が加えられた。血球計を用いて生存細胞の数が概算された。細胞は次に１５０ｘｇで遠心され、上澄みが除去され、細胞ペレットは、改良型ＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）グルタミン（４ｍＭ）、１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、および１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の凍結処方に１．０ｘ１０6細胞／ｍＬで再懸濁された。１ｍＬの小分注は凍結用バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に分配された。細胞は、以下のプロトコルに従って速度制御冷凍庫（ＣｒｙｏＭｅｄ Ｆｒｅｅｚｅｒ ７４５２， ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ， Ｍａｒｉｅｔｔａ， ＯＨ）内で凍結媒体への１５分以内の曝露で凍結された。
Figure 0005340599
細胞のバイアルは、解凍二日前に窒素蒸気保存ユニット（ＣｒｙｏＭｅｄ ７４００， ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ， Ｍａｒｉｅｔｔａ， ＯＨ）に移され、３７℃の温浴中で目に見える氷の結晶がなくなるまで穏和に回旋して急速解凍された。細胞は１０ｍＬの増殖培地に添加され、遠心されて前述のように細胞数と生存率が概算された。細胞は細胞の接着能と増殖能を検討するためにゼラチン被覆したフラスコに５，０００細胞／ｃｍ2で播種された。
また細胞はＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌs Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて、メーカーの規定に従って老化がアッセイされた。簡単に述べると、細胞はゼラチン被覆した６ウェルプレートにウェル当たり１．５ｘ１０5細胞で、増殖培地中に播種された。３日後、細胞はＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で１回洗浄され、固定液中で室温（ＲＴ）で６〜７分間インキュベートされた。次に細胞はＰＢＳで３回リンスされ、１．５ｍＬの染色液が各ウェルに添加された。プレートは３７℃で振盪器で穏和に振盪しながら、細胞が青く染まるまでインキュベートされた。青い（老化）細胞のパーセンテージが測定された。
ＭＴＳアッセイが上述のように行われた。同様に、細胞は、増殖培地中にウェル当たり１，０００細胞の開始濃度で８つ組で９６ウェルプレートに播種された（改良型ＤＭＥＭには再播種されなかった）。
結果
臍ＰＰＣの短期増殖
１１代継代の臍由来ＰＰＣの短期間（１、３、および４日）の細胞増殖を検討するために、１５０以上の異なる培地処方がＭＴＳアッセイによって比較された。細胞はウェル当たり１，０００細胞でプレーティングされた。
基本培地（添加物なし）に関しては、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ、Ｆ１０培地、改良型ＤＭＥＭ（Ｌグルタミン含有）および増殖培地が、臍由来ＰＰＣの増殖を４日以上培地中で維持した。ＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ培地では３日目から４日目に全体的な細胞数の減少があり、細胞は不健康であるように見えた。
試験された添加物の解析は、基礎培地単独と比較して、ＩＴＳ＋３が臍由来ＰＰＣの４日にわたる増殖において優れていることを示した。
基礎培地に添加された増殖因子の解析は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦは、臍由来ＰＰＣの増殖において全て個別に有用であり、４日目の細胞数に基づいた増殖ではｂＦＧＦが最も増殖を刺激した増殖因子であることを示した。この結果は、増殖培地で観察された結果を上回った。興味深いことに、複数の増殖因子の添加は、試験された条件下では増殖を更に刺激することはなかった。１日目と４日目の間の集団倍加時間へデータを変換すると、ＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびＩＧＦは、ｂＦＧＦを上回った。この結果は、ｂＦＧＦ中の細胞に対するタイムゼロと１日目の間の細胞接着と増殖の強化によって説明される可能性がある。
長期増殖解析
血清を含まない代替品の探索を狭めることを目的とした短期増殖実験の結果を前提として、１０組合せの培地が選択され、臍由来ＰＰＣが平方ｃｍあたり５，０００細胞の播種密度で１０代継代（予め、増殖培地で増殖させた）から増殖された。コントロール条件（増殖培地）を除いては、臍由来ＰＰＣの増殖を１０継代以上維持した唯一の培地の組合せは、Ｌグルタミン（４ｍＭ）とｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した改良型ＤＭＥＭだった。改良型ＤＭＥＭは、増殖培地よりも低率ではあるが少なくとも約２３継代にわたって臍由来ＰＰＣの増殖を維持し続け、これらの細胞は３３継代で最終的に老化した。
フローサイトメトリー結果
添加物を加えた改良型ＤＭＥＭ（ＬグルタミンとｂＦＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ含有）で増殖させた初期継代、後期継代の両方の臍帯細胞は、以前、増殖培地で増殖させたＰＰＤＣの特徴付けに用いられた様々な細胞表面マーカーで染色された。増殖培地で増殖させた臍由来ＰＰＣは、培地組成に起因する差を評価するための比較に用いられた。ほとんどのマーカーの発現は同様であったが、二つのマーカーは培地組成間で発現が異なった。ＨＬＡ-ＡＢＣとＰＤＧＦｒ-αは共に増殖培地で発現していたが、いずれも改良型ＤＭＥＭでは発現していなかった（表２７−３および表２７−４）。これは、初期継代（Ｐ４）と後期継代（Ｐ３３）の両方の臍由来細胞で観察された。
Figure 0005340599
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凍結保存結果
凍結保存前にトリパンブルー染色で評価された細胞の初期生存率は、ほぼ１００％だった。解凍後の細胞の生存率と老化細胞％を表２７−５にまとめる。
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凍結保存前に増殖培地で増殖させた胎盤由来細胞と臍帯由来細胞の両方で細胞生存率にやや減少があった。改良型ＤＭＥＭベースの培地で凍結保存された生存細胞は、***し、コンフルエントの単層を３日以内に形成した。増殖速度に識別可能な差（ＭＴＳ測定で判定）はなかった。老化アッセイは、改良型ＤＭＥＭと増殖培地で増殖させた胎盤由来細胞でそれぞれ＜１％と３％の老化細胞集団を明らかにした。臍帯由来細胞では、老化細胞のパーセンテージはやや高かく、約７％だった。
考察と結論
データは、一般に用いられる増殖培地（１５％ウシ胎児血清含有）に加えて、産褥由来細胞の増殖を維持する培地処方があることを示す。本研究での最良の合成培地組成は、１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを添加した高グルコースを含む改良型ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）だった。この培地は、予め増殖培地で増殖させた１０継代の臍由来ＰＰＤＣの短期と長期両方の増殖を維持する可能性もある。細胞は増殖し、集団は良く増殖したが、その増殖は血清を添加した増殖培地で得られた増殖に相当する程ではなかった。
別の予期せぬ知見は、増殖培地で増殖した同等の細胞がＨＬＡ-ＡＢＣを発現していたにもかかわらず、改良型ＤＭＥＭで増殖させた細胞はＨＬＡ-ＡＢＣの発現が欠如していることだった。このことが移植片不適合性に影響する（例えば移植片不適合性が軽減する）ことが予期されるかどうかは不明であり、血清を含まない培地で培養した細胞での動物の研究が必要である。ＨＬＡ-ＡＢＣマーカーとＰＤＧＦｒマーカーにおける変化は、前臨床での有効性に影響する可能性がある。しかし、これらの二つの培地処方での細胞増殖の結果としての遺伝子発現の変化を予め検討することが有益である。
最後に、凍結保存される前記の細胞の能力の解析は、非生存細胞数の減少には（増殖培地との比較で）改良型ＤＭＥＭが有利である可能性を示唆している。臍由来ＰＰＣと胎盤由来ＰＰＣの両方で、回復率は穏やかではあるが上昇した。胎盤由来細胞に対して臍帯由来細胞の外見的な低回復率は、細胞のより高い継代数（２１）に起因する可能性があり、このことは老化アッセイの結果でも反映されている。従って、増殖培地で増殖させた臍由来細胞は、一定の利点がある改良型ＤＭＥＭで凍結保存されることもできる。
実施例２８
産褥由来細胞の単離と増殖のための血清を含まない培地の更なる同定と開発
要約：前記の実施例は、改良型ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が産褥由来細胞の無血清増殖のための至適化に有用な基礎培地であることを述べた。単離時から改良型ＤＭＥＭで増殖させた臍由来細胞は性質がはっきりしており、ＰＤＧＦｒ-αとＨＬＡ-ＡＢＣの発現が低下していることが示された。改良型ＤＭＥＭおよび増殖培地の両方で増殖させた産褥由来細胞は、細胞表面マーカーの発現に対する増殖培地の影響を特定するためにフローサイトメトリーを用いて更に特徴が明らかにされた。遺伝子発現プロフィールは、皮膚線維芽細胞と***線維芽細胞、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などのその他の細胞と比較された。培地の切り替えは、フローサイトメトリーで測定されたようにＨＬＡ-ＡＢＣとＰＤＧＦｒ両方の発現を変化させることもできる。特定の「***遺伝子（signature gene）」発現パターン（本明細書の実施例で述べられた）は、双方の培地で同様であった。このことは、臍帯由来産褥細胞は「***」遺伝子発現の明確な変化なしに合成培地で増殖し得る、単離時から独特の細胞であることを裏付ける。ＨＬＡ-ＡＢＣ細胞表面マーカーの発現の変化は、移植、移植植え付け、もしくは移植拒絶に影響する可能性もある。
序論：ＨＬＡ-ＡＢＣおよびＰＤＧＦｒαの発現は、産褥細胞が二つの異なる培地（増殖培地対、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した改良型ＤＭＥＭ）で増殖した場合に変化することが示された。この知見は興味深く、この現象は、例えば産褥由来細胞の異なる亜集団を促進することに起因するのかどうか、あるいは特定の産褥細胞集団に異なる増殖培地に対するこれらの細胞表面マーカーの発現調節能があるのかどうかなど、更なる研究の誘因となった。
この問題を研究するために、二組の実験が行われた。最初に、臍由来産褥細胞が増殖培地、ｂＦＧＦ添加改良型ＤＭＥＭ、あるいは二つの切り替えで増殖され、次にフローサイトメトリーでＨＬＡ-ＡＢＣとＰＤＧＦｒ発現が解析された。同一条件下で増殖させたこれらの細胞の培養からＲＮＡが単離され、独占的に発現されることが過去に見いだされている遺伝子（対その他の細胞集団）の発現パターンを判定するためにＰＣＲが行われた。その他のコントロール細胞タイプ間の差と同様に、培地条件間の差が解析された。
