JP5331685B2 - 二塩基性b鎖末端を有するインスリン類似体の生産方法 - Google Patents
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Description
アミド化され、若しくは保護基でC末端が保護された天然の塩基性アミノ酸を、又は天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体からなりかつC末端でアミド化され、若しくは保護基で保護されたペプチドを、
A鎖及び/若しくはB鎖のC末端アミノ酸が天然の塩基性アミノ酸、若しくはその類似体若しくは誘導体を含む群より選択される出発インスリン類似体、若しくはその誘導体に、
トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で上記1つのC末端アミノ酸に、付加し、
そして得られる修飾されたインスリン類似体を精製し、そして場合により付加されたア
ミノ酸の又は付加されたペプチドのアミド基又はC末端保護基を除去する、
方法に関する。
(A1−A5)ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A1〜A5のアミノ酸残基、
(A12−A19)ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A12〜A19のアミノ酸残基、
A21 天然のアミノ酸残基、
(B8−B18)ヒトインスリン又は動物インスリンのB鎖の位置B8〜B18のアミノ酸残基、
(B20−B26)ヒトインスリン又は動物インスリンのB鎖の位置B20〜B26のアミノ酸残基、
(A8−A10)ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A8〜A10のアミノ酸残基、
R30 化学結合又は天然のアミノ酸残基、
B1 化学結合又は天然のアミノ酸残基、
B3 天然のアミノ酸残基、
B27、B28
及びB29 天然のアミノ酸残基、
R1 アミノ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R2 カルボキシ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R3 アミノ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R4 化学結合、又はC末端に存在するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸を表す1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R5 C末端が遊離又はアミド化されたの何れかである1又は2個の塩基性アミノ酸残基であり、
そこで、C末端でR5のN末端に連結されるアミノ酸残基が、天然の塩基性アミノ酸を含む群より選択される]
によって特徴付けられる上述の方法に関する。
によって特徴付けられる上述の方法に関する。
米国特許第5,663,291号の実施例1には、構造
実施例1に対する代替として、融合タンパク質は、また細菌系における分泌によって調製することが可能であった。この場合、融合タンパク質の部分としてのプロインスリン構造は正確に折りたたまれており、「インビトロ」でのリフォールディング工程なしで済ますことができた。国際特許出願公開WO02/068660は、この種類の系を提案している。例えば、Asn(A21)についてのコドンが、この国際特許出願の実施例1において記載されているプラスミドpBpfuHir_InsにおけるGly(A21)についてのコドンによって置換される場合、結果として、一例としてインスリングラルギンを得ることができる融合タンパク質が生じ、そしてさらにArg(B31)、Gly(A21)ヒトインスリンを、実施例1に記載したように、副産物として単離することが可能であった。
21A−Gly−30B a L−Arg−インスリン100mgをアルギニンアミド溶液0.95mL(446g/L)に溶解し、1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)0.13mL及びDMF2mLを添加した。反応混合物を12℃に冷却し、トリプシン0.094mL(0.075mg、Roche Diagnostics)を添加することによって開始した。
8時間後、TFAをpH2.5まで添加することによって反応を停止させ、HPLCによって分析した。60%を超えるArg(B31)、Arg(B32)、Gly(A21)ヒトインスリンが生成した。トリプシン阻害剤溶液を添加した後、米国特許第5,656,722号と同様に、アミド化された類似体を精製した。次に、アミド化されたインスリン類似体を、酸の存在下で数時間加水分解して、Arg(B31)、Arg(B32)、−Gly(A21)ヒトインスリンを得た。
21A−Gly−30B a L−Arg−インスリン100mgをリシンアミド溶液0.93mL(400g/L)に溶解し、1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)0.13mL及びDMF2mLを添加した。反応混合物を12℃に冷却し、トリプシン0.094mL(0.075mg、Roche Diagnostics)を添加することによって開始した。