これらの実験結果は、増殖培地と改良型ＤＭＥＭ培地で増殖させた産褥由来細胞は同様のパターンで遺伝子を発現するものの、これらの細胞表面マーカーの発現は、二つの培地で変更され得ることを示す。このことは、例えば、様々な産褥由来細胞を互いに識別する、同様に成人、胎児もしくは新生児由来のその他の幹細胞タイプから識別するなど、多くの理由から重要である。また本明細書で述べられたＨＬＡ-ＡＢＣの発現減少の方法は、移植片または移植（grafts or inplantation）のために性質が向上された細胞作出のための意義深い機会も開いている。このような方法は、シクロスポリンＡのような免疫抑制剤の非存在下で移植片不適合性の可能性を低減する可能性がある。
材料と方法
ＰＰＣの単離
細胞は、上記の実施例を通じて本明細書に述べられたように単離された。
ＰＰＣ細胞のプレーティング
単離時から（実施例２７で述べられたように）ｂＦＧＦを添加した改良型ＤＭＥＭで増殖させた産褥由来細胞（ｕｍｂｉｌｉｃｕｓ ０６３００４Ｂ）は、増殖培地への切り替え時点でＰ３もしくはＰ４のいずれかで継代された。細胞は平方ｃｍあたり５，０００細胞でゼラチン被覆された標準的な組織培養フラスコにプレーティングされた。ＰＤＧＦｒα、ＨＬＡ-ＡＢＣ、およびＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱのＰ３細胞、ならびに一次抗体（ＩｇＧ-ＰＥおよびＩｇＧ-ＦＩＴＣ）を欠いたそれぞれのコントロールについてフローサイトメトリーが実施された。Ｐ４継代し培地を切り替えた細胞は、３日か４日ごとに継代して継代数８まで増殖させ、その時点で細胞表面マーカーに対するフローサイトメトリーが実施された。
増殖培地で増殖させ、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した改良型ＤＭＥＭに切り替えられた細胞で、逆の実験も行われた。臍由来（０６３００４Ｂ）産褥細胞は単離時から増殖培地で継代数１２まで増殖された。継代数１３で、細胞は改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦに切り替えられ、継代数１４まで増殖させ、その時点でフローサイトメトリーが実施された。同様に、臍由来（０９０３０４Ａ）産褥細胞は単離時から増殖培地で継代数８まで増殖され、その後継代数９で改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦに切り替えられた。培養は、継代数１０まで維持され、その時点でフローサイトメトリーが実施された。最後に、臍由来（０４２３０３）産褥細胞は単離時から増殖培地で継代数１０まで増殖され、その時点で１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加した増殖培地中で凍結保存され、液体窒素容器内に置かれた（実施例２７で述べられたようなプロトコル）。細胞は後に解凍され、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した改良型ＤＭＥＭ中で平方ｃｍあたり５，０００細胞でゼラチン被覆したフラスコに直接プレーティングされた。培養は、継代数３３まで維持され、その時点で興味がある細胞表面マーカーに対してフローサイトメトリーが実施された。
フローサイトメトリー
増殖培地（１５％ウシ胎児血清含有）での同等の細胞増殖と比較した場合に、改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）中での増殖が表面マーカーの発現を変化させるかどうかを判定するため、興味があるマーカーのフローサイトメトリー解析が行われた。陽性染色とバックグラウンドの間の蛍光レベルの差を明らかにするために、染色された試料の結果は適切なＩｇＧコントロールと比較された。
コントロール細胞の増殖条件
正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児と成人）が増殖培地でゼラチン被覆されたＴ７５フラスコ中で増殖された。間葉系幹細胞（ＭＳＣ， Ｃａｍｂｒｅｘ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）はＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ， Ｃａｍｂｒｅｘ）で増殖された。
全ＲＮＡの単離
ＲＮＡは、異なる条件で培養したコンフルエントの臍帯由来細胞から抽出された。またＲＮＡは線維芽細胞とＭＳＣから抽出された。細胞はβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む３５０μＬのＲＬＴ緩衝液を用いてメーカーの取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ； Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）に従って溶解され、ＲＮＡはメーカーの取扱い説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ； Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）に従って２．７Ｕ／試料のＤＮａｓｅ処理（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で抽出された。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理済みの水で抽出され、-８０℃で保存された。
逆転写
ＲＮＡは、ランダムへキサマーを用いて、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）で、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間の温度／時間サイクルを用いて逆転写された。試料は-２０℃で保存された。「***遺伝子」と呼ばれる遺伝子（酸化型ＬＤＬ受容体、インターロイキン-８、レニン、およびレティキュロン（reticulon））は、リアルタイムＰＣＲと従来のＰＣＲを用いて更に研究された。
リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡ試料に対して、Ａｓｓａｙｓ-ｏｎ-Ｄｅｍａｎｄ（商標）遺伝子発現産物を用いてＰＣＲが実施された。酸化型ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レティキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＩＬ-８（Ｈｓ００１７４１０３）およびＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）が、メーカーの取扱い説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に従って、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）と共に７０００配列検出系を用いて、ｃＤＮＡとＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間、および９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルだった。
従来型ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲの結果を裏付けるために、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）を用いて従来のＰＣＲが行われた。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液、１ｘＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、および最初の変性に９４℃で５分間を用いて行われた。増幅は、各プライマーセットのために至適化された。ＩＬ-８とレティキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３０サイクル）、レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３８サイクル）、酸化型ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３３サイクル）。増幅に用いられたプライマーは表２８−１に列挙された。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、０．５μＭだったＧＡＰＤＨを除いて１μＭだった。ＧＡＰＤＨプライマーは、メーカーのＴａｑＭａｎプローブが最終ＰＣＲ反応液に添加されなかった点を除いて、リアルタイムＰＣＲと同じだった。試料は、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで泳動され、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で染色された。６６７Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｗｉｎｐａｃｋ ｆｉｌｍ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）で焦点距離ＰｏｌａｒｏｉｄＴＭカメラ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）を用いて画像が取り込まれた。
Figure 0005340599
結果
改良型ＤＭＥＭと増殖培地で単離時から培養された細胞集団間の細胞表面マーカーの発現における差
実施例２７において、増殖培地および改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦ中で単離時から増殖させた臍由来産褥細胞は、フローサイトメトリーを用いて一連の細胞表面マーカーの抗体を用いて試験された。大部分のマーカーの発現は同様だったが、二つのマーカーは培地処方の間で発現が実質的に異なった。ＨＬＡ-ＡＢＣおよびＰＤＧＦｒ-αの両方が増殖培地中で発現されたが、改良型ＤＭＥＭではどちらも発現されなかった（実施例２７の表２７−３および表２７−４）。
細胞表面マーカーの発現に対する培地切り換えの影響
培地組成が細胞表面マーカーの発現の変化の原因であるかどうかを究明するために、臍由来産褥細胞は最初に前述の二つの培地組成の一つで培養され、次に他方の培地に切り換えられた。細胞が最初に改良型ＤＭＥＭ-ｂＦＧＦ中で培養され、後に増殖培地に切り換えられた場合、細胞培養は直ちに、継代数が上がるに従って段階的にＨＬＡ-ＡＢＣの発現を開始した。しかし、ＰＤＧＦ受容体αは継代数が上がっても発現は開始しないようだった。
細胞が最初に増殖培地で培養され、次に後から改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦに切り換えられた場合、ＨＬＡ-ＡＢＣの発現は短期間維持された（０６３００４Ｂ＋Ｐ１４、０９０３０４Ａ＋Ｐ１０）が、数継代後、ＨＬＡ-ＡＢＣ発現は失われた（０４２３０３＋Ｐ３３）。単離時から増殖培地のみで培養した細胞との比較では、ＰＤＧＦ受容体αの発現は、改良型ＤＭＥＭ＋ｂＦＧＦでの２回目の継代で早くも失われた。
ＨＬＡ-ＡＢＣおよびＰＤＧＦｒαに加えて、これらの分離株それぞれ(０４２３０３＋Ｐ３３は除く)のＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱの発現が試験された。維持された培地にかかわらず、全ての単離株が陰性だった。
ＰＣＲ結果
二つの異なる培地、成人線維芽細胞、および、ＭＳＣで培養したヒト臍帯由来細胞に由来する細胞のｃＤＮＡに対して行った選択された「***」遺伝子のリアルタイムＰＣＲの結果は、レティキュロンと酸化型ＬＤＬ受容体ＲＮＡのレベルは臍帯由来細胞で他の細胞タイプよりも高いことを示している。また結果は、***遺伝子の発現パターンは、細胞が単離時から改良型ＤＭＥＭ＋１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで、もしくは増殖培地で培養されようが、あるいは一方の培地から次に他方に切り換えられようが、培地にかかわらず変化しないことを裏付けた。リアルタイムＰＣＲの結果は、従来のＰＣＲで裏付けられた。酸化型ＬＤＬ受容体（０６３００４Ｂ Ｐ１４、０９０３０４Ａ Ｐ１０）のバンドは、存在したものの強度が低かったことは注目すべきである。従来型ＰＣＲは定量的でないため、見込まれる発現レベルの差はここでは識別することはできなかった。臍由来細胞は、胎盤由来細胞に存在したマーカーであるレニンを発現しなかった。
産褥由来細胞におけるサイトカイン、ＩＬ-８の発現は、増殖培地で培養した臍帯由来細胞と改良型ＤＭＥＭ＋１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで培養した臍帯由来細胞の両方で上昇した。この観察は、従来型ＰＣＲで裏付けられた。
考察と結論
増殖培地とｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した改良型ＤＭＥＭの間の細胞の切り換えは、ＰＰＤＣ細胞における細胞表面マーカーであるＨＬＡ-ＡＢＣおよびＰＤＧＦｒαの発現に影響する。試験が行われた条件下で、ＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱは検出されなかった。ＨＬＡ-ＡＢＣとＰＤＧＦｒαの発現は、細胞の増殖培地の変化に基づいて調節される可能性もある。この知見は、治療細胞の移植片または移植（grafts or implantation）の拒絶反応に対する重大な意味があり得る。ＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱマーカーは、培地組成にかかわらず少しも発現されなかった。
酸化型ＬＤＬ受容体やレティキュロンのような***遺伝子の発現は、臍由来産褥細胞の培養に用いられた培地の組成にかかわらず変化しなかった。これらの遺伝子のレベルは、ＭＳＣなどの他の細胞タイプよりも検出可能なほど更に高かったため、これらの遺伝子は臍由来産褥細胞を特定し識別するために実際に有用な***となる。別々の亜集団が臍由来細胞集団に存在している可能性があるかどうかが依然として問題だが、***遺伝子の発現プロフィールの一貫性は、何かその様な亜集団が互いに密接に関連しており、もしその他の細胞タイプを試験した場合には関係が更に隔たっているという強力な証拠である。
ＨＬＡ-ＡＢＣの発現が異なるという知見は、実際、ＨＬＡ-ＡＢＣ発現が調節されている可能性があることを示唆する。これが移植片不適合性に影響し得るかどうかは、このマーカーの発現を欠いた細胞集団が、ことによっては免疫抑制剤なしにより良好に生着する可能性があり得るという更なる興味の一つである。
ＰＤＧＦｒαが容易に遮断され、直ちには作動され得ないという知見は、増殖因子受容体の微妙な性質と迅速なターンオーバー、並びに発現のために非常に特別な増殖条件の必要性を示す可能性がある。当該の受容体（もしくは、例えば培地変化によるその他の任意の増殖因子受容体）の欠如を考えると、細胞の潜在力は、特定の動物モデルの枠組みで変化する可能性がある。
実施例２９
標準的増殖培地およびＢＭＥを含まない増殖培地、並びにゼラチン被覆およびＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆されたフラスコにおける臍由来細胞の増殖特性
ここに、また上記で述べたように、臍由来細胞はゼラチンで被覆された表面をもつフラスコ中に増殖培地で培養されることもできる。本実施例は、好適な細胞培養プロトコル中の二つの成分が必要かどうかを調査した。具体的には、調査されたのは、（１）標準的増殖培地の添加物としてのβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）が増殖に必要かどうか、また（２）ゼラチン（動物由来のタンパク質）が細胞培養フラスコの被覆として必要かどうかだった。更に、接着を促進する合成被覆剤であるＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）の有効性がゼラチンもしくはその他の動物由来の製品の代替物として試験された。ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）は、ポリスチレン表面の芳香族基を減少させるために高度に反応性のプラズマを用いる、特許され、市販されているフラスコ被覆剤である。
材料と方法
試薬：ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）から入手された。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（定義済みウシ血清）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）から入手された。β−メルカプトエタノールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手された。
実験計画：臍由来細胞は、二つの培地（増殖培地とＢＭＥを含まない増殖培地）とゼラチンもしくはＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）のいずれかで被覆された容器で単離された。従って、４つの条件のセット、（１）ゼラチン被覆／増殖培地（普通条件）（２）ＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）被覆／増殖培地（３）ゼラチン被覆／ＢＭＥを含まない増殖培地（４）ＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）被覆／ＢＭＥを含まない増殖培地が試験された。細胞は、指定のセットの条件下で単離株から老化まで連続的に継代された。培地と容器の表面被覆の影響を測定し、増殖における変化を評価するために、各セットの条件下で集団増殖動態が計算された。表現型の変化の最初のスクリーニングとして、一連の細胞表面マーカーの発現が評価された。
細胞：完全な同意を得て、National Disease Research Interchange（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｉａ， ＰＡ）を通じて臍帯が一つ入手され、ほぼ等しいサイズの２片に分けられた。
単離方法と培地：産褥細胞は、一般的に本明細書で前述されたように単離された。組織は細かく切り刻まれ、ほぼ等しく分割された。一部分は標準的増殖培地（ＤＭＥＭ：低グルコース、１５％ＦＢＳ；β−メルカプトエタノール（１００ｍＬあたり１μＬ）；５０μＬ／ｍＬのペニシリン／５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｍＬあたり１ｍＬ（ｍＬあたり１０，０００単位）））中で単離された。別の一部分は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない前述の増殖培地（Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ｗ／ｏ ＢＭＥ）中で単離された。
細胞の培養：臍帯組織の各部分から単離された細胞は、ゼラチン被覆したＴ２２５フラスコとＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆したＴ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、細胞が単離された培地と同じ培地に３，０００細胞／ｃｍ2で播種された。細胞は３７℃で、加湿した５％ＣＯ2大気中で培養された。細胞が約８５％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理をおこなって計数された。生存細胞は、新しいフラスコに適切な培地と表面被覆と共に５，０００細胞／ｃｍ2で播種された。細胞収量、集団倍加（Ｉｎ（細胞最終／細胞初期）／Ｉｎ２）と倍加時間（培養時間（時間）／集団倍加）が各継代毎に測定された。過程は細胞が老化に達するまで、即ち、細胞が増殖能を失ったように見える、あるいはそれ以上の増殖ができなくなるまで、繰り返された。
細胞表面マーカーの解析：細胞表面マーカーは、前述されたようにフローサイトメトリーで本質的に解析された。解析は、継代数３、７、および１５でゼラチン上で標準的増殖培地もしくはＢＭＥを含まない増殖培地のいずれかで培養された細胞に対して、また継代数７でＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆上で増殖培地もしくはＢＭＥを含まない増殖培地のいずれかで培養された細胞に対して実施された。具体的には、トリプシン処理と計数後、試料あたり５００，０００細胞が３％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水１００μＬに懸濁された。解析されるマーカーに一致する抗体２０μＬが各試料に添加された。細胞は４℃で１時間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は３ｍＬのＰＢＳで１回洗浄され、０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁された。試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析され、結果は付属のソフトウェア（Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ， ＢＤ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いて編集された。
結果
臍帯から単離された細胞は、ＢＭＥを含むもしくは含まない培地で、ゼラチン被覆された容器もしくはＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆された容器のいずれかで培養されても良い。これらの実験において増殖の最大速度（０．５１倍加／日）が、ＢＭＥを含まない増殖培地でゼラチン被覆されたフラスコで観察された。臍由来細胞は、一日当たりの倍加のより大きな数字に反映されるように、一日当たりの倍加０．３３に対して（標準的増殖培地／ゼラチン）一日当たりの倍加０．５１（ＢＭＥを含まない増殖培地／ゼラチン）で、ＢＭＥを含まない増殖培地でより速い速度で増殖した。細胞はＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆された表面上で、ＢＭＥを含むもしくは含まない培地で増殖した。