8時間後、TFAをpH2.5まで添加することによって反応を停止させ、HPLCによって分析した。Arg(B31)、Lys(B32)−NH2、Gly(A21)ヒトインスリンを生成させ、米国特許第5,656,722号と同様に、トリプシン阻害剤溶液の添加後に精製した。次に、酸の存在下で、アミド化されたインスリン類似体を数時間加水分解し、Arg(B31)、Lys(B32)、Gly(A21)ヒトインスリンを得た。
Arg(B31)、Gly(A21)ヒトインスリン0.25mgをエッペンドルフ容器中で0.1Mピリシン酢酸緩衝液(pH5.6)11μL、0.1Mピリシン酢酸緩衝液(pH5.6)中のH−Arg(Boc)2−OH×HCl130g/L溶液60μL及びDMF119μLと混合し、トリプシン(Roche Diagnostics)と共に12℃で数時間インキュベートした。
25%水、25%アセトニトリル及び50%トリフルオロ酢酸の混合物を添加することによって、反応を停止させた。混合物を凍結乾燥し、保護基を除去するために、TFA1mLに溶解し、室温で約3時間放置した。Arg(B31)、Arg(B32)−NH2、Gly(A21)ヒトインスリンの精製は、例証として、米国特許第5,656,722号と同様に行った。
Arg(B31)、−Gly(A21)ヒトインスリン50mgをH−Lys(Boc)−OtBu溶液(0.5g/mL、pH5)0.62mLに溶解し、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)1mLを添加した。混合物を12℃に冷却し、トリプシン(Roche Diagnostics)2mgを添加した。
10時間を超えた後、50%濃度のアセトニトリル/水混合物2mL及びTFA(100%)1mLを添加することによって、反応を停止させた。混合物を凍結乾燥し、Boc保護基を除去するために、TFA1mLに溶解し、室温で約3時間放置した。Arg(B31)、Lys(B32)、OHの精製は、例証として、米国特許第5,656,722号と同様に行った。
欧州特許出願公開第1,364,032(A)号により、酵母における価値のある医薬的に関心のある他のタンパク質の発現及び分泌のための融合パートナーとしてのヒルジンの使用が提唱された。
実施例7に記載したプラスミドpADH2Hir_ins_glyA21のDNAを使用して、Arg(B31)、Gly(A21)ヒトインスリンの直接的な分泌のためのベクターコンストラクトを調製した。
次のプライマーを合成した。
発現ベクターのクローニングは、欧州特許出願公開第1,364,032号(A)の実施例4と同様に行った。この場合、配列プライマーpichia_H_Irev2の代わりに、プライマーins_gly_rev2を使用し、その後、そのPCR産物
適切な発現ベクターを、実施例7と同様に構築した。プラスミドpPich_Hir_ins−GlyA21並びに2つのプライマーpich_insgly_dirf及びpich_insgly_dirrevのDNA
プラスミドpADH2Hir_ins_glyA21のDNAは、テンプレートとして機能する。2つのプライマーを合成した。
プラスミドpADH2Hir_ins_glyA21のDNAは、出発材料として機能する。本願の実施例7由来のプライマーins_gly_a21_rev及び出願公開WO02/070722A1の実施例1由来のhirf1を使用した。この目的のために、2つの新たなプライマーを調製した。
13)のコドンを含む。第一に、プライマーペア、hirf1/Hir_entero_insrev及びHir_entero_insf/ins_gly_a21_revを使用して、2回のPCRを行った。反応産物を単離した。その材料のアリコートを混合し、その混合物をプライマーペアhirf1/ins_gly_a21_revのためのテンプレートとして、第三のPCRにおいて使用した。記載のとおり、反応産物をクローニングした。その結果、ベクターpADH2Hir_ins_glyA21が生じた。記載のとおり、融合タンパク質を調製した。
プラスミドpADH2_LT_H6_Hir_ins_glyA21のDNA及びプライマーHir_entero_insrev、Hir_entero_insf及びins_gly_a21_revを使用し、以下の配列を有するプライマーalpha_lt_enterofによってプライマーhirf1を置換した。
形質転換及び発現は、実施例7と同様に行った。
2つのプライマー配列を合成した。
独国特許第3844211号に記載のとおり、インスリン前駆体をリシルエンドペプチダーゼ(LEP)と反応させた(実施例1)。この目的のため、Lys(B31)−ミニプロインスリン10mgをトリス緩衝液(pH8.0)に溶解し、リソバクター酵素前駆体(enzymogene)由来のLEPを添加した(1mg/mL濃度の水溶液0.01mL、Merckbiosciences)。インキュベーションを室温で2時間行い、RP−HPLC(Nucleosil 120−5カラム)によって精製した。結果としてB(1〜29)−A(1〜21)スプリットインスリンが生成した。
B(1〜29)−A(1〜21)スプリットインスリン100mgをアルギニンアミド溶液0.95mL(446g/L)に溶解し、1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)0.13mL及びDMF2mLを添加した。反応混合物を12℃に冷却し、トリプシン0.094mL(0.075mg、Roche Diagnostics)を添加することによって開始した。