増殖培地もしくはＢＭＥを含まない増殖培地のいずれかでゼラチン被覆した容器で培養された臍由来細胞は、約１２０日まで増殖することができた。また増殖培地もしくはＢＭＥを含まない増殖培地のいずれかでＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆した容器で培養された臍由来細胞は、約１０３日まで増殖することができた。
細胞表面マーカーは、継代数３、７、１５でゼラチン被覆した容器でＢＭＥを含むもしくは含まない培地で培養した細胞に対して、また継代数７でＣＥＬＬＢＩＮＤ被覆上でいずれかの増殖培地で培養された細胞に対して、フローサイトメトリーで解析された。結果は解析された細胞表面マーカーの発現パターンに反映されるように、表現型変化の証拠を全く示さなかった。結果を下の表２９−１に示す。
Figure 0005340599
要約：結果は、臍由来細胞はＢＭＥを含まない培養中で増殖可能であるという証拠をもたらした。
実施例３０
臍帯組織からの細胞単離のための代替条件
前述のように血清を含む基礎的細胞培養培地処方での組織処理方法を用いて、ヒト臍帯組織からの細胞集団単離のための最初の試みが行われた。ここでは、いくつかの異なる培地処方の存在下での、細かく切り刻んだ臍帯組織からの単離細胞のための代替方法と培養条件が述べられる。別の目的は、代替の単離条件が過去に特性づけられていない新しい細胞タイプの増殖が可能かどうかを判定することである。単離時からこれらの異なる条件下で培養した臍由来細胞の次の特性に関して明らかにされた。（１）長期培養の可能性、（２）細胞表面マーカーの表現型、（３）幹細胞特異的遺伝子の発現、および（４）栄養因子の産生。データは、臍由来細胞が様々な培地組成と培養条件を用いて単離され得ることを示す。
材料と方法
試薬。
ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水、ペニシリンとストレプトマイシン、およびディスパーゼは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）から入手された。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（定義済みウシ血清）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）から入手された。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびβ−メルカプトエタノールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手された。
ヒト臍帯からの細胞単離：ヒト臍帯は正常分娩後にNational Disease Research Interchange（ＮＤＲＩ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｉａ， ＰＡ）を通じて入手された。血液と残がいを取り除くため、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ低グルコース）もしくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄された。次に組織は、細かいパルプへと細かく刻まれるまで組織培養プレート中で機械的に分離された。細かくされた組織は５０ｍＬのコニカルチューブに移され、５００単位／ｍＬコラゲナーゼ、５００単位／ｍＬディスパーゼ、および５０単位／ｍＬヒアルロニダーゼを含む酵素混合液中で消化された。酵素混合液は、下記の表３０−１に概説されたように、個別の培地処方（「テスト培養培地」）と混合された。組織、培地、および消化酵素を含むコニカルチューブは、オービタルシェーカーで２２５ｒｐｍで２時間、３７℃でインキュベートされた。
消化後、組織は１５０ｘｇで５分間遠心され、上澄みが吸引除去された。ペレットは２０ｍＬのテスト培養培地（表３０−１）に再懸濁された。細胞懸濁液は、４０μｍのナイロンＢＤ ＦＡＬＣＯＮ Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を通じて濾過された。濾過物は培地（全体積＝５０ｍＬ）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心された。上澄みは再度吸引除去され、細胞は５０ｍＬの新しいテスト培養培地に再懸濁された。この処理は２回繰り返された。
最後の遠心後、上澄みは吸引除去され、細胞ペレットは５ｍＬの新しいテスト培養培地に再懸濁された。生存細胞の数は、Ｇｕａｖａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）を用いて測定された。細胞は次にプレーティング(plate)され、３００細胞／ｃｍ2、２，０００細胞／ｃｍ2、もしくは５，０００細胞／ｃｍ2の密度でゼラチン被覆した組織培養フラスコに播種された。細胞は、培地中で表３０−１に述べられた条件下で培養された。増殖培地コントロールは、各種類の培地の単離株の生存率測定に用いられた。
Figure 0005340599
ＦＡＣｓ解析：表３０−１で述べられた培地処方と培養条件に従って培養された臍由来細胞でフローサイトメトリー解析が行われた。細胞は４から５継代テスト培養培地でゼラチン被覆したＴ２２５フラスコに３７℃、５％ＣＯ2で培養された。接着した細胞はＰＢＳで洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離された。細胞は回収、遠心され、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＰＢＳに１ｘ１０7細胞／ｍＬの濃度で再懸濁された。１００μＬの細胞懸濁液に特異的な抗体が添加され、混合液は暗所で３０〜４５分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞はＰＢＳで洗浄され、次に過剰な抗体を除くために遠心された。細胞はＰＢＳ（５００μＬ）に再懸濁され、フローサイトメトリーで解析された。フローサイトメトリー解析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて行われた。使用された抗体は、表３０−２に示される。
Figure 0005340599
全ＲＮＡの単離：ＲＮＡは、異なる条件で培養したコンフルエントの臍帯由来細胞から抽出された（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ； Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理済みの水で抽出され、-８０℃で保存された。
逆転写：ＲＮＡは、ランダムへキサマーを用いて、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）で、２５℃１０分間、３７℃６０分間、および９５℃１０分間で逆転写された。試料は-２０℃で保存された。酸化型ＬＤＬ受容体、インターロイキン-８、およびレティキュロンの発現がリアルタイムＰＣＲと従来のＰＣＲで検討された。
リアルタイムＰＣＲ：ＰＣＲは、ｃＤＮＡ試料に対してＡｓｓａｙｓ-ｏｎ-Ｄｅｍａｎｄ（商標）遺伝子発現産物を用いて実施された。レニン（Ｈｓ００１６６９１５）、酸化型ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レティキュロン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）（Ｈｓ００３８２５１５）、ＩＬ-８（Ｈｓ００１７４１０３）およびＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）がメーカーの取扱い説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に従って、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）と共に７０００配列検出系を用いて、ｃＤＮＡとＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間、および９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間の４０サイクルだった。
従来型ＰＣＲ：リアルタイムＰＣＲの結果を裏付けるために、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）を用いて従来のＰＣＲが行われた。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液、１ｘＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、および最初の変性に９４℃で５分間を用いて行われた。増幅は、各プライマーセットのために至適化された。ＩＬ-８とレティキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３０サイクル）、レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３８サイクル）、酸化型ＬＤＬ受容体とＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および、７２℃で３０秒間で３３サイクル）。増幅に用いられたプライマーは表３０−３に列挙された。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、０．５μＭだったＧＡＰＤＨを除いて１μＭだった。ＧＡＰＤＨプライマーは、メーカーのＴａｑＭａｎプローブが最終ＰＣＲ反応液に添加されなかった点を除いて、リアルタイムＰＣＲと同じだった。試料は、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで泳動され、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で染色された。６６７Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｗｉｎｐａｃｋ ｆｉｌｍ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）で焦点距離カメラ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， ＮＪ）を用いて画像が取り込まれた。
Figure 0005340599
ＥＬＩＳＡ：異なる単離条件由来の凍結した臍由来細胞は、継代数４で解凍され、各１５ｍＬのそれぞれの増殖培地（表３０−１）を含んだゼラチン被覆したＴ７５フラスコに５，０００細胞／ｃｍ2で播種された。細胞は３７℃、５％二酸化炭素と大気中酸素で２４時間培養された。培地は次に血清を含まない培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ））に交換され、更に８時間培養された。血清を含まない条件培地はインキュベーションの最後に１４，０００ｘｇで５分間の遠心で回収され、-２０℃で保存された。
各フラスコの細胞数を推定するため、細胞はＰＢＳで洗浄され、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて剥離された。細胞数はＧｕａｖａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）を用いて推定された。試料は次に、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子-１(tissue inhibitor of metalloprotease-1)（ＴＩＭＰ１）、血小板由来上皮増殖因子ｂｂ(platelet-derived epithelial growth factor bb)（ＰＤＧＦｂｂ）、ケラチン生成細胞増殖因子(Keratinocyte growth factor)（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor)（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ-ＥＧＦ）、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子-２(tissue inhibitor of metalloprotease-2)（ＴＩＭＰ２）、単球走化性タンパク質-１（ＭＣＰ１）、インターロイキン-６（ＩＬ６）、インターロイキン-８（ＩＬ８）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ストロマ由来因子１Ｂ(stromal-derived factor IB)（ＳＤＦ１Ｂ）、繊毛様神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)（ＣＮＴＦ）、塩基性神経成長因子（ｂＮＧＦ）、ニューロトロフィン-３(neurotrophin-3)（ＮＴ３）についてアッセイされた。
結果
臍由来細胞の単離
臍由来細胞は、表３０−１に識別された、異なる培地組成と培養条件を用いて単離された。単離された一部の細胞集団は、正常酸素圧と低酸素圧（５％酸素）の両方の大気条件下で培養された。また細胞は、低密度（３００細胞／ｃｍ2）と高密度（２，０００細胞／ｃｍ2）の初期密度も用いて単離された。増殖培地と増殖条件の組合せ１０通りが臍由来細胞の増殖を維持した。これらは、全て正常酸素圧と低酸素圧大気条件下の両方での、ＥＧＭ２、ＲＥＧＭ、およびＳＭＧＭ２、を含む。それぞれ正常酸素圧と低酸素圧大気条件下の両方でのソニック・ヘッジホッグ培地(Sonic hedgehog medium)とＫＧＭも細胞増殖を維持した。
長期増殖解析
臍由来細胞の増殖を維持する培地処方が選択され、細胞は継代数４または５から増殖され、ゼラチン被覆したプレート上で５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種された。細胞集団は、数週間、老化に達するまで継続的に継代された。細胞が調査時間間隔の間の集団倍加１以上に達しなかった場合に、老化と判定された。
いくつかの単離株が長期増殖能について試験され、継代数４以上の増殖が示された（表３０−４）。ＳＭＧＭ２培地中に低酸素圧条件下で単離されたＵｍｂ０３２９０５は、集団倍加３２以上の最も堅調な増殖能を示した。集団は、低密度播種で単離された細胞では７４日で、高密度播種で単離された細胞は６４日で老化に達した。正常酸素圧条件もしくは低酸素圧条件で培養されＲＥＧＭ中で単離されたｕｍｂ０５２４０５で、中程度の増殖能が観察された（単離３、４）。これらの条件は、それぞれ集団倍加１８と１０が得られた。
Figure 0005340599
フローサイトメトリーによる表面マーカーの表現型解析
異なる単離条件から作成された細胞集団は、フローサイトメトリーで特性付けされた。単離条件２２のうち、１０系統の細胞株が継代数４まで培養され、細胞表面マーカープロフィールが特定された。大部分の細胞単離株は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＨＬＡ-ＡＢＣに陽性の染色を示した。試験された条件下では、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１８４、およびＨＬＡ-ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの表面発現は陰性だった。大部分のマーカーが、その他の細胞単離株と同様に上述の実施例で述べられた好適な条件を用いた細胞単離と同様の発現パターンを示した。
ＲＴ-ＰＣＲ解析
臍由来細胞単離株は、臍由来細胞特異的遺伝子と幹細胞特異的遺伝子の発現について解析された。表３０−５に提供されたデータは、全単離条件に由来する細胞がレティキュロン、ＬＤＬ-Ｒ、およびＩＬ-８を発現したことを示す。表３０−５は、異なる培地処方で培養したヒト臍帯由来細胞のｃＤＮＡに対して行ったリアルタイムＰＣＲの結果を示す。結果は、興味ある遺伝子と内部コントロールのＧＡＰＤＨの転写の間の閾値サイクル数（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（ＣＴ））の比として表現される。データは、レティキュロン、酸化型ＬＤＬ受容体、およびＩＬ-８の発現レベルが全て類似していたことを示す。
Figure 0005340599
栄養因子産生解析
８分離株について、異なる増殖因子とサイトカインの産生が解析された（表３０−６）。全ての臍由来細胞単離条件は、比較的多量（＞３０ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）の組織性メタロプロテアーゼ阻害因子-１（ＴＩＭＰ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ-ＥＧＦ）、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子-２（ＴＩＭＰ２）、インターロイキン-８（ＩＬ８）、ストロマ由来因子１Ｂ（ＳＤＦ１ｂ）を分泌する細胞集団をもたらした。検出不能な低量（＜３０ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）の血小板由来上皮増殖因子ｂｂ（ＰＤＧＦｂｂ）、塩基性神経増殖因子（ＮＧＦ）、およびニューロトロフィン-３（ＮＴ３）が同じ試料から検出された。
ＥＧＭ２培地で単離された細胞は、ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などの、低量の多くの栄養因子を産生する細胞集団を生じた。しかし、これらの細胞株は、試験された他の細胞株と比較して多量のインターロイキン-６（ＩＬ６）を産生した。ＳＭＧＭ２で普通の大気下に低密度播種で単離した細胞は非常に多量（４，７３７ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）のＨＧＦを産生した。またこれらの細胞は、他の単離条件と比較して非常に多量のＴＩＭＰ２（２６，００２ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）も分泌した。これらの細胞により、試験された他の細胞株よりもやや多量（３９．６ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）のＴＧＦαが産生された。
代替単離条件は、様々な量のＶＥＧＦを分泌する細胞集団も提供した。ＲＥＧＭで正常酸素圧と低酸素圧条件下で単離された臍由来細胞は、比較的多量のＶＥＧＦ（それぞれ、６４．８ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞と１３１．６ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０6細胞）を産生した。その他の単離条件と増殖条件は、比較的低いＶＥＧＦ分泌を示した。
Figure 0005340599
考察
ヒト臍帯組織から細胞を単離するために、異なる培地処方と培養条件が用いられた。しかし、これらの代替単離条件は、最初にこれらの細胞を単離して特徴づけるのに用いた条件を用いて単離した細胞と類似していると思われる細胞を得た。
表面マーカープロフィール、および遺伝子発現解析に基づき、代替条件を用いて単離された細胞は、増殖培地で最初の条件下で単離された細胞タイプとおなじ細胞タイプをもたらした。更に、試験された全ての単離条件から得られた細胞は、同様の栄養因子分泌プロフィールを示した。代替単離条件は程度の差はあれ一つ以上の特定の因子を産生する一部の細胞を刺激する可能性があり、これは治療的使用への応用になる可能性もある。
長期の増殖能は、同種異系に基づく細胞治療のための細胞を作出するための代替単離条件の能力評価のための重要な測定値である。表３０−１に述べられた条件は、一般的に集団倍加がほぼ５まで増殖可能な細胞集団を得た。
長期増殖能、表面マーカー表現型、***遺伝子発現、幹細胞特異的遺伝子発現、および栄養因子産生の比較を鑑みると、これらの細胞集団は標準的条件を用いて単離した細胞と同様であると思われる。
臍由来細胞と培養の生物学的蓄積
本明細書に提供された詳細な説明と前述の実施例と一致して、本発明の臍由来細胞の実施例は、２００４年６月１０日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）に登録され、以下の通りのＡＴＣＣ受託番号が与えられた。（１）系統記号ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）は、受託番号ＰＴＡ-６０６７が与えられ、（２）系統記号ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）は、受託番号ＰＴＡ-６０６８が与えられた。
本発明は現時点で好適な実施態様を参照して具体的に示され、述べられてきたが、本発明が本明細書に具体的に開示され例示された実施例に限定されないことは予め知られている。添付の特許請求の範囲に説明されるように、数多くの変化と改良が本発明の好適な実施態様に対して行われ、数多くの変化と改良が本発明の範囲と精神から逸脱せずに行われる可能性がある。
〔実施の態様〕
（１）
実質的に血液を含まない哺乳類臍帯組織から由来する細胞を含む単離された臍由来細胞において、
前記細胞は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、細胞。
（２）
実施態様（１）に記載の単離細胞において、
約５％〜約２０％の酸素の存在下で拡大培養可能である、細胞。
（３）
実施態様（２）に記載の細胞において、
増殖にＬ−バリンを必要とする、細胞。
（４）
実施態様（３）に記載の単離細胞において、
約１０3細胞／ｃｍ2で播種された場合に、培養約８０日以内に約１０14細胞を超える収量を得るのに十分に倍加可能である、細胞。
（５）
実施態様（３）に記載の単離細胞において、
約５×１０3細胞／ｃｍ2で播種された場合に、培養約８０日以内に約１０15細胞を超える収量を得るのに十分に倍加可能である、細胞。
（６）
実施態様（５）に記載の単離細胞において、
約５×１０3細胞／ｃｍ2で播種された場合に、培養約６５日以内に約１０17細胞を超える収量を得るのに十分に倍加可能である、細胞。
（７）
実施態様（３）に記載の単離細胞において、
培養において少なくとも４０回の倍加を受けることができる、細胞。
（８）
実施態様（３）に記載の細胞において、
ヒト臍から単離された、細胞。
（９）
実施態様（８）に記載の単離細胞において、
メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、または粘液溶解酵素を含む１以上の酵素活性の存在下で単離された、細胞。