B(1〜29)−A(1〜21)スプリットインスリン100mgをリシンアミド溶液0.93mL(400g/L)中に溶解し、1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)0.13mL及びDMF2mLを添加した。反応混合物を12℃に冷却し、トリプシン0.094mL(0.075mg、Roche Diagnostics)を添加することによって出発した。8時間後、TFAをpH2.5まで添加することによって反応を停止させ、HPLCによって分析した。Lys(B30)−インスリンアミドが生成し、米国特許第5,656,722号と同様に、トリプシン阻害剤溶液の添加後に精製した。次に、アミド化されたインスリンを酸の存在下で数時間加水分解してLys(B30)−インスリンを得るか、又は薬剤として直接使用することが可能であった。
Claims (15)
- C末端でアミド化されたアルギニン、又は保護基でC末端が保護されたアルギニンを、一般式II
(A1−A5) ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A1〜A5のアミノ酸残基、
(A12−A19) ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A12〜A19のアミノ酸残基、
A21 天然のアミノ酸残基、
(B8−B18) ヒトインスリン又は動物インスリンのB鎖の位置B8〜B18のアミノ酸残基、
(B20−B26) ヒトインスリン又は動物インスリンのB鎖の位置B20〜B26のアミノ酸残基、
(A8−A10) ヒトインスリン又は動物インスリンのA鎖の位置A8〜A10のア
ミノ酸残基、
B30 化学結合又は天然のアミノ酸残基、
B1 化学結合又は天然のアミノ酸残基、
B3 天然のアミノ酸残基、
B27、B28及びB29 天然のアミノ酸残基、
R1 アミノ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R2 カルボキシ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R3 アミノ基又は1〜3個の天然のアミノ酸残基、
R4 C末端に存在するアミノ酸残基が塩基性アミノ酸を表す1〜3個の天然のアミノ酸残基、
である]
で表される出発インスリン類似体若しくはその誘導体のB鎖のC末端アミノ酸残基に、トリプシンの生物活性を有する酵素の存在下で付加し、
そして得られる一般式I
R5は、C末端が遊離であるか又はアミド化されたか又はC末端保護基で保護されたかの何れかであるアルギニン残基である]
で表される修飾されたインスリン類似体を精製し、そして場合により、付加されたアルギニン残基のアミド基又はC末端保護基を除去する、
インスリン類似体又はその誘導体を調製するための方法。 - 修飾されたインスリン類似体が、B鎖のC末端がアミド化されたGly(A21)、Arg(B31)、Arg(B32)ヒトインスリンである、請求項1に記載の方法。
- 出発インスリン類似体が、Gly(A21)、Arg(B31)ヒトインスリンである、請求項2に記載の方法。
- 出発インスリン類似体が、出発インスリン類似体のA鎖及びB鎖を含む前駆体タンパク質の組換え発現によって調製される、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- レプリコンの部分である遺伝子を発現する、請求項4に記載の方法。
- 細菌又は酵母を、宿主細胞として使用する、請求項4又は5に記載の方法。
- 前駆体タンパク質が発現後に分泌される、請求項4〜6の何れか一項に記載の方法。
- 前駆体タンパク質が細菌又は酵母の細胞上清から単離される、請求項7に記載の方法。
- 前駆体タンパク質が、細菌の周辺質から単離される、請求項6に記載の修飾されたインスリン類似体を調製するための方法。
- 請求項4〜7の何れか一項に記載のとおり得られる前駆体タンパク質を、フォールディングプロセス及び酵素的切断にかける、請求項4〜7の何れか一項に記載の方法。
- 出発インスリン類似体が、組換え体直接発現によって調製される、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- トリプシンの生物活性を有する酵素が、ヒトトリプシン、ブタトリプシン、ウシトリプシン、並びにヒトトリプシン、ブタトリプシン及びウシトリプシンの変異体を含む群より選択される、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- 酵素が、リシルエンドペプチダーゼ活性を有する、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- 修飾されたインスリン類似体のB鎖のC末端が、その後加水分解反応において脱保護される、請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
- 得られるインスリン類似体が、Gly(A21)、Arg(B31)、Arg(B32)ヒトインスリンである、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
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