（１０）
実施態様（９）に記載の単離細胞において、
前記酵素活性は、少なくとも１つのコラゲナーゼと、プロテアーゼ活性、ディスパーゼおよびサーモライシンの１以上を含む、細胞。
（１１）
実施態様（９）に記載の単離細胞において、
前記酵素活性は、ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼおよびディスパーゼである、細胞。
（１２）
実施態様（１１）に記載の単離細胞において、
前記酵素活性は、ヒアルロニダーゼをさらに含む、細胞。
（１３）
実施態様（１２）に記載の単離細胞において、
コートまたは非コート組織培養容器において接着（attach）および拡大培養（expand）し、
コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ポリリジン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンによるコーティングを含む、細胞。
（１４）
実施態様（１３）に記載の単離細胞において、
約２％〜約１５％の付加的血清の存在下、β−メルカプトエタノールの存在または不在下、およびＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦまたはＬＩＦを含む付加的増殖因子の存在または不在下で拡大培養する、細胞。
（１５）
細胞培養物において、
実施態様（１）の単離細胞を含み、
母体細胞を含まない、細胞培養物。
（１６）
実施態様（１）に記載の単離細胞において、
継代培養されても正常な核型を維持する、細胞。
（１７）
実施態様（１）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ−α、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＣおよびＨＬ−Ｄｒ，ＤＰ，ＤＱを含む１以上の細胞表面マーカーの産生または産生の欠如で特徴付けられる、細胞。
（１８）
実施態様（１７）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの１以上を産生する、細胞。
（１９）
実施態様（１８）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの各々を産生する、細胞。
（２０）
実施態様（１７）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱの１以上を産生しない、細胞。
（２１）
実施態様（２０）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの１以上を産生する、細胞。
（２２）
実施態様（２０）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱのいずれも産生しない、細胞。
（２３）
実施態様（２２）に記載の単離細胞において、
前記細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの各々を産生する、細胞。
（２４）
細胞表面マーカープロフィールを有する単離されたＣＤ４５-臍由来細胞において、
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、またはＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの１以上を産生し、かつ、
フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、またはＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱの１以上を発現しない、細胞。
（２５）
実施態様（２４）に記載の単離細胞において、
前記細胞表面マーカー発現プロフィールは、継代培養、培養容器表面コーティング、または単離手順によって実質的に変化しない、細胞。
（２６）
実施態様（２５）に記載の単離細胞において、
インターロイキン８；レティキュロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；または腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3)のうち１以上の遺伝子を発現する、細胞。
（２７）
実施態様（２６）に記載の単離細胞において、
インターロイキン８；レティキュロン(reticulon)１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各々の遺伝子を発現する、細胞。
（２８）
実施態様（２７）に記載の単離細胞において、
前記発現は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、または胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現よりも増大(increase)されている、細胞。
（２９）
実施態様（２５）に記載の単離細胞において、
繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒトｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現が低減されている、細胞。
（３０）
実施態様（２９）に記載の単離細胞において、
インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；または腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３のうち１以上の遺伝子を発現し、
前記発現は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜骨髄細胞、または胎盤由来細胞であるヒト細胞の発現よりも増大されている、細胞。
（３１）
実施態様（２９）に記載の単離細胞において、
繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒトｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａの各々の遺伝子の発現が低減されている、細胞。
（３２）
実施態様（３１）に記載の単離細胞において、
インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各々の遺伝子を発現し、
前記発現は、繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞の発現よりも増大されている、細胞。
（３３）
単離されたヒト臍由来細胞において、
繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒトｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤの各々の遺伝子の発現が低下しており、かつ、
インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３の各々の遺伝子を発現し、その発現が繊維芽細胞、間葉幹細胞、腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞の発現に比べて増大されている、細胞。
（３４）
実施態様（３３）に記載の単離細胞において、
自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する、細胞。
（３５）
実施態様（３４）に記載の単離細胞において、
ビメンチンおよびα平滑筋アクチンの一方または双方を産生する、細胞。
（３６）
実施態様（３５）に記載の単離細胞において、
ビメンチンとα−平滑筋アクチンの双方を産生する、細胞。
（３７）
実施態様（３６）に記載の単離細胞において、
ビメンチンおよびα平滑筋アクチンの産生が増殖条件下での継代培養中保持される、細胞。
（３８）
治療用細胞培養物において、
実施態様（３４）の細胞を含む、治療用細胞培養物。
（３９）
実施態様（３８）に記載の治療用細胞培養物において、
同種異系のＰＢＭＣを実質的に刺激しない、細胞培養物。
（４０）
実施態様（３９）に記載の治療用細胞培養物において、
フローサイトメトリーにより同定される、検出可能な量のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を欠いている、細胞培養物。
（４１）
実施態様（４０）に記載の治療用細胞培養物において、
フローサイトメトリーにより同定される、検出可能な量のＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８をさらに欠いている、細胞培養物。
（４２）
実施態様（４１）に記載の治療用細胞培養物において、
フローサイトメトリーにより同定される、検出可能な量のＰＤ−Ｌ２を産生する、細胞培養物。
（４３）
実施態様（３４）に記載の治療用細胞培養物において、
混合リンパ球反応において同種異系対照と比べ、インビトロでリンパ球により媒介される応答を実質的に刺激しない、細胞培養物。
（４４）
自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する単離されたヒト臍由来細胞において、
ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞を実質的に刺激せず、かつ、ＰＤ−Ｌ２を発現するが、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ１７８、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＢ７−Ｈ２を発現しない、細胞。
（４５）
実施態様（４４）に記載の単離細胞において、
ビメンチンとα−平滑筋アクチンの双方を産生する、細胞。
（４６）
実施態様（４４）に記載の単離細胞において、
１以上の細胞因子を分泌する、細胞。
（４７）
実施態様（４６）に記載の単離細胞において、
因子は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１である、細胞。
（４８）
実施態様（４７）に記載の単離細胞において、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、およびＴＩＭＰ１の各々を分泌する、細胞。
（４９）
実施態様（４４）に記載の単離細胞において、
ＥＬＩＳＡにより検出される細胞因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦのうち１以上を分泌しない、細胞。
（５０）
実施態様（４９）に記載の単離細胞において、
因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、およびＴＩＭＰ１のうち１以上を分泌する、細胞。
（５１）
実施態様（５０）に記載の単離細胞において、
因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、およびＴＩＭＰ１の各々を分泌する、細胞。
（５２）
実施態様（４９）に記載の単離細胞において、
ＥＬＩＳＡにより検出される因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦをいずれも分泌しない、細胞。
（５３）
実施態様（５２）に記載の単離細胞において、
因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１のうち１以上を分泌する、細胞。
（５４）
実施態様（５３）に記載の単離細胞において、
因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、およびＴＩＭＰ１の各々を分泌する、細胞。
（５５）
単離されたヒト臍由来細胞において、
因子ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１のうち１以上のを分泌するが、ＥＬＩＳＡにより検出される因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦの１以上を分泌しない、細胞。
（５６）
実施態様（５５）に記載の単離細胞において、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、およびＴＩＭＰ１の各々を分泌する、細胞。
（５７）
実施態様（５０）に記載の単離細胞において、
ＥＬＩＳＡにより検出される因子ＳＤＦ−１α、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂまたはＶＥＧＦをいずれも分泌しない、細胞。
（５８）
治療用細胞培養物において、
実施態様（５５）の単離細胞を含む、治療用細胞培養物。
（５９）
実施態様（５８）に記載の治療用細胞培養物において、
製薬上許容される担体、別の細胞培養物、抗アポトーシス化合物、抗血栓性化合物、抗炎症性化合物、免疫抑制化合物、免疫調節化合物、脈管形成因子、および神経栄養因子のうち１以上をさらに含む、細胞培養物。
（６０）
臍帯組織から単離細胞を誘導（derive）する方法において、
前記細胞は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有し、
前記方法は、
（ａ）臍帯組織を採取する工程と；
（ｂ）実質的に全ての血液を除去して、実質的に血液を含まない臍帯組織を得る工程と；
（ｃ）機械的処理もしくは酵素的処理、またはその双方により組織を解離させる工程と；
（ｄ）前記組織を培養培地に再懸濁させる工程と；
（ｅ）自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有する臍由来細胞（umbilicus-derived cell）の増殖を可能とする増殖条件を提供する工程と；
を含む、方法。
（６１）
実施態様（６０）に記載の方法において、
培養約１０〜約１００時間後に接着細胞を選択する工程、
をさらに含む、方法。
（６２）
実施態様（６１）に記載の方法において、
前記臍組織がヒト由来である、方法。
（６３）
実施態様（６２）に記載の方法において、
前記誘導された細胞（derived cell）は、２％〜約１５％の付加的血清を含む培地中、付加的増殖因子の不在下で拡大培養可能である、方法。
（６４）
実施態様（６３）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、約５％〜約２０％の酸素の存在下で拡大培養可能である、方法。
（６５）
実施態様（６４）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、Ｌ−バリンの不在下で維持することができない、方法。
（６６）
実施態様（６５）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、培養で少なくとも４０回の倍加を受け得る、方法。
（６７）
実施態様（６５）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、約５×１０3細胞／ｃｍ2で播種された場合に、培養約６５日以内に少なくとも約１０17細胞を生成するのに十分に倍加可能である、方法。
（６８）
実施態様（６２）に記載の方法において、
前記臍帯組織は、満期妊娠または早産妊娠からの自然出産または外科的補助出産後に得られる、方法。
（６９）
実施態様（６０）に記載の方法において、
前記解離工程は、メタロプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、および中性プロテアーゼからなる群から選択される１以上の酵素活性の使用を含む、方法。
（７０）
実施態様（６９）に記載の方法において、
前記酵素活性は、コラゲナーゼおよびディスパーゼである、方法。
（７１）
実施態様（７０）に記載の方法において、
前記酵素活性は、ヒアルロニダーゼをさらに含む、方法。
（７２）
実施態様（７１）に記載の方法において、
前記解離工程は、約３７℃でインキュベートすること（incubating）を含む、方法。
（７３）
実施態様（７２）に記載の方法において、
前記インキュベーション（incubating）は、１時間以上である、方法。
（７４）
実施態様（７２）に記載の方法において、
前記インキュベーションは、約２時間である、方法。
（７５）
実施態様（６９）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、コートまたは非コート組織培養容器において接着および拡大培養し、
前記コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ポリリジン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンによるコーティングを含む、方法。
（７６）
実施態様（６９）に記載の方法において、
前記誘導された細胞は、約２％〜約１５％のウシ胎児血清の存在下、β−メルカプトエタノールの存在または不在下、ならびにＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦおよびＬＩＦを含む１以上の付加的増殖因子の存在または不在下で拡大培養する、方法。
（７７）
実施態様（６０）に記載の方法において、
前記除去工程は、洗浄、吸引、ブロッティング、遠心分離、または酵素的除去のうち１以上による、遊離の血液もしくは凝固した血液を除去することを含む、方法。
（７８）
実施態様（６０）に記載の方法において、
前記解離工程は、無菌的に実施される、方法。
（７９）
実施態様（７８）に記載の方法において、
前記解離工程は、細断、ブレンド、ホモジナイズ、または摩砕のうち１以上を含む、方法。
（８０）
単離されたヒト臍由来細胞のにおいて、
実施態様（６９）に記載の方法により誘導される、細胞。
（８１）
実施態様（８０）に記載の単離細胞において、
継代培養しても正常な核型を維持する、細胞。
（８２）
ヒト臍由来細胞の治療用培養物において、
前記ヒト臍由来細胞は、実施態様（６９）に記載の方法により誘導され、
母体細胞を含まない、培養物。
（８３）
細胞馴化培養培地において、
実施態様（１５）または実施態様（８２）に記載の培養物の増殖により生成される、細胞馴化培養培地。
（８４）
実施態様（８３）に記載の細胞馴化培地において、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１のうち１以上を含む、細胞馴化培地。
（８５）
哺乳類細胞培養物において、
実施態様（８４）に記載の細胞馴化培地と、
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、またはＴＩＭＰ１を必要とする哺乳類細胞と、
を含む、哺乳類細胞培養物。
（８６）
実施態様（１５）または実施態様（８２）に記載の培養物において、
臍由来細胞と、
任意の表現型の別の哺乳類細胞と、
を含む、培養物。
（８７）
実施態様（８６）に記載の培養物において、
前記臍由来細胞に加えてヒト細胞系統を含む、培養物。
（８８）
三次元マトリックスにおいて、
実施態様（１）に記載の臍由来細胞を含む、マトリックス。
（８９）
実施態様（８８）に記載の三次元マトリックスにおいて、
生体適合性または生体吸収性ポリマーを含む、マトリックス。
（９０）
実施態様（８９）に記載の三次元マトリックスにおいて、
ＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー、ＰＣＬ／ＰＧＡコポリマー、または自己集合ペプチドを含む、マトリックス。
（９１）
移植可能な組織構造において、
実施態様（８９）に記載のマトリックスを含む、構造。
（９２）
移植可能なデバイスにおいて、
実施態様（８２）に記載の治療用細胞を含む、デバイス。
（９３）
移植可能なヒト組織マトリックスにおいて、
実施態様（８０）に記載の細胞を含む、マトリックス。
（９５）
ヒト組織において、
実施態様（８）に記載の細胞を含む、組織。
（９６）
細胞溶解物において、
実施態様（８）に記載の細胞から誘導された、細胞溶解物。
（９７）
可溶性細胞画分において、
実施態様（８）に記載の細胞から誘導された、可溶性細胞画分。
（９８）
膜富化細胞画分において、
実施態様（８）に記載の細胞から誘導された、膜富化細胞画分。
（９９）
細胞外膜画分において、
実施態様（８）に記載の細胞から誘導された、細胞外膜画分。
（１００）
注射可能な治療用細胞において、
実施態様（４４）に記載の単離されたヒト臍由来細胞を含む、治療用細胞。
（１０１）
実施態様（１００）に記載の注射可能な細胞において、
組織因子を不活性化するために処置される、細胞。
（１０２）
実施態様（１０１）に記載の注射可能な細胞において、
前記処置は、抗組織因子抗体を伴う、細胞。
（１０３）
単離された産褥由来細胞において、
実質的に血液を含まないヒト産褥組織から誘導されたＬ−バリン要求細胞、
を含み、
前記細胞は、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、心筋細胞表現型の細胞へ分化する能力を有し、
前記細胞は、約５％〜少なくとも約２０％の酸素を含む雰囲気下で増殖可能であり、
前記細胞は、次の特徴：
培養において少なくとも約４０回の倍加能；
コートまたは非コート組織培養容器における接着（attachment）および拡大培養（expansion）であって、前記コート組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む、接着および拡大培養；
組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；
フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；
インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３のうち少なくとも１つの発現；
繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒトｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａのうち少なくとも１つが低減されている発現；
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；および、
ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１β、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如；
のうち少なくとも１つの特徴を含む、細胞。
（１０４）
実施態様（１０３）に記載の単離された産褥由来細胞において、
前記細胞は、次の特徴：
培養において少なくとも約４０回の倍加能；
コートまたは非コート組織培養容器における接着および拡大培養（該コート組織培養容器はゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンのコーティングを含む）；
組織因子、ビメンチン、およびα−平滑筋アクチンのうち少なくとも１つの産生；
ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうち少なくとも１つの産生；
フローサイトメトリーにより検出されるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうち少なくとも１つの産生の欠如；
インターロイキン８；レティキュロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫増殖刺激活性α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；および腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３のうち少なくとも１つの発現；
繊維芽細胞、間葉幹細胞、または腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞に比べ、低身長ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（間質細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上部狭窄症、ウィリアムス−ビューレン症候群）；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２）；間充織ホメオボックス２（成長停止特異的ホメオボックス）；sine oculisホメオボックスホモログ１（ショウジョウバエ）；クリスタリンαＢ；形態形成のdisheveled関連アクチベーター２；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１に類似；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；src homology three（ＳＨ３）およびシステイン豊富ドメイン；Ｂ細胞転移遺伝子１、抗増殖因子；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；runt関連転写因子３；機能未知タンパク質ＦＬＪ２３１９１；インターロイキン１１受容体α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；frizzledホモログ７（ショウジョウバエ）；機能未知遺伝子ＢＣ００８９６７；ＶＩＩＩ型コラーゲンα１；テネイシンＣ(hexabrachion)；iroquoisホメオボックスタンパク質５；hephaestin；インテグリンβ８；シナプス小胞糖タンパク質２；ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム依存性チャネルサブファミリーＮメンバー４；インテグリンα７；ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１タンパク質；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベーター；sine oculisホメオボックスホモログ２（ショウジョウバエ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；初期増殖応答３；distal-lessホメオボックス５；機能未知タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ）；ビグリカン；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリンβ様１（ＥＧＦ様リピートドメイン）；ヒトｍＲＮＡ全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（atrionatriureticペプチド受容体Ｃ）；機能未知タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ヒトｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；小胞関連膜タンパク質５(myobrevin)；ＥＧＦ含有fibulin様細胞外マトリックスタンパク質１；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａのうち少なくとも１つが低減されている発現；
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＩＭＰ１のうち少なくとも１つの分泌；および、
ＥＬＩＳＡにより検出されるＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１β、Ｉ３０９、ＭＤＣ、およびＶＥＧＦのうち少なくとも１つの分泌の欠如；
の各々を含む、細胞。
（１０５）
単離された産褥由来細胞において、
前記細胞が血清含有培地で増殖されるか、または血清を含まない培地で増殖されるかによらず、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡが存在する***遺伝子プロフィールを含む、細胞。
（１０６）
実施態様（１０５）に記載の単離された産褥由来細胞において、
血清を含まない培地で増殖された場合に比べ、血清含有培地で増殖された場合に、細胞表面マーカーの発現を変更する能力をさらに含む、細胞。
（１０７）
実施態様（１０６）に記載の単離された産褥由来細胞において、
ＰＤＧＦ受容体αおよびＨＬＡ−ＡＢＣに対するマーカーが変更されている、細胞。
（１０８）
治療用細胞または細胞培養物を調製する方法において、
ａ）細胞を単離する工程と；
ｂ）まず、前記細胞の拡大培養を補助し、前記細胞が一定量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣを産生する血清含有培地中で、前記細胞を有用な数まで拡大培養する工程と；
ｃ）前記細胞を、低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地に移行する工程と；
ｄ）前記細胞を、前記細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない培地で継代培養し、これにより、治療用細胞または培養物を調製する工程と；
を含む、方法。
（１０９）
実施態様（１０８）に記載の方法において、
前記細胞が低量の細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣしか産生しない前記培地は、血清を含まない培地である、方法。
（１１０）
実施態様（１０９）に記載の方法において、
移植(implantation)用の細胞または培養物の産生を目的とする、方法。
（１１１）
実施態様（１０８）に記載の方法において、
移植(grafting)用の細胞または培養物の産生を目的とする、方法。
（１１２）
産褥由来細胞の拡大培養用の血清を含まない培地において、
１以上の増殖因子が添加されている、培地。
（１１３）
実施態様（１１２）に記載の血清を含まない培地において、
添加される前記１以上の増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、またはＰＤＧＦである、培地。
（１１４）
実施態様（１１３）に記載の血清を含まない培地において、
添加される前記１以上の増殖因子は、ｂＦＧＦを含む、方法。
（１１５）
実施態様（１１４）に記載の血清を含まない培地において、
少なくとも継代培養２０回の間、拡大培養を補助する、培地。
（１１６）
治療用培養物において、
血清を含まない培地で拡大培養された産褥由来細胞を含む、治療用培養物。
（１１７）
実施態様（１１６）の治療用培養物において、
前記細胞が血清含有培地で増殖されるか、または血清を含まない培地で増殖されるかによらず、レティキュロン、酸化ＬＤＬ受容体、およびＩＬ−８の遺伝子由来のｍＲＮＡが存在する***遺伝子プロフィールを含む、培養物。
（１１８）
細胞培養バンクにおいて、
実施態様（１１７）に記載の細胞を含む、細胞培養バンク。
種々の条件下で単離された臍帯細胞の長期増殖能。５回以上の集団倍加を可能とする条件をさらに長期増殖能に関して分析した。細胞を、示された培地処方および培養条件を用いて、老化に達するまで培養した。細胞が試験期間中に２回以上の集団倍加を行えなかった場合に老化と判定した。

Claims (5)

  1. 治療用臍帯組織由来細胞または培養物を調製する方法において、
    ａ）実質的に血液を含まない単離されたヒト臍帯組織から細胞を単離する工程と；
    ｂ）まず、前記細胞の拡大培養を補助し、前記細胞が、細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣを発現する、胎児ウシ血清含有増殖培地中で、前記細胞を有用な数まで拡大培養する工程と；
    ｃ）血清含有増殖培地で拡大培養された細胞に比べ、前記細胞表面マーカーＨＬＡ−ＡＢＣの前記細胞による発現が減少する、第２の血清不含かつＬ−グルタミンおよび塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）含有改良型ダルベッコの改変必須培地に前記細胞を移行して、前記第２の血清不含培地中で、前記細胞を継代培養し、これにより、治療用臍帯組織由来細胞または培養物を調製する工程と；
    を含む、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、
    移植(implantation)のための治療用臍帯組織由来細胞または培養物の産生を目的とする、方法。
  3. 請求項１に記載の方法において、
    移植(grafting)のための治療用臍帯組織由来細胞または培養物の産生を目的とする、方法。
  4. 請求項１に記載の方法において、
    前記実質的に血液を含まないヒトの臍帯組織から単離された細胞が、自己再生および培養増殖が可能であり、かつ、他の表現型の細胞へ分化する能力を有し、少なくとも４０回の倍加を受けることができ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＰＤ−Ｌ２のそれぞれを発現し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６，ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱを発現せず、かつ、線維芽細胞、間葉幹細胞または腸骨稜骨髄細胞であるヒトの細胞に比べて、インターロイキン−８およびレティキュロン１の発現が増加している、という特徴をさらに有する、
    方法。
  5. 請求項４に記載の方法において、
    前記血清不含培地が、１以上の追加的増殖因子を含む、方法。
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